CN112831579A - 肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用,所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。本发明对分离的肠道菌群核酸样本进行测序,以获得测序结果,根据测序结果,对肠道菌群中的肠道微生物的相对丰度进行检测,得到相对丰度值,将得到的肠道微生物相对丰度值与设定值进行比较,得到的结果可作为中间信息辅助诊断早产儿支气管肺发育不良。本发明通过高通量测序技术对早产儿粪便样本16SrDNA基因进行测序,首次探讨肠道菌群与早产儿BPD发生的关系,为BPD的预防及治疗提供可靠依据。
Description
技术领域
本发明是属于生物技术,具体涉及肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用。
背景技术
在“肠道菌群”是在宿主胃肠道中定殖的各种微生物群落的总称,包括细菌、病毒、真菌和原核生物。越来越多研究表明,肠道菌群是维持健康的关键。随着16SrDNA高通量测序技术的发展,研究者们开始着眼于肠道菌群与人体健康方面的研究。研究发现,肠道菌群在疾病的代谢、免疫调节和炎症反应中发挥着重要作用,随之肠-脑轴和肠-肝轴等概念被提出。肺部和肠道有着共同的胚胎起源和黏膜免疫系统,是与外界直接相通的空腔脏器,存在各自的菌群。MARSLAND等的研究提出,肺部和肠道之间存在肠-肺轴的联系。
慢性肺部疾病患者的肠道菌群特征、免疫信号传递和益生菌治疗已经成为近年来的研究热点。肠-肺轴是肠道与肺部“沟通”的桥梁,两者间相互影响,相互调控,主要表现在两个方面:(1)肠道菌群的紊乱影响肺部疾病的发生发展。当肠道菌群的丰富度和多样性发生变化时,菌群可通过调节免疫应答、改变T淋巴细胞亚群的活性和免疫细胞的募集、迁移,进而调节机体的免疫反应。肺部并发症是类风湿性关节炎的重要死因。Bardley等研究发现,肠道菌群中的分节丝状菌(segmented filamentous bacteria,SFB)可远距离刺激肺部,通过肠-肺轴诱导Th17细胞应答,激活自身免疫,产生抗体,同时在外周组织中,选择性扩增表达Th17细胞的双T细胞受体,识别SFB表位和自身抗原,增强自身免疫。Huang等研究发现,在炎症信号的反应过程中,2型固有淋巴样细胞(type-2 innate lymphoid cell,ILC2s)可从肠道进入肺部,影响肺部的免疫反应。ILC2s可被IL-25激活,产生大量的IL-5和IL-13,当IL-25诱导或微生物感染作为炎症信号时,富集于小肠的ILC2s通过1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)依赖的方式打开通向淋巴管的通路,被激活ILC2s又称炎性ILC2s(inflammatorytype ILCs,iILC2s),iILC2s可从淋巴管进入血管迁移至肺部,参与肺部的Ⅱ型免疫和组织修复。(2)肺部疾病的发生发展会影响肠道菌群的稳定,伴发许多胃肠道疾病。WANG等研究发现,呼吸道流感病毒感染在肺损伤时可引起的肠损伤,肠损伤并非由肠道病毒感染引起。感染流感病毒后,肺源性CCR9+ CD4+ T细胞进入小肠产生干扰素-γ(IFN⁃γ)使肠道微生物群组成发生改变。感染流感病毒后,小肠TH17细胞显著增加,IL⁃17a中和抗体使小肠损伤减轻。肠道菌群改变可刺激肠上皮细胞生成IL-15,促进小肠中Th17细胞的激活。可见,在肠道与肺部疾病的相互影响中,肠-肺轴至关重要。
.综上所述,16srRNA技术的发展使人们对肠道菌群的研究成为可能,已有各种研究证明了肠道菌群与肺部疾病相关,肠道菌群紊乱会导致肺部疾病,肺部疾病亦可引起肠道菌群的改变。肠道菌群对肺部免疫作用机制目前尚未明确,仍需进一步研究。人们可以通过使用益生菌或FMT来调节肠道菌群,以预防和治疗肺部感染。总之,肠道菌群在肺部健康中发挥着重要作用,从肠道菌群的角度治疗肺部疾病将是一种新的方法,需要开展更多的研究,明确肠道菌群对肺部免疫的作用机制,为临床治疗提供依据。
支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)最常见于因新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)接受机械通气和氧疗的早产儿。随着围产生殖技术发展、新生儿重症监护室(neonatal intensive care unit,NICU)医疗水平提高,早产儿尤其是极低出生体重儿(出生体重<1500g)及超低出生体重儿(出生体重<1000g)的存活率明显提高,但随之而来的相关并发症发生率也显著提高,其中BPD是小早产儿好发的严重并发症之一。BPD的发生率与胎龄、出生体重相关。有文献报道极低出生体重儿的BPD发病率为40%~68%。BPD对患儿的神经认知、肺功能影响均显著,可延续到青春期甚至成年,对患儿生存质量影响严重,给社会及家庭带来了沉重负担,因此,对BPD的防治仍是重要问题。1967年,Northway等在报告中描述了一种从严重NRDS发展到肺损伤过程的疾病,并将其命名为BPD,即“旧”BPD,亦称经典型BPD。近年来,由于产前糖皮质激素及产后肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)的使用,通气策略的改进,新生儿护理技术的进步,经典型BPD已明显减少。2000年,NICHD及其他疾病委员会制定了“新”BPD的定义及病情分级。根据新定义,BPD可以是任何氧依赖[吸入氧浓度(FiO2)>21%]超过28d的新生儿,若胎龄<32周,则根据纠正胎龄36周或出院时FiO2分为:轻度:无需吸氧;中度:FiO2<30%;重度:FiO2≥30%或机械通气。若胎龄≥32周,根据生后56d或出院时FiO2进行上述分级。胸片不再作为评估疾病严重性的依据。新型BPD主要特征是肺泡及肺微循环发育不良。近年来,随着国内外对BPD的深入研究,已取得了较大的成就,但其确切病因及发病机制仍不明确,无特效治疗手段,因此,有效预防BPD对提高早产儿存活率及改善其预后至关重要。肠道微生态是微生物与肠道内环境之间的关系,是指在消化道中存在的细菌、病毒、真菌、衣原体等微小生物群体,以细菌为主。肠道是机体中细胞数量最多的独特组织器官,肠道内细菌总数为1013~1014cfu/m3,有400~500菌种,近200万个基因。肠道菌群的定植可促进免疫系统的发育、肠道屏障功能的建立以及机体营养物质的代谢。随着对肠道微生态的研究深入,研究者们将目光开始集中在探寻肠道菌群与各种疾病之间的关系。目前已有人关注婴幼儿哮喘、肺炎等肺部疾病与肠道菌群关系的研究。
与正常足月新生儿相比,早产儿由于胃肠道发育不成熟、生后暴露于医院等环境下,无法获得自然生长状态下的肠菌定植情况,肠道菌群定植延迟,更易发生肠道微生态失调。BPD常见于早产儿,但由于早产儿肠道菌群定植所受影响因素多、标本难以留取等原因,目前尚无关于BPD与肠道菌群的相关研究。
发明内容
16SrRNA是原核生物核糖体中30S亚基的组成部分,16SrDNA是基因组中编码核糖体16SrRNA分子对应的DNA序列。该基因全长约1540bp,存在于所有细菌染色体基因组中,包含10个保守区和9个可变区,其中保守区反映了物种间的亲缘关系,可变区可体现物种间的差异,且变异程度与菌群发育密切相关,是最适于鉴别细菌系统发育和分类的指标。本发明通过16SrDNA测序技术对早产儿粪便菌群进行动态测序,探讨早产儿生命早期肠道菌群定植模式及肠道菌群在BPD发生、发展过程中的变化,为临床上用益生菌早期防治BPD提供理论依据。
本发明采用如下技术方案:
肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用;所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
本发明公开了肠道微生物在制备早产儿支气管肺发育不良症标志物中的应用;所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
本发明公开了检测肠道微生物丰度的试剂在制备早产儿支气管肺发育不良症标志物中的应用;所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
检测肠道微生物丰度的试剂包括检测肠道微生物的引物或者探针;比如检测检测克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)16SrRNA的引物。
利用本发明肠道微生物辅助诊断早产儿支气管肺发育不良的系统,包括测序模块,对分离的肠道菌群核酸样本(粪便DNA)进行测序,以获得测序结果;丰度计算模块,根据测序结果,对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测,得到相对丰度值;比较模块,将得到的微生物标志物相对丰度值与设定值进行比较。设定值为正常组(非BPD组)得到的微生物标志物相对丰度值。 优选的,所述肠道微生物由克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)组成。
优选的,早产儿支气管肺发育不良症为早产儿早期支气管肺发育不良症。
支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿最严重的并发症之一,对呼吸、神经等系统的不利影响可持续至成年,至今其病因及发病机制仍未完全明确,肠道菌群变化被认为在肺部慢性疾病中起着重要作用。本发明通过高通量测序技术对早产儿粪便样本16SrDNA基因进行测序,探讨肠道菌群对早产儿BPD发生、发展的影响,BPD组和非BPD组早产儿肠道菌群定植模式均表现为变形菌门的一过性增高,其相对丰度自生后第4天至28天BPD组均低于非BPD组,且BPD组变形菌门丰度达峰时间(生后第14天)晚于非BPD组(生后第7天);本发明首次公开了由克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)组成的肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用,为BPD的预防及治疗提供可靠依据。
附图说明
图1为有效序列长度分布统计;
图2为第4天Top50相对丰度的OTU热图;
图3为第7天Top50相对丰度的OTU热图;
图4分别是克雷伯氏菌属(Klebsiella)在两组间的相对丰度差异;
图5分别是普雷沃菌属(Prevotella)在两组间的相对丰度差异;
图6分别是链球菌属(Streptococcus)在两组间的相对丰度差异;
图7分别为肠球菌属(Enterococcus)在两组间的相对丰度差异;
图8分别为葡萄球菌属(Staphylococcus)在两组间的相对丰度差异;
图9分别为拟杆菌属(Bacteroides)在两组间的相对丰度差异;
图10为BPD组与非BPD组chao1指数、observed species指数箱型图;
图11为BPD组与非BPD组shannon指数、simpson指数箱型图;
图12 为BPD组与非BPD组PCA图,生后第4天;
图13为BPD组与非BPD组PCA图,生后第7天。
具体实施方式
本发明中,“标志物”是指,将支气管肺发育不良的早产儿与非支气管肺发育不良的早产儿进行比较时,由于在两个组别中存在有明显差别而可以成为支气管肺发育不良的的危险程度或者诊断是否发生疾病时的基准的物质。
在本发明中,“引物”表示寡核苷酸,可以是单链或双链,足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素,其中包括温度、引物来源和使用方法。例如,通常含有15-25个或更多核苷酸,根据本发明公开的克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus),对于本领域技术人员容易知道对于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)16SrRNA的引物。
实施例
本发明公开了克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)在制备早产儿支气管肺发育不良症微生物标志物中的应用;以克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)作为早产儿支气管肺发育不良症微生物标志物;特别的,克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)在制备早产儿早期支气管肺发育不良症微生物标志物中的应用,早期为出生至7天。通过克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)的检测可以早期识别发生BPD的高危儿,早期干预,降低BPD尤其是中/重度BPD的发生率,提高早产儿的生存质量。
为了验证以克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)作为早产儿支气管肺发育不良症微生物标志物的准确性以及特异性,本发明从肠道菌群入手,以2018年04月20日至2019年09月20日期间于生后24小时内收住苏州大学附属儿童医院NICU和/或苏州市立医院本部母子中心NICU、胎龄≤32周且住院时间≥28天的早产儿作为研究对象,验证了肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用。入选标准:2018年04月20日至2019年09月20日期间于生后24小时内收住苏州大学附属儿童医院NICU和/或苏州市立医院本部母子中心NICU、胎龄≤32周且住院时间≥28天的早产儿作为研究对象。本研究获患儿家属知情同意及苏州大学附属儿童医院伦理委员会批准。排除标准:(1)入院时龄>24小时者;(2)胎龄>32周者;(3)于我院和/或苏州市立医院NICU住院时间<28天者;(4)生后28天内予母乳喂养者;(5)先天性消化系统疾病,住院期间发生消化道穿孔及行手术者;(6)复杂先天性心脏病者(除外动脉导管未闭);(7)隔疝、先天性呼吸道畸形;(8)入院未经抢救即死亡或积极抢救治疗数小时之内死亡的新生儿;(9)染色体异常;(10)临床资料不完整者。 BPD诊断标准及分级标准:BPD定义及分级标准均参照2000年NICHD及其他疾病委员共同举办的 BPD 研讨会提出标准:任何氧依赖(FiO2>21%)超过28d的新生儿。分级标准详见表1。
根据BPD诊断标准将发展为BPD的早产儿作为BPD组,在未发生BPD的早产儿中按1∶1比例随机抽取一般资料与BPD组匹配的早产儿作为非BPD组,根据NICHD及其他疾病委员会于2000年共同举办的BPD研讨会提出的分度标准将BPD组分为轻度和中/重度两亚组。 患儿基本信息 2018年04月20日至2019年09月20日期间共观察197例早产儿,其中因入院未经抢救即死亡或积极抢救治疗数小时之内死亡排除20例,因住院时间不满28天排除21例,因先天性胃壁缺如排除1例,因肠穿孔行手术者4例,纳入队列中共151例,其中有58例早产儿发生BPD,纳入BPD组,其中轻度26例,中/重度32例;未发生BPD的早产儿93例中按1:1的比例与BPD组随机匹配为非BPD组,两组共116例,男59例(50.86%),女57例(49.14%);胎龄27~32周,平均胎龄(29.73±1.37)周;出生体重800~2330g,平均出生体重(1245.60±239.89)g。两组间性别分布、出生体重、胎龄、分娩方式、是否为试管婴儿、是否双胎或多胎、Apgar 1分钟、Apgar 5分钟评分等一般情况均无显著差异(P>0.05),详见表2
BPD组与非BPD组早产儿母亲一般情况比较 两组早产儿母亲年龄<20岁或>35岁、妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、产前感染、产前使用抗生素、产前使用糖皮质激素、胎膜早破≥18小时及阴道炎在两组间比较无显著差异(P>0.05),详见表3。
BPD组与非BPD组早产儿基础疾病及合并症情况
BPD组早产儿PDA、频发呼吸暂停、ROP、PNAC、EUGR的发生率明显高于非BPD组,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);而NRDS、肺动脉高压、PVH-IVH、PVL、新生儿肺炎、呼吸衰竭、贫血、败血症发生率在两组间无明显差异(P>0.05)。具体见表4。
BPD组与非BPD组早产儿住院期间治疗情况比较
BPD组早产儿输血≥3次、有创通气、无创通气、单联特殊级抗生素使用率明显高于非BPD组,PICC置管时长、有创通气天数、无创通气天数、总吸氧天数、抗生素使用时长、肠外营养天数、住院时长明显多于非BPD组,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);而开奶日龄、PICC置管、首次抗生素为非限制级、首次抗生素为限制、首次抗生素为非限制级与限制级二联使用、使用二联及以上特殊级抗生素在两组间比较无显著差异(P>0.05)。具体见表5。
表5 BPD组与非BPD组早产儿住院期间治疗情况比较
注:※为Mann WhitneyU检验,#为卡方检验。
早产儿发生BPD的Logistic多因素回归分析
将PDA、频发呼吸暂停、PICC置管时长、输血≥3次、有创通气天数、无创通气天数为自变量,以BPD发生为因变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示:频发呼吸暂停(OR=0.134,95% CI: 0.030~0.603)、输血≥3次(OR=0.081,95% CI: 0.015~0.429)及无创通气天数(OR=1.251,95% CI: 1.111~1.409)为BPD发生的独立高危因素。具体见表6。
前瞻性巢式病例对照研究
采用前瞻性巢式病例对照研究(Nested Case-Control study, NCCS)方法,对符合入选标准的早产儿进行随访观察,采集早产儿的基本信息及母亲孕期基本资料,收集所有入选的早产儿的粪便样本,分别于生后第1、4、7、14、21、28天留取粪便样本,抽取已采集好的BPD组与非BPD组的临床信息和粪便样本,对两组不同时间点的粪便标本采用16SrDNA高通量测序技术进行检测并行生物信息学分析。
在规定时间内采集样本,前后不超过24小时。取样前,使用消毒液洗手,并戴无菌手套。取样时,用无菌棉签收集尿不湿上的新鲜粪便,采集时注意无菌操作,注意避免粪尿混合,避免出现交叉污染及外来细菌污染,用1~3个1.5ml灭菌EP管分装,在2小时内用装有冰块的保温桶送至实验室,-80℃冰箱保存,等待集中检测。
标本检测,具体的操作方法比如样本DNA提取、扩增、测序、数据处理等为现有技术。
样本DNA提取
(1)在室温下进行操作,添加750ul裂解液至裂解管,用无菌勺取150mg粪便样本加入,使用高频振荡器震荡3min。
(2)将裂解管放到离心机中,用11000rpm离心1分钟,所得上清加到3号柱中,3号柱套在一个收集管中,在8000rpm下离心1分钟,弃过滤柱。
(3)收集管中添加1200ul基因组DNA裂解液并用移液枪吹打使其充分混匀。
(4)将2号柱套在一个新的收集管。
(5)从步骤(3)的收集管中吸取800ul混合液加入2号柱,用10,000rpm离心1分钟,倒掉废液。重复一次。
(6)将2号柱套在新收集管,添加200ul基因组DNA洗涤液1到2号柱中,在11000rpm下离心1分钟。
(7)添加500ul基因组DNA洗涤液2到2号柱中,在11,000rpm下离心1分钟。弃废液,并将2号柱套回收集管,离心2分钟,除净洗液。
(8)在干净收集管中移入2号柱,开盖放置片刻,后添加100ul的基因组DNA洗脱液到柱基质上,室温下静置5分钟,用11000rpm离心1分钟将基因组DNA洗脱。
(9)将抑制物去除柱套在收集管中,加入600ul抑制物去除液,用11000rpm离心3分钟。
(10)吸取洗脱的基因组DNA100ul放入制备好的抑制物去除柱内,抑制物去除柱套在一个干净的1.5ml离心管中,在16000rpm下离心3分钟,得到的DNA需进行DNA浓度及纯度检测。
DNA 浓度检测
(1)准备样品所需的0.5mlEP管。
(2)盖子做好记号。
(3)取工作液199ul添加到各个EP管中,在提取后的每一个DNA液样品取1ul添加到包含工作液的试管中,以2-3秒的涡流混合。
(4)所有配置好的样本在室温下静置2分钟。
(5)将孵育好的样本置于QubitTM3.0 Fluorometer上,测定DNA浓度,并记录数值。
(6)将提取成功的DNA液(浓度≥5ng/ul)保存在-20℃的冰箱中备用。
MetaVx文库构建
原核生物16S rDNA上V3、V4 的2个高度可变区使用一系列PCR引物扩增,具体步骤如下:
(1) 1stPCR以样品中提取的DNA稀释至5ng/ul为模板,使用现有试剂盒中的Primer和PCR酶对V3~V4区域进行扩增,使用H2O作为阴性对照进行实验。
1)在冰上配制反应液。依照如下组份先按反应数+α的量配制扩增预混Mix,取配制好的预混Mix分装到PCR反应管中。(除DNA提取液和H2O以外)。
反应体系的配置(总体积 25ul):
注:此处不添加 DNA 提取液。
取上面反应管中的一个作为阴性对照,在反应管中加入 H2O 后将管盖压紧。
2)添加DNA提取液。
3)进行PCR反应。
<初期变性>95℃,3分钟
<PCR:27cycles>95℃,30秒;60℃,30秒;72℃,20秒
<总延伸>72℃,5分钟
<Hold>4℃,Hold
(2)1st PCR产物的纯化
使用磁珠(Agencourt AMPure XP)纯化1st PCR扩增产物。
1)4℃冰箱取出,室温放置30min,将磁珠打散、混匀。
2)将磁珠按比例加入PCR产物:25ul PCR产物中加入45ul磁珠。
3)混匀后在室温下静置5min,离心,磁力架上放3min,弃上清液。
4)反应管中加入70%的乙醇200ul,室温下放置1min,过滤80%的乙醇。
5)重复上述 4)步骤,离心,去除残留70%的乙醇。
6)室温干燥10min。
7)加入40ul的洗脱液,轻轻地上下吸打混匀,室温放置5min,瞬时离心,磁力架上静置3min,回收上清液。
(3)以操作纯化得到的1st PCR产物为模板,进行2nd PCR导入测序接头,可对检测样品添加不同组合的Index primer。
1) 除1st PCR纯化产物以外,依照如下组份先按反应数+α的量配制扩增预混Mix,取配制好的预混Mix分装到PCR反应管中。
反应体系的配置(总体积 50ul):
注:此处不添加 1st PCR 纯化产物。
2) 添加DNA提取液
3) 进行PCR反应
(4)与【1st PCR 产物的纯化】进行相同的操作,对2nd PCR产物进行按比例纯化:在50ulPCR产物中加入90ul磁珠。
(5)文库质检
使用Agilent 2100生物分析仪进行文库质检,通过QubitTM 3.0 Fluorometer检测文库浓度。
DNA测序
(1)文库预处理
1)准备变性试剂:取200ul 1N文库变性液浓储,加800ul 无酶水配置成0.2N文库变性液,涡旋混匀,短暂离心,室温放置备用。
2)文库变性:取5ul文库(4nM)至低吸附管管底,再加入5ul0.2N文库变性液,吹打混匀。
3)文库稀释:变性后的10ul文库中加入990ul冰上预冷的稀释缓冲液,混匀后快速离心,置于冰上备用。
(2)上样
1)用1ml枪头刺穿样品孔的封箔,将600ul已制备文库注入样品孔中。避免接触封箔。
2)样品加载后检查孔中是否有气泡,如果有气泡在工作台轻轻敲打试剂盒。
3)使用MiSeq测序仪对加载好样品的测序试剂盒进行2×250bp双端测序(PE),使用MiSeq Control Software读取序列信息。
生物信息学分析 原始测序数据处理与优化 为避免高通量测序中出现一些测序错误(如点突变等)、序列末端的质量低等问题,使生物信息分析结果更高质量、更准确,需优化处理测序原始数据。优化步骤:(1)根据两条序列比的结果,进行末端重叠区的拼接,拼接时需去除拼接含有N的序列且保证至少有20bp的重叠区;(2)去除长度小于200bp的序列,去除引物、接头序列及两端质量值低于20的碱基;(3)将上述拼接过滤后的序列在数据库中进行比对,去除其中的嵌合体序列,得到最终有效数据。对测序数据预处理后,有效序列长度集中在450-500bp(如图1所示)。 可操作分类单元(operational taxonomy units,OTU)是在系统发生学或群体遗传学研究中,为利于分析,给某一个分类单元(品系、种、属、分组等)人为设置的同一标志。在生物信息分析中,测序得到的每一条序列来自一个菌。对序列进行归类操作后可了解样品测序结果中的菌种、菌属等信息。通过归类操作,将序列按照相似性分归为许多小组,一个小组就是一个OTU。根据指定的相似度,对所有序列进行OTU划分及进行生物信息统计分析。在本实施例按97%相似性对优化序列中的非重复序列进行OTU聚类,聚类过程中为得到OTU代表序列,需去除嵌合体;选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU表格,做基于OTU的热图分析。按不同样本采集时间对两组早产儿粪便样本的 OTU 进行聚类分析,可直观展现两组早产儿不同日龄的OTU丰度信息,并对OTU相似性进行聚类,展示各样本间的差异性。在生后第4天,BPD组与非BPD组已有同组样本聚类趋势(详见图2);第7天时,大部分BPD组样本聚类到左侧,大部分非BPD样本聚类到右侧,表明两组样本区分较为明显,且左侧BPD组样本丰度较右侧非BPD组偏低(详见图3);图2与图3中,行名是OTU编号,列名是样本组别,图左侧为OTU聚类树,上方为样本聚类树,中间热图每一个方格颜色对应的值为每一行OTU相对丰度经过归一化处理(log10)后的值,蓝色到红色的渐变色反映丰度由低到高的变化,越趋近于蓝色,丰度越低,越趋近于红色,丰度越高。根据常规技术:(1)物种注释:每个OTU选择一条代表性序列,为得到OTU对应的物种分类信息,了解每个样本的群落组成,使用GreenGene对代表性序列进行物种分类注释。注释完成之后可在不同分类水平(门、纲、科、属、种)下进行物种相对丰度统计和差异分析。 (2)物种聚类:样本与样本间序列的差异关系,用样品间聚类关系树表示,同一分支内的样品序列进化关系相近。样品与样品中的OTU在丰度上的相似程度用物种OTU丰度相似性树表示,丰度相近的会分配到同一分支上。 两组早产儿肠道菌群组成在门水平上均以变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)为主,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria),两组间差异明显;在纲水平上,两组以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)所占比例最高,其次是芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、 拟杆菌纲(Bacteroidia)、放线菌纲(Actinobacteria);在科水平上,两组均以肠杆菌科(Enterobacteriaceae) 最为丰富,其次为肠球菌科(Enterococcaceae)、普雷沃菌科(Prevotellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae);在属水平上,BPD组相对丰度前五位为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、普雷氏菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides),非BPD组前五位为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)。图4、图5、图6分别是克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)在两组间的相对丰度差异,可看出具有显著差异,符合统计学差异显著性;图7、图8、图9分别为肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)在两组间的相对丰度差异,可看出不具差异或者差异无规律。可以看出,克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)的结合作为早产儿支气管肺发育不良症微生物标志物的准确性以及特异性良好。 Alpha多样性(Alpha diversity)是指一个特定区域或生态系统内的多样性,可反映丰富度和均匀度综合指标。Alpha多样性主要与两个因素有关:1. 多样性,群落中个体分配上的均匀性;2. 种类数目,即丰富度。群落多样性(Community diversity)指数,包括Shannon指数和Simpson指数。群落丰富度(Community richness)指数主要包括Chao指数和Observed species指数,Chao和Observed species越大,说明群落中含有的OTU数目越多,群落的丰富度越大。 (1)Shannon指数:用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与Simpson多样性指数均为常用的alpha 多样性的指数。Shannon值越大,群落多样性越高。
(2)Simpson指数: 是生态学中常用的一个指数,它反映的是优势种在群落中的地位和作用,在 QIIME 中Simpson指数越大,说明群落多样性越高。
(3)Chao1指数:用于估计样品中所含OTU数目,数值越大代表物种越多,它对稀有的物种很敏感。
(4)Observed species指数:表示单个样本中含有的物种数目。
BPD组chao1指数、observed species指数在生后第4~28天始终高于非BPD组,且在生后第4、7天时,与非BPD组相比,BPD组chao1指数、observed species指数明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),提示BPD组在生后第4、7天时的物种丰富度明显高于非BPD组,详见图10,A、B分别代表BPD组与非BPD组chao1指数、observed species指数箱型图,纵坐标分别代表chao1指数、observed species指数,箱子上下两端分别为第75百分位数、第25百分位数,箱子中间的横线为中位数,上下触须的末端分别为第95百分位数和第5百分位数,圆点为第95百分位数和第5百分位数以外的数值。***为P<0.05。
Beta多样性(Beta diversity)是生物多样性的重要组成部分,主要用来研究不同样品或处理组之间的物种群落结构差异。Beta多样性是比较不同样品(生态系统)之间的多样性差异。常用于展示beta多样性的分析方法有:(1)主成分分析(Principal componentanalysis,PCA):可以观察个体或群体间的差异。(2)主坐标分析(principal co-ordinatesanalysis,PCoA):根据不同的距离算法计算样品之间的距离,随后对距离矩阵进行处理,使图中点间的距离正好等于原来的差异数据,实现定性数据的定量转换。在第4、7天时,BPD组shannon指数、simpson指数显著高于非BPD组(P<0.05),提示BPD组粪便样本菌群多样性在第4、7天时明显增高,详见图11,A、B分别代表BPD组与非BPD组shannon指数、simpson指数箱型图,纵坐标分别为shannon指数、simpson指数,箱子上下两端分别为第75百分位数、第25百分位数,箱子中间的横线为中位数,上下触须的末端分别为第95百分位数和第5百分位数,圆点为第95百分位数和第5百分位数以外的数值。***、****为P<0.05。
BPD组与非BPD组间PCA和PCoA均显示,在日龄第4、7天时,两组之间菌群差异突出,同组内部聚集在一起,提示生后4、7天BPD组与非BPD组之间菌群差异显著,详见图12、图13,不同颜色对应各图图例的分组名称,样品距离越近,说明样品之间的微生物组成结构越相似,差异性越小。
组间菌群结构差异显著性分析
根据样品丰度表,进行样本或样本组间的物种差异分析。在不同时间的点(生后第1、4、7、14、21、28天)的不同分类水平下(门、纲、科、属、种)分别进行差异分析;本发明利用Qiime分析软件中MetagenomeSeq方法分析两组样本之间具有显著差异的微生物物种,Pvalue<0.05作为差异显著性筛选阈值。
根据样品丰度表,进行样本或样本组间的物种差异分析。在不同时间的点(生后第1、4、7、14、21、28天)的不同分类水平下(门、纲、科、属、种)分别进行影响不同分组的重要菌属差异分析。本发明利用Qiime分析软件中MetagenomeSeq方法分析筛选两组样本之间具有显著差异的微生物物种,P value<0.05作为差异显著性筛选阈值。使用SPSS 25.0软件进行数据分析。以率(%)表示计数资料,两组间使用卡方检验或Fisher精确概率法进行比较。符合正态分布的计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示,经方差齐性检验后,用t检验对两组进行比较;非正态分布的用中位数(P25,P75)表示,用Mann-Whitney U检验对两组进行比较。将两组间单因素比较有统计学差异的变量进行多因素Logistic回归分析,得到生后发生BPD的独立危险因素。P<0.05认为差异具有统计学意义(双侧检验)。
两组间总样本在门的分类水平上,BPD组变形菌门明显减少(P=0.000),厚壁菌门(P=0.000)、放线菌门(P=0.000)、拟杆菌门(P=0.000)显著增多。在纲的分类水平上,BPD组与非BPD组总样本相比较,BPD组γ-变形菌纲(P=0.000)明显减少,放线菌纲(P=0.000)、芽孢杆菌纲(P=0.004)、拟杆菌纲(P=0.000)明显增多,差异有统计学意义。在科水平上,与非BPD组相比,BPD组肠杆菌科(P=0.000)显著减少,而普雷沃氏菌科(P=0.000)、葡萄球菌科(P=0.001)、韦荣氏球菌科(P=0.000)、棒杆菌科(P=0.000)显著增多。在属水平上,BPD组克雷伯菌属(P=0.000)、肠杆菌属(P=0.000)、双歧杆菌属(P=0.000)、乳杆菌属(P=0.001)水平均明显低于非BPD组,而葡萄球菌属(P=0.001)、棒杆菌属(P=0.005)水平高于非BPD组,差异有统计学意义。在生后第4天,在门水平,BPD组变形菌门(P=0.028)显著减少,厚壁菌门(P=0.008)、拟杆菌门(P=0.003)、放线菌门(P=0.002)显著增多。在纲水平上,与非BPD组相比,BPD组红蝽菌纲(Coriobacteriia)(P=0.000)、梭菌纲(P=0.002)显著增多,γ-变形菌纲(P=0.028)显著减少;在科的水平上,肠杆菌科(P=0.034)显著减少,普雷沃氏菌科(P=0.001)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(P=0.000)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)(P=0.000)显著增多;在属的水平上,BPD组中普氏菌属(P=0.002)、粪杆菌属(Faecalibacterium)(P=0.000)明显增多,差异有统计学意义。在生后第7天,与非BPD组相比,在门水平上,BPD组变形菌门明显减少(P=0.000),厚壁菌门(P=0.000)、拟杆菌门(P=0.000)、放线菌门(P=0.000)明显增多,差异具有统计学意义;在纲水平上,γ-变形菌纲显著减少(P=0.001),芽孢杆菌纲(P=0.002)、拟杆菌纲(P=0.000)、梭菌纲(P=0.006)显著增多;在科水平,肠杆菌科(P=0.001)显著减少;在属的水平上,拟杆菌属(P=0.000)显著增多,克雷伯菌属(P=0.006)、肠杆菌属(P=0.004)明显减少,差异有统计学意义。
本发明考虑到早产儿肠道菌群菌种少、多样性低,传统培养法不能满足检测需要,故采用基于细菌16SrDNA V3-V4区的二代高通量测序技术。目前BPD尚无特效治疗手段,主要以综合对症为主,因此,预防BPD至关重要。BPD高危因素主要包括胎龄、出生体重、机械通气时长、用氧时长、母亲阴道炎、母亲妊娠期高血压、NRDS、败血症、窒息等。本发明中两组早产儿均于生后24小时内入住NICU,且均为配方奶喂养,具有较为一致的生活环境及护理方式,两组早产儿在基本情况、生产方式、开奶时间、母亲产前感染、母亲产前抗生素使用等方面无统计学差异。抗生素是NICU最常用的药物之一,有研究表明,使用抗生素会破坏肠道菌群的稳态,导致菌群多样性下降,条件致病菌增多。在本实验中,两组早产儿均使用抗生素,且两组间首次抗生素暴露无统计学差异,故两组早产儿具有可比性。目前已有研究表明,呼吸暂停、输血次数、持续正压通气时长是发生BPD的危险因素。本发明中,频发呼吸暂停、输血≥3次及无创通气天数是早产儿生后发生BPD的高危因素,与上述结果一致。
在本发明中,在第4、7天时,BPD组菌群多样性显著增高,提示早产儿在BPD发生前肠道菌群多样性已发生改变,但目前尚无类似研究报道。目前研究发现不同地域和种族的个体,肠道菌群呈现不同的多样性,但在门水平上主要分为四种菌群,分别是厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门。本发明结果显示,两组早产儿肠道菌群组成在门水平上均以变形菌门、厚壁菌门为主,其次是放线菌门和拟杆菌门,与目前的研究结果一致。本发明动态观察了从生后第1天至28天在门水平上肠道菌群相对丰度的变化,发现两组在构成比例上存在明显差异,且两组在同一日龄时各菌门的变化也不同。
实施例二 利用本发明肠道微生物辅助诊断早产儿支气管肺发育不良的系统,包括测序模块,对分离的肠道菌群核酸样本(粪便DNA)进行测序,以获得测序结果;丰度计算模块,根据测序结果,对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测,得到相对丰度值;比较模块,将得到的微生物标志物相对丰度值与设定值进行比较。设定值为正常组(非BPD组)得到的微生物标志物相对丰度值。
本发明应用方法简单,无需复杂的数据计算。采集6例出生7日、2例出生4日临床确诊为BPD且无其他肺部疾病的早产儿粪便样本(非实施例一),分别采用实施例一一样的DNA提取、扩增、测序、OTU物种注释及聚类方法,得到克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)的相对丰度,与实施例一的非BPD组相比,两组间差异明显,且所有临床对比的差异与实施例一BPD组近似(倍数误差10%以内)。采集6例出生7日临床确诊为无BPD但有其他肺部疾病(新生儿肺炎、肺动脉高压、NRDS各2例)的早产儿粪便样本,分别采用实施例一一样的DNA提取、扩增、测序、OTU物种注释及聚类方法,得到克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)的相对丰度,与实施例一的非BPD组相比,所有样本结果差异小,无显著性。
从而,根据克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)与早产儿BPD的相关性,可以通过检测样本中克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)的丰度来辅助诊断早产儿BPD,据此本发明公开了一种基于检测克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)丰度的辅助诊断早产儿BPD的试剂盒。试剂盒组分如下:检测克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)16SrRNA的引物对以及其他常规试剂,比如DNA提取试剂、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、Taq-聚合酶等。
综上所述,本文围绕早产儿肠道菌群,探讨了胎龄≤32周早产儿发生BPD的肠道菌群变化和早产儿生命早期肠道菌群的定殖,研究结果表明,BPD与非BPD,早产儿肠道菌群多样性及肠道菌群组成已发生显著变化。目前尚无关于肠道菌群在BPD发生、发展中的作用机制的研究报道,本发明菌群与BPD发生、发展的关系结论与临床吻合,利于早期识别发生BPD的高危儿,早期干预,降低BPD尤其是中/重度BPD的发生率,提高早产儿的生存质量。
Claims (10)
1.肠道微生物作为早产儿支气管肺发育不良症标志物的应用,其特征在于,所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
2.肠道微生物在制备早产儿支气管肺发育不良症标志物中的应用,其特征在于,所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
3.根据权利要求1或者2所述的应用,其特征在于,早产儿支气管肺发育不良症为早产儿早期支气管肺发育不良症。
4.根据权利要求1或者2所述的应用,其特征在于,所述肠道微生物由克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)组成。
5.检测肠道微生物丰度的试剂在制备早产儿支气管肺发育不良症标志物中的应用;所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,检测肠道微生物丰度的试剂包括检测肠道微生物的引物或者探针。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,检测肠道微生物的引物为检测克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)16SrRNA的引物。
8.利用权利要求1所述肠道微生物辅助诊断早产儿支气管肺发育不良的系统,其特征在于,包括测序模块,对分离的肠道菌群核酸样本进行测序,以获得测序结果;丰度计算模块,根据测序结果,对肠道菌群中的所述肠道微生物的相对丰度进行检测,得到相对丰度值;比较模块,将得到的肠道微生物相对丰度值与设定值进行比较。
9.根据权利要求8所述的系统,其特征在于,设定值为正常组得到的肠道微生物相对丰度值。
10.早产儿支气管肺发育不良症辅助诊断试剂盒,其特征在于,包括检测肠道微生物的引物或者探针;所述肠道微生物为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普雷沃菌属(Prevotella)、链球菌属(Streptococcus)中的一种或几种。
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