CN114806964B - 一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用 - Google Patents

一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用，属于微生物防治技术领域，本发明的复合菌剂的菌种之间相互促进，具有协同增效的作用，可以有效防治植物叶点霉病、植物灰霉病、植物根腐病、植物枯萎病、植物叶斑病和植物炭疽病等多种植物病害，尤其对党参根腐病菌的抑菌率为76.89％。本发明的复合液体菌剂稳定性强、抑菌活性好，经试验证实，该复合液体菌剂储存100d时菌剂中的活菌数数量仍达到3.2×1011cfu/mL以上，对党参根腐病菌抑菌率达60.37％以上。

Description

一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用。
背景技术
植物病害指植物由于环境不适或受到病原菌侵染等无法正常生长发育并导致其产量和质量显著降低的病理现象。植物病害的形成是寄主植物与病原在外界条件下相互影响、相互作用的结果，因而植物、病原物和环境条件三者是构成植物病害的基本因素，其中真菌是最重要的一类病原物，具有细胞壁和真正的细胞核，几乎所有的高等植物都受到一或几种真菌侵染，甚至受到几十种真菌的危害。
长期以来，化学农药及化肥在植物病害防治、提高植物产量以及保障人类食物安全方面起到历史性作用，但由于化学农药及化肥在减轻植物病害的同时也会对人类健康、环境和生物多样性产生不利影响，而由于单一微生物及其制剂在生产中受外界环境影响较大，防治效果不够稳定，因此，开发与研制复合微生物源农药制剂已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用，该复合菌剂和/或复合液体菌剂稳定性强、抑菌活性高，能够有效地防治植物病害。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种防治植物病害的复合菌剂，所述复合菌剂包括链霉菌(Streptomyces dioscori)SF1和链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2；所述链霉菌SF1的保藏编号为CGMCC No.23417，所述链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418。
优选地，所述链霉菌SF1的有效活菌数为1×108cfu/mL～4×108cfu/mL，所述链霉菌SF2的有效活菌数为1×108cfu/mL～4×108cfu/mL。
本发明还提供了一种防治植物病害的复合液体菌剂，所述复合液体菌剂为上述复合菌剂发酵得到的发酵液。
优选地，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：
将链霉菌SF1和链霉菌SF2接种到液体培养基中，在25～30℃下复合发酵2～10天，即得复合液体菌剂。
优选地，所述链霉菌SF1与链霉菌SF2接种比例为1～5:1～2。
优选地，所述的接种方式为先将链霉菌SF1接种至液体培养基培养1～3天后，再将链霉菌SF2接种至液体培养基中进行复合发酵。
优选地，所述液体培养基初始pH为4～10。
本发明还提供了上述复合菌剂或复合液体菌剂在防治植物病害中的应用。
优选地，所述植物病害的病原菌包括真菌型病原菌。
优选地，所述病原菌包括叶点霉病菌、灰霉病菌、根腐病菌、枯萎病菌、叶斑病菌和炭疽病菌中一种或多种。
有益效果：
本发明提供了一种包括链霉菌(Streptomyces dioscori)SF1和链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2的防治植物病害的复合菌剂，所述链霉菌SF1的保藏编号为CGMCC No.23417，所述链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418。本发明的复合菌剂的菌种之间相互促进，具有协同增效的作用，可以有效防治植物叶点霉病、植物灰霉病、植物根腐病、植物枯萎病、植物叶斑病和植物炭疽病等多种植物病害，尤其对党参根腐病菌的抑菌率为76.89％。本发明的复合液体菌剂稳定性强、抑菌活性好，经试验证实，该复合液体菌剂储存100d时菌剂中的活菌数数量仍达到3.2×1011cfu/mL以上，对党参根腐病菌抑菌率达60.37％以上。
生物保藏信息
链霉菌(Streptomyces dioscori)SF1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年9月15日，保藏编号为CGMCC No.23417。
链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年9月15日，保藏编号为CGMCC No.23418。
附图说明
图1为链霉菌SF1的形态特征图，其中A为链霉菌SF1的菌落形态图，B为链霉菌SF1在光学显微镜下的孢子形态图；
图2为链霉菌SF2的形态特征图，其中A为链霉菌SF2的菌落形态图，B为链霉菌SF2在光学显微镜下的孢子形态图；
图3为链霉菌SF1和SF2间亲和性测试结果图；
图4为不同处理方式得到复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果，A为实施例6复合发酵第2、4、6、8、10天后复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果，B为对比例1复合发酵第2、4、6、8、10天后复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果，C为对比例2复合发酵第2、4、6、8、10天后复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果；
图5为实施例3、实施例13～17得到的复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果；
图6为实施例3、实施例7～12得到的复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长结果；
图7为链霉菌SF1发酵液、链霉菌SF2发酵液和实施例3复合液体菌剂的抑菌活性结果。
具体实施方式
本发明提供了一种防治植物病害的复合菌剂，所述复合菌剂包括链霉菌(Streptomyces dioscori)SF1和链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2；所述链霉菌SF1的保藏编号为CGMCC No.23417，所述链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418。
在本发明中，所述链霉菌SF1优选分离自健康，籽粒饱满的甘草种子。本发明所述链霉菌SF1的ITS序列优选如SEQ ID No.1所示：ATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTCGCAGGCATCTGTGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAA。本发明所述链霉菌SF1与NCBI数据库中Streptomyces dioscori strain A217的相似性为99.57％，说明链霉菌SF1与数据库中的链霉菌具有高度相似性。所述链霉菌SF1的菌落形态如图1中的A和B所示为：在高氏一号培养基上生长繁茂，呈黄白色，有浅黄色可溶性色素，菌落呈圆形，表面光滑不透明，边缘较规则，基内菌丝与气生菌丝丰富，基内菌丝呈黄白色、气生菌丝为黄褐色。本发明所述链霉菌SF1具有产柠檬酸、酯酶、氧化酶、过氧化氢酶、脲酶和产吲哚乙酸特性；耐酸碱范围为：pH为5.0～9.0、最适生长的pH值为7.0；温度耐受范围为15～37℃、最适生长温度为28℃；可利用碳源有D-甘露醇、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-果糖、D-山梨醇和蔗糖；可利用氮源有尿素、谷氨酰胺、甘氨酸、硫酸铵和组氨酸。
在本发明中，所述链霉菌SF2优选分离自健康，籽粒饱满的甘草种子，所述链霉菌SF2的16SrDNA的序列优选如SEQ ID NO.2所示：TAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTTCCACTCGCATGGGTGGGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCT。本发明所述链霉菌SF2与NCBI数据库中Streptomyces bungoensis登录号为AY999905.1的相似度为99.37％，说明链霉菌SF2与数据库中的链霉菌具有高度相似性。所述链霉菌SF2的菌落形态如图2中的A和B所示：在高氏一号培养基上生长繁茂，呈白色，无可溶性色素，表面隆起且干燥不透明，边缘不规则向四周扩散，有土腥味；基内菌丝与气生菌丝都很丰富，基内菌丝呈乳白色，气生菌丝为灰褐色，孢子弯曲、表面光滑。在本发明中，所述链霉菌SF2不能使硝酸盐还原，可以使淀粉水解，不能产生H2S，不能使明胶液化、牛奶胨化与凝固；生长pH范围为5.0～9.0，最适生长pH为7.0；温度耐受范围为15～37℃，最适生长温度为28℃；能生长在NaCl含量小于7％的培养基上。
在本发明中，所述复合菌剂能有效防治植物病害，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性，还具有无污染和稳定性强的特性。因此，该复合菌剂能够用于防治植物病害。所述链霉菌SF1的有效活菌数优选为1×108cfu/mL～4×108cfu/mL，所述链霉菌SF2的有效活菌数优选为1×108cfu/mL～4×108cfu/mL。
本发明还提供了一种防治植物病害的复合液体菌剂，所述复合液体菌剂为上述复合菌剂发酵得到的发酵液。
在本发明中，所述发酵液的制备方法优选地包括以下步骤：将链霉菌SF1和链霉菌SF2接种到液体培养基中，在25～30℃下复合发酵2～10天，即得复合液体菌剂。本发明所述液体培养基优选包括高氏一号液体培养基。实本发明中高氏一号液体培养基优选地包括如下组分：可溶性淀粉20g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、蒸馏水1000mL。在本发明中，所述液体培养基初始pH优选为4～10，更优选为5～9，进一步优选为6～8。本发明所述的接种方式优选为先将链霉菌SF1接种至液体培养基培养1～3天后，再将链霉菌SF2接种至液体培养基中进行复合发酵。本发明所述链霉菌SF1与链霉菌SF2接种比例优选为1～5:1～2。在本发明中，在将链霉菌SF1和链霉菌SF2接种到液体培养基中之前，还优选地包括将链霉菌SF1和链霉菌SF2分别活化，本发明对所述活化的方式没有特殊限定，采用本领域常规活化方式即可。
本发明还提供了上述复合菌剂或复合液体菌剂在防治植物病害中的应用。
在本发明中，所述植物优选包括药用植物，更优选包括党参。所述植物病害的病原菌优选地包括真菌型病原菌，所述病原菌优选地包括叶点霉病菌、灰霉病菌、根腐病菌、枯萎病菌、叶斑病菌和炭疽病菌中一种或多种。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的培养基如下：
高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.4。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH自然。
营养琼脂培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏3g，琼脂20g，ddH2O 1L。
ISP2培养基：酵母膏4.0g，麦芽汁10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂20.0g，ddH2O 1L，pH7.0。
ISP3培养基：燕麦粉20.0g，微量元素溶液1mL，ddH2O 1L，pH 7.2；微量元素溶液为FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，ddH2O 1L。
ISP4培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂粉20g，ddH2O 1L。
察氏培养基：NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.5g，蔗糖0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L。
实施例1：链霉菌SF1和链霉菌SF2的分离鉴定
链霉菌SF1和链霉菌SF2的分离
选取健康、籽粒饱满的甘草种子，用质量百分含量为85％的浓硫酸溶液浸湿种子45min，不定时搅拌，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的过氧化氢溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次后再用无菌水浸泡3h，再转入超净工作台中对种子进行表面消毒。在无菌条件下，依次用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡5min、1％过氧化氢溶液浸泡30s、5％次氯酸钠溶液浸泡10s、无菌水冲洗10次，经表面消毒的甘草种子置于事先铺有无菌吸水纸的无菌培养皿中，放置在无菌超净台使其自然干燥。为了确保消毒彻底，取200μL最后一次清洗甘草种子的洗涤水，涂布于高氏一号培养基中上，将平板置于28℃恒温培养一周，观察是否有菌落长出，若无菌落生成，则证明表面消毒彻底。结果是无菌落生成，证明种子表面消毒彻底。
将处理后的甘草种子放入无菌研钵中，加入10mL无菌水研磨。取悬浮液200μL均匀涂布在含有50μg/mL K2Cr2O7的高氏一号培养基上，28℃人工气候箱中暗培养7d后挑取具有典型放线菌菌落形态与质地的单菌落转接到另一高氏一号培养基上，得到两株纯培养的菌株，并分别命名为SF1和SF2。
培养特征观察：
于不同培养基上划线接种分离得到的菌株，28℃恒温培养5～7d，记录菌落气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色、生长状况，结果见表1和表2。
表1 SF1菌株在不同鉴别培养基上的生长及培养特征
Figure BDA0003651080800000091
注：+表示可以生长，++:表示生长良好，+++表示生长很好。
由表1可知，本发明所述SF1菌株在高氏一号培养基上气生菌丝为黄白色，基内菌丝为黄褐色，有浅黄色可溶性色素，生长状况很好，在察氏培养基上的气生菌丝为黄白色，基内菌丝为黑褐色，无可溶性色素，生长状况良好，在营养琼脂培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为灰白色，无可溶性色素，生长状况很好，在PDA培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为黑褐色，无可溶性色素，生长状况很好，在ISP2培养基上气生菌丝为乳白色，基内菌丝为浅黄色，无可溶性色素，生长状况很好，ISP3培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为灰白色，有浅黄色可溶性色素，生长状况良好，在ISP4培养基上气生菌丝为白色，基内菌丝为灰褐色，有浅黄色可溶性色素，生长状况良好。
表2 SF2菌株在不同鉴别培养基上的生长及培养特征
Figure BDA0003651080800000092
Figure BDA0003651080800000101
注：+表示可以生长，++表示生长良好，+++表示生长很好。
由表2可知，所述SF2菌株在高氏一号培养基上气生菌丝为乳白色，基内菌丝为灰褐色，无可溶性色素，生长状况很好，在察氏培养基上的气生菌丝为白色，基内菌丝为白色，无可溶性色素，生长状况良好，在营养琼脂培养基上气生菌丝为乳白色，基内菌丝为黄色，无可溶性色素，生长状况很好，在PDA培养基上气生菌丝为乳黄色，基内菌丝为土黄色，无可溶性色素，生长状况很好，在ISP2培养基上气生菌丝为乳黄色，基内菌丝为黄色，无可溶性色素，生长状况很好，ISP3培养基上气生菌丝为白色，基内菌丝为白色，无可溶性色素，生长状况良好，在ISP4培养基上气生菌丝为黄白色，基内菌丝为米黄色，无可溶性色素，生长状况良好。
生理生化测定：
参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》测定分离得到的SF1菌株的生理生化特性，结果见表3。
参考《放线菌系统学原理、方法及实践》和《链霉菌鉴定手册》测定分离得到的SF2菌株的生理生化特性，结果见表4。
表3 SF1菌株生理生化特性
Figure BDA0003651080800000102
Figure BDA0003651080800000111
注：“+”代表阳性；“-”代表阴性。
由表3可知，SF1菌株具有产柠檬酸、酯酶、氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、产吲哚乙酸特性；其耐酸碱pH范围为5.0～9.0、最适生长pH 7.0；温度耐受范围为15～37℃、最适生长温度为28℃；可利用碳源有D-甘露醇、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-果糖、D-山梨醇、蔗糖；可利用氮源有尿素、谷氨酰胺、甘氨酸、硫酸铵、组氨酸。
表4 SF2菌株的生理生化特征
特征 结果 特征 结果 特征 结果
生化试验 碳源利用 氮源利用
MR试验 + D-甘露醇 + 尿素 +
V-P试验 － D-半乳糖 + 谷氨酰胺 －
柠檬酸盐试验 + D-木糖 + 甘氨酸 －
吲哚产生试验 + 蔗糖 + 硫酸铵 +
氧化酶 + D-葡萄糖 + 组氨酸 +
脂酶 － D-山梨醇 + (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> +
尿素酶 － D-果糖 + KNO<sub>3</sub> +
过氧化氢酶 + D-麦芽糖 －
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
由表4表明，SF2菌株不能使硝酸盐还原，可以使淀粉水解，不能产生H2S，不能使明胶液化、牛奶胨化与凝固；生长pH范围为5.0～9.0，最适生长pH为7.0；温度耐受范围为15～37℃，最适生长温度为28℃；能生长在NaCl含量小于7％的培养基上。
分子生物学鉴定
采用DNA提取试剂盒(购买厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司，货号SK8255)提取SF1和SF2菌株DNA，用16S rDNA细菌通用引物对(SEQ ID No.3正向引物7F-1540R：CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA，SEQ ID No.4反向引物27F-1492R：AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT)提取的DNA进行PCR扩增。
其中，SF1菌株提取的DNAPCR扩增时，PCR反应体系为：模板DNA 0.5μL，10×buffer(with Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，每个引物(10μM)各0.5μL；反应程序：95℃5min；(94℃30s、57℃30s，72℃90s)，30个循环；72℃10min。其中，SF2菌株提取的DNA PCR扩增时，PCR反应体系为：模板DNA 2μL，10×buffer(with Mg2+)5μL，dNTP(10mM)2μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，每个引物(10μM)各2μL；反应参数：96℃1min，95℃10s，50℃5s，60℃4min，共25个循环。PCR扩增后，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增产物送至生工(上海)有限公司测序，其中SF1菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示，SF2菌株的16SrDNA的序列如SEQ ID NO.2所示。并经过NCBI数据库进行BLAST序列比对，SF1菌株与Streptomyces dioscori strainA217的相似度达到99.57％，因而鉴定该菌株为链霉菌(Streptomyces dioscori)，并命名为SF1。SF2菌株与Streptomyces bungoensis相似菌株登录号AY999905.1的相似度达到99.37％，因而鉴定链霉菌(Streptomyces bungoensis)，并命名为SF2。
实施例2链霉菌SF1和SF2间亲和性测试
1)种子液的制备：分别挑取活化培养后的2×108个/mL链霉菌SF1和SF2单菌落，分别接入装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min摇床振荡培养2d得到链霉菌SF1和SF2种子液；
2)SF1和SF2发酵液的制备：将链霉菌SF1和SF2的种子液各5mL分别接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养5d后分别得到SF1和SF2发酵液。
3)复合菌发酵液的制备：将链霉菌SF1和SF2的种子液各5mL同时接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养5d后得到复合菌发酵液。
其中高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.4。
将链霉菌SF2发酵液与已灭菌并冷却至45℃的高氏一号培养基按1:9的体积比混匀后制成含菌平皿；待平皿凝固后，等间距放置3份已灭菌的圆形滤纸片(d＝6mm)，滴加链霉菌SF1发酵液50μL，28℃恒温培养5d后观察滤纸片周围是否出现抑菌圈，实验重复3次。
如图3所示，在链霉菌SF2制成的的含菌平板上，链霉菌SF1周围没有透明圈出现，说明链霉菌SF1和SF2之间没有拮抗作用，可以进行复合发酵。
实施例3
一种复合液体菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)种子液的制备：分别挑取活化培养后的2×108个/mL链霉菌SF1和SF2单菌落，分别接入装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min摇床振荡培养2d得到种子液；
(2)发酵液的制备：先将链霉菌SF1种子液5mL接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养2d后，再接种链霉菌SF2种子液5mL至上述高氏一号液体培养基，28℃、180r/min培养条件下进行复合发酵4d，即得复合液体菌剂。
其中高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.0。
实施例4
一种复合液体菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)种子液的制备：分别挑取活化培养后的1×108个/mL链霉菌SF1和SF2单菌落，分别接入装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，25℃、180r/min摇床振荡培养2d得到种子液；
(2)发酵液的制备：先将链霉菌SF1种子液5mL接入到100mL高氏一号液体培养基中，25℃、180r/min培养条件下培养1d后，再接种链霉菌SF2种子液5mL至上述高氏一号液体培养基，25℃、180r/min培养条件下进行复合发酵6d，即得复合液体菌剂。
其中高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.0。
实施例5
一种复合液体菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)种子液的制备：分别挑取活化培养后的4×108个/mL链霉菌SF1和SF2单菌落，分别接入装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min摇床振荡培养2d得到种子液；
(2)发酵液的制备：先将链霉菌SF1种子液5mL接入到100mL高氏一号液体培养基中，30℃、180r/min培养条件下培养3d后，再接种链霉菌SF2种子液5mL至上述高氏一号液体培养基，30℃、180r/min培养条件下进行复合发酵2d，即得复合液体菌剂。
其中高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.0。
实施例6
一种复合液体菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)种子液的制备：分别挑取活化培养后的3×108个/mL链霉菌SF1和SF2单菌落，分别接入装有100mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min摇床振荡培养2d得到种子液；
(2)发酵液的制备：先将链霉菌SF1种子液5mL接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养2d后，再接种链霉菌SF2种子液5mL至上述高氏一号液体培养基，28℃、180r/min培养条件下进行复合发酵10d，即得复合液体菌剂。
其中高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，ddH2O 1L，pH 7.0。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为4.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为5.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例9
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为6.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例10
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为8.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例11
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为9.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例12
本实施例与实施例3的区别在于，高氏一号培养基pH为10.0，其余步骤与实施例3相同。
实施例13
本实施例与实施例3的区别在于，步骤(2)中发酵液的制备：先将链霉菌SF1种子液接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养2d后，再接种链霉菌SF2种子液至上述高氏一号液体培养基，28℃、180r/min培养条件下进行复合发酵4d，即得复合液体菌剂；其中，所述链霉菌SF1种子液与链霉菌SF2种子液的比例为1:2，种子液的总量为10mL，其中步骤与实施例3相同。
实施例14
本实施例与实施例13的区别在于，所述链霉菌SF1种子液与链霉菌SF2种子液的比例为2:1，其中步骤与实施例13相同。
实施例15
本实施例与实施例13的区别在于，所述链霉菌SF1种子液与链霉菌SF2种子液的比例为3:1，其中步骤与实施例13相同。
实施例16
本实施例与实施例13的区别在于，所述链霉菌SF1种子液与链霉菌SF2种子液的比例为4:1，其中步骤与实施例13相同。
实施例17
本实施例与实施例13的区别在于，所述链霉菌SF1种子液与链霉菌SF2种子液的比例为5:1，其中步骤与实施例13相同。
对比例1
本对比例与实施例6的区别在于步骤(2)发酵液的制备：先将链霉菌SF2种子液5mL接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下培养2d后，再接种链霉菌SF1种子液5mL至上述高氏一号液体培养基，28℃、180r/min培养条件下进行复合发酵10d，即得复合液体菌剂，其余步骤与实施例6相同。
对比例2
本对比例与实施例6的区别在于步骤(2)发酵液的制备：将链霉菌SF1和SF2的种子液各5mL同时接入到100mL高氏一号液体培养基中，28℃、180r/min培养条件下进行复合发酵10d，得复合液体菌剂，其余步骤与实施例6相同。
试验例1
分别将实施例6、对比例1、对比例2复合发酵的第2，4，6，8，10d取发酵液各30mL至已烘干称重的离心管(W1)中，9000r/min离心10min后弃去上清液，将带菌体的离心管烘干至恒重(W2)，换算出1L发酵液中菌体的干重，用质量浓度表示菌体干重(g/L)，计算公式为W＝(W2-W1)×1000/30。
抑菌活性的测定：以党参根腐病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为靶标菌，采用平板对峙法测定SF1和SF2的抑制活性。将靶标菌菌饼(d＝13mm)接种于直径为9cm的PDA平板中央，在菌饼左右各相距1.5cm处对称放置无菌圆形滤纸(d＝6mm)。取各个复合发酵液各50μL分别点接到圆形滤纸片上，每个处理重复3次，对照组为只接种靶标菌。将对峙平板和对照平板置于28℃人工气候箱中暗培养5～7d，采用十字交叉法测量处理菌落直径并计算抑制率。抑制率(％)＝(对照组菌落直径–处理组菌落直径)/(对照组菌落直径)×100，结果如图4所示。
由图4所示，对比例1在复合发酵的第2d综合效果最好，此时抑菌率为67.41％，菌体干重为17.89g/L，对比例2在复合发酵的第8d综合效果最好，此时抑菌率为67.78％，菌体干重为14.89g/L，与对比例1-2相比，实施例6在复合发酵的第4d菌体干重最高，综合效果最好，对党参根腐病菌的抑菌率为67.22％，菌体干重为29.85g/L。
试验例2
实施例3、实施例13～17得到的复合液体菌剂测定对党参根腐病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌活性以及复合菌生长的影响，其中菌体干重和抑菌活性的测定方法参见试验例1，结果见图5。
由图5可知，实施例3、实施例13～17得到的复合液体菌剂均能显著抑制党参根腐病菌，其中实施例17的复合液体菌剂抑菌率为70.67％，菌体干重为25.44g/L。
试验例3
实施例3、实施例7～12得到的复合液体菌剂测定对党参根腐病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌活性以及复合菌生长的影响，其中菌体干重和抑菌活性的测定方法参见试验例1，结果见图6。
由图6可知，实施例3、实施例7～12得到的复合液体菌剂均能显著抑制党参根腐病菌，其中实施例3抑菌活性最好，抑菌率为76.89％，菌体干重为23.44g/L。
试验例4
将实施例2中步骤(2)的链霉菌SF1发酵液、链霉菌SF2发酵液和实施例3得到的复合液体菌剂测定对党参根腐病菌(S.sclerotiorum)抑菌活性以及复合菌生长的影响，其中菌体干重和抑菌活性的测定方法参见试验例1，结果见表5和图7。
表5不同发酵液对抑菌活性以及复合菌生长的影响
试验类型 SF1发酵液 SF2发酵液 复合液体菌剂
抑菌率(％) 65.19±0.0257b 60.74±0.0463c 76.89±0.0372a
菌体干重(g/L) 17.11±1.575b 7.67±0.577c 23.44±1.347a
注：表中数据为三次重复的平均数±标准误；同列数据后不同字母表示在P<0.05。
表5和图7结果表明，比单一菌种相比，复合液体菌剂的抑菌活性和复合菌生长均显著提高。
试验例5
实施例3的复合液体菌剂的性能评价
(1)有效活菌数：采用稀释平板法测得有效活菌数为1.895×1014cfu/mL；
(2)抑菌率和菌体干重：对复合菌发酵条件优化前后发酵液抑菌率及菌体干重进行对比，复合菌发酵条件优化后发酵液的对党参根腐病菌抑菌率和菌体干重分别为76.89％和23.44g/L。
(3)菌剂pH测定：用便携式酸度计测得pH为5～6；
(4)保存温度和时间测定：复合菌剂制备完成后分别置于室温和4℃冰箱保存，每隔20d测定有效活菌数和抑菌率，其中党参根腐病菌抑菌率的测定参见试验例1，结果见表7。
表7复合液体菌剂对党参根腐病菌抑菌活性和活菌数与时间的关系
Figure BDA0003651080800000181
由表7可知，本发明的复合液体菌剂的稳定性强，复合液体菌剂在储存100d时菌剂中的活菌数数量仍达到3.2×1011cfu/mL以上，抑菌率达60.37％以上，符合中华人民共和国国家标准GB 20287-2006有关农用微生物菌剂产品的技术指标。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种防治植物病害的复合菌剂、复合液体菌剂及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg atgaaccact 60
tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc ttcactctgg 120
gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gataacactc tcgcaggcat ctgtgggggt 180
tgaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt gaggtagtgg 240
ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc 360
tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg 420
gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc 480
gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc 540
ggtctgtcgc gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg 600
cagactagag tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata 660
tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga 720
aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggcac 780
taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta acgcattaag tgccccgcct 840
ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg 900
gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catcgcccgg 960
aaagcatcag agatggtgcc ccccttgtgg tcgggtgaca ggtggtgcat ggctgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gttctgtgtt 1080
gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac tgccggggtc aactcggagg 1140
aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca 1200
atggcaggta caatgagctg cgataccgca aggtggagcg aatctcaaaa agcctgtctc 1260
agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat 1320
cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa 1380
agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa 1410
<210> 2
<211> 1439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60
atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc 120
ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatatcactt ccactcgcat 180
gggtgggggt cgaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt 240
gaggtaatgg ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 360
ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc 420
tttcagcagg gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga 540
gctcgtaggc ggcttgtcac gtcgggtgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat 600
tcgatacggg ctagctagag tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa 660
tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca ttactgacgc 720
tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cggtgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta acgcattaag 840
ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga 960
catacaccgg aaacgtctgg agacaggcgc ccccttgtgg tcggtgtaca ggtggtgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gtcctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac cgccggggtc 1140
aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac 1200
acgtgctaca atggccggta caatgagctg cgataccgtg aggtggagcg aatctcaaaa 1260
agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agttgctagt 1320
aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa ccccttgtgg gagggagct 1439
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagagtttga tcctggctag gaggtgatcc agccgca 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtttgatcm tggctcaggg ttaccttgtt acgactt 37

Claims (8)

1.一种防治植物病害的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括链霉菌（Streptomyces dioscori）SF1和链霉菌（Streptomyces bungoensis）SF2；所述链霉菌SF1的保藏编号为CGMCC No.23417，所述链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述链霉菌SF1的有效活菌数为1×108 cfu/mL~4×108 cfu/mL，所述链霉菌SF2的有效活菌数为1×108 cfu/mL~4×108 cfu/mL。
3.一种防治植物病害的复合液体菌剂，其特征在于，所述复合液体菌剂为权利要求1或2所述复合菌剂发酵得到的发酵液。
4.根据权利要求3所述的复合液体菌剂，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：
将链霉菌SF1和链霉菌SF2接种到液体培养基中，在25~30℃下复合发酵2~10天，即得复合液体菌剂。
5.根据权利要求4所述的复合液体菌剂，其特征在于，所述链霉菌SF1与链霉菌SF2接种比例为1~5:1~2。
6.根据权利要求4所述的复合液体菌剂，其特征在于，所述的接种方式为先将链霉菌SF1接种至液体培养基培养1~3天后，再将链霉菌SF2接种至液体培养基中进行复合发酵。
7.根据权利要求4所述的复合液体菌剂，其特征在于，所述液体培养基初始pH为4~10。
8.权利要求1或2所述的复合菌剂或权利要求3~7任意一项复合液体菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病害的病原菌为根腐病菌。
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