CN114774288A - 哈茨木霉菌及其应用和抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了哈茨木霉菌及其应用和抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂。哈茨木霉菌CM‑26，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，保藏号为CGMCC NO.40010。所述微生物菌剂包含所述哈茨木霉菌的发酵液，还可以进一步包含海藻酸钾或/和覆盆子叶子提取液。该哈茨木霉制备的微生物菌剂在促进草莓生长、促进光合以及防控草莓炭疽病方面均表现出显著的功效。

Description

哈茨木霉菌及其应用和抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物 菌剂

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，特别涉及一种哈茨木霉菌及其应用和抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂。

背景技术

草莓是江苏省广泛栽培的重要经济作物，其栽培面积和产量均居全国前列。长期以来，我省草莓生产管理一直存在重产量轻品质的陈旧观念，土壤连作以及高强度、高频率的化肥和农药投入，致使草莓种植棚内病原菌积累，化学农药残留，土壤盐渍化和酸化，肥料利用率降低，造成草莓品质下降，食品安全性难以保障。草莓炭疽病在育苗期和定植初期成为草莓生产中的重要病害之一。草莓炭疽病以分生孢子在发病组织或落地病残体中越冬，并借助雨水、病叶、病果、带菌的操作工具等在田间进行传播，当气温为28℃～32℃，相对湿度在90％以上时，最适合病原菌侵染，属于典型的高温高湿病害，草莓的叶片、托叶、叶柄、匍匐茎、萼片、花瓣和果实都可受害，发病时会造成局部病斑或全株萎蔫枯死。

多年来，化学药剂防治作物病害产生的农药残留等问题，以及由此导致的相关食品安全问题非常突出，每年仅因蔬菜农药残留超标导致的中毒事故就多达10万人次。通过有益微生物的寄生、抗生、营养生态位的竞争效应抑制和消灭病原菌，诱导寄主系统抗性增强植物抗病性，有益菌群在植物根际形成生物屏障，可持续控制植物病虫害。在草莓的病害防治方面，有益生防微生物及其代谢产物已成功应用于草莓病害生物防治中，在有害生物综合治理中发挥了重要作用。木霉菌Trichoderma viride是自然界广泛分布的生防真菌，在国内外应用广泛，目前发现，木霉菌至少对18个属29种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用。微生物菌剂具有广谱防病效果和多重抗病机制，而且不易产生抗药性，对环境安全友好，是减少或替代化学农药的重要资源，被越来越多地应用到农作物病害防控中。

生物刺激素是指能促进植物生长和提高应激响应的物质，海藻酸是通过物理、化学和生物等方法将生长在海洋中的大型藻类提取出具有生理活性和富含多种营养的天然物质，可作为土壤调节剂、生物肥料和生物刺激素作用于植物和土壤。生物刺激素的出现，为减少农药残留、提高农产品安全提供了新的解决方法与思路，并广泛应用于农作物生产。

覆盆子，又称树莓，蔷薇科悬钩子属，木本植物，属落叶灌木。具有抗氧化性、抗菌性、抑制癌症的发生等多种作用，天然产物植物杀菌剂来自于自然，具有很好的环境兼容性。天然产物植物杀菌剂作为农用杀菌剂在产业化研究和应用方面具有广阔的前景。覆盆子具有多重生物活性，既具有杀虫活性，也具有抑制病原菌活性。它的这些特点有巨大的开发潜力与发展前景。

中国农业科学院植物保护研究所申请了一株防治苜蓿炭疽病的木霉菌及其应用(CN105368719A)，能够有效地防治苜蓿炭疽病的发生。金禾佳农(北京)生物技术有限公司广东中迅农科股份有限公司申请了一种复合微生物制剂、制备方法及应用(CN113122477A)，该发明公开了一种复合微生物制剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JNKC001菌液、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌液和助剂，所制成的微生物复合制剂中哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌落总数比为(1～3):(100～300)；该复合微生物制剂可有效提高柑橘叶片中叶绿素的含量；有效防控柑橘炭疽病发生；提高柑橘中可溶性固形物的含量，提高柑橘的Vc含量；并且对柑橘有良好的促生、促产效果。贵州省生物技术研究所(贵州省生物技术重点实验室、贵州省马铃薯研究所、贵州省食品加工研究所)申请了一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法(CN112111413A)，该发明对一株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌进行液体发酵培养基设计，提高木霉菌发酵液中抑制茶炭疽病菌生长的物质含量，在一定程度上节约成本，提高发酵效率。

以上专利虽然公开了防治苜蓿、柑橘和茶树炭疽病的木霉菌、微生物复合制剂和木霉菌液体发酵培养基，但与本技术都有很大的区别性，本技术是针对抗草莓炭疽病并促进草莓生长发育的微生物菌剂的研制。

发明内容

本发明提供了一种哈茨木霉菌CM-26及用途。

一种哈茨木霉菌CM-26，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，保藏号为CGMCC NO.40010。该菌株CM-26，菌落在PDA平板上25℃培养4天扩展8cm，深灰绿色；菌丝具隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm；分生孢子近球形、卵形，单个近无色，聚集时呈淡绿色，壁光滑，3-4×2.5-3μm。

该菌株已经保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.40010，保藏日2021年12月17日。

本发明还提供了一种哈茨木霉菌CM-26的发酵液，制备方法包括：

向活化培养基中接种权利要求1所述的哈茨木霉菌CM-26，30～35℃培养24～28h，得到哈茨木霉菌CM-26活化菌种；将体积比为2.0-5.0％的活化菌种接种到发酵培养基中，30～35℃培养48～60h，得到哈茨木霉菌CM-26发酵液。其中，所述活化培养基的组成为：蛋白胨1.0-2.6g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、氯化钠0.2-0.8g/L、pH值7.0-7.2；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖2.5-3.5g/L、蛋白胨0.5-1.5g/L、酵母膏0.5-1.0g/L、磷酸二氢钾0.35-0.50g/L和碳酸钙0.25-0.60g/L、pH值7.0-7.2。

本发明还提供了一种微生物菌剂，包括所述的哈茨木霉菌CM-26的发酵液。

所述的微生物菌剂，还包括海藻酸钾粉。

所述海藻酸钾粉与发酵液的质量比为10-15:30-50，优选为10:40。

所述的微生物菌剂还包括覆盆子叶子提取液。

所述覆盆子叶子提取液与所述海藻酸钾与所述发酵液质量比为40-60:10-15:30-50，优选为50:10:40。

所述覆盆子叶子提取液的制备方法包括：将覆盆子叶子粉碎，过60目筛，用5～10倍量去离子水冷浸过夜，70～80℃浸提4～6h，同样方法提取2-4次，合并提取液减压浓缩，除菌，得到覆盆子叶子提取液。

本发明还提供了所述的哈茨木霉菌CM-26、发酵液或微生物菌剂在预防草莓炭疽病或/和促进草莓生长中的应用。

综上，与现有产品相比，本发明具有的优点是：

本发明可以有效防治草莓炭疽病；该微生物菌剂中含有能够高效拮抗草莓炭疽病菌的哈茨木霉菌CM-26，真菌寄生是木霉主要拮抗机制之一。在包括趋向生长、识别、接触、缠绕和穿透等步骤的真菌寄生过程中，木霉分泌产生的一系列细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要作用，所以哈茨木霉菌CM-26可以有效的对草莓炭疽病进行生物防治。

本发明菌剂可以提高草莓的生长、促进光合、提高土壤供氮水平，木霉对植物生长具有明显的促进作用，其代谢过程中含有多种植物生长激素，如：细胞分裂素、生长素、赤霉素、脱落酸等，它们可以诱导植株的某些代谢过程，而且木霉菌株能够在根际占据有利位点而成功定殖，即能够随着根系的生长进行延伸、拓展，这是促进植物生长的重要前提。

本发明安全无药物残留：本发明微生物菌剂是由哈茨木霉菌CM-26、海藻酸钾、覆盆子叶子提取液组成，无任何有害成分，在草莓生产中避免使用农药所带来的农药残留和食品安全等问题，符合草莓种植产业绿色可持续发展的要求。

附图说明

图1哈茨木霉菌CM-26的形态；

图2不同处理灌根对草莓叶片1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的影响；

图3不同处理灌根对草莓叶片1,5-二磷酸核酮糖加氧酶的影响；

图4不同处理灌根对草莓根际土壤脲酶的影响；

图5不同处理灌根对草莓炭疽病防效的影响。

具体实施方式

实施例1：菌株的分离和鉴定

分离过程：草莓生长季节从江苏句容采集健康草莓的土壤，无菌塑料袋将其分装带回实验室，4℃冰箱保存备用。称取健康草莓根际土壤10g，置于250mL锥形瓶中，随后加入100mL无菌水，震荡得到根际土壤悬液；分别吸取100μL10^-4-10^-6不同稀释度的土壤悬浮液，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏I号培养基平板上，每个稀释度做2-3个平行，而后置于28℃恒温培养箱中培养3-5d。待菌落长出，挑取单一的菌落移入相应的培养基进行纯化，并进行菌落形态描述，挑取单菌落，制作切片，镜检，拍照，最后将纯化后的单一菌株转接到PDA试管斜面上，置于4℃冰箱中保存。采用对峙培养法确定挑选的菌落对草莓炭疽病菌菌丝生长的平板抑制作用，将与草莓炭疽病菌菌丝接触后能很好抑制炭疽病菌丝生长与繁殖的菌株进行鉴定。

形态特征：筛选的一株菌株，命名为菌株CM-26，菌落在PDA平板上25℃培养4天扩展8cm，深灰绿色(图1A)。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm(图1B)。分生孢子近球形、卵形，单个近无色，聚集时呈淡绿色，壁光滑，3-4×2.5-3μm(图1C)。

扩增该菌株CM-26的rRNA基因的ITS1-5.8S-ITS2序列，如SEQ ID NO：1所示。

依据CM-26菌株的形态特征和rRNA基因的ITS1-5.8S-ITS2序列鉴定为CM-26菌株为哈茨木霉。

实施例2：微生物发酵液的制备

(1)种子液的制备：向活化培养基中接种哈茨木霉菌CM-26，35℃培养28h，得到哈茨木霉菌CM-26活化菌种；其中，活化培养基的组成为：蛋白胨1.0g/L、酵母粉1.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH值7.2。

(2)发酵液的制备：将体积比为5.0％的活化菌种接种到发酵培养基中，35℃培养60h，得到哈茨木霉菌CM-26发酵液；其中，发酵培养基的组成为：葡萄糖3.5g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L和碳酸钙0.6g/L，pH值7.2。

发酵液的技术指标为：有效活菌数≥25亿/mL。

实施例3：含海藻酸钾微生物菌剂

将海藻酸钾粉碎后过60目筛，得到海藻酸钾粉，然后与上述实施例2制备的含哈茨木霉菌CM-26的微生物发酵液按照10:40的质量比混合均匀后瓶装，于25℃保存，得到含海藻酸钾微生物菌剂，CM-26哈茨木霉有效活菌数≥20亿/mL、pH值5.0～8.0。

实施例4：抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂

抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂的制备步骤：将覆盆子叶子粉碎，过60目筛，用5～10倍量灭菌去离子水冷浸过夜，70～80℃浸提4～6h，同样方法提取3次，合并3次提取液，用时经滤膜除菌浓缩，得到覆盆子叶子提取液。然后与将覆盆子叶子提取液、海藻酸钾粉、上述实施例2制备的含哈茨木霉菌CM-26的微生物发酵液以50:10:40的质量比混合均匀，得到抗草莓炭疽病的微生物菌剂，CM-26哈茨木霉有效活菌数≥10亿/mL、pH值5.0～8.0。

实施例5性能测试：微生物菌剂用于抗炭疽病促进草莓生长发育

试验位于江苏省镇江市句容市白兔镇樊忠家庭农场的草莓大棚，土壤pH5.40、有机质20.99g/kg、水解性氮128.72mg/kg、有效磷40.87mg/kg、速效钾223.56mg/kg。供试草莓品种：红颊，于2020年9月13日定植。在草莓定植后5d(2020年9月18日)进行第1次灌根处理，2020年9月24日进行第2次灌根处理，9月30日进行第3次灌根处理。处理设置：处理1：实施例2的微生物菌剂250倍液；处理2：实施例3的微生物菌剂250倍液；处理3：实施例4的微生物菌剂500倍液；处理4：实施例4的微生物菌剂250倍液；处理5：10％苯醚甲环唑水分散粒剂500倍液；处理6：CK、清水对照，共设6个处理，每处理3个重复，随机区组排列。

测定项目及方法

草莓生长指标测定定植后50d，测量草莓植株株高、根茎粗、倒4叶的叶柄长、叶长、叶宽等生长指标，统计和评估各处理对草莓植株生长的影响。

草莓光合指标及相关酶活测定定植后50d(上午9:00～11:30)，用LI-6400便携式红外气体分析仪(美国基因公司)测定草莓倒4叶的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率。每小区采集草莓植株倒4叶后液氮处理后-80℃保存，待测光合相关酶活。采用1,5二磷酸核酮糖羧化酶的ELISA试剂盒(购自上海羽朵生物科技有限公司)对草莓的倒4叶的光合相关酶活性进行测定。1,5二磷酸核酮糖羧化酶：在一定条件下(25℃)，每小时，1g样本中使3-PGA转化为1μmol NADP的量表示一个活力单位U。

草莓根际土壤酶活性的测定方法定植后50d，使用土壤脲酶的ELISA试剂盒(购自上海羽朵生物科技有限公司)对草莓的根际土壤脲酶活性进行测定。土壤脲酶酶活单位：在一定条件下，每24小时1g土壤中消耗1mg NH3-N的量为1个酶活力单位(U)。

草莓炭疽病防效测定方法第三次灌根处理后28d，调查各处理死苗株数。

死苗率(％)＝(死苗株数/调查株数)×100％

防效(％)＝(对照死苗率-处理死苗率)/对照死苗率×100％

数据统计与分析

试验数据采用Excel和DPS软件进行统计与分析。统计采用邓肯法多重比较，不同小写字母表示各处理间差异显著(P＜0.05)。

(1)各处理灌根对草莓形态生长的影响

与处理6(清水灌根)和处理5(苯醚甲环唑灌根)相比，处理2-4的株高均显著增加，处理4的根茎粗较处理6显著增加，处理2-4的叶柄长较处理6与处理5均显著增加，处理1-4的叶面积较处理6与处理5均显著增加，叶面积是光合产量的重要影响因素(表1)。

表1不同处理灌根对草莓形态生长的影响

综合而言，处理4，在株高、根茎粗、倒4叶叶柄长和叶面积各个生长指标中均表现出显著的促进作用。

(2)各处理灌根对草莓光合的影响

相对于处理6(清水灌根)，处理3和处理4的净光合速率和蒸腾速率均显著高于对照，其中处理3和4的叶片净光合速率分别增加了15.98％和25.74％；蒸腾速率则分别增加21.85％、30.13％；气孔导度则分别增加19.22％、19.66％。综合而言，处理4的草莓植株表现出最强的光合能力且增幅远超其他处理。

表2不同处理灌根对草莓光合参数的影响

微生物菌剂的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性和加氧酶活性均高于对照，这表明微生物菌剂可以显著提高草莓的碳同化速率和光呼吸速率(图2和图3)。处理1-4，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性相比对照增幅范围为30.12-46.97％，处理4的羧化酶活性最高(图2)。处理1-4，1,5-二磷酸核酮糖加氧酶活性相比对照增幅范围为13.73-37.45％，处理4的加氧酶活性最高(图3)。酶活与光合参数趋势一致，处理1-4对植物光合的促进作用，其中处理4的促进作用最强。

(3)各处理灌根对草莓根际土壤脲酶活性的影响

土壤脲酶活性高低反应了土壤氮代谢旺盛程度、土壤氮转化和土壤无机氮供应能力。

处理1-4的根际土壤脲酶活性均显著高于对照；处理1-4的根际土壤脲酶活性显著高于对照12.94-37.00％，其中，处理4的土壤脲酶活性显著高于其他处理(图4)。

(4)各处理灌根对草莓炭疽病防效的影响

处理3和处理4对草莓炭疽病的预防效果相对最好，分别为78.26％和89.13％，显著高于其他药剂处理，比对照处理防效提高16.13-32.25％(图5)。由上述结果可以看出，本发明筛选出的微生物菌剂是由哈茨木霉菌CM-26、海藻酸钾、覆盆子叶子提取液组成，能够促进草莓植株生长、增强光合作用、提高土壤供氮水平并有效防控草莓炭疽病，按照250倍液的用量，该微生物菌剂的防治效果最佳。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所

<120> 哈茨木霉菌及其应用和抗炭疽病促进草莓生长发育的微生物菌剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 612

<212> DNA

<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)

<400> 1

ggacctggca tctactgatc gaggtcacat ttcagaagtt gggtgtttaa cggctgtgga 60

cgcgccgcgc tcccgatgcg agtgtgcaaa ctactgcgca ggagaggctg cggcgagacc 120

gccactgtat ttcggagacg gccaccgcca aggcagggcc gatccccaac gccgaccccc 180

cggaggggtt cgagggttga aatgacgctc ggacaggcat gcccgccaga atactggcgg 240

gcgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc 300

gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg aaagttttga 360

ttcattttcg aaacgcctac gagaggcgcc gagaaggctc agattataaa aaaacccgcg 420

agggggtata caataagagt tttggttggt cctccggcgg gcgccttggt ccggggctgc 480

gacgcacccg gggcagagat cccgccgagg caacagtttg gtaacgttca cattgggttt 540

gggagttgta aactcggtaa tgatccctcc gctggttcac caacggagac cttgttacga 600

ttttttactt cc 612

Claims (10)

1.一种哈茨木霉菌CM-26，其特征在于，分类命名为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，保藏号为CGMCC NO.40010。

2.一种哈茨木霉菌CM-26的发酵液，其特征在于，制备方法包括：

向活化培养基中接种权利要求1所述的哈茨木霉菌CM-26，30～35℃培养24～28h，得到哈茨木霉菌CM-26活化菌种；将体积比为2.0-5.0％的活化菌种接种到发酵培养基中，30～35℃培养48～60h，得到哈茨木霉菌CM-26发酵液。

3.根据权利要求2所述的哈茨木霉菌CM-26的发酵液，其特征在于，所述活化培养基的组成为：蛋白胨1.0-2.6g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、氯化钠0.2-0.8g/L，pH值7.0-7.2；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖2.5-3.5g/L、蛋白胨0.5-1.5g/L、酵母膏0.5-1.0g/L、磷酸二氢钾0.35-0.50g/L和碳酸钙0.25-0.60g/L，pH值7.0-7.2。

4.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求3所述的哈茨木霉菌CM-26的发酵液。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，还包括海藻酸钾粉。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述海藻酸钾粉与发酵液的质量比为10-15:30-50。

7.根据权利要求4或5所述的微生物菌剂，其特征在于，还包括覆盆子叶子提取液。

8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，覆盆子叶子提取液与所述海藻酸钾与所述发酵液质量比为40-60:10-15:30-50。

9.根据权利要求7或8所述的微生物菌剂，其特征在于，所述覆盆子叶子提取物的制备方法包括：将覆盆子叶子粉碎，过60目筛，用5～10倍量去离子水冷浸过夜，70～80℃浸提4～6h，同样方法提取2-4次，合并提取液减压浓缩，除菌，得到覆盆子叶子提取液。

10.根据权利要求1所述的哈茨木霉菌CM-26、权利要求2-3任一项所述的发酵液或权利要求4-9任一项所述的微生物菌剂在预防草莓炭疽病或/和促进草莓生长中的应用。

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