CN114806901B - 一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法 - Google Patents

一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法 Download PDF

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    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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Abstract

本发明公开了一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，（1）以野生型木霉菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获取hacI编码序列上游片段和hacI编码区部分片段，分别命名为UF和DF；（2）以质粒pUC19‑hph‑Ptef1为模板进行PCR扩增，获取包含潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉QM6a中tef1基因启动子序列的片段Ptef1，命名为hph‑Ptef1；（3）利用重叠PCR方法将上述3个片段按以下顺序连接，UF、hph‑Ptef1、DF获得超表达元件，命名为UF‑hph‑Ptef1‑DF；（4）将步骤（3）中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素B筛选、PCR验证和HPLC检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株OEhacI。本发明的方法构建的harzianic acid高产菌株，在发酵4天即可在常规培养基PDB中摇瓶产生大量harzianic acid，从而为规模化生产harzianic acid提供有效开发技术和相应工程生产菌。

Description

一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法。
背景技术
Harzianic acid及其衍生物是一类具有多种功能活性的木霉菌次生代谢产物，不仅能够强烈抑制多种植物病原真菌如立枯丝核菌、核盘菌、尖孢镰刀菌等的生长，也能够促进番茄、大豆、油菜和草莓等多种农作物的生长，提高其产量并改善果实营养成分。此外，harzianic acid还具有络合重金属离子(镉、铅、镍、钴等)的能力，能够提高植物在重金属污染土壤中的耐受性。因此，harzianic acid 在农业生产实践中具有重要的应用价值。然而，木霉菌次生代谢产物生物合成基因簇多处于沉默或低表达状态，目前野生状态下未发现其高产菌株，这极大地限制了harzianic acid的规模化生产和进一步应用。
本发明通过基因克隆了具有激活harianic acid生物合成功能的转录因子编码基因(命名为hacI)，并利用其构建了在短时间液体发酵条件下(PDB、25℃、 170rpm、4天)能够大量合成harzianic acid的木霉菌株OEhacI，为高产harzianic acid工程菌株的构建提供了一种新的思路和方法。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法；本发明的第二个目的是提供前述构建方法构建得到的基因工程菌。本发明利用组成型启动子Ptef1，定点激活转录因子编码基因hacI的超表达，大幅提高harzianic acid生物合成基因簇整体转录水平，从而获得高产 harzianic acid的木霉工程菌株
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)以野生型木霉菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获取hacI编码序列上游片段和hacI编码区部分片段，分别命名为UF和DF；
(2)以质粒pUC19-hph-Ptef1为模板进行PCR扩增，获取包含潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉QM6a中tef1基因启动子序列的片段Ptef1，命名为 hph-Ptef1；
(3)利用重叠PCR方法将上述3个片段按以下顺序连接，UF、hph-Ptef1、DF,获得超表达元件，命名为UF-hph-Ptef1-DF；
(4)将步骤(3)中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素B筛选、PCR 验证和HPLC检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株OEhacI。
进一步的，所述的出发菌株野生型木霉菌株为沈氏木霉(Trichoderma shenii)NJAU4742，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19936，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步的，步骤(1)中hacI的序列如SEQ ID No：1所示。
更进一步的，步骤(1)中UF序列如SEQ ID No：2所示。
更进一步的，步骤(1)中的DF序列如SEQ ID No：3所示
进一步的，步骤(3)中超表达元件的序列如SEQ ID No：4所示。
进一步的，步骤(4)中的转化方法为聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化方法。
本发明还保护前述构建方法构建的基因工程菌。
有益效果
本发明所提供的方法能够有效地构建harzianic acid高产木霉菌株，依据此方法所构建的OEhacI菌株在发酵4天即可在常规培养基PDB中摇瓶产生大量 harzianic acid(野生型菌株在此条件下无法合成该物质)，从而为规模化生产 harzianic acid提供有效开发技术和相应工程生产菌，提高该多功能活性天然产物在农业实践中的可能性。
附图说明
图1是harzianic acid及其衍生物化学结构式；
图2是定点插入超表达元件的阳性菌株的PCR验证结果；M为DL5000 DNA marker；1、2是以NJAU4742野生型菌丝为模板的扩增片段，3、4是以为OEhacI 菌丝为模板的扩增片段；
图3是OEhacI菌株和野生型菌株发酵产物HPLC检测结果；方框为harzianic acid及其衍生物。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本发明的出发菌株NJAU4742的分类命名为沈氏木霉(Trichoderma shenii)，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19936。
实施例1：hacI基因超表达元件的构建
(1)超表达元件各片段的PCR扩增
使用如下引物：
UF-f:5’-GTTCGAATCATGCACTGCC-3’；
UF-r:5’-TCTCGGATCCTTCTTGTAATACCACGGCTGG-3’；
DF-f:5’-ACAAACCGTCATGGAACCTCGGGGCGCCTTTA-3’；
DF-r:5’-CATTCGGTCCAGGTGCTTGT-3’；
hph-Ptef1-f:5’-ATTACAAGAAGGATCCGAGAGCTACCTTAC-3’；
hph-Ptef1-r:5’-GAGGTTCCATGACGGTTTGTGTGATGTAGC-3’；
其中，UF-f和UF-r扩增hacI编码区上游片段，DF-f和DF-r扩增hacI编码区部分片段，hph-Ptef1-f和hph-Ptef1-r扩增潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉(Trichodermareesei QM6a)中tef1基因启动子序列的片段Ptef1。
PCR扩增体系如下：
其中，NJAU4742基因组DNA用于扩增UF和DF片段的模板，质粒 pUC19-hph-Ptef1用于扩增hph-Ptef1片段的模板。
PCR反应条件如下：
a.95℃预变性3min；
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s或1min30s，进行30个循环；
c.72℃延伸5min；
d.10℃5min；
其中，扩增UF和DF片段时b步骤中延伸时间为40s，扩增hph-Ptef1片段时b步骤中延伸时间为1min30s。
所获得的3个片段分别经琼脂糖凝胶检测确认，并采用诺唯赞公司的 FastPureGel DNA Extraction Mini Kit进行纯化后，-20℃保存备用。
(2)重叠PCR法获得超表达元件
该方法分为两步，具体如下：
第一步PCR不添加引物，扩增体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 10μl
UF片段(100ng μl-1) 1μl
DF片段(100ng μl-1) 1μl
hph-Ptef1片段(100ng μl-1) 2μl
无菌双蒸水 6μl
第一步PCR反应条件如下：
a.95℃预变性3min；
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min30s，进行15个循环；
c.72℃延伸5min；
d.10℃ 5min；
第二步PCR所用引物为UF-f和DF-r，扩增体系如下：
第二步PCR反应条件如下：
a.95℃预变性3min；
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min30s，进行30个循环；
c.72℃延伸5min；
d.10℃ 5min；
PCR产物经琼脂糖凝胶检测确认，并采用诺唯赞公司的FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit进行纯化后，获得hacI基因超表达元件，分装为500ngμl-1 并置于-20℃保存备用。
实施例2：OEhacI菌株的构建
(1)NJAU4742原生质体的制备
按每个平板100μl将新鲜的NJAU4742孢子悬液均匀涂布于贴有玻璃纸的 PDA培养基上，28℃黑暗培养10h后收集刚萌发的孢子，置于含有20ml的溶液 A(1.2M山梨醇、0.1M磷酸二氢钾、0.15g Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum[Sigma,L1412]、pH＝5.6)的离心管中，28℃、100rpm黑暗条件下培养2h。裂解完成后，于4℃、3000rcf离心10min，弃去裂解液并使用5ml 4℃预冷的溶液B(1M山梨醇、50mM氯化钙、10mM Tris-HCl、pH＝7.5)进行重悬。重悬完成后，再次经4℃、3000rcf离心并弃去重悬液，加入1ml预冷的溶液B。随后取样进行镜检并稀释，分装至每份5×107个原生质体，-80℃保存备用。
(2)PEG介导的原生质体转化
在无菌离心管中依次加入以下成分：
NJAU4742原生质体 200μl
PEG溶液 50μl
hacI超表达元件 10μl
其中PEG溶液配方为25％PEG6000、50mM氯化钙、10mM Tris-HCl、pH＝ 7.5；
将反应液混匀，冰浴20min，随后加入2ml PEG溶液并混匀，室温放置5min。最后加入3ml溶液B并混匀，涂布于含有1M蔗糖、100μg ml-1的PDA平板上， 28℃培养3天。待菌落形成后，将每个菌落转接至新的含有100μg ml-1的PDA 平板继续培养3天待验证。
(3)定点插入突变株的PCR鉴定
取0.5mm2大小区域的菌丝，采用Phire Plant Direct Master Mix(ThermoScientific)试剂盒进行PCR验证，验证引物如下：
正向引物:5’-TCACCCAGCCAATGCCTAA-3’；
反向引物:5’-AGTGCTCTTCCAACTACCGC-3’；
PCR扩增体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
正向引物(10μM) 2μl
反向引物(10μM) 2μl
模板(50ngμl-1) 1μl
无菌双蒸水 20μl
其中，模板为试剂盒中菌丝裂解液(详情参考Phire Plant Direct Master Mix说明书)；
PCR反应条件如下：
a.95℃预变性3min；
b.95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，进行30个循环；
c.72℃延伸5min；
d.10℃ 5min；
经琼脂糖凝胶电泳确认片段大小正确的PCR产物送至南京擎科生物科技有限公司(Tsingke)进行DNA测序。测序结果确认正确的菌株经3轮单孢分离纯化并验证后，获得遗传稳定的OEhacI菌株(图2)。
实施例3：高效液相色谱(HPLC)法检测harzianic acid的合成
(1)液体发酵条件
将NJAU4742野生型和OEhacI菌株孢子液分别接种至PDB培养基(BD Difco)中，接种浓度为1×105ml-1，于25℃、170rpm条件下液体发酵4天。发酵结束后，通过8层无菌纱布将真菌菌体去除，将发酵液保存至-80℃备用。
(2)HPLC检测样本制备
取20ml(1)中发酵液，加入20ml乙酸乙酯，经12000rcf离心10min，吸取上层乙酸乙酯有机相至新的离心管，重复2次。随后，利用旋转蒸发仪将有机相蒸干，加入2ml HPLC级甲醇充分溶解，获得检测样本。
(3)HPLC检测条件
HPLC仪器为Agilent Technologies 1260Infinity II(美国)；液相分析柱为Poroshell 120EC-C18 4μm(4.6×150mm)；流动相A为乙腈，流动相B为超纯水+0.1％甲酸；流速为0.8ml min-1；线性梯度洗脱条件为0-18min从10％流动相A至100％的流动相A；检测波长360nm；柱温30℃。
结果显示，NJAU4742野生型无法在该条件下合成harzianic acid，而OEhacI 菌株能够产生大量harzianic acid及其衍生物(图3)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcatcgc cccaaatgct acccaaagtc gacatgcgtt acagtaacag ctcgcctctc 60
tctctacgca tgtcgtgcga ccgctgtcgc gtccagaagc ttaaatgctc tgtaccggac 120
ggagcaaaag cttgccagcg gtgcatgcgg gccagagtct cttgcgtgtt tggacgacgg 180
acgccttcga agcgctcaag ccggacagca acacgcccgc caagtccgcc cagcccgccc 240
acacaaaacg aacaaccgcc cttgagcccc caacgggccg ttgccgttcc cccggcgcca 300
agctccgggt tgatagcggc atcagcatcg gcatcgtcat catccacatg ctcgtcacta 360
tcgccaacga tagcgccatc cggctgccag gctgggactc cagatacgga gctggataca 420
tgtacgctca tacatggagt ctctgagccc atgccgtcgg ccgccccaga gccagagctc 480
gagcccagat cgtgcgatga tctccatctc catgcctcgt gggatggctc ggctgtggac 540
ctggacctgt acgagtacag cttcgcctcc accattcccc agcgtgatag cgacatggac 600
atggccggtt acgactggct ggagcagcca ggatttgcct tggatgacgg gagcacgttt 660
gaaatgggcc gattcgacct ggcgccatgg tcccatttac cacccccgac agccgaggcg 720
agacggcccc ctgacgacat ggccgcgatc aataacacct tggccagtca tattaacagg 780
agcagcaacg ctgccactgc aacgaccggc cagcgactca cagccctggt atccgagatc 840
cagcagcagc tacggagatt ggaggagggt ccgtggcaca cagacagcac tcacagcctg 900
cacgactacc cagttggcac cattctcgag ctctcgcagc agttcagcgc cattgcagga 960
tccatcctca gcagcaccgt ctgcaccagt ggtgggctgg aggaggccgg cagcgacgag 1020
gacaatgaca acagcgggag gacggctggc tgcgccacgg cagacacgcc gacgatgctg 1080
ctcatcatgt gcggctacat ttggctggta cgaatctacg gcattgtgat gggccacttt 1140
cacaagcacc tggaccgaat gcctaccggc gatccccgcc atcttattag gacaactgcg 1200
ggtgttatca gccccatcac cagtggtgta agcaccaagc ttcggctagg cgaactcccc 1260
tgtacagacg tggccctgag tctgcagcag attcacacag cggtccgcat gctgcttgac 1320
gtgctacatg agatcgaggg ccacctgggg cgcggggccg tagcagcttg cgacatggcc 1380
gtggcgttgc tgcttaactc tgggaggccc caaaatggca gctcccgcgg cctgggcatc 1440
aaggcggcgg cagtgaagaa gcttctgagg gagaagatgg gtctttga 1488
<210> 2
<211> 1180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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ccggacggag caaaagcttg ccagcggtgc atgcgggcca gagtctcttg cgtgtttgga 240
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gagctcgagc ccagatcgtg cgatgatctc catctccatg cctcgtggga tggctcggct 600
gtggacctgg acctgtacga gtacagcttc gcctccacca ttccccagcg tgatagcgac 660
atggacatgg ccggttacga ctggctggag cagccaggat ttgccttgga tgacgggagc 720
acgtttgaaa tgggccgatt cgacctggcg ccatggtccc atttaccacc cccgacagcc 780
gaggcgagac ggccccctga cgacatggcc gcgatcaata acaccttggc cagtcatatt 840
aacaggagca gcaacgctgc cactgcaacg accggccagc gactcacagc cctggtatcc 900
gagatccagc agcagctacg gagattggag gagggtccgt ggcacacaga cagcactcac 960
agcctgcacg actacccagt tggcaccatt ctcgagctct cgcagcagtt cagcgccatt 1020
gcaggatcca tcctcagcag caccgtctgc accagtggtg ggctggagga ggccggcagc 1080
gacgaggaca atgacaacag cgggaggacg gctggctgcg ccacggcaga cacgccgacg 1140
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<400> 4
gttcgaatca tgcactgccg cgccattaag gattccttgg attgtcaact gctccgggtg 60
tccgatagcg ccagggctga ccaacactag gccgatggga tcgaattcct tggacaaaga 120
ccactggttc ttgaactact gcactcgcgc agacatcgtt accgcaagtg ttgcctagga 180
cggaatcttc tctgatgtgg cgtccatcct tcgagatcgc aaaggtcata ttcggcctca 240
taatagcccg agccgtcctg ggcaatcttg ggaattaata atggtgggat gcgggccgct 300
tatcgatctc cgcggcggac ttcggaaaat agtagtggtg ttagtgtaaa attctctcat 360
gttaacatca gggcgcacat caaccgaatg agcatataca tttattggtg agaggtacag 420
caagtagcct ctaatgacca ggaggcttcg gatcactcac tactacccca gttgttattc 480
tagtaggaac ttttgcagtt cgatcaaagt tacgctgttg gaccaaagtt atacagttgg 540
atcgatcgaa gtcatccaag tgaatcaaag tcatctagcc agatcaaatt cgttgagtta 600
gatcaagttc gttgagttgg atcaaagtct tctatctagt tcaaaggcat ctagctagaa 660
caagttcatt gcgttcgatc aaagccatct agttggatca atgtcatcca tctagataga 720
tcaatattat ccggcgagac caacaccacc tcatccaatt aaggccatcg agccaggtta 780
tgcttattaa aagagagata acaagaaaac agtttgtatt tttaccaata actactatgc 840
aggcacacct tcctaatgta atttagcagg gtagtggatt ttcacttttg gggtgtggaa 900
atcgagggcc ccgtttgccc aggttgccca agggaggtct ggatcgcagc aatgcatcgc 960
gcatctgcat tctaattagg ccaagtctct gttgtcagca tcgatattat cagccgagta 1020
tgagtgcaat ggccaaaaga aggatcaagc ggctgatgtt gaatacgact gacatgttgt 1080
cgaagtaggt aggggtatta attgcaacca tggcacgcaa tcttgccaag agtatatagg 1140
taggaaccat tgcctgccac cagccgtggt attacaagaa ggatccgaga gctaccttac 1200
atcaatatgg ccagcacctc ttcggcgata catactcgcc accccagccg gggcgattgt 1260
gtgcactagg taggctcgta ctataccagc aggagaggtg ctgcttggca atcgtgctca 1320
gctgttaggt tgtacttgta tggtacttgt aaggtggtca tgcagttgct aaggtaccta 1380
gggagggatt caacgagccc tgcttccaat gtccatctgg ataggatggc ggctggcggg 1440
gccgaagctg ggaactcgcc aacagtcata tgtaatagct caagttgatg ataccgtttt 1500
gccaggatta ggatgcgaga agcagcatga atgccgctca tccgatgccg catcaccgtt 1560
gtgtcagaaa cgaccaagct aagcaactaa ggtaccttac cgtccactat ctcaggtaac 1620
caggtactac cagctaccct acctgccgtg cctacctgct ttagtattaa tctttccacc 1680
tccctcctca atcttctttt ccctcctctc ctcttttttt tttcttcctc ctcttcttct 1740
ccataaccat tcctaacaac atcgacattc tctcctaatc accagcctcg caaatcctca 1800
ggttagtatt actactacta caatcatcac cacgatgctc cgcccgacga tgcggcttct 1860
gttcgcctgc ccctcctctc actcgtgcgc ttgacgagct accccgccag actctcctgc 1920
gtcaccaatt tttttcccta tttacccctc ctccctctct ccctctcgtt tcttcctaac 1980
aaccaaccac caccaaaatc tctttggaag ctcacgactc acgcaagctc aattcgcaga 2040
tacaaatcta gatgaaaaag cctgaactca ccgcgacgtc tgtcgagaag ttcctgatcg 2100
aaaagttcga cagcgtctcc gacctgatgc agctctcgga gggcgaagaa tctcgtgctt 2160
tcagcttcga tgtaggaggg cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt 2220
tctacaaaga tcgttatgtt tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag 2280
tgcttgacat tggggaattc agcgagagcc tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg 2340
gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg 2400
aggccatgga tgcgatcgct gcggccgatc tcagccagac gagcgggttc ggcccattcg 2460
gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc 2520
cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg 2580
ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg 2640
cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact 2700
ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc 2760
cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc gctacttcga gcggaggcac ccggagcttg 2820
caggatcgcc gcggctccgg gcgtatatgc tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga 2880
gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg 2940
tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct 3000
ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc 3060
cgagggcaaa ggaatagatg catgtgctgt gttcctcaga atgggcccca gaagggcgtc 3120
gagcattgtc tatgaatgca aacaaaaata gtaaataaat agtaattctg gccatgacga 3180
atagagccaa tctgctccac ttgactatcc ttgtgactgt atcgtatgtc gaacccttga 3240
ctgcccattc aaacaattgt aaaggaatat gagctacaag ttatgtctca cgtttgcgtg 3300
cgagcccgtt tgtacgttat tttgagaaag cgttgccatc acatgctcac agtcactcgg 3360
cttacgatca tgtttgcgat ctttcggtaa gaatacacag agtaacgatt atacatccat 3420
cgctttctat ggttaggtac tcagacaaca catgggaaac aagataacca tcgcatgcaa 3480
ggtcgattcc aatcatgatc tggactgggg tattccatct aagccatagt accctcgagg 3540
acagaatgta cagtactata ctacctacct tagatgccat caccccttcg caggccatgg 3600
aatttctggc aagtcgcacc cttcagccat gcctgtccgc catcatcata ccagatcgtg 3660
tcgtggcggg cacttgggaa ggacgagctc caaccgccgc cgctgattgg cctgatccgc 3720
cacagccact ggcgctcgcg gcgaggaaaa aaaaaaatct tgcgggtgtg cagcagcatt 3780
gagtggaaag cgggagccgc tgcacgacgc tgattcgtcc gggctgcctc gttagggcta 3840
gaccagcagg cgggcgccgc ttattttgcc cctcctcagg ctttttttca caagccccgt 3900
tttgctgccc cgcgcgtggc agaaaaaaaa aatacagcac gagccactgg cacttgcacc 3960
cctccacccc tccgccgacc accttttaaa tctcctcctc ccaccatctg ctttcgaaat 4020
tttctctctt ctgctcttcg tctcgcatac ccggttcaag catccgatct gcgaatttgt 4080
atgtgctgcc tctccctctg accttctggt ctggtgatac catcctccct cagtttggat 4140
catcgcctta ttcttcttcc ctcttctgca tctgcttcct gctcgtttga ggaacatcgc 4200
cagctgactc tgcttgcctc gcagcgatct agtcaagaac aacacagctc tcacgctaca 4260
tcacacaaac cgtcatggaa cctcggggcg cctttatgtt tacagcaatg atcagagttc 4320
gtgacccatc cactgctgcc atggcatcgc cccaaatgct acccaaagtc gacatgcgtt 4380
acagtaacag ctcgcctctc tctctacgca tgtcgtgcga ccgctgtcgc gtccagaagc 4440
ttaaatgctc tgtaccggac ggagcaaaag cttgccagcg gtgcatgcgg gccagagtct 4500
cttgcgtgtt tggacgacgg acgccttcga agcgctcaag ccggacagca acacgcccgc 4560
caagtccgcc cagcccgccc acacaaaacg aacaaccgcc cttgagcccc caacgggccg 4620
ttgccgttcc cccggcgcca agctccgggt tgatagcggc atcagcatcg gcatcgtcat 4680
catccacatg ctcgtcacta tcgccaacga tagcgccatc cggctgccag gctgggactc 4740
cagatacgga gctggataca tgtacgctca tacatggagt ctctgagccc atgccgtcgg 4800
ccgccccaga gccagagctc gagcccagat cgtgcgatga tctccatctc catgcctcgt 4860
gggatggctc ggctgtggac ctggacctgt acgagtacag cttcgcctcc accattcccc 4920
agcgtgatag cgacatggac atggccggtt acgactggct ggagcagcca ggatttgcct 4980
tggatgacgg gagcacgttt gaaatgggcc gattcgacct ggcgccatgg tcccatttac 5040
cacccccgac agccgaggcg agacggcccc ctgacgacat ggccgcgatc aataacacct 5100
tggccagtca tattaacagg agcagcaacg ctgccactgc aacgaccggc cagcgactca 5160
cagccctggt atccgagatc cagcagcagc tacggagatt ggaggagggt ccgtggcaca 5220
cagacagcac tcacagcctg cacgactacc cagttggcac cattctcgag ctctcgcagc 5280
agttcagcgc cattgcagga tccatcctca gcagcaccgt ctgcaccagt ggtgggctgg 5340
aggaggccgg cagcgacgag gacaatgaca acagcgggag gacggctggc tgcgccacgg 5400
cagacacgcc gacgatgctg ctcatcatgt gcggctacat ttggctggta cgaatctacg 5460
gcattgtgat gggccacttt cacaagcacc tggaccgaat g 5501

Claims (3)

1.一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以野生型木霉菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获取hacI编码序列上游片段和hacI编码区部分片段，分别命名为UF和DF；
（2）以质粒pUC19-hph-Ptef1为模板进行PCR扩增，获取包含潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉QM6a中tef1基因启动子序列的片段Ptef1，命名为hph-Ptef1；
（3）利用重叠PCR方法将上述3个片段按以下顺序连接，UF、hph-Ptef1、DF获得超表达元件，命名为UF-hph-Ptef1-DF；
（4）将步骤（3）中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素B筛选、PCR验证和HPLC检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株OEhacI；
所述出发菌株野生型木霉菌株为沈氏木霉（Trichoderma shenii）NJAU4742，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19936；
所述步骤（1）中，hacI的序列如SEQ ID No：1所示；
所述步骤（1）中UF序列如SEQ ID No：2所示；
所述步骤（1）中的DF序列如SEQ ID No：3所示；
步骤（3）中超表达元件的序列如SEQ ID No：4所示。
2. 根据权利要求1任一所述的一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，其特征在于，步骤（4）中的转化方法为聚乙二醇-氯化钙介导的原生质体转化方法。
3.权利要求1-2任一所述的构建方法构建得到的基因工程菌。
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