CN114806490A - 一种贻贝仿生界面粘合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种贻贝仿生界面粘合材料及其制备方法与应用，属于仿生材料技术领域。方法为：合成仿生粘胶高分子前体PGA‑T‑A；用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化前体PGA‑T‑A，得到仿生粘胶高分子PGA‑D‑A；合成仿生还原性高分子前体PGA‑bis‑C，切断其中的二硫键，得到活化的仿生还原性高分子PGA‑C，将它与PGA‑D‑A混合，并用醋酸加强环境的酸性，以模拟贻贝仿生高分子在界面粘附之前的储存过程；在界面粘附时采用类似贻贝粘胶蛋白的延迟氧化环境，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，超过了其它贻贝仿生粘附材料。

Description

一种贻贝仿生界面粘合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及仿生材料技术领域，更具体地，涉及一种贻贝仿生界面粘合材料及其制备方法与应用。
背景技术
贻贝足丝蛋白(Mussel foot proteins,Mfps)粘胶具有超强的湿粘附性能，具有良好的生物相容性，可生物降解，对人体无害，在医学和工业领域应用广泛。“Cell-Tak”是美国的Bio Polymers公司直接从贻贝足丝腺中提取粘胶蛋白制备的超强粘液，售价高昂，这限制了贻贝粘胶蛋白的应用。
除了从贻贝中采用传统蛋白提取方法直接提纯外，还可以采用人工合成多肽法，基因工程法制备相应的粘胶蛋白，但超低的制备量和超高的成本使它们在工业领域难以得到大规模应用。近年来，贻贝仿生高分子粘附材料受到研究人员的关注，通过将贻贝粘胶蛋白上的关键粘附基团和高分子相结合，可制备出具有贻贝粘胶蛋白相同粘附能力的仿生材料。
不论贻贝粘胶蛋白，或者是粘胶蛋白重组或融合肽段，或是贻贝仿生高分子材料，其上面的关键粘附基团，多巴(DOPA)需要由酪氨酸酶催化，经酪氨酸得来，其氧化还原条件很难在体外控制，多巴一旦在界面粘附之前氧化为多巴醌，材料整体的粘附能力会大幅下降，因此研究贻贝粘胶蛋白在界面粘附之前的活化，储存等控制条件对制备贻贝蛋白仿生材料具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有仿生粘胶水下粘附技术的不足，提供一种贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，本发明设计合成Mfp3/5仿生粘胶高分子前体PGA-T-A和Mfp6仿生还原性高分子前体PGA-bis-C；利用固定化酪氨酸酶在还原性反应环境将含苯酚的合成底物PGA-T-A转变为含邻苯二酚的PGA-D-A，固定化酪氨酸酶可以提高反应体系的转化率，还原性反应环境可以防止仿生粘胶高分子PGA-D-A链上的邻苯二酚基团氧化为醌类，以固定化酪氨酸酶和还原性反应环境模拟贻贝仿生高分子的活化过程；反应完成将反应体系的pH转变为酸性，并将还原性物质改变为经PGA-bis-C激活得到的仿生大分子还原剂PGA-C，以更强的酸性环境和强还原性环境模拟贻贝仿生高分子在界面粘附之前的储存过程；最后在延迟氧化的环境中实现界面粘附。由此解决现有技术中采用人工合成多肽法，基因工程法制备相应的粘胶蛋白，制备量低的技术问题。
根据本发明第一方面，提供了一种贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝酪胺盐酸盐和硫酸胍基丁胺，得到贻贝仿生前体；
(2)将步骤(1)得到的贻贝仿生前体溶于缓冲液中，再加入还原剂和固定化酪氨酸酶进行活化，使所述贻贝仿生前体上的苯酚残基转变为邻苯二酚残基，得到贻贝仿生活化前体溶液；
(3)在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝胱胺二盐酸盐，得到仿生还原剂前体，将该仿生还原剂前体分散在缓冲液中，并利用三(2-羧乙基)膦切断该仿生还原剂中的二硫键，得到仿生还原剂溶液；
将步骤(2)得到的贻贝仿生活化前体溶液加入到所述仿生还原剂溶液中，并加入酸液调节pH至酸性，透析后，得到贻贝仿生界面粘合材料。
优选地，步骤(3)中，透析后还包括冷冻干燥的步骤。
优选地，步骤(2)中，所述还原剂为单宁酸、抗坏血酸或谷胱甘肽。
优选地，所述固定化酪氨酸酶为酪氨酸酶通过亲和吸附法连接在固定化载体上，所述固定化载体为表面络合铜离子并以琼脂糖为修饰接枝材料的载体，所述酪氨酸酶的C端携带组氨酸标签。
优选地，步骤(3)中，所述贻贝仿生活化前体溶液中的贻贝仿生活化前体与所述仿生还原剂溶液中的仿生还原剂的质量比为3：(50～300)。
根据本发明另一方面，提供了任一项所述的制备方法制备得到的贻贝仿生界面粘合材料，所述贻贝仿生界面粘合材料中的仿生还原剂成分能够对活化的贻贝仿生前体进行抗氧化保护。
根据本发明另一方面，提供了所述的贻贝仿生界面粘合材料用于界面粘胶的应用。
优选地，所述应用包括额外添加仿生还原剂前体溶液到该贻贝仿生界面粘合材料中，该仿生还原剂前体溶液的制备方法为：在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝胱胺二盐酸盐，得到仿生还原剂前体，将该仿生还原剂前体分散在缓冲液中，并利用三(2-羧乙基)膦切断该仿生还原剂中的二硫键，得到仿生还原剂溶液；以防止贻贝仿生前体上的邻苯二酚残基氧化为邻苯二醌。
优选地，额外加入的仿生还原剂前体溶液与贻贝仿生界面粘合材料的质量比为1：(40～100)。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有的贻贝粘胶蛋白或贻贝粘胶仿生高分子材料相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明制备的贻贝仿生界面粘合材料在潮湿环境下的抗剪切粘附力大大超过了同类材料。
(2)本发明在制备贻贝仿生界面粘合材料的过程中使用了有效的新式固定化酪氨酸酶，不仅有利于最终提高材料的粘附力，固定酶还可以重复使用，进一步降低了材料的成本。
(3)本发明在制备贻贝仿生界面粘合材料的过程中分别精确模拟了贻贝粘胶蛋白前体的翻译后修饰和储存过程，在仿生Mfp6高分子材料保护下的延迟氧化环境中，实现了更强的界面粘附，结果表明对贻贝粘胶蛋白自身特点和微环境的精确模拟可以提高仿生粘附材料的粘附力，克服贻贝粘胶蛋白多巴基团易氧化，难以控制的缺陷。
附图说明
图1为贻贝仿生界面粘合材料的制备流程图。
图2为固定化酪氨酸酶的可重用性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明贻贝仿生界面粘合材料及其的制备方法包括：(1)以EDC/NHS接枝法合成Mfp3/5仿生粘胶高分子前体PGA-T-A；(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化前体PGA-T-A，以模拟贻贝仿生高分子的活化过程，得到功能化的Mfp3/5仿生粘胶高分子PGA-D-A；(3)以EDC/NHS接枝法合成Mfp6仿生还原性高分子前体PGA-bis-C，用TCEP专一性切断PGA-bis-C高分子中二硫键，进而得到活化的Mfp6仿生还原性高分子PGA-C，将它与步骤(2)获得的PGA-D-A混合，并用醋酸加强环境的酸性，以模拟贻贝仿生高分子在界面粘附之前的储存过程；(4)在界面粘附时采用类似贻贝粘胶蛋白的延迟氧化环境，粘附马口铁板，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力，所得粘胶的粘附强度超过了其它类似贻贝仿生粘附材料。
本发明贻贝仿生界面粘合材料及其的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)贻贝仿生前体PGA-T-A的合成方法。将0.1-1.00g聚谷氨酸钠或聚谷氨酸(PGA)溶解于25-100mL pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.25-8.00g碳酰二亚胺(EDC)，0.25-6.00g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，0.24-8.16g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为5.5-8.0，反应温度20-60℃，反应时间6-48h，摇床转速80-300rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T；所得底物PGA-T0.2-1.0g溶于25-100mL pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37-1.48g碳酰二亚胺(EDC)，0.25-1.00g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，0.25-9.00g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为5.5-8.0，反应温度20-60℃，反应时间6-48h，摇床转速80-300rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T-A。所述贻贝仿生底物PGA-T-A以聚谷氨酸或聚谷氨酸钠为骨架；
所述聚谷氨酸钠或聚谷氨酸的添加量优选为0.2-0.5g，最优为0.25g；
所述PGA-T的添加量优选为0.2-0.5g，最优为0.25g；
所述碳酰二亚胺的添加量优选为0.3-0.4g，最优为0.37g；
所述N-羟基丁二酰亚胺的添加量在制备PGA-T的反应中优选为0.2-0.5g，最优为0.25g；
所述酪胺盐酸盐的添加量优选为0.3-0.4g，最优为0.34g；
所述硫酸胍基丁胺的添加量优选为0.4-1.8g，最优为0.45g；
所述磷酸盐缓冲液的pH优选为5.5-6.5，最优为6.0；
所述反应温度优选为27-47℃；
所述摇床转速优选为150-250rpm，最优为200rpm；
所述透析袋为3500KDa；
所述透析时间为48h以上；
所述透析液为去离子水。
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化前体PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A5-100mg溶于0.5-10mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸0.5-100mg，调节反应体系pH为4.0-8.5，加入固定化酪氨酸酶1.25-25mg(蛋白含量为3.0％-20％)并分散均匀，温度为24-56℃，转速为0-2000rpm，反应时间为4-48h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液。
所述固定化酪氨酸酶为采用亲和吸附法制备的固定化酶，固定化酶添加量优选为4-11mg；
所述固定化酪氨酸酶中的酪氨酸酶需携带组氨酸标签；
所述底物PGA-T-A的添加量优选为15-30mg，最优为20mg；
所述磷酸盐缓冲液的体积优选为1.0-2.5mL，最优为2mL；
所述还原剂为单宁酸，所述单宁酸添加量经优选为15-30mg，最优为20mg；
所述反应体系的pH优选为5.0-7.0；
所述反应温度经优选为45-50℃，最优为48℃；
所述反应转速经优选为1200-2000rpm；
反应时间经优选为6-15h。
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25-1.00g聚谷氨酸钠或聚谷氨酸(PGA)溶解于25-100mL pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.25-8.00g碳酰二亚胺(EDC)，0.25-6.00g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45-1.80g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为5.5-8.0，反应温度20-60℃，反应时间6-48h，摇床转速80-300rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-Cys，将2-100mgPGA-bis-C分散在2-10mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入2-100mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为5.5-8.0，反应2-14h以切断PGA-bis-C中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液。
所述聚谷氨酸钠或聚谷氨酸的添加量优选为0.25-0.5g，最优为0.25g；
所述碳酰二亚胺的添加量优选为0.3-0.4g，最优为0.37g；
所述N-羟基丁二酰亚胺的添加量优选为0.2-0.5g，最优为0.25g；
所述胱胺二盐酸盐的添加量优选为0.4-0.5g，最优为0.45g；
所述磷酸盐缓冲液的pH优选为5.5-6.5，最优为6.0；
所述摇床转速优选为150-250rpm，最优为200rpm；
所述合成PGA-bis-C的反应温度优选为27-47℃；
所述透析袋为3500KDa；
所述透析时间为48h以上；
所述透析液为去离子水；
所述三(2-羧乙基)膦的添加量优选为3-20mg；
所述添加TCEP的磷酸盐缓冲液的pH优选为5.5-7.0；
所述添加TCEP的剪切时间优选为6-13h。
(4)仿生材料的粘附的方法。取方法(2)制备的PGA-D-A溶液0.5-10mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.125-2.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为2％-10％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择2％-10％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶1-50mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液2-50μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
所述PGA-D-A溶液添加量优选为1.0-3.0mL，最优为2.0mL；
所述PGA-C溶液添加量优选为0.25-0.75mL，最优为0.5mL；
所述醋酸的浓度优选为5-10％；
所述透析袋为3500KDa；
所述透析时间为48h以上；
所述透析液为醋酸溶液，醋酸溶液的浓度优选为5-10％；
所述仿生粘胶在粘附时的添加量优选为5-8mg；
所述粘附时添加的PGA-C溶液添加量优选为4-10μL，最优为5μL。
本发明中制备贻贝仿生界面粘合材料的方法，本发明中粘合材料由活化PGA-D-A与大分子还原剂PGA-C组成；以经过活化的高分子仿生材料PGA-D-A为贻贝仿生界面粘合材料的主要组成部分，并采用活化的高分子仿生还原剂PGA-C对PGA-D-A进行抗氧化保护。
本发明中活化的PGA-D-A，由固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A来制备。
一些实施例中，所述酪氨酸酶通过亲和吸附法连接在固定化载体上，所述固定化载体为表面络合铜离子并以琼脂糖为基本修饰接枝材料的载体，所述酪氨酸酶的特征为蛋白序列C端携带6个组氨酸残基的特异性标签，所述固定化酪氨酸酶的添加量为1.25-25mg。
一些实施例中，本发明中固定化酪氨酸酶可运用以下步骤制备得到：
(1)将三价铁盐溶于去离子水中，然后加入琼脂糖，加热使所述琼脂糖溶解；通入非氧化保护气体以除氧，再加入二价铁盐，调节pH至碱性，使三价铁离子、二价铁离子和氢氧根反应生成四氧化三铁，且琼脂糖包覆该四氧化三铁；将混合体系置于外加磁场中，所得沉淀为表面羟基化的核壳结构磁性纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的表面羟基化的核壳结构磁性纳米颗粒超声分散于环氧氯丙烷溶液中，调节pH至碱性，从而使环氧氯丙烷接枝到表面羟基化的核壳结构磁性纳米颗粒上；然后加入亚氨基二乙酸，再次调节pH至碱性，使亚氨基二乙酸与接枝的环氧氯丙烷反应，然后磁分离纳米颗粒，得到表面羧基化的核壳结构磁性纳米颗粒；
(3)将步骤(2)得到的表面羧基化的核壳结构磁性纳米颗粒分散在去离子水中，再加入铜盐并超声分散，使铜离子与表面羧基化的核壳结构磁性纳米颗粒发生配位反应，将所得固体磁分离后，得到铜离子络合的核壳结构磁性纳米颗粒载体。
具体为：
(1)将6-10g FeCl3·6H2O溶解于100-200mL去离子水中，然后加入8.5-12.5g琼脂糖，升温至85-95℃，开启冷凝回流装置，300-500r/min搅拌，待琼脂糖完全溶解后，在混合溶液中通入氮气除氧5-10min，然后加入2.5-6.5g FeSO4·7H2O并溶解，缓慢滴加100-200mL25％(m/m)NH3·H2O(或0.01M NaOH)，使混合体系的pH值维持在9-11，反应过程维持2-6h并持续通入氮气除氧，反应结束后将混合体系置于外加磁场中，所得沉淀用蒸馏水和乙醇反复洗涤去除杂质，所得沉淀为表面羟基化的核壳结构磁性纳米颗粒；
(2)将70-130mg表面羟基化核壳结构磁性纳米颗粒超声分散于由9-11mL去离子水、4-6mL乙醇、3-5mL环氧氯丙烷组成的混合溶液中，加入0.8-1.1g NaOH溶解，超声5-10min，在30-40℃，150-250rpm水浴摇床中反应8-12h；然后在反应结束后的混合体系中直接加入0.4-0.6g亚氨基二乙酸并混匀溶解，调节体系的pH为10.0，升温至65℃，在150-250rpm水浴摇床中反应6-8h，反应结束后磁分离纳米颗粒，用大量乙醇和去离子水洗涤分离的固体，得到表面羧基化的核壳结构磁性纳米颗粒；
(3)当乙醇和去离子水洗涤液变为中性时，将上述磁性纳米颗粒分散在18-22mL去离子水中并将4-8g CuSO4·5H2O溶解于上述溶液中并超声分散，30℃，在100-150rpm悬摇12h或常温静置12h，将所得固体磁分离并清洗后得到铜离子络合的核壳结构磁性纳米颗粒载体。
本发明中的贻贝仿生界面粘合材料制备方法的反应流程图为：
仿生粘胶主要成分PGA-D-A的合成:
Figure BDA0003618321660000101
还原剂2 PGA-C的合成:
Figure BDA0003618321660000102
实施例1
一种贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其具体步骤为：
(1)贻贝仿生底物PGA-T-A的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC)，0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.34g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间6h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T；所得底物PGA-T0.25g溶于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1.35g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间6h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-Tyr-Arg；
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A20mg溶于2mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸20mg，调节pH为5.0，加入固定化酪氨酸酶4.4mg(蛋白含量为5％)并分散均匀，温度为48℃，转速为1600rpm，反应时间为10h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液；
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间6h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-C，将3mg PGA-bis-C分散在5mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入3mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为6.0，反应6h以切断PGA-bis-C中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液；
(4)仿生材料的粘附的方法。取方法(2)制备的PGA-D-A溶液2mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为5％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择5％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶5mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液5μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
实施例2
(1)贻贝仿生底物PGA-T-A的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于75mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC)，0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.34g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T；所得底物PGA-T 0.25g溶于75mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1.35g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T-A；
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A20mg溶于2mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸20mg，调节pH为6.0，加入固定化酪氨酸酶4.4mg(蛋白含量为17％)并分散均匀，温度为48℃，转速为1600rpm，反应时间为10h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液；
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于75mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度30℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-C，将6mg PGA-bis-C分散在10mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入6mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为6.0，反应6h以切断PGA-bis-Cys中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液；
(4)仿生材料的粘附的方法。取方法(2)制备的PGA-D-A溶液2mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为5％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择5％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶8mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液5μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
实施例3
(1)贻贝仿生底物PGA-T-A的合成方法，将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于100mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.34g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度40℃，反应时间24h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-Tyr；所得底物PGA-T 0.25g溶于100mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1.35g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度40℃，反应时间24h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T-A；
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A20 mg溶于2mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸20mg，调节pH为7.0，加入固定化酪氨酸酶5mg(蛋白含量为5％)并分散均匀，温度为48℃，转速为1200rpm，反应时间为10h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液；
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于100mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度40℃，反应时间24h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-C，将20mg PGA-bis-C分散在10mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入20mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为6.0，反应12h以切断PGA-bis-C中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液；
(4)仿生材料的粘附的方法。取方法(2)制备的PGA-D-A溶液2mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为5％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择5％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶8mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液5μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
实施例4
(1)贻贝仿生底物PGA-T-A的合成方法，将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于25mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.34g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T；所得底物PGA-T 0.25g溶于25mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1.35g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T-A；
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A20mg溶于2mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸20mg，调节pH为5.0，加入固定化酪氨酸酶5mg(蛋白含量为5％)并分散均匀，温度为48℃，转速为1600rpm，反应时间为11h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液；
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25g聚谷氨酸钠(PGA)溶解于25mLpH为6.5的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间12h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-C，将6mg PGA-bis-C分散在5mL pH为5.8的磷酸盐缓冲液中，加入6mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为6.0，反应6h以切断PGA-bis-C中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液；
(4)仿生材料的粘附的方法，取方法(2)制备的PGA-D-A溶液2mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为5％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择10％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶6mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液5μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
实施例5
(1)贻贝仿生底物PGA-T-A的合成方法，将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.34g酪胺盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度30℃，反应时间48h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T；所得底物PGA-T 0.25g溶于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1.35g硫酸胍基丁胺并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度30℃，反应时间48h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-T-A；
(2)用固定化酪氨酸酶在还原性环境中活化底物PGA-T-A的方法。将底物PGA-T-A20mg溶于2mL磷酸盐缓冲液中，加入还原剂单宁酸20mg，调节pH为5.0，加入固定化酪氨酸酶5mg(蛋白含量为5％)并分散均匀，温度为48℃，转速为1600rpm，反应时间为13h，反应结束即得到经过活化的产物PGA-D-A的溶液；
(3)大分子仿生还原剂PGA-C的合成方法。将0.25g聚谷氨酸(PGA)溶解于25mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，然后依次加入0.37g碳酰二亚胺(EDC),0.25g N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0.45g胱胺二盐酸盐并溶解，然后调节反应液的pH为6.0，反应温度37℃，反应时间48h，摇床转速200rpm，所得反应液使用3500KDa透析袋透析48h以上，经冷冻干燥后，获得底物PGA-bis-C，将6mg PGA-bis-C分散在5mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入6mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为6.0，反应12h以切断PGA-bis-Cys中的二硫键，所得为大分子仿生还原剂PGA-C的溶液；
(4)仿生材料的粘附的方法，取方法(2)制备的PGA-D-A溶液2mL，加入方法(3)制备的PGA-C溶液0.5mL，加入醋酸调整溶液中醋酸的浓度为5％，然后使用3500KDa透析袋透析48h以上，透析液选择5％的醋酸溶液，经冷冻干燥后，获得仿生粘胶，取仿生粘胶5mg，加入方法(3)所得PGA-C溶液5μL，粘附面积10mm×10mm，所得粘胶在潮湿环境下的剪切粘附力能达到9.5MPa，固定化酪氨酸酶重复使用三次，第二次重复使用制备的粘胶可以保留93％的粘附力，第三次重复使用所得粘胶可以保留67％的粘附力。
在附图1展示了贻贝仿生界面粘合材料的制备流程图，其中图1中具体的制备流程包括粘胶材料前体的制备，粘胶材料前体的体外固定化酪氨酸酶催化的体外修饰反应，活化的粘胶材料的粘附前储存和粘胶材料的粘附。粘胶材料前体利用聚谷氨酸(PGA)作为骨架材料，通过EDC/NHS接枝法在侧链接枝酪氨酸残基和精氨酸残基，制备的仿生粘胶前体PGA-T-A通过申请号为AJ2210150中的方法制备得到的固定化酪氨酸酶催化的体外翻译后修饰反应，在还原剂单宁酸的保护下。将前体PGA-T-A中的酪氨酸残基转变为多巴残基，获得仿生粘胶关键成分PGA-D-A，然后通过磁分离去除固定化酶，通过透析去除单宁酸和其它小分子，通过加入预先由TCEP激活的仿生大分子还原剂PGA-C和醋酸，将反应的微环境转变为储存的微环境，并在粘附时将仿生粘胶的pH转变为7～8实现胶体对界面的粘附和固化。
附图2展示了固定化酪氨酸酶的可重用性。其中图2中的(1)-图2中的(4)展示了固定化酶催化体外翻译后修饰反应中底物PGA-T-A上的酪氨酸残基转变为多巴和多巴醌残基的变化情况。图2中的(1)表示多巴含量随反应时间的变化，在反应11h后达到最高；图2中的(2)表示多巴醌含量随反应时间的变化，在整个反应过程中多巴醌残基的含量没有超过2mmoL/L；图2中的(3)表示多巴和多巴醌总含量随反应时间的变化；图2中的(4)表示酪氨酸残基转化为多巴和多巴醌残基的转化率随反应时间的变化，在转化率达到最高时停止反应并磁分离固定化酶，固定化酶立刻催化下一个批次的体外翻译后修饰反应，所得反应液通过透析去除其它的小分子，并加入PGA-C和醋酸，使PGA-D-A的环境变为储存环境；图2中的(5)表示固定化酪氨酸酶重复使用制备的不同批次仿生粘胶的粘附力(MPa)大小，第一批次仿生粘胶的抗剪切粘附力为9.5MPa，第二批次仍然高达8.9MPa，第三批次可维持6.7MPa；图2中的(6)表示固定化酪氨酸酶重复使用制备的不同批次仿生粘胶的抗剪切粘附力(N)随万能拉力机工作时间的变化。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝酪胺盐酸盐和硫酸胍基丁胺，得到贻贝仿生前体；
(2)将步骤(1)得到的贻贝仿生前体溶于缓冲液中，再加入还原剂和固定化酪氨酸酶进行活化，使所述贻贝仿生前体上的苯酚残基转变为邻苯二酚残基，得到贻贝仿生活化前体溶液；
(3)在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝胱胺二盐酸盐，得到仿生还原剂前体，将该仿生还原剂前体分散在缓冲液中，并利用三(2-羧乙基)膦切断该仿生还原剂中的二硫键，得到仿生还原剂溶液；
将步骤(2)得到的贻贝仿生活化前体溶液加入到所述仿生还原剂溶液中，并加入酸液调节pH至酸性，透析后，得到贻贝仿生界面粘合材料。
2.如权利要求1所述的贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，透析后还包括冷冻干燥的步骤。
3.如权利要求1所述的贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述还原剂为单宁酸、抗坏血酸或谷胱甘肽。
4.如权利要求1所述的贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其特征在于，所述固定化酪氨酸酶为酪氨酸酶通过亲和吸附法连接在固定化载体上，所述固定化载体为表面络合铜离子并以琼脂糖为修饰接枝材料的载体，所述酪氨酸酶的C端携带组氨酸标签。
5.如权利要求1所述的贻贝仿生界面粘合材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述贻贝仿生活化前体溶液中的贻贝仿生活化前体与所述仿生还原剂溶液中的仿生还原剂的质量比为3：(50～300)。
6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的贻贝仿生界面粘合材料，其特征在于，所述贻贝仿生界面粘合材料中的仿生还原剂成分能够对活化的贻贝仿生前体进行抗氧化保护。
7.如权利要求6所述的贻贝仿生界面粘合材料用于界面粘胶的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括额外添加仿生还原剂前体溶液到该贻贝仿生界面粘合材料中，该仿生还原剂前体溶液的制备方法为：在聚谷氨酸钠或聚谷氨酸上接枝胱胺二盐酸盐，得到仿生还原剂前体，将该仿生还原剂前体分散在缓冲液中，并利用三(2-羧乙基)膦切断该仿生还原剂中的二硫键，得到仿生还原剂溶液；以防止贻贝仿生前体上的邻苯二酚残基氧化为邻苯二醌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，额外加入的仿生还原剂前体溶液与贻贝仿生界面粘合材料的质量比为1：(40～100)。
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