CN114790227A - 以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用，属于活性多肽技术领域，以龙须菜为原料的活性多肽，其氨基酸序列为：SFYYGK。制备方法，包括以下步骤：S1：取龙须菜进行酶解，对酶解液进行过滤处理，得到澄清的多肽酶解液，S2：进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干，S3：进行质谱测定，进行分析，获得多条多肽序列，筛选得到多条不重复的多肽，S4：筛选出对接分数得分排名靠前的多肽，进行固相合成，然后测定ACE抑制活性，S5：选择ACE抑制率＞80％的多肽，得以龙须菜为原料的活性多肽。本发明获得以龙须菜为原料的活性多肽的氨基酸序列，制备的以龙须菜为原料的活性多肽具有良好的ACE抑制活性。

Description

以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用
技术领域
本发明属于活性多肽技术领域，尤其涉及一种以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用。
背景技术
龙须菜属于红藻门，江蓠科，江离属，别名海草或海菜，是世界第三大海洋藻类植物。其高产量(中国第二)，低成本，养育范围广，经济价值高备受关注，其体内富含多糖、蛋白质、粗纤维等营养资源，本身就是作为食疗和药疗的天然食物，具有润肠通便、清热解毒、延年益寿等功效，常被用于开发利用多糖、多肽、藻红蛋白、膳食纤维等多种生物活性物质。因此，龙须菜在海洋食品、食品添加剂、功能食品、海洋药物等领域具有潜在开发价值。
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸(His-Leu)的切除，能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
现有在从榛子、牦牛乳、贝肉、枸杞等食物中制备活性多肽的技术，但未见以龙须菜作为原料制备具有ACE抑制活性的活性多肽的技术。
发明内容
本发明的目的在于提出一种以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用，以龙须菜作为原料，获得以龙须菜为原料的活性多肽的氨基酸序列，制备的以龙须菜为原料的活性多肽具有良好的ACE抑制活性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的以龙须菜为原料的活性多肽，其氨基酸序列为：SFYYGK。
优选地，其分子量为763.3541Da。
优选地，其对ACE抑制的IC5O值为8.76-9.60μmoL/L。
本发明还提供以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，包括以下步骤：S1：取龙须菜进行酶解，得到酶解液，对酶解液进行过滤处理，去除残渣得到澄清的多肽酶解液，S2：将步骤S1得到的多肽酶解液经陶瓷膜过滤后，进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干，S3：对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，获得多条多肽序列，删除重复序列，筛选得到多条不重复的多肽，S4：通过对接软件UCSF DOCK 6.9的小分子虚拟筛选模块，将多条多肽以与ACE分子对接的模式进行虚拟筛选，筛选出对接分数得分排名前20名的多肽，分别命名A1-A20多肽，进行固相合成，然后测定ACE抑制活性，S5：选择ACE抑制率＞80％的多肽，得以龙须菜为原料的活性多肽。
优选地，步骤S1的具体步骤为：取龙须菜进行反复冲洗去除大颗粒杂质，进行沥干水分1.8-2.2h后，取龙须菜溶于超纯水中，在碱性蛋白酶的条件下进行酶解得到酶解液，将酶解液在95-100℃灭活8-12min，冷却后在7500-8500r/min和4℃的条件下离心 18-22min，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。
优选地，酶解条件为：碱性蛋白酶添加量为超纯水的质量的1.8-2.2％，pH值为8.2-8.6，底物浓度为16-20％，酶解温度为50-60℃，酶解时间为2.8-3.2h。
优选地，步骤S2的具体步骤为：将步骤S1得到的多肽酶解液经180-220nm的陶瓷膜过滤后，然后分别采用＞10kDa、5-10kDa、1-5kDa、＜1kDa的超滤膜进超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干。
优选地，步骤S3的具体步骤为：采用Q-Exactive质谱仪对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，用C18除盐柱进行除盐，经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS 分析上样3μL的分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干，柱流量控制在300nL/min，柱温为 40℃，电喷雾电压2kV，质谱参数设置为：质量/电荷(m/z)＝100-1500，一级MS的操作条件为：分辨率＝70000；AGC target＝3e6，最大IT＝50ms，扫描电荷＝1-6，二级MS/MS的操作条件为：分辨率＝17500，topN＝20，隔离窗口＝2m/z，AGC target＝1e5，最大IT＝60ms， NCE/SteppedNCE＝28kv，动态排除时间＝30s，质谱原始文件由Peaks Studio进行分析，可信度指标-10lgP的值设置为＞23.9，获得178多肽序列，删除重复序列，筛选得到101 条不重复的多肽。
优选地，步骤S4的具体步骤为：运用对接软件UCSF DOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB 处理，多肽分子以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE 的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选，将虚拟筛选的结果按照对接分数从高到低进行排名，筛选排名前20名的多肽，分别命名A1-A20多肽。
本发明还提供上述的以龙须菜为原料的活性多肽在制备辅助降血压药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、以龙须菜作为原料，获得的CE抑制肽的氨基酸序列，制备的以龙须菜为原料的活性多肽具有良好的ACE抑制活性。
2、以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK与ACE口袋残基，通过Asn66、Ala356、Tyr523、Glu411、Val399、Lys118之间形成氢键；与Asp121、Arg522、Glu123和Glu384形成盐桥；同样与Phe391、Hie410、Glu403、Tyr360、Trp357、Trp59、Ala63疏水间作用力，其中连接一个Zn701，氢键、盐桥、疏水间作用是SFYYGK与ACE发生结合的主导作用力。
3、通过本发明方法制备得到的以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK与ACE酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物中。
附图说明
图1是本发明的不同大小分子量的多肽组分的ACE抑制率测定图。
图2是本发明的不同浓度下以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK的ACE抑制率测定图。
图3是本发明的以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK与ACE的分子对接复合模式图。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
本实施例中提供的以龙须菜为原料的活性多肽，其氨基酸序列为：SFYYGK，其分子量为763.3541Da，其对ACE抑制的IC5O值为9.18μmoL/L。
以龙须菜为原料的活性多肽构效关系研究：
方法：使用AutoDock将ACE-C端结构域与以龙须菜为原料的活性多肽进行分子对接，以龙须菜为原料的活性多肽配体进行柔性设置，其他参数默认，Vina程序进行分子对接，分析以龙须菜为原料的活性多肽与ACE的构效关系。
结果：如图3所示，以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK与ACE口袋残基，通过Asn66、Ala356、Tyr523、Glu411、Val399、Lys118之间形成氢键；与Asp121、Arg522、Glu123 和Glu384形成盐桥；同样与Phe391、Hie410、Glu403、Tyr360、Trp357、Trp59、Ala63 疏水间作用力，其中连接一个Zn701，氢键、盐桥、疏水间作用是SFYYGK与ACE发生结合的主导作用力。
本发明还提供以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：取龙须菜进行酶解，得到酶解液，对酶解液进行过滤处理，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。具体的：
取龙须菜进行反复冲洗去除大颗粒杂质，进行沥干水分2h后，取6g龙须菜溶于60mL 超纯水中，在碱性蛋白酶的最适酶解条件下(碱性蛋白酶添加量为超纯水的质量的2％，pH 值为8.4，底物浓度为18％，酶解温度为55℃，酶解时间为3h)进行酶解得到酶解液，将酶解液在100℃灭活10min，冷却后在8000r/min和4℃的条件下离心20min，去除残渣得到澄清的多肽酶解液，对澄清的多肽酶解液进行多肽得率和ACE抑制率分析。
分析结果：多肽酶解液的ACE抑制率为91.12±0.17％，多肽得率为19.54±0.56％。
S2：将步骤S1得到的多肽酶解液经陶瓷膜过滤后，进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干。具体的：
将步骤S1得到的多肽酶解液经200nm的陶瓷膜过滤后，然后分别采用＞10kDa、 5-10kDa、1-5kDa、＜1kDa的超滤膜进超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干，如图1所示。其中＜1kDa(GLP)组分表现出最高ACE抑制活性， IC50值为0.62mg/mL，如表1所示：
Figure BDA0003657898180000051
表1不同分子量多肽组分ACE抑制率的分析
＜1kDa组分(GLP)活性验证：
方法：将GLP-F分为低剂量组(1200mg/kg·bw)、中剂量组(1500mg/kg·bw)、高剂量组(1800mg/kg·bw)经口灌胃原发性高血压大鼠(SHR)；另外设置阳性对照组，给予30mg/kg·bw卡托普利溶液(Cap)，空白组SHR则给予1mL 0.9％NaCl溶液，正常组WKY 也给予1mL 0.9％NaCl溶液。给药前测定SHR血压值及测定给药后每间隔2h的血压值。
结果：雄性一次性给药的SBP变化结果如表2所示，SHR在给药8h后血压值降低最低，且均呈现剂量-效应关系，低剂量组8h后能降低13.46mmHg，中剂量组能降低18.27mmHg，高剂量组能降低25.71mmHg，而Cap组在第2h则能降低32mmHg，且血压在4-24 h后慢慢维持正常水平，说明低、中、高剂量均有一定的降压效果。
Figure BDA0003657898180000061
表2一次性灌胃GLP收缩压变化
注：单因素组内Duncan方差分析，*p＜0.05、**p＜0.01与0h相比
S3：对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，获得多条多肽序列，删除重复序列，筛选得到多条不重复的多肽。具体的：
＜1kDa组分(GLP)序列鉴定：
方法：采用Q-Exactive质谱仪对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，用C18除盐柱进行除盐，经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析上样3μL的分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，质谱参数设置为：质量/电荷(m/z)＝100-1500，一级MS的操作条件为：分辨率＝70000；AGC target＝3e6，最大IT＝50ms，扫描电荷＝1-6，二级MS/MS的操作条件为：分辨率＝17500， topN＝20，隔离窗口＝2m/z，AGC target＝1e5，最大IT＝60ms，NCE/Stepped NCE＝28kv，动态排除时间＝30s，质谱原始文件由Peaks Studio进行分析，可信度指标-10lgP的值设置为＞23.9。
结果：LC-MS/MS测序结果通过PEAKS Studio的protein-peptides(蛋白肽)模块对小于1kDa的龙须菜多肽冻干的序列进行分析。质谱检测多肽原理是将LC-MS检测到的多肽分子量和数据库中分子量非常接近多肽进行比较，并进一步筛选碎片离子的相关性获得准确的氨基酸序列组成。为提高肽序列的准确性和可信度，将-10lgP作为可信度指标，值越大表明匹配结果越好，值越大表明该蛋白包含的可信肽段越多，因此将可信度指标 -10lgP的值设置为＞23.9，最终获得178条序列(如表3所示)，删除重复序列，筛选得到101条不重复的多肽。
Figure BDA0003657898180000071
Figure BDA0003657898180000081
Figure BDA0003657898180000091
Figure BDA0003657898180000101
Figure BDA0003657898180000111
Figure BDA0003657898180000121
Figure BDA0003657898180000131
Figure BDA0003657898180000141
Figure BDA0003657898180000151
表3LC-MS鉴定GLP序列
S4：通过对接软件UCSF DOCK 6.9的小分子虚拟筛选模块，将多条多肽以与ACE分子对接的模式进行虚拟筛选，筛选出对接分数得分从高到低排名前20名的多肽，分别命名A1-A20多肽。具体的：
ACE作为受体，蛋白质ACE的3D结构可从RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org) 下载人血管紧张素转化酶(天然)的晶体结构(PDB ID：1O8A)。运用对接软件UCSF DOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB处理，多肽分子以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选，将虚拟筛选的结果通过分子对接分数(Grid Score)得分进行排名，筛选排名前20名的多肽，分别命名A1-A20多肽。对A1-A20多肽进行固相合成，经RP-HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量，纯度为＞98％。测定20条多肽配制成1mg/mL溶度，并观察多肽溶解性及晶体状态，并稀释成100μg/mL浓度，测定ACE抑制活性。从表4可知，其中YIGNNPAKG(对应A4)、 RLVPVPY(对应A6)、SFYYGK(对应A9)这3个多肽的ACE抑制率均高于80％，说明具有良好的ACE抑制活性。
Figure BDA0003657898180000161
Figure BDA0003657898180000171
表4多肽序列、对接分值及ACE抑制率
S5：选择ACE抑制率＞80％的多肽，得以龙须菜为原料的活性多肽，本实施例选择A9 多肽，得氨基酸序列为SFYYGK的以龙须菜为原料的活性多肽，ACE抑制率为94.21％。
如图2所示，以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK的抑制活性验证：
方法：将以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK配制成(10mg/kg·bw)的浓度进行一次性腹腔注射，同时设置空白组SHR(1mL 0.9％NaCl溶液)和阳性对照组Cap(5mg/kg·bw)，观察0、2、4、6、8、24h的收缩压变化情况，如表5所示：
Figure BDA0003657898180000172
Figure BDA0003657898180000181
表5一次性腹腔注射10mg/kg·bw以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK收缩压变化
结果：对以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK的抑制活性进行测定，结果显示，SFYYGK 的ACE半数抑制率IC50＝9.18±0.42μmoL/L。说明以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK有体外抑制活性。
一次性降压效果在4h变化最明显，以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK在10mg/kg·bw的剂量下降幅18.67mmHg。
本发明还提供上述的以龙须菜为原料的活性多肽在制备辅助降血压药物中的应用。通过本发明方法制备得到的以龙须菜为原料的活性多肽SFYYGK与ACE酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物中。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 以龙须菜为原料的活性多肽、制备方法及应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 龙须菜
<400> 1
Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
1 5

Claims (10)

1.以龙须菜为原料的活性多肽，其特征在于：
其氨基酸序列为：SFYYGK。
2.根据权利要求1所述的以龙须菜为原料的活性多肽，其特征在于：
其分子量为763.3541Da。
3.根据权利要求1所述的以龙须菜为原料的活性多肽，其特征在于：
其对ACE抑制的IC5O值为8.76-9.60μmoL/L。
4.以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取龙须菜进行酶解，得到酶解液，对酶解液进行过滤处理，去除残渣得到澄清的多肽酶解液；
S2：将步骤S1得到的多肽酶解液经陶瓷膜过滤后，进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干；
S3：对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，获得多条多肽序列，删除重复序列，筛选得到多条不重复的多肽；
S4：通过对接软件UCSF DOCK 6.9的小分子虚拟筛选模块，将多条多肽以与ACE分子对接的模式进行虚拟筛选，筛选出对接分数得分排名靠前的多肽，进行固相合成，然后测定ACE抑制活性；
S5：选择ACE抑制率＞80％的多肽，得以龙须菜为原料的活性多肽。
5.根据权利要求4所述的以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：
取龙须菜进行反复冲洗去除大颗粒杂质，进行沥干水分1.8-2.2h后，取龙须菜溶于超纯水中，在碱性蛋白酶的条件下进行酶解得到酶解液，将酶解液在95-100℃灭活8-12min，冷却后在7500-8500r/min和4℃的条件下离心18-22min，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。
6.根据权利要求5所述的以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，酶解条件为：
碱性蛋白酶添加量为超纯水的质量的1.8-2.2％；
pH值为8.2-8.6；
底物浓度为16-20％；
酶解温度为50-60℃；
酶解时间为2.8-3.2h。
7.根据权利要求4所述的以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为：
将步骤S1得到的多肽酶解液经180-220nm的陶瓷膜过滤后，然后分别采用＞10kDa、5-10kDa、1-5kDa、＜1kDa的超滤膜进超滤处理，分别收集不同大小分子量的多肽组分并冻干得龙须菜多肽冻干。
8.根据权利要求4所述的以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为：
采用Q-Exactive质谱仪对分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干进行质谱测定，用C18除盐柱进行除盐，经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析上样3μL的分子量小于1kDa的龙须菜多肽冻干，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV；
质谱参数设置为：质量/电荷(m/z)＝100-1500；
一级MS的操作条件为：分辨率＝70000；AGC target＝3e6，最大IT＝50ms，扫描电荷＝1-6；
二级MS/MS的操作条件为：分辨率＝17500，topN＝20，隔离窗口＝2m/z，AGC target＝1e5，最大IT＝60ms，NCE/Stepped NCE＝28kv，动态排除时间＝30s；
质谱原始文件由Peaks Studio进行分析，可信度指标-10lgP的值设置为＞23.9，获得178多肽序列，删除重复序列，筛选得到101条不重复的多肽。
9.根据权利要求4所述的以龙须菜为原料的活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的具体步骤为：
运用对接软件UCSF DOCK 6.9对ACE分子加氢、加电荷和除水、质子化预处理，保留Zn2+，剔除远离的Cl-，进行能量最小化Amber ff12SB处理，多肽分子以Discovery Studio2019Client绘制小分子作为配体，最后确定ACE的活性口袋，在口袋范围10，盒子边缘6的条件下虚拟筛选，将虚拟筛选的结果按照对接分数从高到低进行排名，筛选排名靠前的多肽。
10.权利要求1-3任一项所述的以龙须菜为原料的活性多肽在制备辅助降血压药物中的应用。
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