CN114813979B - 一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法 - Google Patents
一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种生物传感芯片结合感官评价在翘韵食品酒活性成分辨识中的应用，其特征在于，方法的具体步骤如下：(1)采用生物传感芯片技术，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片；(2)基于此生物传感芯片，开展翘韵食品酒中的主要活性成分连翘酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用检测；(3)采用电子舌结合高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分进行感官评价和定量检测分析；(4)结合两者结果，建立翘韵食品酒活性成分辨识集成方法。此翘韵食品酒具有较好的清热解毒及抗炎等功效。本发明为翘韵食品酒中连翘酯苷A和连翘苷等多种活性成分的辨识提供了重要方法指导，也为其他产品的活性成分品质评价提供参考。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，涉及一种翘韵食品酒活性成分辨识的方法，具体涉及一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法。
背景技术
连翘叶提取物含有较高的苯乙醇苷类(连翘酯苷A)和木脂素类(连翘苷)等有效成分，且现代药理研究表明，连翘叶提取物有较好的抗炎、抗氧化、抗衰老、降脂保肝等保健作用。翘韵食品酒是连翘叶提取物与调味剂和汾酒共同制备而成，色泽清透，口感独特，还含有较高的连翘酯苷A和连翘苷等多种活性成分，不仅具有清热解毒等功效，而且还具有抗氧化、抗衰老等保健作用。
随着大众健康意识的不断加强，对于食品中具有特殊功效的活性成分及其含量的关注日益升高。但由于酒中活性成分较为复杂难辨，难以完全控制辨识，通过生物传感芯片对翘韵食品酒中的潜在质量标志物进行确证，提高了对酒质量检测的准确性和高效性。因此，采用生物传感芯片技术对翘韵食品酒中活性成分进行检测分析，具有十分重要的意义和实际应用价值。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
获得翘韵食品酒的样品；以及
采用生物传感芯片技术，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片；
基于此生物传感芯片，开展翘韵食品酒中的主要活性成分连翘酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用检测；
采用电子舌结合高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分进行感官评价和定量检测分析；
结合两者结果，建立翘韵食品酒活性成分辨识集成方法。
根据本发明一些具体实施方案，其中，
(1)翘韵食品酒的原料质量份数组成为：连翘叶提取物1-10份、调味剂2.5-10份和汾酒1000份；
优选地，翘韵食品酒的原料质量份数组成为：连翘叶提取物4份、冰糖2.5份和42％vol传统汾酒1000份；
该翘韵食品酒不仅风味独特，而且含有较高的连翘酯苷A、连翘苷以及黄酮类等活性成分，具有较好的清热解毒、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用。
(2)采用生物传感芯片技术，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片；
优选地，构建IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器；
(3)基于此生物传感芯片，开展翘韵食品酒中的主要活性成分连翘酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用检测；
分别精密称取翘韵酯苷A标准品加入10mM PBS溶液配置成1mM翘韵酯苷A标准品溶液作为母液，按十倍梯度稀释母液至0.1pM，制备6-11个浓度梯度翘韵酯苷A标准品梯度浓度样品溶液；
按化合物浓度由低到高的顺序依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入翘韵酯苷A标准品溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS。
(4)采用电子舌结合高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分进行感官评价和定量检测分析；
将电子舌传感器活化、校正后进行测样，将过滤后的翘韵食品酒按照浓度梯度由低到高进行检测，每个样品重复3-9次；
取后10s-40s的数据结果进行处理，对翘韵食品酒的品质进行分析评价。
以超纯水和甲醇为流动相，以翘韵食品酒中活性成分为标准品，以翘韵食品酒为供试品，通过梯度洗脱，采用高效液相色谱技术，对其活性成分进行含量测定。
(5)结合两者结果，建立翘韵食品酒活性成分辨识集成方法。
综上所述，本发明提供了一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法。本发明的方法具有如下优点：
与传统的检测分析方法相比，本发明方法采用生物传感芯片，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片，可实现对翘韵食品酒中发挥抗炎功效的活性成分准确、高效地辨识。相较于单一的分析辨识方法，本发明提供一种翘韵食品酒活性成分辨识集成方法，为更全面、有效地辨识提供了重要方法指导，也为其他产品的活性成分品质评价提供参考。
附图说明
图1：不同浓度连翘酯苷A与IL-1β结合的IDS-VDS信号变化
图2：不同浓度连翘酯苷A与IL-1β结合的线性拟合结果
图3：不同浓度的翘韵食品酒电子舌检测结果
图4：冰糖矫味的翘韵食品酒电子舌检测结果
图5：连翘酯苷A和连翘苷标准溶液的液相色谱图
图6：翘韵食品酒的液相色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的：
实施例1：基于人工感官评价的翘韵食品酒的制备工艺
步骤1：考察不同连翘叶提取物对酒口感和澄明度的影响
分别按1：1000的料液比取的青色连翘叶提取物和连翘叶提取物，加入适量的汾酒(传统)，摇匀密封，静置,品尝口感、观察色泽和有无沉淀或悬浮物出现。
表1考察不同连翘叶提取物对翘韵食品酒的影响
比较了不同连翘叶提取物在基酒中的澄明度和配制后的色、香、味、格，结果连翘叶提取物比青色连翘叶提取物的澄明度更好，色泽更饱满，感官评价较优。
因此，优选连翘叶提取物作为添加物。
步骤2：考察不同汾酒来源对于酒口感和澄明度的影响
按1：1000的料液比取的连翘叶提取物，分别加入适量的42％vol传统汾酒和42％vol生态汾酒中，摇匀密封，静置,品尝口感、观察色泽和有无沉淀或悬浮物出现。
表2不同汾酒对于翘韵食品酒的口感和澄明度的影响
比较了加入等比例连翘叶提取物的不同基酒，发现相同酒精浓度的基酒，生态汾酒比传统汾酒更辣，因次，优选传统汾酒作为基酒。
步骤3：考察料液比对于酒口感和澄明度的影响
基于以上实验结果，优选连翘叶提取物和传统汾酒进行翘韵食品酒的配制。按照优选的连翘叶提取物浓度范围，将连翘叶提取物与传统汾酒分别以1：1000、2：1000、4：1000、6：1000、8：1000、10：1000的重量比配制成酒，混合均匀，避光静置，待稳定后过滤，对其进行感官评价。
表3不同料液比对翘韵食品酒口感和澄明度的影响
实验考察了提取物浓度分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％的酒，发现浓度低时，酒的苦味太重，药味无法盖住酒味，0.1％、0.2％浓度的酒均存在此情况；随浓度升高，药味逐渐盖住酒味，0.4％时，药味与酒味达到一个最佳态，而0.6％、0.8％、1％的酒药味重于酒味，随浓度升高，酒味更苦。因此，优选连翘叶提取物与传统基酒的比例为4：1000。
通过考察对翘韵食品酒制备工艺进行优化，优选连翘叶提取物作为添加物，传统汾酒作为基酒，按照提取物：基酒为4：1000的质量比进行勾兑。
步骤4：基于人工评价的翘韵食品酒的矫味工艺优化
考虑到加入了连翘叶提取物，所得酒在口感上相较于基酒变苦。因此，按以上制备实验所得最优工艺所得的翘韵食品酒，分别考察不同浓度的冰糖、木糖醇对翘韵食品酒口感的影响，按照酒的色泽、香气、口味、风格等为指标进行人工评定，找出较优的矫味剂种类和浓度。
设计方案如下表：
表4以连翘叶提取物浓度0.4％的翘韵食品酒分别加入不同浓度的冰糖
表5以连翘叶提取物浓度0.4％的翘韵食品酒分别加入不同浓度的木糖醇
通过单因素考察方法对翘韵食品酒矫味工艺进行优化，优选连翘叶提取物：传统汾酒为4：1000的质量比进行勾兑，优选冰糖浓度为2.5mg/mL或木糖醇浓度为10mg/mL。
上述提供的该翘韵食品酒是通过选用连翘叶直接超声提取的方式得到的连翘叶提取物，关于连翘叶提取物的获取并不仅限于上述超声提取的方式，凡是能够得到连翘叶提取物的方式均属于本发明的保护范围。
翘韵食品酒在配料过程中，调味剂可采用木糖醇，木糖醇在调节翘韵食品酒的口味的同时，还能补充热量，改善糖代谢，木糖醇在人体内代谢并不依赖胰岛素的参与，直接透过细胞膜参与糖代谢而不增加血糖浓度，因此，木糖醇作为调味剂，适合糖尿病患者的饮用要求。
实施例2：基于生物传感芯片对翘韵食品酒中的主要活性成分与抗炎关键蛋白的相互作用检测
步骤1：构建IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器
将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入羧基活化剂，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子抗体，反应完成，即得IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件生物传感器。
步骤2：翘韵食品酒中的主要活性成分与抗炎关键蛋白的相互作用检测
以制备好的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入翘韵酯苷A标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS，不同浓度下的IDS-VDS信号如图1所示；由图1可知，当浓度范围为0.1pM-1.0μM时，IDS信号的绝对值成规律性下降；
以翘韵酯苷A标准溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pM-10nM时，线性关系较好；取1.0pM-10nM四个浓度点进行线性拟合，结果如图2所示，由图2可知，线性关系良好，方程为y＝0.01420x+0.1272，(R2＝0.9813)；
根据上述的浓度范围，以翘韵酯苷A标准溶液的浓度([Ag])为横坐标，以浓度([Ag])/电流变化(I-I0,ΔI)为纵坐标，进行线性拟合，得到线性方程为y＝-31456x+2E-06，(R2＝0.9997)；根据公式
其中[Ab]为IL-1β浓度，[Ag]为翘韵酯苷A的浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值。
计算翘韵酯苷A与IL-1β相互作用的解离常数KD，得KD＝6.358×10-11M。
采用生物传感芯片，对翘韵食品酒中主要活性成分翘韵酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用进行检测，可实现对翘韵食品酒的活性成分品质评价。
实施例3：基于电子舌技术对翘韵食品酒的品质进行感官评价
步骤1：对不同浓度提取物的翘韵食品酒进行电子舌检测
对42％vol传统汾酒与提取物浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％翘韵食品酒进行电子舌检测。将待测样品经过0.45μm滤膜过滤后，置于电子舌专用烧杯中待测。将电子舌传感器活化、校正后进行测样。实验重复3次，每次取后20s的检测结果，将得到的数据进行归一化处理。
表6基酒与提取物浓度为0.2％、0.4％、0.6％翘韵食品酒电子舌检测原始数据
对数据进行了标准化处理后见图3，可以发现随着提取物浓度的增加，7个传感器上的信号相应均有所增加。其中0.4％酒的数据较为适宜，该浓度酒在苦味上处于适宜可调的范围，且浓度在0.4％后其甜味的响应不在上升，相较于0.2％酒的咸味和鲜味比较高，可以中和药的苦味，也不会像0.6％酒的在酸味上增加的十分明显。且在人工口尝评价中，连翘叶提取物0.4％也是口感最优的浓度。
步骤2：对加不同浓度冰糖的翘韵食品酒进行电子舌检测
对分别加入0、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL冰糖矫味后0.4％的翘韵食品酒进行电子舌检测。将待测样品经过0.45μm滤膜过滤后，置于电子舌专用烧杯中待测。将电子舌传感器活化、校正后进行测样。实验重复3次，每次取后20s的结果，将得到的数据进行归一化处理。
表7 0.4％翘韵食品酒加0、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL冰糖矫味的电子舌检测原始数据
对数据进行了标准化处理后见图4，结果显示对于固定提取物浓度的酒在苦味无明显差异；在甜味上，加糖的酒要比不加糖的酒信号响应值更高，但加不同浓度的冰糖没有显著差异；其中口尝最佳为加2.5mg/mL的冰糖的酒，在咸味和鲜味上响应值较高，鲜味和咸味可在一定程度上调和酒的苦味，使其口感更佳，且在酸味上的响应值没有加5mg/mL冰糖的酒更高，为最优条件。
实施例4：基于高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分定量检测分析
以超纯水和甲醇为流动相，以翘韵食品酒所含有效成分为标准品，以所制翘韵食品酒为供试品，通过梯度洗脱，对其有效成分进行含量测定，具体步骤如下：
步骤1：设置检测条件，如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相：A为超纯水，B为甲醇；
| 阶段 | VA相：VB相 | 洗脱时间min |
| 0 | 10：90～38：62 | 0 |
| 1 | 10：90～38：62 | 0-5 |
| 2 | 38：62～40：60 | 5-60 |
柱温：室温35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：235nm；
步骤2：制备供试品溶液：取翘韵食品酒适量，经滤膜过滤后即得待测样品溶液；
步骤3：制备标准品溶液：取连翘苷和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加42％乙醇制成每1mL含连翘苷0.721mg的溶液，即得；
步骤4：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，如图5和图6；
步骤5：根据连翘苷的标准曲线以及相同波长下检测待测样品溶液的峰面积值，得到翘韵食品酒中连翘苷的含量为0.071 6mg/mL。
表8连翘苷的标准曲线
本发明制备的翘韵食品酒含有较高的连翘苷和连翘酯苷A等活性成分。采用生物传感芯片技术，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片；并基于此生物传感芯片，开展翘韵食品酒中的主要活性成分连翘酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用检测；进一步采用电子舌结合高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分进行感官评价和定量检测分析；结合两者结果，建立翘韵食品酒活性成分辨识集成方法。该方法全面、有效、准确地对翘韵食品酒中连翘酯苷A和连翘苷等多种活性成分的辨识提供了重要方法指导，也为其他产品的活性成分品质评价提供参考。
最后说明，本领域技术人员将会理解，以上描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，也均落在本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种生物传感芯片结合感官评价的翘韵食品酒活性成分辨识方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1：采用生物传感芯片技术，结合电化学工作站，构建抗炎靶点修饰的生物传感芯片，所述生物传感芯片为AlGaAs/GaAs HEMT半导体芯片；步骤2：基于此生物传感芯片，开展翘韵食品酒中的主要活性成分连翘酯苷A与抗炎关键蛋白的相互作用检测，具体步骤如下：步骤(1)：构建IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入羧基活化剂，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子，反应完成，即得IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件生物传感器；步骤(2)：分别精密称取连翘酯苷A标准品加入10mM PBS溶液配制成1mM连翘酯苷A标准品溶液作为母液，按十倍梯度稀释母液至0.1pM，制备6-11个浓度梯度连翘酯苷A标准品梯度浓度样品溶液；步骤(3)：按化合物浓度由低到高的顺序依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入连翘酯苷A标准品溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS-VDS；步骤3：采用电子舌结合高效液相色谱技术对翘韵食品酒活性成分进行感官评价和定量检测分析；步骤4：结合两者结果，建立翘韵食品酒活性成分辨识集成方法。
2.根据权利要求1所述的辨识方法，其特征在于，步骤2中的翘韵食品酒的原料质量份数组成为：连翘叶提取物1-10份、调味剂2.5-10份和汾酒1000份。
3.根据权利要求2所述的辨识方法，其特征在于，步骤2中所述翘韵食品酒的原料质量份数组成为：连翘叶提取物4份、冰糖2.5份和42％vol传统汾酒1000份。
4.根据权利要求1所述的辨识方法，其特征在于，步骤3中的电子舌技术的检测步骤如下：步骤(1)：将待测翘韵食品酒经滤膜过滤后，置于电子舌专用烧杯中待测；步骤(2)：将电子舌传感器活化、校正后进行测样，将处理好的翘韵食品酒按照浓度由低到高进行检测，每个样品重复3-9次；步骤(3)：取后10s-40s的数据结果进行处理，对翘韵食品酒的品质进行分析评价。
5.根据权利要求1所述的辨识方法，其特征在于，步骤3中的高效液相色谱法以超纯水和甲醇为流动相，以翘韵食品酒中活性成分为标准品，以翘韵食品酒为供试品，通过梯度洗脱，对其活性成分进行含量测定，具体步骤如下：步骤(1)：设置检测条件；步骤(2)：制备翘韵食品酒的供试品溶液；步骤(3)：制备连翘苷和连翘酯苷A的标准品溶液；步骤(4)：根据实验条件分别对对照品溶液与供试品溶液进行测定；步骤(5)：根据标准曲线以及峰面积值，对翘韵食品酒中连翘苷进行定量分析。
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