CN114796308B

CN114796308B - 黄杞叶提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

Info

Publication number: CN114796308B
Application number: CN202111524974.6A
Authority: CN
Inventors: 郭晓强; 张雨铖; 幸红霞; 周婷; 姚倩; 康泰然; 刘佳豪
Original assignee: Chengdu University
Current assignee: Chengdu University
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN114796308A

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了黄杞叶提取物作为α‑葡萄糖苷酶抑制剂的应用；包括黄杞叶提取物的组合物具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖显著疗效和一定降血脂功效，可明显改善糖尿病小鼠体内脂质代谢紊乱状况；本发明组合物为泡腾片，休止角小，崩解时间短，硬度大，发泡量大，pH适中，甜度适中。

Description

黄杞叶提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及黄杞叶提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是一组代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌的绝对或相对不足以及靶细胞对胰岛素敏感性降低而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病人常会出现多尿、口渴、持续饥饿、体重减轻、视力改变和疲劳等症状。

针对不同类型糖尿病，目前所采行的治疗方法，主要可以分为口服降血糖药及注射胰岛素治疗两种方法，其中口服降血糖药，依其作用机制可分为四大类：

1.α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。

2.胰岛素增敏剂，如二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮等。

3.胰岛素分泌促进剂，如格列齐特、格列美脲、瑞格列奈等。

4.二肽基肽酶-Ⅳ抑制剂，如沙格列汀、维格列汀、西格列汀等。

上述各种治疗用药中的α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-Glucosidase inhibitor)，主要作为治疗患病比例最高的第二型糖尿病的口服降血糖药，详细说明其机制为：

糖类经摄取后首先会被唾液中的淀粉酶或胰脏的消化酶(淀粉酶)将多糖分解为双糖或寡糖，寡糖进入小肠后，小肠上皮细胞所分泌的α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)会将其水解为单糖如葡萄糖、果糖，唯有单糖才能进入血液循环被人体利用。而α-葡萄糖苷酶是在碳水化合物进行消化作用的最后一步产生作用，因此，若该酶受到有效抑制，则可减少糖类的吸收，进而抑制餐后高血糖症的发生，因此α-葡萄糖苷酶是否受到抑制，对于预防或治疗包括糖尿病、高脂蛋白血症与肥胖等疾病方面，显然具有相当潜力。

α-葡萄糖苷酶抑制剂根据化学结构特点，可以分为二糖类、亚氨基糖、碳环糖及假氨基糖、硫糖和其他非糖构型，均为糖类似物。目前临床批准的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，这些抑制剂具有腹部不适、胃肠道紊乱和腹泻等不良反应，也不能有效地控制并发症。

发明内容

有鉴于此，本申请提供黄杞叶提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，包括黄杞叶提取物的组合物(药物制剂)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖显著疗效和一定降血脂功效，可明显改善糖尿病小鼠体内脂质代谢紊乱状况，尤其是改善脏器脂肪变性引起的沉积状况，能够发挥药食同源植物资源副作用极低的优点。本申请组合物(药物制剂)为泡腾片，休止角小，崩解时间短，硬度大，发泡量大，pH适中，甜度适中。

为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是黄杞叶提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

优选地，所述黄杞叶提取物为黄杞叶醇提物。

优选地，所述黄杞叶醇提物的制备方法包括：

(1)将黄杞叶粉碎后过筛得黄杞叶粉末；

(2)将黄杞叶粉末采用乙醇溶解后，采用微波提取，得到黄杞叶提取液；

(3)将黄杞叶提取液过滤、减压浓缩至浸膏状，再真空冷冻干燥，即得。

优选地，所述步骤(1)具体为：将黄杞叶粉碎后过60目筛得黄杞叶粉末。

优选地，所述步骤(2)中，黄杞叶粉末和乙醇料液比1：15。

优选地，优选地，所述步骤(2)中，乙醇为55vol％乙醇。

优选地，优选地，所述步骤(2)中，微波提取条件为于49℃提取57s。

优选地，所述步骤(3)中，真空冷冻干燥时间为24h。

优选地，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂选自下述至少一种：

(a)预防和/或治疗糖尿病的药物制剂；

(b)预防和/或治疗降血脂的药物制剂。

本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂包括黄杞叶提取物。

本发明提供了一种组合物，所述组合物包括黄杞叶提取物，所述组合物选自下述至少一种：

(a)预防和/或治疗糖尿病的药物制剂；

(b)预防和/或治疗降血脂的药物制剂。

优选地，所述药物制剂包括：黄杞叶提取物和药学上可接受的辅料。

优选地，所述组合物为药物制剂。

优选地，所述组合物为泡腾剂。

优选地，所述药剂为泡腾剂。

优选地，所述泡腾剂为泡腾片。

优选地，以质量百分比计，所述组合物中黄杞叶醇提物含量为1～9％。

优选地，所述组合物中黄杞叶醇提物含量为5％。

优选地，所述组合物，包括：黄杞叶提取物、填充剂、润滑剂、崩解剂和润滑剂。

优选地，所述填充剂选自可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇和糊精中的一种或多种。

优选地，所述填充剂为乳糖。

优选地，以质量百分比计，所述组合物中填充剂含量为30.90％。

优选地，所述润滑剂为十二烷基硫酸钠或聚乙二醇6000。

优选地，所述润滑剂为聚乙二醇6000。

优选地，以质量百分比计，所述组合物中润滑剂含量为1％～9％。

优选地，以质量百分比计，所述组合物中润滑剂含量为3％。

优选地，所述组合物，还包括：甜味剂。

优选地，所述甜味剂为木糖醇。

优选地，以质量百分比计，所述药物制剂中甜味剂含量为0.1％～0.9％。

优选地，以质量百分比计，所述药物制剂中甜味剂含量为0.30％

优选地，所述崩解剂为富马酸和碳酸氢钠。

优选地，所述崩解剂酸碱比为：(2～1):(1～2)。

优选地，所述崩解剂酸碱比为1:2。

优选地，以质量百分比计，所述药物制剂中崩解剂含量为30％～70％。

优选地，以质量百分比计，所述药物制剂中崩解剂含量为60％。

优选地，所述药物制剂由黄杞叶醇提物、木糖醇、富马酸、碳酸氢钠、乳糖、聚乙二醇6000、硬脂酸镁和柠檬酸组成。

优选地，以质量百分比计，所述组合物由黄杞叶醇提物5％、木糖醇0.30％、富马酸20％、碳酸氢钠40％、乳糖30.90％、聚乙二醇6000 3％、硬脂酸镁0.30％和柠檬酸0.50％组成。

本发明提供了上述泡腾剂的制备工艺，所述泡腾剂为泡腾片，制备工艺包括：采用直接压片法制备。

优选地，所述制备工艺具体包括：将泡腾片原辅料过筛，混匀后直接压片。

本发明提供了一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括使用权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂或权利要求5～9任意一项所述组合物的步骤。

优选地，所述方法为体内或体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

优选地，所述方法为体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

优选地，所述方法为非疾病诊断和治疗目的抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

黄杞叶提取物对ɑ-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，抑制类型为混合型抑制，对α-葡萄糖苷酶的猝灭方式为动态猝灭；本发明提供的黄杞叶提取物药物制剂对ɑ-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用。

黄杞叶提取物可以通过增加由四氧嘧啶诱导的实验型糖尿病小鼠体内胰岛素含量从而降低空腹血糖水平，并且黄杞叶醇提物呈现一定剂量依赖性；本发明提供的黄杞叶提取物组合物(药物制剂)可以通过增加由四氧嘧啶诱导的实验型糖尿病小鼠体内胰岛素含量从而降低空腹血糖水平，并且呈现一定剂量依赖性。

黄杞叶提取物有效地增强了四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的糖耐量，加速了外源葡萄糖的消耗，进而降低了血糖浓度；本发明提供的黄杞叶提取物组合物(药物制剂)增强了四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的糖耐量，加速了外源葡萄糖的消耗，进而降低了血糖浓度。

黄杞叶提取物可以降低糖尿病小鼠血清中TG、TC和LDL-c含量，具有一定降血脂功效，黄杞叶提取物为有前途的辅助降血脂药物；本发明提供的黄杞叶提取物组合物(药物制剂)具有一定降血脂功效。

黄杞叶提取物可明显改善糖尿病小鼠体内脂质代谢紊乱状况，尤其是改善脏器脂肪变性引起的沉积状况；本发明提供的组合物(药物制剂)可明显改善糖尿病小鼠体内脂质代谢紊乱状况，尤其是改善脏器脂肪变性引起的沉积状况。

本发明采用黄杞叶提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，黄杞叶为胡桃科黄杞属植物黄杞(Engelhardtiaroxburghianawall.)的干燥叶，又名罗汉茶，含有丰富的黄酮类及酚类物质，是一种生长于中国广东、广西和福建省的亚热带乔木。黄杞叶自古以来就被用作预防肥胖的甜茶和治疗腹痛和发烧的民间药物。在日本，它也被用作促进健康的饮料(日本名，Kohki tea)。落新妇苷(Astilbin)是黄杞叶的关键生物活性成分，黄杞叶作为提取落新妇苷的首选药用植物原料。天然植物中有效成分具有多靶点、多途径、多向性的药理特点，本发明黄杞叶提取物、组合物(药物制剂)不仅可以降低血糖水平，还可以发挥药食同源植物资源副作用极低的优点。

本发明组合物(药物制剂)为泡腾片；直接压片法制备的泡腾片表面光滑；筛选泡腾片的原辅料，得到的泡腾片休止角小，崩解时间短，硬度大，发泡量大，pH适中，甜度适中。

本发明上述黄杞叶提取物采用黄杞叶醇提物。

附图说明

图1(a)为黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性图；

图1(b)为黄杞叶醇提物的Lineweaver-Burk曲线图；

图1(c)为落新妇苷的Lineweaver-Burk曲线图；

图1(d)为L-B双倒数曲线斜率对黄杞叶醇提物浓度做二次曲线图；

图1(e)为L-B双倒数曲线斜率对落新妇苷浓度做二次曲线图；

图2(a)为α-葡萄糖苷酶被黄杞叶醇提物淬灭的荧光光谱；

图2(b)为α-葡萄糖苷酶被落新妇苷淬灭的荧光光谱；

图2(c)为黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶Stern-Volmer曲线；

图2(d)为落新妇苷对α-葡萄糖苷酶Stern-Volmer曲线；

图3(a)为黄杞叶醇提物对空腹血糖水平的影响图；

图3(b)为黄杞叶醇提物对胰岛素含量的影响图；

图4(a)为黄杞叶醇提物对口服葡萄糖耐量(a)的影响图；

图4(b)为黄杞叶醇提物对AUC的影响图；

图5为黄杞叶醇提物对小鼠肝脏和肾脏周围脂肪沉积的影响图；图5中，图5(a)为模型组小鼠的肝脏；图5(b)模型组小鼠的肾脏；图5(c)为高剂量醇提物治疗后的小鼠肝脏；图5(d)为高剂量醇提物治疗后的小鼠肾脏；

图6为按照表4制备得到的泡腾片。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

黄杞叶提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

优选地，所述黄杞叶提取物为黄杞叶醇提物。

本发明提供了一种黄杞叶提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

优选地，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂选自下述至少一种：

(a)预防和/或治疗糖尿病的药物制剂；

(b)预防和/或治疗降血脂的药物制剂。

本发明提供了本发明提供了一种组合物，所述组合物包括黄杞叶提取物，所述组合物选自下述至少一种：

(a)预防和/或治疗糖尿病的药物制剂；

(b)预防和/或治疗降血脂的药物制剂。

根据本发明的实施方案，所述药物制剂包括：黄杞叶提取物和药学上可接受的辅料。

在某些具体实施例中，所述组合物为药物制剂。

根据本发明的实施方案，所述药物制剂为泡腾剂。在某些具体实施例中，所述泡腾剂为泡腾片。

根据本发明的实施方案，以质量百分比计，所述组合物中黄杞叶醇提物含量为1～9％；在某些具体实施例中，所述组合物中黄杞叶醇提物含量为5％。

根据本发明的实施方案，所述组合物，包括：黄杞叶提取物、填充剂、润滑剂、崩解剂和润滑剂。

在某些具体实施例中，所述填充剂选自可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇和糊精中的一种或多；在某些具体实施例中，所述填充剂为乳糖。

在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中填充剂含量为30.90％。

在某些具体实施例中，所述润滑剂为十二烷基硫酸钠或聚乙二醇6000；在某些具体实施例中，所述润滑剂为聚乙二醇6000。

在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中润滑剂含量为1％～9％；在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中润滑剂含量为3％。

在某些具体实施例中，所述组合物还包括：甜味剂；在某些具体实施例中，所述甜味剂为木糖醇。

在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中甜味剂含量为0.1％～0.9％；在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中甜味剂含量为0.30％

在某些具体实施例中，所述崩解剂为富马酸和碳酸氢钠；在某些具体实施例中，所述崩解剂酸碱比为：(2～1):(1～2)；在某些具体实施例中，所述崩解剂酸碱比为1:2。

在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中崩解剂含量为30％～70％；在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述组合物中崩解剂含量为60％。

在某些具体实施例中，所述组合物由黄杞叶醇提物、木糖醇、富马酸、碳酸氢钠、乳糖、聚乙二醇6000、硬脂酸镁和柠檬酸组成；在某些具体实施例中，以质量百分比计，所述药物制剂由黄杞叶醇提物5％、木糖醇0.30％、富马酸20％、碳酸氢钠40％、乳糖30.90％、聚乙二醇6000 3％、硬脂酸镁0.30％和柠檬酸0.50％组成。

本发明还提供了上述泡腾剂的制备工艺，所述泡腾剂为泡腾片，制备工艺包括：采用直接压片法制备。

根据本发明的实施方案，泡腾片的制备工艺具体包括：将泡腾片原辅料过筛，混匀后直接压片。

本发明提供了一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括使用上述的α-葡萄糖苷酶抑制剂或上述组合物的步骤。

根据本发明的实施方案，所述方法为体内或体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

在某些具体实施例中，所述方法为体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

在某些具体实施例中，所述方法为非疾病诊断和治疗目的抑制α-葡萄糖苷酶活性的方法。

黄杞叶由友绿环生态农业公司购买得到，本发明所用到的其他原料、试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

黄杞叶醇提物的制备

黄杞叶醇提物的制备方法：

(1)将黄杞干燥叶(友绿环生态农业公司)粉碎后过60目筛得黄杞叶粉末；

(2)将黄杞叶粉末以料液比1:15，用55vol％乙醇溶解后，采用微波辅助提取，49℃条件下提取57s，得到黄杞叶提取液；

(3)将黄杞叶提取液过滤、减压浓缩至浸膏状，再真空冷冻干燥24h，即得黄杞叶醇提物。

实施例2

本实施例所用黄杞叶提取物为实施例1制备得到的黄杞叶醇提物。

1黄杞叶提取物对α-葡萄糖苷酶的影响

1.1溶液的配制

α-葡萄糖苷酶溶液(1U/mL)：精密称取α-葡萄糖苷酶1mg，用0.05mol/L PBS缓冲液(pH＝6.8)溶解并定容至100mL。

对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(PNPG)：精密称取PNPG0.1506g，用0.05mol/LPBS缓冲液(pH＝6.8)溶解并定容至25mL即得20mM PNPG溶液。

1.2黄杞叶提取物对α-葡萄糖苷酶的体外抑制实验

在目前文献报道中，α-葡萄糖苷酶抑制试验测定方法有很多，大多数采用的是pNPG法，即4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷法，在文献报道的方法基础上进行改进。具体操作过程：在96孔微孔板中，加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液与50μL不同浓度(0.1、0.5、1.2、2、2.5mg/mL)黄杞叶提取物(aeLEW)，于37℃下低速振荡反应30min；然后加入50μL底物(20mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG))，并将微孔板在低速振荡下于37℃反应30min，然后立即加入Na₂CO₃溶液(1mol/L；10μL)终止反应。同时设置样品组(待测物+PNPG+酶)，样品空白组(待测物+PBS+PNPG)，对照组(PBS+PNPG+酶)，对照空白组(PBS+PNPG)。多功能酶标仪于405nm处测量吸光度。以黄杞叶提取物同浓度梯度的落新妇苷作为样品对照，同浓度梯度的阿卡波糖作为阳性对照。样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性用IC₅₀值表示。

α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝1－[(A_样品组-A_{样品空白组})/(A_对照组-A_{对照空白组})]×100％。

黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用如图1(a)，醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性极显著(p<0.05)，且在高浓度时其抑制作用强于落新妇苷组(p<0.05)。IC₅₀值分别为0.761±0.09，0.424±0.03，抑制能力由高到低分别为阿卡波糖(0.124±0.03)>落新妇苷(0.424±0.07)>醇提物(0.761±0.09)表明黄杞叶醇提物对ɑ-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用。

1.4酶动力学研究

固定α-葡萄糖苷酶溶液浓度0.5U/mL，改变底物PNPG浓度(0.4、0.5、1.0、2.0、5.0mM)；测定不同浓度黄杞叶醇提物(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL，aeLEW(a～e))和落新妇苷(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL，Astilbin(a～e))反应初速率。以反应速率倒数(1/V)对底物浓度倒数(1/S)作图，得Lineweaver-Burk双倒数曲线图，判断黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制类型，并计算抑制常数Ki^【1-2】。

双倒数形式的Lineweaver-Burk方程表达如下：

式中，v：酶反应速率；v_max：最大反应速率；K_m：米氏常数；K_i：抑制常数；[I]：抑制剂浓度；[S]：底物浓度；α：非竞争性抑制常数与竞争性抑制常数比值。

结果见图1，醇提物和落新妇苷抑制ɑ-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线如图1(b)、图1(c)所示，L-B双倒数曲线均交于第二象限上一点，醇提物和落新妇苷浓度的增加引起Vmax减小，Km增大，表明抑制类型为混合型抑制；将L-B双倒数曲线斜率对抑制剂浓度做二次曲线如图1(d)、图1(e)所示，由公式(2)计算得Ki分别为0.145、0.474mg/mL。Ki值越小，抑制作用越强，抑制剂与酶的结合强度越强。

图1(a)为黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性图(注：不同字母之间具有显著性差异)；

图1(b)为黄杞叶醇提物的Lineweaver-Burk曲线图(注：a～e为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL黄杞叶醇提物)；

图1(c)为落新妇苷的Lineweaver-Burk曲线图(注：a～e为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL落新妇苷溶液)；

图1(e)为L-B双倒数曲线斜率对落新妇苷浓度做二次曲线图。

1.5荧光光谱分析

将α-葡萄糖苷酶溶液(1U/mL)与黄杞叶醇提物和落新妇苷溶液以1：2(v:v)混匀，于37℃水浴30min；取上述溶液于石英比色皿中，采用荧光分光光度计在激发波长290nm处激发和发射狭缝均为10nm的条件下，扫描250～500nm范围内的荧光光谱，分析黄杞叶醇提物和落新妇苷与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用^【3-4】。

为了描述猝灭剂与α-葡萄糖苷酶之间可能的猝灭机制，荧光猝灭数据由Stern-Volmer方程分析：

式中，F₀：不存在猝灭剂时的荧光强度；F：存在猝灭剂时的荧光强度；K_sv：猝灭常数(K_qτ₀)；[Q]：猝灭剂浓度；K_q：猝灭速率常数；τ₀：不存在猝灭剂时荧光基团的平均寿命，值为10^-8s。

若猝灭常数小于猝灭剂对各种生物大分子的最大扩散碰撞常数2.0×10¹⁰，猝灭机理即为动态猝灭，即猝灭剂通过与荧光基团之间发生物理碰撞从而使其荧光强度下降；反之则为静态猝灭，即猝灭剂通过与荧光基团之间结合形成无荧光特性的配合物从而使其荧光强度下降^【5】。

结果见图2，α-葡萄糖苷酶中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等荧光基团使酶在激发波长下发出荧光，若猝灭剂与酶分子之间发生相互作用，使荧光基团结构发生改变，则会造成荧光强度下降，酶的构象发生变化，从而造成酶活性降低甚至丧失。黄杞叶醇提物和落新妇苷对α-葡萄糖苷酶荧光光谱图如图2(a)、2(b)，随着猝灭剂浓度不断增加，荧光强度不断减弱。醇提物对α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer曲线如图2(c)，呈现一定线性关系，由公式(3)计算得猝灭常数Kq为3.546×109，即醇提物对α-葡萄糖苷酶的猝灭方式为动态猝灭。落新妇苷对α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer曲线如图2(d)，曲线向x轴方向弯曲且猝灭常数Kq为4.804×109，即猝灭机理为混合猝灭方式。

图2(a)为α-葡萄糖苷酶被黄杞叶醇提物淬灭的荧光光谱(注：a～f为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL黄杞叶醇提物)；

图2(b)为α-葡萄糖苷酶被落新妇苷淬灭的荧光光谱(注：a～f为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL落新妇苷溶液)；

图2(c)为黄杞叶醇提物对α-葡萄糖苷酶Stern-Volmer曲线；

图2(d)为落新妇苷对α-葡萄糖苷酶Stern-Volmer曲线。

2黄杞叶醇提物体内降血糖研究

2.1糖尿病模型建立

由成都达硕实验动物有限公司提供的昆明小鼠，雄性，每只小鼠质量(20±2)g。用普通饲料将所有小鼠于动物房适应性喂养3d，自由饮食、摄水，适应环境，每天更换垫料。随机选取健康小鼠50只，称重，取6只作为正常空白组(NC)，禁食不禁水12h，取尾部静脉血测定其血糖值，作为该批次正常小鼠的基础血糖值。其余小鼠禁食不禁水24h后给予小鼠腹腔注射四氧嘧啶(200mg·kg^-1)进行造模^【6-7】，恢复小鼠正常饮食饮水，三天后测空腹血糖，并观察小鼠状态，根据情况决定是否需要追加剂量，若血糖值高于11.1mmol·L^-1则为糖尿病小鼠，即造模成功^【8】。选取造模成功的高血糖模型小鼠，以禁食12h的血糖水平及每只小鼠体重为指标随机分为6组，分别为黄杞叶提取物高(aeLEW-H)、中(aeLEW-M)、低剂量组(aeLEW-L)，糖尿病模型(MC)组，落新妇苷对照组(AC)以及盐酸二甲双胍阳性对照组(PC)。给药剂量为：糖尿病模型组及正常空白组小鼠灌胃生理盐水；落新妇苷组小鼠灌胃落新妇苷(30mg·kg^-1)；黄杞叶醇提物高、中、低剂量组分别灌胃(0.6、0.3、0.15g·kg^-1)黄杞叶醇提物；阳性对照组小鼠灌胃盐酸二甲双胍(100mg·kg^-1)，一天给药两次，连续给药28d。表1显示了糖尿病小鼠的体重、排泄量以及食物和水的消耗量。

表1 aeLEW对体重、食物摄入、水分摄入和排泄量的影响

注：“a”表示与正常组之间具有显著性差异，p<0.05；“b”表示与模型组之间具有显著性差异，p<0.05；“c”表示与模型组之间具有极显著性差异，p<0.01

与正常对照组相比，在灌胃的第一天，除体重和食物消耗量外其余指标均显著性增加(p<0.05)。另一方面，在灌胃第28天模型组除了体重下降其余指标均显著性增加(p<0.01)。

然而，与模型组相比，阳性对照组、落新妇苷对照组、aeLEW-H和aeLEW-M组的体重在第28天显著性增加(p<0.05)，而食物和水消耗量及排泄量显著性减少(p<0.01)。aeLEW-L组与模型组之间无显著性差异(p>0.05)。

2.2醇提物对空腹血糖和胰岛素含量的影响

治疗过程中，每周测一次空腹血糖值考察醇提物对小鼠血糖水平的影响。实验最后一天取小鼠血清，ELISA试剂盒测小鼠血清中胰岛素含量。

结果见图3，图3(a)显示了在28天期间接受不同治疗的小鼠的空腹血糖值。在治疗第1天，除了正常组，其他各组的空腹血糖水平之间无显著性差异，即除了正常组，其余各组均显示出高血糖症状。与模型组相比，治疗第28天，aeLEW-M组和落新妇苷组的空腹血糖水平显著性降低(p<0.05)，且两组之间降糖效果无显著性差异，阳性对照组和aeLEW-H组空腹血糖水平极显著性降低(p<0.01)。

各组小鼠治疗后胰岛素水平如图3(b)，与模型组相比，阳性对照组和aeLEW-H组胰岛素含量显著性增加(p<0.01)，AC组和aeLEW-M组胰岛素显著性增加(p<0.05)，结果表明，落新妇苷和aeLEW可以通过增加由四氧嘧啶诱导的实验型糖尿病小鼠体内胰岛素含量从而降低空腹血糖水平，并且aeLEW呈现一定剂量依赖性。

图3(a)为黄杞叶醇提物对空腹血糖水平的影响图(注：“*”表示与模型组之间具有显著性差异，p<0.05；“**”与模型组之间具有极显著性差异，p<0.01)；

图3(b)为黄杞叶醇提物对胰岛素含量的影响图(注：“a”表示与正常组之间具有显著性差异，p<0.05；“b”表示与模型组之间具有显著性差异，p<0.05；“c”表示与模型组之间具有极显著性差异，p<0.01)。

2.3口服葡萄糖耐量

最后一天给药后，禁食12h后给所有小鼠灌胃剂量为1.5g/kg的葡萄糖溶液，每隔半小时测一次血糖。口服葡萄糖耐量结果表示为2h的AUC^【9】。

结果见图4，口服葡萄糖耐量及各组曲线下面积(AUC)分别如图4(a)、图4(b)所示，结果显示正常对照组在口服葡萄糖30分钟时血糖达到最高值，然后逐渐回到初始水平，其余时间保持不变。在测量的时间范围内，MC组空腹血糖水平显着高于NC组(P<0.001)，表明四氧嘧啶明显增加了空腹血糖水平，进而降低了口服葡萄糖耐量能力。与模型对照组相比，aeLEW组剂量依赖性地降低空腹血糖峰值。

各组的曲线下面积(AUC)可以判断血糖耐受的强度，如图4(b)所示，MC组葡萄糖AUC显著高于NC组(P<0.001)，表明四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的糖耐量显著受损。与模型组相比，阳性对照组、落新妇苷对照组及aeLEW治疗组的AUC值显著性降低，AUC分别下降57.57％、12.99％、32.95％及15.53％。在aeLEW治疗组中，高剂量组小鼠比中剂量组小鼠具有更强的葡萄糖耐受性。结果表明aeLEW和落新妇苷有效地增强了四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的糖耐量，加速了外源葡萄糖的消耗，进而降低了血糖浓度。

图4(a)为黄杞叶醇提物对口服葡萄糖耐量(a)的影响图(注：“*”表示与模型组之间具有显著性差异，p<0.05；“**”与模型组之间具有极显著性差异，p<0.01)；

图4(b)为黄杞叶醇提物对AUC的影响图(注：“a”表示与正常组之间具有显著性差异，p<0.05；“b”表示与模型组之间具有显著性差异，p<0.05；“c”表示与模型组之间具有极显著性差异，p<0.01)。

2.4血样分析

实验最后一天，取眼球血，离心得到血清后立即储存在-20℃直到测量。用试剂盒检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及胰岛素含量^【10】。

表2黄杞叶醇提物对小鼠血脂的影响

糖尿病和糖尿病前期患者发生血脂异常和心血管疾病的风险总是增加^【11】。如表2所示，与MC组相比，PC、AC、aeLEW-H及aeLEW-M组的TG、TC及LDL-c含量显著性降低(p<0.05)，HDL-c含量显著性升高(p<0.05)。aeLEW组与模型组之间无显著性差异。结果表明aeLEW和落新妇苷可以降低糖尿病小鼠血清中TG、TC和LDL-c含量，具有一定降血脂功效，aeLEW是一种有前途的辅助降血脂组分。

2.5脏器分析

将小鼠处死后，取出肾脏及肝脏，计算肝脏湿重及肾脏湿重。

表3醇提物对小鼠肝体比和肾体比的影响

图5为黄杞叶醇提物对小鼠肝脏和肾脏周围脂肪沉积的影响图；图5(a)为模型组小鼠的肝脏；图5(b)模型组小鼠的肾脏；图5(c)为高剂量醇提物治疗后的小鼠肝脏；图5(d)为高剂量醇提物治疗后的小鼠肾脏；

各组小鼠脏器指数如表3所示，与MC组相比，aeLEW-H组脏器指数显著下降(p<0.05)，效果接近PC组。MC组小鼠肝脏肾脏周围有大量脂肪堆积(图5a，图5b)，然而经过高剂量aeLEW治疗过后的小鼠肝脏和肾脏周围无明显脂肪堆积(图5c，图5d)；同样落新妇苷(AC组)在一定程度上也能缓解脂肪堆积，但弱于aeLEW。结果表明，黄杞叶醇提物可明显改善糖尿病小鼠体内脂质代谢紊乱状况，尤其是改善脏器脂肪变性引起的沉积状况。

3黄杞叶提取物泡腾片制备工艺及质量评价

3.1泡腾片制备工艺

泡腾片制备工艺主要有酸碱混合制粒法、酸碱分开制粒法以及直接压片法。主要操作步骤如下。

酸碱混合制粒法：分别将原辅料过100目筛，将原料(黄杞叶醇提物)及崩解剂(酸源、碱源)、甜味剂和乳糖混合均匀后加适量聚乙烯吡咯烷酮k30乙醇溶液制软材并过20目筛整粒，于45℃恒温鼓风干燥4小时，干燥结束后加适量润滑剂混匀，压片机压片。

酸碱分开制粒法：分别将原辅料过100目筛，将原料(黄杞叶醇提物)及酸源、甜味剂和乳糖混合均匀，加适量聚乙烯吡咯烷酮k30乙醇溶液制软材，过20目筛整粒得酸粒；按照同样方法制得碱粒，将酸粒和碱粒混合均匀后加适量润滑剂，混匀后压片。

直接压片法：将所有原辅料(黄杞叶提取物、填充剂、润滑剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂)过100目筛，混匀后直接压片。

经过三种方法制备出的泡腾片，其中酸碱混合制粒法和酸碱分开制粒法得到的泡腾片表面不均匀，黏冲。直接压片法制备的泡腾片表面光滑，可避免黏冲。故采用直接压片法。

3.2泡腾片质量指标评定

3.2.1吸湿率

将底部盛有饱和氯化钾溶液的干燥器开盖放置1天，使其与空气完全接触，确保干燥器内达到80％湿度，将干燥至恒重的泡腾片分别放进称量瓶中并带瓶精密称其质量m₁，再放置于上述干燥器中密封，分别在第1、2、3、4、5天同一时间进行称量操作，精密称取样品的带瓶质量m₂，计算吸湿百分率。

3.2.2崩解时间

按照2015版《中国药典》0921崩解时限检查法，具体操作为：取一片泡腾片，置于盛有200mL温度为20℃±5℃蒸馏水的250mL烧杯中，即有大量气泡放出；当泡腾片周围的气体停止逸出时，泡腾片应该完全溶解或者分散在蒸馏水中，无聚集颗粒残留。同样方法检查6片，每片均应在5分钟内崩解完全，如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。

3.2.3 pH测定

取一片泡腾片置于20℃的100mL蒸馏水中，待崩解完全后，用pH计测定溶液的pH值。同法测量6片。

3.2.4发泡量

参照2015版《中国药典》0101片剂发泡量检查，具体操作为：除另有规定外，取25mL具塞刻度试管(内径1.5cm，若片剂直径较大，可改为内径2.0cm)10支，按表中规定加一定量的水，置37℃±1℃水浴中5分钟，各试管中分别投入供试品1片；20分钟内观察最大发泡量的体积，平均发泡体积不得少于6mL，且少于4mL的不得超过2片。

3.2.5休止角

休止角是粉体堆积层的自由斜面在静止平衡状态下，与水平面形成的最大角，休止角可以判断粉末的流动性以及均匀性。休止角不仅可以直接测定，也可以通过tanθ＝HD。

3.3处方优化

分别对泡腾片的填充剂、润滑剂、甜味剂、黄杞叶醇提物、崩解剂、酸碱比等参数进行考察。

3.3.1填充剂考察

泡腾片在遇水溶解完全后形成的应是清澈透明且无沉淀的溶液，泡腾片在储存过程中由于原辅料不同程度的吸湿性经常出现色变、变质等现象，因此水溶性好且吸湿性小的填充剂(稀释剂)为首要选择。常用的填充剂有可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇及糊精，以泡腾片的吸湿性及崩解时间来确定填充剂。

表4填充剂对泡腾片吸湿率的影响

由表4可知，经过5天后，乳糖吸湿率在各组中最低，故确定乳糖为泡腾片填充剂。

3.3.2润滑剂考察

黄杞叶提取物泡腾片润滑剂以水溶性的十二烷基硫酸钠及聚乙二醇6000作为考察对象，以直接压片法制备的泡腾片的休止角、硬度、崩解时间以及泡腾片感官指标作为评定标准考察最优润滑剂。

表5润滑剂对泡腾片质量的影响

由表5可知，以PEG6000作为润滑剂所制得的泡腾片休止角更小，崩解时间更短，硬度更大，故确定PEG6000为泡腾片润滑剂。

3.3.3甜味剂考察

以木糖醇作为泡腾片甜味剂，确定木糖醇含量0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％制备泡腾片，以泡腾后的口感作为评定指标考察木糖醇最适占比。

表6木糖醇对泡腾片口感的影响

由表6可知，木糖醇含量为0.3％时制备出的泡腾片甜度适中，崩解时间良好，故确定木糖醇含量为0.3％。

3.3.4黄杞叶醇提物考察

以黄杞叶醇提物含量1％、3％、5％、7％、9％制备泡腾片，根据感官实验筛选最适醇提物比例。

表7黄杞叶醇提物含量对泡腾片的影响

由表7可知，黄杞叶醇提物含量为5％时，感官最佳，故确定黄杞叶醇提物含量为5％。

3.3.5崩解剂考察

以富马酸和碳酸氢钠作为泡腾片的崩解剂，固定酸碱比1:1，确定崩解剂含量30％、40％、50％、60％和70％，以崩解时间、发泡量和pH为评定指标筛选最佳崩解剂含量。

表8崩解剂含量对泡腾片的影响

由表8可知，崩解剂含量为60％时，崩解时间、发泡量最佳，pH适中，故确定崩解剂含量为60％。

3.3.6酸碱比考察

选择富马酸为酸源，碳酸氢钠为碱源组成泡腾片固定崩解剂，含量为60％，确定酸碱比2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2，以崩解时间、发泡量和pH为评定指标筛选最佳酸碱比。

表9酸碱比对泡腾片的影响

由表9可知，酸碱比为1:2时，崩解时间最短，发泡量最大，pH适中，故确定酸碱比为1:2。

3.3.7润滑剂考察

确定润滑剂含量1％、3％、5％、7％、9％，以休止角、硬度及堆密度为评定指标筛选最佳润滑剂含量。

表10润滑剂含量对泡腾片的影响

由表10可知，PEG6000含量为3％时，休止角符合标准，崩解时间最短，硬度最大，故确定PEG6000含量为3％。

综上，黄杞叶醇提物泡腾片最佳处方见表11。

表11泡腾片最佳处方

黄杞叶醇提物中含有多糖，容易吸潮，在压片时极易粘冲，因此添加一定硬脂酸镁避免粘冲；柠檬酸起到矫味作用，增加黄杞叶泡腾片口感。

3.4质量评价

由表11最优处方制备的泡腾片，见图6；质量评价结果见表12。

表12

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以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种黄杞叶提取物泡腾片，其特征在于，所述黄杞叶提取物泡腾片按照质量百分比计，由黄杞叶醇提物5％、木糖醇0.30％、富马酸20％、碳酸氢钠40％、乳糖30.90％、聚乙二醇6000 3％、硬脂酸镁0.30％和柠檬酸0.50％组成；

所述黄杞叶提取物为黄杞叶醇提物，所述黄杞叶醇提物的制备方法如下：

(1)将黄杞干燥叶粉碎后过60目筛得黄杞叶粉末；

(2)将黄杞叶粉末以料液比1∶15，用55vol％乙醇溶解后，采用微波辅助提取，49℃条件下提取57s，得到黄杞叶提取液；