CN114807443A - 与慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了与慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记及其应用，具体公开了一种与乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的序列如SEQIDNO.3所示，SNP位点位于第68位，多态性为C/T。本发明提供的SNP分子标记可应用于预测乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效，能够根据基因分型结果对乙型肝炎患者对抗病毒治疗应答疗效进行评估，从而有利于乙型肝炎患者治疗方法的选择及精准治疗。

Description

与慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记及 其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及与慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染作为一种全球性公共卫生威胁，且HBV感染患者发展为慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)、肝失代偿、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的风险较高(Polaris ObservatoryCollaborators.Lancet Gastroenterol Hepatol.2018；3:383～403.)。目前，HBV感染被认为是肝癌发生的主要危险因素，约54％肝癌患者的主要病因是HBV感染(Tanaka M,JEpidemiol.2011；21:401～416.)。目前抗HBV的临床一线用药包括核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide analogues，NAs)和干扰素(Interferon，IFN)。对于接受NAs治疗的患者，必须关注许多问题，例如停药后的复发、大多数患者需要终身治疗、与药物费用相关的经济负担以及潜在的耐药性等(Terrault NA,Hepatology.2018；67:1560～1599.)。干扰素α(IFN-alpha，IFN-α)具有广泛的抗菌活性，同时也是抗病毒感染最重要的一种细胞因子，目前用于治疗成人慢性乙型肝炎的干扰素是聚乙二醇干扰素α(Pegylated interferon-alpha，PegIFN-α)。尽管干扰素存在明显的不良反应，但其诸多优点也让它始终活跃在临床一线治疗方案中：如每周一次的给药方案提高了患者的依从性及耐受性，且具有调节免疫及抗病毒的双重功效，有望使患者获得长久应答，在预防慢乙肝患者进展为肝癌方面发挥重要作用等(Lin S-M,J Hepatol.2007；46:45～52.)。然而，目前聚乙二醇干扰素α治疗停药后只在一小部分患者(少于20％)中持续产生应答(Cornberg M,Hepatology.2019.)，且治疗价格相对昂贵，因此在用药之前通过检测一些新的标志物来预测干扰素α的疗效显得尤为重要。

单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism，SNP)，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。目前，SNP是研究人类常见疾病遗传变异的重要依据。研究发现STAT4 rs7574865(Chen H,Clin Gastroenterol Hepatol.2020；18:196～204.e8.)和CFB rs12614(Chen H,Aliment Pharmacol Ther.2020；51:469～478.)与HBeAg阳性聚乙二醇干扰素α治疗的慢性乙型肝炎患者的治疗反应相关，可作为预测聚乙二醇干扰素α疗效的重要依据。

申请人南方医科大学于2019年11月21日提出发明申请专利，公开了一个与聚乙二醇干扰素治疗应答相关的SNP及其应用，该发明提供了检测CFB rs12614位点的方法以及特异性核酸引物，还涉及了SNP位点CFB rs12614的检测试剂盒及其应用。根据该发明对CFBrs12614位点进行基因分型，方法简便快速，结果准确明了，为慢性乙型肝炎患者聚乙二醇干扰素治疗应答的预测提供了一个新的途径。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种与乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记。

本发明第二方面的目的，在于提供用于扩增本发明第一方面的SNP分子标记的引物组。

本发明第三方面的目的，在于提供一种乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效预测试剂盒。

本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的SNP分子标记在构建慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效预测模型或系统中的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的SNP分子标记、本发明第二方面的引物组或本发明第三方面的试剂盒在制备预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的产品中的应用。

本发明第六方面的目的，在于提供一种预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种与乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的序列如SEQIDNO.3所示，SNP位点位于第68位，多态性为C/T。

优选地，所述乙型肝炎为慢性乙型肝炎。

优选地，所述乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效为干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效。

TRIM26作为一种E3连接酶，该分子具有N端的RING结构、B-box结构、卷曲螺旋和C端的SPRY结构，在先天免疫、病毒复制和肿瘤发生等方面发挥重要作用，该基因上rs116806878处的核苷酸C→T纯合突变会影响干扰素的抗病毒活性，使慢性乙型肝炎患者对干扰素应答疗效更差，换言之，具有TRIM26 rs116806878CC/CT基因型的慢性乙型肝炎患者对干扰素应答的效果优于TRIM26 rs116806878TT基因型的患者。

本发明的第二个方面，提供用于扩增本发明第一方面的SNP分子标记的引物组。

优选地，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

rs116806878.F：5’-ACTGATACAGAGATCATGGTGC-3’(SEQ ID NO:1)；

rs116806878.R：5’-GAAGGAGTCTGTATAAGCAAGGGA-3’(SEQ ID NO:2)。

本发明的第三个方面，提供一种乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效预测试剂盒，包括本发明第二方面的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括PCR中使用的缓冲液。

优选地，所述PCR中使用的缓冲液为PCR扩增所需要的任何试剂，比如聚合酶、dNTP、taq酶等等。

本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的SNP分子标记在构建慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效预测模型或系统中的应用。

优选地，所述慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效为干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效。

优选地，所述干扰素为聚乙二醇干扰素α。

本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的SNP分子标记、本发明第二方面的引物组或本发明第三方面的试剂盒在制备预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的产品中的应用。

优选地，所述慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效为干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效。

优选地，所述干扰素为聚乙二醇干扰素α。

本发明的第六个方面，提供一种预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的方法，检测待测样品基因组中本发明第一方面的SNP分子标记的基因型，根据基因型测序慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的好坏；

所述方法为非疾病诊断目的。

优选地，所述方法包括以下步骤：以待测样品DNA为模板，使用本发明第二方面的引物组或本发明第三方面的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行测序分析，确定待测样品中与所述的SNP分子标记的基因型。

优选地，所述待检测样品为慢性乙型肝炎患者的血液。

优选地，若所述待检测样品基因组中的SNP分子标记的基因型为CC或CT，则该慢性乙型肝炎患者对干扰素抗病毒治疗应答的疗效好；若所述待检测样品基因组中的SNP分子标记的基因型为TT，则该慢性乙型肝炎患者对干扰素抗病毒治疗应答的疗效较差。

优选地，所述抗病毒治疗为干扰素治疗。

优选地，所述抗病毒治疗为聚乙二醇干扰素α治疗。

优选地，所述PCR扩增的反应程序为90～94℃ 10～15min；90～94℃ 30～35s，50～55℃ 30～35s，72～75℃ 30～35s，35个循环；70～72℃ 5～10min。

本发明的有益效果是：

本发明提供的SNP分子标记可应用于预测乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效，能够根据基因分型结果对乙型肝炎患者对抗病毒治疗应答疗效进行评估，从而有利于乙型肝炎患者治疗方法的选择及精准治疗。

本发明提供的引物组和试剂盒能够高效、特异性的检测出SNP分子标记，有利于进一步挖掘影响慢性乙型肝炎干扰素抗病毒治疗应答疗效的因素，通过在临床开展治疗前的TRIM26突变筛查工作，实现对干扰素α抗病毒治疗应答的疗效评估。

附图说明

图1为实施例4的PCR扩增产物电泳图。

图2为实施例4中1号病人rs116806878位点的检测结果图。

图3为实施例4中2号病人rs116806878位点的检测结果图。

图4为实施例4中3号病人rs116806878位点的检测结果图。

图5为实施例4中4号病人rs116806878位点的检测结果图。

图6为实施例4中5号病人rs116806878位点的检测结果图。

图7为实施例4中6号病人rs116806878位点的检测结果图。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

实施例1

本实施例提供一种与慢性乙型肝炎干扰素α抗病毒治疗应答疗效相关的SNP位点，该SNP位点为rs116806878，位于TRIM26基因，TRIM16基因部分序列如下所示：GGATTCAGGGGAATTGCAGACAATGTTAGTTGTATAGAACCATTTGTTTTTGAGAGTCTGCCATAACNAGATAAATGAAACACAGTACCACTTCTATGACCAATCCCTTCCCTTGCTTATACAGACTCCTTC(SEQ ID NO:3)，其中，上述核苷酸序列中核苷酸N的碱基为C或T，因此，rs116806878的等位基因为C/T。

申请人通过在千人基因组计划数据库中，分析筛选了慢性乙型肝炎患者的TRIM26基因区域与干扰素α治疗应答相关的SNP位点，TRIM26区域(chr.6:30150K～30190K)中的所有等位基因频率>0.05的SNP位点(n＝120)。使用Haploview基于120个单核苷酸多态位点计算了10个基因区块(https://www.broadinstitute.org/haploview/haploview)。从每个基因区块中选择一个标签单核苷酸多态(Tag-SNP)，最后在TRIM26区域中总共选择了10个Tag-SNP位点。然后根据复旦大学复旦VARI遗传流行病学中心的方法，使用SequenomMassArray平台(Sequenom)对10个标签单核苷酸多态位点进行基因分型。然后在两个PegIFN-α队列中(共945例患者)分析了各Tag-SNP位点与HBeAg血清转化、HBV DNA水平和联合应答率的相关性，在这些单核苷酸多态性位点中，只有rs11680878与HBeAg血清转化、HBVDNA水平低于3.3log10 IU/mL以及72周时的联合应答率显著相关(P<0.05)，且其阳性预测值、敏感性及特异性均优于其他常规预测指标(表1)，表明TRIM26基因的rs116806878位点与慢性乙型肝炎干扰素α抗病毒治疗应答疗效相关，rs116806878处的核苷酸C→T纯合突变会影响干扰素α的抗病毒活性，使慢性乙型肝炎患者对干扰素α应答疗效更差，即具有TRIM26 rs116806878 CC/CT基因型的慢性乙型肝炎患者对干扰素α应答的效果优于TRIM26rs116806878 TT的患者。

表1 Tag-SNP位点与HBeAg血清转化、HBV DNA水平和联合应答率的相关性

实施例2

本实施例提供一种用于检测实施例1中SNP位点rs116806878的引物组，其核苷酸序列为：

rs116806878.F：5’-ACTGATACAGAGATCATGGTGC-3’(SEQ ID NO:1)；

rs116806878.R：5’-GAAGGAGTCTGTATAAGCAAGGGA-3’(SEQ ID NO:2)。

实施例3

本实施例提供一种慢性乙型肝炎干扰素抗病毒治疗应答疗效预测试剂盒，包括实施例2中所包含的引物组。

实施例4

本实施例提供一种预测慢性乙型肝炎干扰素抗病毒治疗应答疗效的方法，包括以下步骤：

(1)抽取受试者的全血，采用QIAamp Blood MiniKit250(购买自QIAGEN公司)试剂盒按说明书方法提取受试者的基因组DNA，使用Nano Drop分光光度计测定所提取DNA的浓度及纯度，确定符合提取标准，并于-80℃保存备用。

(2)根据Takara LA Taq PCR酶配制PCR反应体系，体系中加入受试者的基因组DNA和实施例2中的引物，PCR反应体系的具体配制如表2所示：

表2 PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		H<sub>2</sub>O	12.5
10×LA Bufferr	2
		dNTPs(2.5mM)	3
LA-Taq	0.2
		rs 116806878.F(10μM)	0.2
rs 116806878.R(10μM)	0.2
		DNA样本(50ng/μL)	2
总体积	20

其中，10×LA Buffer，dNTPs和LA-Taq从TAKARA公司购买，引物由华大基因公司合成。

(3)使用上述PCR反应体系，在ABI PCR仪(购置于ABI公司)上设置反应程序，进行PCR扩增，PCR反应程序如表3所示：

表3 PCR反应程序

(3)PCR产物检测：使用2％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，以检测是否为目的片段并确认其纯度。

PCR产物电泳结果显示条带单一，无杂带(图1)，无非特异扩增，且电泳条带位置(200bp)符合预期(根据引物推测扩增目的片段应为200bp左右)，为目的片段。

(4)PCR产物的纯化及测序：将上述所得PCR产物经切胶回收目的片段后，用ABI3730测序仪进行测序。

(5)利用MEGA-X软件对步骤(4)得到的序列与TRIM26正常基因组的标准序列(NCBIAccession number)进行比对，以确定所测序列中的TRIM26是否含有rs116806878C→T杂合或纯合突变。

通过对6名慢性乙型肝炎患者的DNA进行了分析，电泳结果图如图1所示，泳道Marker为DNA marker III(天根生化科技有限公司)，P1～P6分别为1号患者、2号患者、3号患者、4号患者、5号患者和6号患者，电泳结果显示6份样本目的条带的位置大约在200bp位置，符合200bp的预判，目标条带位置清晰单一，未见非特异性条带，且通过该方法扩增效率高，结果可靠。测序结果如图2～7所示，1号患者、2号患者、3号患者和4号患者的测序结果在框记处为rs116806878位点的碱基，其碱基均为T，发生了C→T纯合突变(参考序列中该位置的核苷酸应为C纯合子)；而5号患者和6号患者在rs116806878位点的测序峰图为双峰，即碱基为CT杂合子，发生了C→T杂合突变，上述此结果也符合突变后等位基因T在人群中所占比例较高的结果。根据此结果可以推断1号患者、1号患者、2号患者、3号患者、4号患者对干扰素治疗效果不佳，5号患者和6号患者对干扰素治疗效果较好。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 与慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actgatacag agatcatggt gc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggagtct gtataagcaa ggga 24

<210> 3

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggattcaggg gaattgcaga caatgttagt tgtatagaac catttgtttt tgagagtctg 60

ccataactag ataaatgaaa cacagtacca cttctatgac caatcccttc ccttgcttat 120

acagactcct tc 132

Claims (10)

1.一种与乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQIDNO.3所示，SNP位点位于第68位，多态性为C/T。

2.用于扩增权利要求1所述的SNP分子标记的引物组。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

rs116806878.F：5’-ACTGATACAGAGATCATGGTGC-3’(SEQ ID NO:1)；

rs116806878.R：5’-GAAGGAGTCTGTATAAGCAAGGGA-3’(SEQ ID NO:2)。

4.一种试剂盒，包括权利要求2或3所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR中使用的缓冲液。

6.权利要求1所述的SNP分子标记在构建慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效预测模型或系统中的应用。

7.(1)～(3)中任一项在制备预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的产品中的应用；

(1)权利要求1所述的SNP分子标记；

(2)权利要求2或3所述的引物组；

(3)权利要求4或5所述的试剂盒。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效为干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效。

9.一种预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的方法，检测待测样品基因组中权利要求1所述的SNP分子标记的基因型，根据基因型预测慢性乙型肝炎抗病毒治疗应答疗效的好坏；

所述方法为非疾病诊断目的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以待测样品DNA为模板，使用权利要求2或3所述的引物组或权利要求4或5所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行测序分析，确定待测样品中与所述的SNP分子标记的基因型。

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