CN116380755A - CD127+PMN-MDSCs在诊断支气管肺发育不良中的应用及诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检验技术领域，尤其是CD127+PMN‑MDSCs在诊断支气管肺发育不良中的应用及辅助诊断试剂盒。本发明采集出生胎龄≤32w的早产儿生后28日龄以上的外周血样本进行分析发现，支气管肺发育不良(BPD)早产儿的外周血中CD127+PMN‑MDSCs的含量存在显著差异；出生胎龄≤32w的BPD患儿生后28日龄以上的外周血中CD127+PMN‑MDSCs的数量较同出生胎龄非BPD早产儿有显著的下降，差异具有统计学意义。PMN‑MDCSs及CD127+PMN‑MDSCs是一个诊断效果很好的支气管肺发育不良(BPD)辅助标记物，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，减轻患者的负担和痛苦。因此，CD127+PMN‑MDSCs检测试剂可作为支气管肺发育不良的辅助诊断试剂，用于制备支气管肺发育不良辅助诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其是CD127+PMN-MDSCs在诊断支气管肺发育不良中的应用及诊断试剂盒。
背景技术
支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿最常见的并发症之一，尤其是超未成熟儿和超低出生体重儿。1967年，Northway等首次报道了BPD(即“旧”BPD)的定义，认为BPD是一种慢性肺部疾病。患儿生后大多数有严重的肺透明膜病，表现为肺泡发育受阻，出生28d后仍需吸氧治疗。随着近年来早产儿救治技术的提升，尤其是肺表面活性物质和呼吸机的应用，使得可存活的早产儿胎龄及体重逐渐减小，这反而导致了BPD的发生率不断升高，其病理特征也因此发生了改变。
研究表明，BPD在胎龄28周以下早产儿中的发生率高达40％，对患儿神经系统与呼吸系统等造成了严重损害。BPD是早产儿最普遍和最严重的长期后遗症之一。患有BPD的早产儿其健康、神经发育和生活质量均受到损害。与没有BPD的婴儿相比，患有BPD的早产儿再住院率更高；并且具有更高的呼吸系统疾病发病率和呼吸药物需求；肺功能异常，尤其是常常存在气道狭窄。
“新”BPD的病理特征是由继发于呼吸窘迫综合症后的慢性炎症所致的肺发育受阻为主，具体表现为肺泡数目减少、体积增大、结构简单化以及肺微血管发育不良，纤维化程度较过去轻。于是，美国国家儿童保健及人类发展研究院(NICHD)于2001年及2018年两次修改其定义及诊断标准。
支气管肺发育不良是多因素作用的结果，包括早产、低出生体重、机械通气、氧中毒、感染、未应用肺表面活性物质、遗传易感性等等。
BPD的治疗目前仍以对症支持治疗为主，缺乏针对性的病因治疗或特别有效的方法，患儿死亡率较高，部分即使存活，也可能有长期的并发症如神经发育功能异常、支气管肺炎、婴幼儿哮喘、生长发育迟缓、心血管系统后遗症。
因此，有效预防BPD对降低其发病率、减少并发症、提高早产儿存活率及提高新生儿的健康水平至关重要。此前未见将CD127+PMN-MDSCs用于诊断BPD的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种诊断支气管肺发育不良(BPD)的生物标志物及其在诊断支气管肺发育不良中的应用，所述生物标志物为CD127+PMN-MDSCs。支气管肺发育不良患者外周血中的CD127+PMN-MDSCs的数量显著下降，差异具有统计学意义，检测灵敏度和特异性均较高。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在制备诊断支气管肺发育不良的试剂中的应用。其中PMN-MDSCs为粒细胞型髓系抑制性细胞。
本发明人经过大量研究及试验发现，PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在支气管肺发育不良患者中的数量显著下降，可以作为支气管肺发育不良(BPD)的诊断标志物，有利于支气管肺发育不良的辅助诊断，不容易错过治疗时期。
第二目的，本发明提供了检测PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在待测者生物样本中的含量的试剂在制备诊断或检测支气管肺发育不良试剂盒中的应用。
第三目的，本发明提供了PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs检测试剂在制备支气管肺发育不良检测试剂盒中的应用。
在其中一些实施例中，所述生物样本为外周血。生物样本不仅仅可以为上述外周血，还可以为本领域常用的生物样本。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述CD127+PMN-MDSCs为HLA-DR-CD11b+CD14-CD15+CD127+的CD127+PMN-MDSCs。HLA-DR-CD11b+CD14-CD15+CD127+为CD127+PMN-MDSCs的流式细胞术分析标记。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述CD127+PMN-MDSCs在支气管肺发育不良早产儿中表达显著低于非BPD早产儿。
BPD患儿生后28天以上的外周血中CD127+PMN-MDSCs的数量较同出生胎龄非BPD早产儿有显著的下降。该结果提示，早产儿出生后28天以上外周血中的CD127+PMN-MDSCs数量减少对BPD的发病可能有辅助诊断作用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述早产儿的胎龄≤32周。
出生胎龄≤32w的BPD患儿生后28日龄以上的外周血中CD127+PMN-MDSCs的数量较同出生胎龄非BPD早产儿有显著的下降。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测试剂为流式细胞术检测试剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测试剂为流式细胞术检测抗体。
第四目的，本发明提供了一种诊断支气管肺发育不良的试剂盒，所述试剂盒包含检测CD127+PMN-MDSCs在待测者生物样本中的含量的试剂。
作为本发明所述诊断支气管肺发育不良的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括红细胞裂解液、人外周血淋巴细胞分离液和PBS缓冲液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采集出生胎龄≤32w的早产儿生后28日龄以上的外周血样本进行分析发现，支气管肺发育不良(BPD)早产儿的外周血中CD127+PMN-MDSCs的含量存在显著差异；出生胎龄≤30w的BPD患儿生后28日龄以上的外周血中CD127+PMN-MDSCs的数量较同出生胎龄非BPD早产儿有显著的下降，差异具有统计学意义，该结果提示，早产儿出生后外周血中的CD127+PMN-MDSCs数量减少可能是BPD潜在的发病原因。
进一步进行ROC曲线分析，单独PMN-MDSCs在用于支气管肺发育不良(BPD)的辅助诊断时的AUC是0.7937；CD127+PMN-MDSCs和PMN-MDSCs联合用于支气管肺发育不良(BPD)的辅助诊断时的时AUC＝0.8889，P＝0.0095，在灵敏度＝88.89％，特异性＝85.71％时达到最佳界值，证实PMN-MDCSs及CD127+PMN-MDSCs联合对BPD的诊断具有很高的准确性，灵敏度和特异性均高。这些结果表明PMN-MDCSs及CD127+PMN-MDSCs是一个诊断效果很好的支气管肺发育不良(BPD)标记物，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，减轻患者的负担和痛苦。因此，CD127+PMN-MDSCs检测试剂可作为支气管肺发育不良的辅助诊断试剂，用于制备支气管肺发育不良辅助诊断试剂盒。
附图说明
图1为CD127+PMN-MDSCs在用于诊断支气管肺发育不良(BPD)的ROC曲线分析图。其中，Control代表健康志愿者(胎龄≤30w的非BPD早产儿)；BPD代表支气管肺发育不良。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。以下结合具体实施例对本发明进行说明。
2001年诊断支气管肺发育不良(BPD)的定义及其诊断标准如表1所示。
表1
2001年BPD的定义及其诊断标准注意：GA，gestation age出生胎龄；PMA,postmenstrual age纠正胎龄；PNA，
postnatal age生后日龄；
FiO2，fractional inspired oxygen吸入氧分数。
实施例1
一、病例信息：
样本信息如下表2：
表2
纳入标准：胎龄≤32w，日龄≥28d的早产儿。采样时无感染，无使用抗生素和激素。
排除标准包括：有复杂型先天性心脏病(PDA、ASD、VSD、PPHN)、严重先天性畸形、染色体异常、遗传代谢病及资料不完整者。
二、实验方法
1、采集1ml上述病例的全血于EDTA抗凝管中，4℃，1000G离心5min，留取上清，然后按照1:5的比例用PBS缓冲液稀释上清(上清和PBS缓冲液的体积比为1:5)。
2、缓慢注入4ml Ficoll中，18℃，1000G离心20min，升5，降5。吸取中间白膜层，加入5ml PBS洗涤，18℃，300G离心5min，升9，降9，弃上清。
3、裂红，加入1ml PBS缓冲液重悬，加入3ml的1x红细胞裂解液；室温静置5min；加入5ml MACS终止裂红；300g离心5min，弃上清。
4、加入100μl流式抗体标记CD127+PMN-MDSCs(HLA-DR、CD11b、CD14、CD15、CD45各0.5μl，加入100μl MACS稀释)。4℃冰箱中避光染色30min。加入300μl PBS缓冲液终止染色，离心500G 5min，弃上清，
5、100μl MACS重悬，上机前加入2μl 7-AAD静置于冰上5min。加入适量MACS终止染色。
6、使用流式细胞术检测CD127+PMN-MDSCs细胞比例，并通过流式细胞仪分选得到CD127+PMN-MDSCs细胞(CD127+PMN-MDSCs标记为HLA-DR-CD11b+CD14-CD15+CD127+)。
7、统计分析使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 8进行处理。统计数值用均数±标准差(Mean±SD)表示。采用均数t检验。p＜0.05表示有统计学差异。
三、实验结果
结果如图1所示，本研究通过采集出生胎龄≤32w的早产儿生后28日龄以上的外周血，检测其中的CD127+PMN-MDSCs数量，并根据2001年版BPD的定义及其诊断标准确诊有无BPD后进行分组比较，发现：出生胎龄≤32w的BPD患儿生后28日龄以上的外周血中CD127+PMN-MDSCs的数量较同出生胎龄非BPD早产儿(Control)有显著的下降，差异具有统计学意义。该结果提示，早产儿出生后外周血中的CD127+PMN-MDSCs数量减少可能是BPD潜在的发病原因。CD127+PMN-MDSCs可作为特异性生物标志物用于诊断BPD，可及时指导临床用药，减轻患者的负担和痛苦。检测CD127+PMN-MDSCs在待测者外周血中含量的试剂即可作为诊断BPD的试剂，具有很高的临床应用价值，用于制备支气管肺发育不良辅助诊断试剂盒。
为了评价CD127+PMN-MDSCs在诊断支气管肺发育不良(BPD)的诊断性能，进一步进行了ROC曲线分析，结果显示，单独PMN-MDSCs在用于支气管肺发育不良(BPD)的辅助诊断时的AUC是0.7937；CD127+PMN-MDSCs在用于支气管肺发育不良(BPD)的辅助诊断时的时AUC＝0.8889，P＝0.0095，在灵敏度＝88.89％，特异性＝85.71％时达到最佳界值，证实PMN-MDCSs及CD127+PMN-MDSCs联合对BPD的诊断具有很高的准确性，灵敏度和特异性均高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在制备诊断支气管肺发育不良的试剂中的应用。
2.检测PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在待测者生物样本中的含量的试剂在制备诊断或检测支气管肺发育不良试剂盒中的应用。
3.PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs检测试剂在制备支气管肺发育不良检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述CD127+PMN-MDSCs为HLA-DR-CD11b+CD14-CD15+CD127+的CD127+PMN-MDSCs。
5.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述CD127+PMN-MDSCs在支气管肺发育不良早产儿中表达显著低于非BPD早产儿。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述早产儿的胎龄≤32周。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为流式细胞术检测试剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为流式细胞术检测抗体。
9.一种诊断支气管肺发育不良的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测PMN-MDSCs或CD127+PMN-MDSCs在待测者生物样本中的含量的试剂。
10.如权利要求9所述的诊断支气管肺发育不良的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括红细胞裂解液、人外周血淋巴细胞分离液和PBS缓冲液。
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