CN114796245A - 一种石斛寡糖的新用途 - Google Patents

Abstract

一种石斛寡糖的新用途。本发明公开了一种石斛寡糖在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。本发明发现该石斛寡糖可在不影响RAW264.7细胞活力的前提下，抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞分泌NO以及炎症因子TNF‑α、IL‑6、IL‑1β的释放。

Description

一种石斛寡糖的新用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种石斛寡糖的新用途。

背景技术

寡糖(又名低聚糖)是指2-10个糖苷键聚合而成的化合物，功能性低聚糖对人消化酶不敏感，从而产生各种药理作用，例如抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗癌等药理活性。

炎症是一种对有害刺激进行精细调节的生理反应，当反应得不到控制时，会向病理方向发展。慢性炎症与多种疾病的发病机制有关，如动脉粥样硬化、代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病、甚至癌症。尽管在抗炎症方面取得了很大进展，但仍然存在许多挑战，包括化疗药物的严重不良反应、毒性作用且作用靶点较为单一。

因此，人们越来越关注新的抗炎症策略，例如被认为是无毒和多靶向的具有抗炎作用的天然产物。

石斛作为我国传统中药，具有益胃生津、滋阴清热的功效，在临床上也常用于萎缩性胃炎、浅表性胃炎、肝炎、胆囊炎等疾病的治疗。有研究表明石斛多糖具有良好的抗炎活性，其中的葡甘聚糖(分子量为200,000-2,000,000)在其抗炎活性中起着重要作用，但是对于石斛寡糖的抗炎活性未见有相关报道。

发明内容

基于此，本发明提供了一种石斛寡糖在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含石斛寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

进一步地，该石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎。

进一步地，该石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。

进一步地，该石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。

进一步地，该石斛寡糖由3～7个单糖单元通过糖苷键结合而成。

进一步地，该石斛寡糖由葡萄糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成。

进一步地，该石斛寡糖选自以下的一种或多种：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。

进一步地，该石斛寡糖为麦芽四糖和/或甘露六糖。

进一步地，该炎症为活化的巨噬细胞参与的炎症。

进一步地，该炎症为促炎刺激物质诱导的炎症。

进一步地，该巨噬细胞为单核巨噬细胞。

进一步地，该促炎刺激物质为脂多糖。

进一步地，该巨噬细胞为人或动物巨噬细胞。

进一步地，该巨噬细胞选自以下的一种或多种：人单核白血病细胞(THP-1)、小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)或小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞。

进一步地，该炎症为NO含量和炎症因子含量均上升的炎症。

进一步地，该炎症因子选自以下的一种或多种：TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β。

进一步地，该组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

进一步地，该组合物被配制成口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。

进一步地，该口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂。

进一步地，该辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。

进一步地，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。

进一步地，该附加治疗剂为抗炎药。

进一步地，该抗炎药为非甾体抗炎药。

进一步地，该非甾体抗炎药选自以下的一种或多种：阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、保泰松、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、尼美舒利和萘丁美酮。

本发明的有益效果：

本发明主要基于LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，对石斛寡糖(DOOS)的抗炎活性进行研究。以不同浓度的DOOS作用于LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞，采用CCK-8试剂对巨噬细胞的细胞活力进行检测，采用Griess试剂和ELISA试剂盒分别对细胞上清液中NO含量和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量进行检测。本发明发现DOOS可在不影响RAW 264.7细胞活力的前提下，抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞分泌NO以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的释放，其中DOOS-20-4(麦芽四糖)和DOOS-20-7(甘露六糖)相比于其它石斛寡糖对于NO的分泌抑制作用更为显著。上述实验结果表明铁皮石斛寡糖的抗炎活性不是通过抑制巨噬细胞增殖，而是通过降低巨噬细胞活力而引起的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

图1为不同浓度的DOOS对RAW 264.7巨噬细胞活力影响结果示意图。误差线代表SD，n＝5个独立实验，^**P＜0.005vs.LPS；^###p<0.001vs.对照组；ns代表无显著性差异。

图2为DOOS(5mg/mL，浓度以对应生药材质量计算)对RAW 264.7巨噬细胞的形态影响结果示意图。

图3为不同浓度的DOOS对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO分泌量的影响结果示意图。误差线代表SD，n＝3个独立实验，^***P＜0.001vs.LPS。其中AH为氨基胍盐酸盐(50μg/mL)。

图4为不同浓度的DOOS对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞分泌细胞因子(a)TNF-α；(b)IL-6；(c)IL-1β的影响结果示意图。误差线代表SD，n＝3个独立实验，^***P＜0.001vs.LPS。其中DEX为地塞米松(30μM)。

图5为DOOS-20各纯化部位(DOOS-20-2，蔗糖；DOOS-20-3，麦芽三糖；DOOS-20-4，麦芽四糖；DOOS-20-5，麦芽五糖；DOOS-20-6，麦芽六糖；DOOS-20-7，甘露六糖；DOOS-20-8，麦芽七糖)不同浓度梯度(400，200，100，50，25μg/mL)对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO分泌抑制作用结果示意图。^***p＜0.001表示与LPS组显著不同。其中AH为氨基胍盐酸盐(50μg/mL)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何物质或材料，但本文描述了优选的物质或材料。

正如背景技术部分所描述的，现有上市的抗炎存在严重的不良反应、毒性较大、药物作用机制较为单一的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种石斛寡糖在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

本发明的术语“食品”、“保健品”、“食物产品”、“保健产品”、“保健组合物”或“食物组合物”的含义是期望被动物(包括人)摄入并向该动物提供营养或保健作用的产品或组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含石斛寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

在一种优选的实施方式中，该石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎。

本发明的“石斛”包含但不限于兰科植物中上述石斛品种的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。石斛品种之间相互近似，均可适用于本发明的技术方案。

在一种优选的实施方式中，该石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。

在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。

在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由3～7个单糖单元通过糖苷键结合而成。

在本发明中，个数、浓度或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“3～7”，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数例如3、4、5、6和7，且在上述数值范围内均能实现本发明的技术效果。

在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由葡萄糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成。

在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖选自以下的一种或多种：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。

在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖为麦芽四糖和/或甘露六糖。

在一种优选的实施方式中，该炎症为活化的巨噬细胞参与的炎症。

本发明的术语“巨噬细胞”在免疫反应和验证过程中发挥着重要作用，包括从激活到消退炎症和调节组织修复的多种功能。

在一种优选的实施方式中，该炎症为促炎刺激物质诱导的炎症。

在一种优选的实施方式中，该巨噬细胞为单核巨噬细胞。

在一种优选的实施方式中，该促炎刺激物质为脂多糖。

本发明的术语“脂多糖(LPS)”是一种应用最广泛地促炎刺激物质，能够激活巨噬细胞，分泌NO和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β，引发炎症反应。

在一种优选的实施方式中，该巨噬细胞为人或动物巨噬细胞。

在一种优选的实施方式中，该巨噬细胞选自以下的一种或多种：人单核白血病细胞(THP-1)、小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)或小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞。

本发明的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)株建自Abelson小鼠白血病病毒诱发的肿瘤组织，是科研上最常用的炎症细胞模型之一。该细胞易于增殖，高效DNA转染力，对RNA干扰敏感，常用作转染宿主细胞和复制小鼠诺如病毒。该细胞表面sIg-、Ia-、Thy-1.2抗原阴性。据报道，该细胞建系后已不分泌且检测不到病毒颗粒，XC斑点形成实验阴性。可以抗体依赖性地分解绵羊红血球与肿瘤靶细胞，LPS或PPD处理2天后可诱导分解红血球但对肿瘤靶细胞无作用。经检测鼠痘病毒阴性。

在一种优选的实施方式中，该炎症为NO含量和炎症因子含量均上升的炎症。

在一种优选的实施方式中，该炎症因子选自以下的一种或多种：TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β。

在一种优选的实施方式中，该组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

在一种优选的实施方式中，该组合物被配制成口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。

在一种优选的实施方式中，该口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂。

在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。

本发明所涉及的辅料包括但不限于以下所列举的这些。

举例而言，崩解剂选自羟甲基淀粉钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙甲纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮中的一种或几种；稳定剂选自聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚山梨酯80中的一种或几种；稀释剂选自淀粉、预胶化淀粉、乳糖、糊精、微晶纤维素、甘露醇、山梨糖醇、硫酸钙、硫酸氢钙中的一种或几种；粘合剂选自淀粉浆、羟甲基纤维素、聚维酮、明胶、聚乙二醇中的一种或几种；乳化剂选自卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯、阿拉伯胶中的一种或几种。

在一种优选的实施方式中，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。

在一种优选的实施方式中，该附加治疗剂为抗炎药。

在一种优选的实施方式中，该抗炎药为非甾体抗炎药。

在一种优选的实施方式中，该非甾体抗炎药选自以下的一种或多种：阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、保泰松、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、尼美舒利和萘丁美酮。

本发明所要求保护的抗炎药不限于上述所列举的抗炎药，还可包括其他类型的抗炎药、其他来源的生物多糖以及中药有效成分等。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述石斛寡糖，用于预防或治疗受试者中的炎症。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述石斛寡糖的组合物，用于预防或治疗受试者中的炎症。

根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的炎症的方法，包括向该受试者施用有效量的上述石斛寡糖或包含上述石斛寡糖的组合物。

在本发明中，术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表炎症模型的受试者。优选地，所述受试者是人。这样的受试者们典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述石斛寡糖或包含上述石斛寡糖的组合物来预防或治疗的病症。

本发明所用的上述石斛寡糖或包含上述石斛寡糖的组合物的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或预防效果。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、炎症的类型、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。“有效量”具体指的是向所治疗的受试者赋予治疗作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述石斛寡糖或包含上述石斛寡糖的组合物的量。

根据本发明的另一个方面，提供了一种石斛寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：称取适量的石斛药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至一定体积并离心，弃去药渣，上清液加入乙醇沉淀，充分搅拌均匀后静置过夜，离心，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥，干燥物加水充分溶解，涡旋混匀后离心，吸取上清液，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱，先蒸馏水洗脱，除去绝大部分单糖成分和无机盐等杂质，然后用约50％甲醇溶液洗脱出寡糖类成分，约50％甲醇洗脱液水浴氮吹吹干，残余物加水溶解后离心，取上清液干燥后得到石斛寡糖。

进一步地，该方法的步骤包括如下的[1]～[11]项中的任意一项或者多项：

[1]将该石斛药材进行粉碎；

[2]将粉碎后的该石斛药材过60～100目筛，例如80目筛；

[3]该水为蒸馏水或去离子水；

[4]该温度为50℃～100℃，优选为60℃～80℃，例如约70℃；

[5]该加热提取的操作重复2～4次，例如2次；

[6]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为20～70倍量，更优选为40～60倍量，例如约60倍量；

[7]该加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为2～5小时，例如约2小时；

[8]该一定体积为加入的该水的体积的1/10～1/2，优选为1/6；

[9]该离心的条件为在2000rpm～6000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在3000rpm～5000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约3600rpm转速下离心约10分钟；

[10]该无水乙醇的量为该上清液的1～5倍体积，例如约4倍体积；

[11]该乙醇沉淀所用的该乙醇的浓度为60％～100％，优选为70％～90％，例如约80％。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

1实验仪器与材料

1.1试剂与材料

DMEM培养基(GIBCO，美国)

0.25％胰酶-EDTA(GIBCO，美国)

胎牛血清(GIBCO，美国)

DPBS缓冲液(GIBCO，美国)

细胞孔板(科宁，CORNING，美国)

细胞培养皿(赛默飞，Thermo Fisher Scientific，美国)

Griess试剂盒(普洛麦格，Promega，美国)

Mouse TNF-αELISA试剂盒(赛默飞，Thermo Fisher Scientific，美国)

Mouse IL-6ELISA试剂盒(赛默飞，Thermo Fisher Scientific，美国)

Mouse IL-1βELISA试剂盒(赛默飞，Thermo Fisher Scientific，美国)

二甲基亚砜(卡迈舒，Amresco，美国)

细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(上海翊圣生物科技有限公司，中国)

吐温-20(国药集团化学试剂有限公司，中国)

双抗(青霉素-链霉素，Penicillin-Streptomycin，P/S)(GIBCO，美国)

1.2仪器与设备

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，中国)

台式离心机(上海菲怡尔分析仪器有限公司，中国)

冷冻干燥机(Labconco，美国)

恒温水浴锅(上海智城分析仪器有限公司，中国)

CO₂细胞培养箱(艾本德，Eppendorf，美国)

超净台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)

低温高速离心机(艾本德，Eppendorf，美国)

酶标仪(美谷分子仪器，Molecular Devices，美国)

移液枪(艾本德，Eppendorf，美国)

倒置荧光显微镜(奥林巴斯，Olympus Corporation，日本)

涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司，中国)

液氮罐(上海隆拓仪器设备，中国)

MLS-3780SANYO高压灭菌锅(三洋，SANYO，日本)

2实验方法

2.1铁皮石斛寡糖样品制备

精密称定浙江雁荡山批次铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，平行三份，置于圆底烧瓶中，加入30mL纯净水，70℃水浴加热回流2h，冷却后过滤，药渣再次加入30mL纯净水，重复提取两次，然后将两次滤液合并至100mL容量瓶中，加适量纯净水定容至刻度线，上下颠倒摇匀，精密移取2mL铁皮石斛水提液，50℃水浴氮吹吹干。干燥样品加入1mL配置好的80％乙醇溶液，充分涡旋混匀后，12000rpm离心10min，小心吸取上清液800μL，50℃水浴氮吹吹干后，样品加入500μL超纯水复溶，涡旋混匀，即得供试品溶液。

CNWBOND Carbon-GCB Cartridge SPE小柱活化：取石墨化碳SPE小柱，依次用水、甲醇、水各5mL进行冲洗活化。

将该供试品溶液以铁皮石斛药材计，配成100mg/mL水溶液，充分溶解，涡旋混匀后，12000rpm离心10min，小心吸取上清液1mL，上样于活化处理后的石墨化碳SPE小柱。用5mL蒸馏水洗脱，除去绝大部分单糖成分和无机盐等杂质，然后用5mL 50％甲醇溶液洗脱寡糖类成分，50％甲醇洗脱液50℃水浴氮吹吹干，残余物加0.2mL超纯水溶解，12000rpm离心10min，取上清液得到铁皮石斛寡糖样品溶液，干燥后加入适量DPBS缓冲液，配成500mg/mL(浓度以对应生药材质量计算)母液，-20℃保存备用。加药前，以DMEM完全培养基稀释至不同浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

2.2铁皮石斛寡糖的分离纯化

将铁皮石斛寡糖首先采用活性炭-硅藻土柱层析法分离，通过不同浓度乙醇溶液洗脱将铁皮石斛寡糖进行初步分级，得到3组级分分别为：DOOS-W、DOOS-20和DOOS-50。得率分别为2.73％、1.72％和0.69％。其中DOOS-W包含绝大部分单糖组分以及无机盐等杂质，DOOS-20为不同聚合度寡糖，DOOS-50为糖苷等糖的衍生物。根据实验目的，将DOOS-20作为后续纯化的主要对象。

采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，以RID示差检测器进行在线检测，对DOOS-20进行进一步纯化，得到DOOS-20-2，蔗糖；DOOS-20-3，麦芽三糖；DOOS-20-4，麦芽四糖；DOOS-20-5，麦芽五糖；DOOS-20-6，麦芽六糖；DOOS-20-7，甘露六糖；DOOS-20-8，麦芽七糖。

上述所列举的石斛寡糖纯品还可来源于商业购买。

2.3细胞培养基本操作

细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中小心取出，并立即将其置于37℃无菌水浴锅中，轻轻摇晃，使其快速融化，75％酒精进行消毒后，在超净台上将冻存管内的细胞转移到15mL离心管中，并加入提前37℃温浴的DMEM完全培养基2mL，轻轻吹打混匀后，800rpm离心4min，将后上清液吸弃加入1mL完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取细胞液转移至放有5mL完全培养基的细胞培养皿中，十字法混匀，放入37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜，并于第二日更换新的完全培养基。

细胞传代：在倒置显微镜下观察细胞生长状态，当观察到细胞生长至80％左右即可进行传代。小心吸去细胞培养皿中的培养基，加入预热30min的DPBS缓冲液2mL轻轻清洗两次，加入1mL的胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养皿底部，放入细胞培养箱中消化2min，取出，倒置显微镜下观察细胞状态变圆时，移入超净台，加入2mL完全培养基终止消化，1mL移液枪轻轻吹打使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心4min，吸弃上清液，加入3mL完全培养基将细胞轻轻吹打均匀，分别加入3个已加入5mL完全培养基的细胞培养皿中，十字法混匀，置于细胞培养箱中培养。

细胞冻存：倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞状态良好并且生长至融合比例80％左右即可进行冻存。小心吸去培养皿中的培养基，加入预热30min的DPBS缓冲液轻轻清洗两次，加入1mL的胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养皿底部，放入细胞培养箱中消化2min，取出，倒置显微镜下观察细胞状态变圆时，移入超净台，加入2mL完全培养基终止消化，1mL移液枪轻轻吹打使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心4min，吸弃上清液，加入3mL细胞冻存液重悬细胞。分装至细胞冻存管中，标记好细胞名称，代数以及日期，置于细胞梯度降温盒中，放入-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐中保存。

2.4细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测DOOS对RAW 264.7巨噬细胞活力影响

将生长至对数期的RAW 264.7巨噬细胞配置成2×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。给药组加入终浓度为40、20、10、5、2.5mg/mL的DOOS溶液(DOOS浓度以对应生药材质量计算)和终浓度1μg/mL的LPS。模型组加入终浓度为1μg/mL的LPS，空白对照组加入相同体积的DMEM完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。每孔加入20μL的CCK-8溶液，放入培养箱中孵育30min，取出于多功能酶标仪检测450nm的吸光度，以公式：细胞存活率％＝[给药组(OD)－空白组(OD)]/[对照组(OD)－空白组(OD)]×100％，计算RAW 264.7巨噬细胞的细胞存活率。

2.5DOOS对RAW 264.7巨噬细胞的形态变化

将生长至对数期的RAW 264.7巨噬细胞配置成2×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。给药组加入终浓度为5mg/mL的DOOS溶液(DOOS浓度以对应生药材质量计算)和终浓度1μg/mL的LPS。模型组加入终浓度为1μg/mL的LPS，空白对照组加入相同体积的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。显微镜下观察RAW 264.7巨噬细胞的形态变化并拍照留存。

2.6DOOS对RAW 264.7巨噬细胞炎症模型NO分泌的影响

将生长至对数期的RAW 264.7巨噬细胞配置成5×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。给药组加入终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL的DOOS溶液(DOOS浓度以对应生药材质量计算)和终浓度1μg/mL的LPS。阳性药组加入终浓度为50μg/mL的氨基胍盐酸盐和终浓度1μg/mL的LPS。模型组加入终浓度为1μg/mL的LPS，空白对照组加入相同体积的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。

取100μL细胞上清液，加入50μL磺胺溶液，室温避光孵育10min，再加入50μL NEDSolution溶液，室温避光孵育10min，酶标仪检测540nm处吸光度值。同时使用NaNO2标准溶液制作吸光度与NO浓度之间的标准曲线，将吸光度值带入标准曲线得到各组NO分泌量。

2.7DOOS对RAW 264.7巨噬细胞炎症模型细胞因子检测

将生长至对数期的RAW 264.7巨噬细胞配置成4×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，以每孔0.5mL细胞悬液接种于24孔板内，放入细胞培养箱中培养过夜。给药组加入终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL的DOOS溶液(DOOS浓度以对应生药材质量计算)和终浓度1μg/mL的LPS，阳性药组加入终浓度为40μM地塞米松和终浓度1μg/mL的LPS，模型组加入终浓度为1μg/mL的LPS，空白对照组加入相同体积的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。离心，取细胞上清液，按如下步骤分别对TNF-α、IL-6、IL-1β的含量进行测定：

①包被抗体：96孔板内每孔加入100μL捕获抗体(1X),密封，4度孵育过夜；

②洗涤：吸出孔内液体，洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤3次，1min/次，每次用吸水纸吸干；

③封闭：每孔加200μL ELISA/ELISPOT稀释液(1X)，室温孵育1h；

④洗涤：吸出孔内液体，洗涤缓冲液(300μL/孔)至少洗涤1次，1min/次，用吸水纸吸干；

⑤加样：对应孔内加入100μL标准品和待测样品，密封，室温孵育2h；

⑥洗涤：吸出孔内液体，洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤3次，1min/次,每次用吸水纸吸干；

⑦加入二抗：每孔加入100μL检测抗体(1X)，密封，室温孵育1h；

⑧洗涤：吸出孔内液体,洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤5次，1min/次，每次用吸水纸吸干；

⑨加入HRP：每孔加入100μL亲和素-HRP，密封，室温孵育30min；

⑩洗涤：吸出孔内液体，洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤7次，2min/次，每次用吸水纸吸干；

加入TMB：每孔加入100μL TMB(1X)，室温孵育15min；

加终止液并完成检测：每孔加入100μL终止液，并用酶标仪检测450nm下的吸光度值。

2.8DOOS-20各纯化样品对RAW 264.7巨噬细胞炎症模型NO分泌的影响

精密称定DOOS-20各纯化样品(如表1所示)约10mg左右，加入一定量DPBS缓冲液，配成20mg/mL母液，-20℃保存备用。加药前，以DMEM完全培养基稀释至不同浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

表1 DOOS-20各纯化部位样品信息

其中DOOS-20-2，蔗糖；DOOS-20-3，麦芽三糖；DOOS-20-4，麦芽四糖；DOOS-20-5，麦芽五糖；DOOS-20-6，麦芽六糖；DOOS-20-7，甘露六糖；DOOS-20-8，麦芽七糖。

将生长至对数期的RAW 264.7巨噬细胞配置成5×10⁵个细胞/mL，96孔板中每孔加入100μL细胞液，放入细胞培养箱中培养过夜。给药组加入终浓度为400、200、100、50、25μg/mL的DOOS-20各纯化样品和终浓度1μg/mL的LPS。阳性药组加入终浓度为50μg/mL的氨基胍盐酸盐和终浓度1μg/mL的LPS。模型组加入终浓度为1μg/mL的LPS，空白对照组加入相同体积的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。

取100μL细胞上清液，加入50μL磺胺溶液，室温避光孵育10min，再加入50μL NED溶液，室温避光孵育10min，酶标仪检测540nm处吸光度值。

2.9统计方法

实验数据中的计量资料以均数±标准差

表示，采用Graphpad Primer8.0中的One-way ANOVA进行统计分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3实验结果

3.1DOOS对RAW 264.7巨噬细胞活力影响

为检测DOOS对RAW 264.7巨噬细胞是否有细胞毒性，加入终浓度为40、20、10、5、2.5mg/mL的DOOS溶液(DOOS浓度以对应生药材质量计算)和终浓度1μg/mL的LPS孵育24h。通过CCK-8实验检测不同浓度DOOS对巨噬细胞细胞活力的影响。结果如图1所示：1μg/mL的LPS孵育24h会刺激巨噬细胞的增殖，40mg/mL的DOOS溶液给药组的细胞活力相较于LPS组略微下降，20mg/mL～2.5mg/mL的DOOS溶液给药组的细胞活力与LPS组相比，细胞活力无明显影响，因此后续实验的DOOS最高浓度选择不超过20mg/mL。

3.2DOOS对RAW 264.7巨噬细胞的形态变化

DOOS(5mg/mL，浓度以对应生药材质量计算)和LPS对RAW264.7巨噬细胞的形态影响如图2所示：空白组巨噬细胞呈圆形或椭圆形，胞质致密，边界明显，细胞内无明显液泡；1μg/mL的LPS刺激的巨噬细胞胞体明显变大，有大量伪足伸出增强黏附能力，同时可见颗粒状胞质和掌状凸起。DOOS孵育后的细胞相较于LPS组，细胞边界开始明显，伪足伸出减少，细胞形态趋近于空白组的细胞形态。

3.3DOOS对RAW 264.7巨噬细胞炎症模型NO分泌的影响

LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞炎症模型是抗炎物质体外活性筛选的常用模型。LPS是广泛使用的促炎症刺激物之一，能够激活巨噬细胞并引发炎症反应。被激活的巨噬细胞释放大量的一氧化氮(NO)作为促炎症介质，可通过Griess试剂盒检测得到不同浓度的DOOS对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞释放NO的影响，结果如图3所示：1μg/mL的LPS可显著增加RAW 264.7巨噬细胞分泌NO的含量，DOOS可明显抑制LPS诱导的巨噬细胞释放NO，并有明显的剂量依赖性。20mg/mL和10mg/mL浓度的DOOS抑制巨噬细胞释放NO的作用与阳性药氨基胍盐酸盐组效果不相上下，不同浓度DOOS给药组的NO分泌量与LPS组相比，差异有统计学意义(P＜0.001)。结合DOOS对RAW 264.7巨噬细胞活力影响结果可知，DOOS抑制巨噬细胞分泌NO不是通过抑制巨噬细胞增殖，降低巨噬细胞活力引起。

3.4DOOS对RAW 264.7巨噬细胞分泌细胞因子的影响

巨噬细胞通过释放多种因子，如一氧化氮(NO)和致炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)，在炎症反应中发挥重要作用。当巨噬细胞受到刺激时，会导致炎症因子的大量分泌。通过ELISA试剂盒检测不同浓度的DOOS对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-1β的影响，结果如图4所示：1μg/mL的LPS可显著增加RAW 264.7巨噬细胞分泌TNF-α(图4a)、IL-6(图4b)、IL-1β(图4c)的含量，DOOS可抑制LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-1β，并且不同浓度DOOS给药组的TNF-α、IL-6、IL-1β分泌量与LPS组相比，差异有统计学意义(P＜0.001)，并有明显的剂量依赖性。

3.5DOOS-20各纯化样品对RAW 264.7巨噬细胞炎症模型NO分泌的影响

DOOS-20各纯化部位寡糖，以相同的浓度梯度(400、200、100、50、25μg/mL)作用于LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞，通过Griess试剂盒检测得到DOOS-20各纯化部位对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞释放NO的影响，结果如图5所示：除DOOS-20-2(峰1，蔗糖)以及DOOS-20-3(峰3，麦芽三糖)的25μg/mL浓度时，对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO分泌的抑制，与LPS组相比没有统计学意义外，其余各部位各浓度梯度对巨噬细胞NO分泌的抑制与LPS组之间差异有统计学意义(p＜0.001)。其中DOOS-20-4(峰4，麦芽四糖)组与DOOS-20-7(峰7，甘露六糖)组各浓度梯度的NO分泌量均低于其他各部位各浓度梯度的NO分泌量，且差异具有统计学意义(P＜0.001)，说明DOOS-20-4和DOOS-20-7对于LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO的分泌的抑制作用更为显著。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.石斛寡糖在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

2.一种包含石斛寡糖的组合物在制备用于预防和/或治疗炎症的药品、食品和/或保健品中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎；

优选地，所述石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成；

优选地，所述石斛寡糖由3～7个单糖单元通过糖苷键结合而成；

更优选地，所述石斛寡糖由葡萄糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成；

又优选地，所述石斛寡糖选自以下的一种或多种：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述石斛寡糖为麦芽四糖和/或甘露六糖。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述炎症为活化的巨噬细胞参与的炎症；

优选地，所述炎症为促炎刺激物质诱导的炎症；

更优选地，所述巨噬细胞为单核巨噬细胞；

又优选地，所述促炎刺激物质为脂多糖。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述巨噬细胞为人或动物巨噬细胞；

优选地，所述巨噬细胞选自以下的一种或多种：人单核白血病细胞(THP-1)、小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)或小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述炎症为NO含量和炎症因子含量均上升的炎症；

优选地，所述炎症因子选自以下的一种或多种：TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β。

9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述组合物被配制成口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂；

更优选地，所述口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、口服液或膏剂；

又优选地，所述辅料选自以下的一种或多种：崩解剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、增溶剂、乳化剂、包衣剂、缓冲剂和增稠剂。

10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂；

优选地，所述附加治疗剂为抗炎药；

更优选地，所述抗炎药为非甾体抗炎药；

又优选地，所述非甾体抗炎药选自以下的一种或多种：阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、保泰松、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、尼美舒利和萘丁美酮。

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