CN114761577A

CN114761577A - 新型细胞表型筛选方法

Info

Publication number: CN114761577A
Application number: CN202180006906.2A
Authority: CN
Inventors: 坪内朝子; 太田祯生; 河崎史子
Original assignee: New Xite Corp; University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: New Xite Corp; University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2022-07-15
Also published as: JP7107535B2; US11643649B2; EP4089181A1; JP2022130706A; US20230348893A1; JPWO2021141138A1; EP4089181A4; WO2021141138A1; JP7493725B2; US20230058670A1

Abstract

本申请提供了一种用于筛选细胞的方法，所述方法包括：制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有第一条形码核酸并且用测试靶标处理，所述第一条形码核酸与所述测试靶标相关；使用成像细胞分选仪基于细胞表型来选择所述多个细胞的步骤；以及，使用所述第一条形码核酸作为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。

Description

新型细胞表型筛选方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求基于2020年1月10日递交的美国专利申请公开号62/959,420的优先权，并且该在先专利申请的全部公开内容通过引用作为本说明书公开的一部分。

技术领域

本申请涉及新型细胞表型筛选。

背景技术

细胞表型(表型筛选)作为利用细胞来筛选各种药物的筛选方法而广为人知。表型筛选是利用细胞和器官的表型，例如细胞增殖率、细胞死亡以及以特定蛋白或细胞结构的定位表示的细胞图像信息作为指标来寻找改变细胞和器官的表型的药物(例如，低分子量化合物、肽等)的方法。细胞表型筛选的重要目标之一是检查与输入(测试物质、药物刺激等)有关的以下信息：(i)表现出什么样的细胞表型变化(图像反应)，(ii)表现出的基因表达反应，以及(iii)作为它们基础的作用机制。

然而，在利用相关技术的孔的通用型大规模表型筛选测定系统中，需要将每种药物施用于在每个孔中培养的细胞，检查图像反应，然后取出在其中产生被认为是靶标表型的反应的对象，并对个体受试者进行遗传分析以找出基因表达反应和作用机制(例如，非专利文献1等)。因此，除了速度慢、成本高之外，难以快速地对个体细胞的基因表达反应、作用机制等进行多方面分析。

[引用列表]

[非专利文献]

[非专利文献1]

自然方法(Nature Methods)，16卷，619-626页，(2019)

发明内容

本申请提供了用于快速检测与测试靶标(诸如药物)共存的细胞的图像反应和基因表达反应的方法。

根据本申请的实施方式，提供了一种用于筛选测试靶标的方法，该方法包括：制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有与测试靶标相关联的第一条形码核酸并且用所述测试靶标处理；使用成像细胞分选仪基于细胞表型来分选所述多个细胞的步骤；以及，使用所述第一条形码核酸作为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。

根据本申请，能够快速检测与测试靶标共存的细胞的图像反应和基因表达反应。根据本申请，将每个输入信息(例如测试对象对细胞进行的处理)与图像反应和基因表达反应在汇集状态(pooled state)下相关联，并且能够在进行高速表型筛选时有利地使用。有利地，能够使用本申请来选择或寻找引起细胞中期望的表型变化的测试靶标。

附图说明

图1为本申请的筛选方法的实施方式的示意图。

图2为示出了在本申请的筛选方法中读取每个细胞的核酸信息的步骤的实施方式的概念图。(1)示出了第二条形码核酸与第一条形码核酸的杂交，以及(2)示出了第二条形码核酸与细胞基因组或对应于其衍生物的基因组相关核酸的杂交。

图3为在本申请的第一实施方式中，成像细胞分选仪的实施方式的示意图。

图4为在加入红色荧光染料Cy5缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)并在每种溶液中孵育30分钟后，细胞的荧光显微照片。

图5为细胞样品的荧光显微照片。制备标记有绿色荧光染料FAM缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)的细胞和标记有红色荧光染料Cy5缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)的细胞，并将它们彼此混合。照片在孵育1小时后拍摄。

图6为在附着有红色荧光染料Cy5缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)的细胞中随时间观察到寡核苷酸与细胞的附着的照片。

图7为在用福尔马林固定或DTSSP固定后，用针对NFκB蛋白的一抗和缀合至荧光染料(Alexa Fluor 488)的二抗进行免疫抗体染色的细胞中观察染色程度和NFκB蛋白的分布变化的照片。

图8为示出了通过流式细胞术基于源自可固定红外(Fixable Far Red)的真值标签信号(ground truth label signal)来测量和量化细胞组的纯度的图示。横轴是源自于NFκB蛋白的免疫染色的荧光强度，纵轴是源自于可固定红外的荧光强度，其用于标示正确回应。

图9为示出了在1mg或10mg DTSSP的固定条件下，用可固定红外标签来标签化的每个细胞组的预测结果与真实数据比较的SVM(支持向量机)得分(直方图)和结果的矩阵和表格。SVM是一种机器学习模型。该机器学习通过从图像信号数据获得的NFκB蛋白的核定位的存在或不存在(核定位为阳性，无核定位为阴性)来进行。

图10为示出了实施例5和6中，用于遗传分析技术的部分试剂的示意图。在该图中，Multi-seq条形码、10×条形码和UMI分别对应于第一条形码序列、第二通用条形码区域和第二独特条形码区域序列。第二条形码核酸与第一条形码核酸杂交，或者第二条形码核酸与细胞基因组或对应于其衍生物的基因组相关核酸杂交。

图11为实施例5和6中在PCR反应后采用的序列文库的示意图。

图12A为表示在混合样品(其中存在LPS药物的细胞与其中不存在药物的细胞的比例为9:1)中每个细胞的第二通用条形码区域序列，以及从具有上述序列的独特读长中检测到的每个第一条形码序列的读长的数量的表格(表1-1)。

图12B为表示在混合样品(其中存在LPS药物的细胞与其中不存在药物的细胞的比例为9:1)中每个细胞的第二通用条形码区域序列，以及从具有上述序列的独特读长中检测到的每个第一条形码序列的读长的数量的另一表格(表1-2)。

图13为这样的图表(图表1)：对于第二独特条形码区域与互补链DNA侧数据匹配的第一条形码序列侧数据的每个第二独特条形码区域序列，表示从具有上述特征(混合样品(其中存在LPS药物的细胞与其中不存在药物的细胞的比例为9:1)(第一条形码核酸序列A：LPS药物不存在，第一条形码核酸序列B：LPS药物存在))的独特读长中检测到的第一条形码核酸序列(两种类型)的读长的数量分布。

图14A为表示其中不存在LPS药物的每个阴性对照细胞的第二通用条形码区域序列和从具有上述的独特读长中检测到的每个第一条形码区域序列的读长的数量的表格(表2-1)。

图14B为表示其中不存在LPS药物的每个阴性对照细胞的第二通用条形码区域序列和从具有上述的独特读长中检测到的每个第一条形码区域序列的读长的数量的表格(表2-2)。

图15为这样的图示(图表2)：对于第二独特条形码区域与互补链DNA侧数据匹配的第一条形码序列侧数据的每个第二独特条形码区域序列，表示从具有上述特征(其中不存在药物的阴性对照细胞)(第一条形码核酸序列A：LPS药物不存在，第一条形码核酸序列B：LPS药物存在))的独特读长中检测到的第一条形码核酸序列(两种类型)的计数的分布。

图16为示出了产生的第一子隔室的实例的显微照片。(这里，在图中的实施例中，第一隔室在没有加入测试物质和第一条形码核酸的情况下产生)。

图17为示出了在微流体装置中通过一对一液滴融合产生的均匀液滴(隔室)(直径约110μm)的状态的显微照片。

图18为实施例8的细胞表型筛选方法的示意图，其中利用96孔微型版来寻找引起期待表型变化的测试靶标。

图19为示出了实施例8中使用的96种测试靶标(24种测试物质×4种浓度)和测试物质的功能(已知作用机理)的表。

图20A为示出了实施例8中使用的第一条形码核酸(条形码#：Ind_8bp_0015-Ind_8bp_036)的序列的表。

图20B为示出了实施例8中使用的第一条形码核酸(条形码#：Ind_8bp_037-Ind_8bp_074)的序列的表。

图20C为示出了实施例8中使用的第一条形码核酸(条形码#：Ind_8bp_075-Ind_8bp_262)的序列的表。

图21为示出了实施例8中分选的细胞的第一条形码核酸序列的富集水平的图示。

图22为利用现有的图像流式细胞仪来拍摄细胞的照片图像并计算核定位分数来确认实施例8中通过成像细胞分选仪分选和回收的细胞是否确实表现出表型的照片。

具体实施方式

根据本申请的实施方式，筛选细胞的方法包括：制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有与测试靶标相关联的第一条形码核酸并且用所述测试靶标处理；使用成像细胞分选仪基于细胞表型来分选所述多个细胞的步骤；以及，使用所述第一条形码核酸作为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。

定义

在本说明书中，“基因组相关信息”表示与细胞基因组或其衍生物相关的信息，是指与伴随基因表达变化的核酸和蛋白质的变化相关的信息。另外，在本文中，“基因组相关核酸”是与基因组相关信息相关的核酸，并且其合适的示例为细胞的基因组DNA、源自于细胞基因组的RNA(诸如mRNA)或它们的cDNA。另外，“基因组相关核酸”的其他示例包括：与分子(诸如细胞中表达的蛋白)特异性相互作用(例如结合)的核酸探针。另外，在核酸为基因组DNA的情况下，DNA可以是用限制性内切酶等切割的片段，或者，可以将DNA标记(tag)引入DNA片段中。

在本说明书中，“条形码区域”是碱基序列的区域，包括T(胸腺嘧啶)或U(尿嘧啶)、A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)，并且不限于以下描述的通用条形码区域或独特条形码区域的序列。此外，条形码核酸是包括条形码区域的核酸，其能够识别细胞的基因组相关信息和源自于与细胞共存的测试靶标或珠子的成像信息。

条码区域包括通用条形码区域和独特条形码区域这两类。

条码区域的长度没有限制；然而，该序列优选为8至40个碱基长。例如，在条形码区域为12个碱基长的情况下，能够一次性对4¹²种不同的条形码序列进行核酸扩增。

“通用条形码区域”是用于识别的相同对象的共有条形码区域。在识别对象为测试靶标的情况下，其示例包括对于每种测试对象不同的条形码区域，即，对于一个测试靶标而言是共有的条形码区域。使用通用条形码区域进行标记能够识别每个测试靶标。此外，在识别对象是测试靶标的组合的情况下，诸如测试靶标的组合被包括在一个隔室的情况下，用条形码核酸进行标记，其中该条形码核酸具有对于每个组合都不同的条形码区域，即对于测试靶标的特定组合而言共有的条形码区域。使用这样的通用条形码区域进行标记能够识别测试靶标的组合。在识别对象是单个细胞的基因组相关信息的情况下，其示例包括对于每个细胞不同的条形码区域，即对于单个细胞而言是共有的条形码区域。使用通用条形码区域进行标记能够识别源自于同一细胞的基因组相关信息。

“独特条形码区域”是通过用不同的条形码区域标记每个条形码核酸来单独区分每个条形码核酸的条形码区域。例如，在独特条形码区域中的标记能够识别与每个条形码核酸连接的珠子、包括每个条形码核酸的生物体，以及与每个条形码核酸杂交的基因组相关核酸。

在本说明书中，“杂交”意味着条形码核酸的杂交区域与细胞基因组或其衍生物或其他条形码核酸形成双链复合物。在本文中，用于形成这种双链复合物的示例性条件的示例包括：在37℃、40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS下杂交以及在55℃至60℃下于在0.5X-1X SSC中洗涤。当形成上文所述双链复合物时的其他方面的示例包括在严格条件下进行复合物的形成。在本文中，严格条件是指形成所谓的特异性复合物而不是形成非特异性复合物的条件，包括上文所述的示例性条件。这样的严格条件是本领域技术人员已知的并且能够参照，例如Molecular Cloning(Third Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)和分子生物学中的当前方案(Frederick M.Ausubel等人编，1987)来设定。具有与条形码核酸的杂交区域杂交的序列的示例包括该杂交区域的互补序列。

相应地，“杂交区域”优选地是与对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸或另一条形码核酸结合(杂交)的区域。该杂交区域优选与条形码区域一起存在于条形码核酸中。

以下，将根据图1对本申请的筛选方法的一个实施方式进行说明。

在本申请的方法中，制备用测试靶标处理并标记有第一条形码核酸的细胞。该制备步骤可包括，例如以下步骤(图1中的步骤1-1至步骤1-3)。

步骤1：制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有与测试靶标相关联的第一条形码核酸并且用所述测试靶标处理。

步骤1-1：生成子隔室(液滴)(形成液滴的步骤，该液滴包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸。

根据本申请的实施方式，如图1中步骤1-1的上部所示，使包括测试靶标和第一条形码核酸的液态介质与有机溶剂混合以形成包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的子隔室(液滴)。具体地，例如，可以将水凝胶珠加入到包括测试靶标和第一条形码核酸的液态介质中以产生包括测试靶标和第一条形码核酸的第一子隔室。在更具体的方法中，通过使预先制备的水凝胶颗粒与测试靶标和对应于该测试靶标的第一条形码核酸混合，并且向其中加入有机溶剂和表面活性剂来在每个容器(例如，每个孔)中进行涡旋，能够产生大量包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的均匀液滴。此外，通过类似的方法，也可以按照Anal.Chem.,2018,90,16,9813-9820中描述的方法进行上文所述的步骤。例如，可以使用由诸如丙烯酰胺、琼脂糖、胶原、藻酸盐/酯，或聚乙二醇等材料制成的珠子作为水凝胶颗粒用作该步骤的模板。

本申请的测试靶标没有特别的限制，只要它们是待研究细胞中所需反应的测试靶标即可，其示例包括低分子量有机化合物、肽化合物、具有核酸或其衍生物作为基本框架的核酸化合物、酶、抗体、多肽(诸如抗体片段)、蛋白、细胞、病毒和测试物质(诸如药物)。

待研究的细胞的类型没有特别的限制，只要不妨碍本申请的效果，并且可以根据目的来选择细胞，例如可以使用人源性细胞，诸如源自患者血细胞的细胞，或者从干细胞诱导分化成靶细胞的细胞，诸如iPS细胞(诱导多能干细胞)；以及源自哺乳动物的细胞如，诸如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。

步骤1-2：通过使子隔室融合生成隔室(使包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的子隔室(液滴)和包括细胞的子隔室(液滴)融合的步骤)

此外，根据本申请的实施方式，如步骤1-2所示，如下进行该步骤：将包括测试靶标和第一条形码核酸的液滴与包括细胞的液滴混合以使测试靶标、第一条形码核酸和细胞相关联。具体地，测试靶标、第一条形码核酸和细胞的相关联可通过使包括测试靶标和第一条形码核酸的第一子隔室与包括细胞的第二子隔室融合并产生包括测试靶标、第一条形码核酸和细胞的隔室来进行。在更具体的方法中，在微流体装置中，通过从一个通道倾倒包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的一组液滴且从另一个通道倾倒包括细胞的一组液滴，并且在微流体装置中进行连续液滴-液滴融合，能够在有机溶剂相中产生大量包括细胞、测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的液滴。此时，如下文所述的实施例中，通过在微流体装置中形成包括细胞的液滴，并且使该液滴与包括测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的液滴融合，也能够产生包括细胞、测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码核酸的液滴。在上文所述的有机溶剂相中的液滴中，通过在细胞受到测试靶标影响的同时，使对应于测试靶标的条形码核酸附着于细胞表面，能够用第一条形码核酸来标记细胞。能够根据Anal.Chem.2018,90,2,1273-1279中描述的方法进行上述步骤。

隔室或子隔室是隔室单元，其使得能够区分隔室或子隔室中成分的每个组合与其他隔室。

本申请的隔室中所包括的测试对象的种类和数量没有特别的限制，只要不妨碍本申请的效果即可，但从简化或明确细胞反应的观点出发，每个隔室一种类型是优选的。然而，例如，在组合多种测试靶标以检查细胞对测试靶标的反应的情况下，每个隔室的测试靶标类型的数量可以是多个。另外，也可以将测试靶标的浓度分别设定为不同的浓度，从而能够评价在不同浓度的测试靶标下的细胞反应。这些方面也涵盖在本申请中。

本申请的隔室没有特别的限制，只要能够保持隔室与其他隔室能够区分即可，并且其示例包括通过上文所述的步骤产生的水性液滴(例如，油中的水性液滴)。其进一步的示例包括水凝胶的凝胶颗粒、具有多个重叠的未混合界面的水/油结构(诸如乳液)、具有单层或双层的囊泡(诸如胶束或微脂囊)等。此时，对于液滴所包括的水性相，例如可以使用水性溶液，诸如细胞培养基、生理盐水或缓冲液。另外，对于有机溶剂相，例如可以使用油，诸如EvaGreen的液滴发生器油(Bio-Rad Laboratories,Inc.制造)。

从区别于其他隔室的观点来看，本申请的隔室优选在其外围具有物理屏障功能。用于产生具有这种屏障功能的隔室的合适方法的示例包括相分离法等。在相分离法中，例如，隔室能够通过将细胞和珠子与水性基质混合以获得水性液滴，然后将该水性液滴悬浮在疏水性溶剂中来产生。此外，隔室还能够通过在微流体装置中的分支部分或合并部分将液滴混合在一起来产生。

此外，本申请的隔室还能够通过将隔室容纳在容器中，诸如容纳在微孔、孔或管中来形成。在这种情况下，测试靶标和对应于测试靶标的第一条形码与细胞的相关联(即，接触)通过在孔中共存等来发生。

此外，根据本申请的实施方式，能够在包括测试靶标、第一条形码核酸和细胞的隔室中用第一条形码核酸标记细胞。理想的是，第一条形码核酸具有包括能够将第一条形码核酸连接到细胞表面的锚定子(例如，设置有寡核苷酸区域的已知锚定子)和脂质区域(胆固醇、壳聚糖-二醇-脂质等)的配置。具体地，其优选示例包括锚定子DNA等，其用在下文描述的实施例中。此外，第一条形码核酸也可以以包围在颗粒中或与颗粒结合等形式使用。在这种情况下，第一条形码核酸被设计为从包围颗粒等中适当地释放。

以下，将详细描述第一条形码核酸的配置。

此外，根据本申请的一个实施方式，能够在隔室中通过测试靶标对细胞进行处理。

根据需要，可以在隔室中于细胞和测试靶标共存的状态下进行培养。这种培养的示例包括：使该隔室在期望的培养温度下保持期望的培养时间。在保持隔室时，可以移动该隔室并将其保持在能够保持多个隔室的储存器中。上述步骤能够使用已知方法来进行。例如，上述步骤能够根据J.J.Agresti et al,Proc Natl Acad Sci U S A.,107(9),4004-9(2010),A.Abbaspourrad et al,Sci Rep.,5,12756(2015),B.L.Wang et al.,NatBiotechnol.32(5),473-8(2014)中所述的方法来进行。

这里，作为培养时间和培养温度，可将培养时间和培养温度设定为能够评价细胞对于测试靶标的反应的水平。培养时间的示例包括0小时或更长且14天或更短，并且优选2小时或更长且5天或更短。培养温度的示例包括4℃或更高且40℃或更低，优选约37℃的温度。

除了寻找如上文所述的引起细胞中的表型改变的测试靶标之外，本申请的寻找测试靶标的一个实施方式包括寻找在细胞中发生所需表型变化的靶标位点。靶标位点的寻找包括，例如，寻找基因上发生所需表型变化的靶标位置(靶标)。通过用其中确定了信息的第一条形码核酸标记细胞，其中该信息预先确定了待应用于细胞的过程(例如，确定基因编辑发生位置的信息、关于向导RNA的核酸序列的信息或用于基因编辑等)，能够将确定对细胞进行处理的信息添加到经成像细胞分选仪分类并获取的细胞中，因此利用成像细胞分选仪能够有效地寻找发生所需表型变化的基因上的靶标位置(靶标)。

步骤1-3：破坏隔室

(回收标记有第一条形码核酸的细胞的步骤)

本申请的实施方式包括从上述隔室中回收细胞的步骤，如图1的步骤1-3所示。作为具体方法，能够从有机溶剂相中液滴回收标记有第一条形码核酸的细胞(包括受测试靶标影响并标记有第一条形码核酸的细胞)。在上述回收步骤中，例如可以通过向有机溶剂相中添加有机溶剂来引起相分离，或者通过向有机溶剂相施加电场来进行。

由于回收的细胞标记有与测试靶标相关联的第一条形码核酸，即使将经不同测试靶标处理的多个细胞混合在一起，通过下文所述的读取核酸信息的步骤仍然能够识别与测试靶标相关的信息。因此，通过混合由该步骤回收的多个标记有第一条形码核酸的细胞，并通过下文所述的基于图像的细胞分选进一步分离产生预定表型的细胞，对于其中发生所需细胞表型变化的细胞，能够同时获得该特定细胞中的基因组相关信息和处理过的测试靶标的信息。

步骤2：细胞分选

(基于图像的细胞分选)

根据本申请的实施方式，基于细胞表型分选多个细胞的步骤利用成像细胞分选仪来进行，如图1的步骤2所示。根据本申请的优选实施方式，能够基于细胞表型对由于测试靶标而发生预定反应的细胞进行分选。以下将描述成像细胞分选仪的更具体方面，而成像细胞分选仪的示例包括WO2017/073737和WO2018/181458中记载的设备。在上述文献中记载的成像细胞分选仪中，通过基于来自作为观察对象的细胞的信号(诸如光和电磁波)进行分析，而无需获得照片图像，能够快速且准确地进行分选，通过机器学习优化了光源系统或检测系统，并通过机器学习还优化了对观察对象进行分析和分类的方法。

步骤3：识别引起期望的细胞变化的测试靶标

(核酸信息读取)

根据本申请的实施方式，如图1的步骤3所示，进行以第一条形码核酸为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。在该步骤中，能够读取第一条形码核酸的核酸信息并将细胞表型的变化与测试靶标相关联，从而能够识别引起期望的细胞表型变化的测试靶标。

此外，在本申请中，优选地，对使用成像细胞分选仪按表型分选的每个细胞的基因组相关信息进行分析。通过分析每个细胞的基因组相关信息，能够将细胞表型变化、细胞的基因组相关信息和测试靶标之间的关系进行关联。因此，能够在基因水平上获得与由于测试靶标而发生期望的表型变化的细胞中发生的现象有关的额外信息，这意味着使得与该现象有关的更详细的信息可用。

作为示例，下面将描述本申请的对优选核酸信息进行分析的步骤。这里，核酸信息包括与测试靶标相关联的第一条形码核酸的信息和对应于源自细胞的基因组或其衍生物的基因组相关核酸的核酸信息。

根据本申请的实施方式，上述分析核酸信息的步骤包括：

制备多个隔室的步骤，所述多个隔室包括利用成像细胞分选仪分选的呈现期望的表型变化的细胞、第一条形码核酸和第二条形码核酸连接珠，其中，所述第二条形码核酸连接珠包括能够与对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸或者与第一条形码核酸杂交的多个第二条形码核酸；

通过使基因组相关核酸和第一条形码核酸中的每一个与第二条形码核酸杂交来获得杂交的复合物的步骤；

产生源自上述杂交的复合物的扩增产物的步骤；以及

在第一条形码核酸和测试靶标与细胞共存后，使用上述扩增产物的表达模式作为指标来检测基因组相关信息的步骤。

下面将基于图2来描述对核酸信息进行分析的步骤的实施方式。

在微流动路径中产生大量液滴(隔室)，并且优选地，使它们混合以使得在每个液滴在概率性上包括比例为1:1的对于每个液滴而言不同的第二条形码核酸连接珠与呈现出所需表型变化的细胞。然后使细胞在上述隔室内裂解，并且对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸和用作测试靶标的标记物的第一条形码核酸以与第二条形码核酸连接珠杂交的状态包括在隔室中，如图2左上部分所示。

第一条形码核酸

本申请的第一条形码核酸没有限制，只要其中包括对应于每个测试靶标的条形码区域即可，例如该核酸为RNA、DNA或它们的组合。

如图2中的(1)所示，根据本申请的实施方式，第一条形码核酸优选包括与对应于每个测试靶标的第一通用条形码区域以及能够与第二条形码核酸杂交的第一杂交区域。例如，第一杂交区域为由聚腺嘌呤形成的序列且该部分能够与第二条形码核酸连接珠的第二杂交区域(例如，由聚硫胺素形成的序列)杂交。这里，使用第一通用条形码区域的序列信息使得能够一一对应地识别相同的测试靶标。因此，使用第一通用条形码区域的序列信息使得能够识别隔室中存在的测试靶标。

对于第一条形码核酸，特定的核酸序列通过固相合成法或酶促合成法来产生。在条形码核酸为RNA的情况下，合成用作单链条形码核酸的互补链的DNA模板后，可通过RNA聚合酶，诸如T7来合成RNA，该RNA聚合酶与DNA模板上的启动子序列结合，并通过线性扩增反应合成包括单链条形码区域的RNA。在条形码核酸是DNA的情况下，条形码核酸没有特别的限制，只要不妨碍本申请的效果并且可以例如使用已知序列合成和/或设计即可。

第二条形码核酸连接珠

如图2中的(1)和(2)所示，第二条形码核酸连接珠连接到第二条形码核酸，其中第二条形码核酸包括能够与对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸或者与第一条形码核酸杂交的序列。

每个隔室中的上述第二条形码核酸连接珠的数量没有特别的限制，但优选每个隔室一个第二条形码核酸连接珠。

第二条形码核酸

此外，图2中的(1)和(2)的下部是第二条形码核酸连接珠的表面的放大图，并且示出了连接至珠子的第二条形码核酸的结构示例。

第二条形码核酸可直接或间接地连接至第二珠子。根据本申请的实施方式，第二条形码核酸是RNA、DNA或它们的组合。

根据本申请的实施方式，如图2中的(1)和(2)的下部所示，第二条形码核酸优选包括在连接至珠子的多个第二条形码核酸中彼此共有的第二通用条形码区域、在连接至珠子的多个第二条形码核酸中能够彼此区分的第二独特条形码区域，以及能够与基因组相关核酸或第一条形码核酸杂交的第二杂交区域。此外，第二条形码核酸优选地还包括PCR引物区域。在图2中的(1)和(2)的下部的一个示例中，第二条形码核酸从珠子侧依次包括PCR引物区域、第二通用条形码区域、第二独特条形码区域和第二杂交区域。

如图2中的(2)所示，如上所述，上述第二通用条形码区域的序列信息在与珠子连接的多个第二条形码核酸中是共有的，并且通过杂交与源自细胞的基因组相关核酸相关联而能够作为用于确定基因组相关核酸来源细胞的指标。此外，由于使用成像细胞分选仪按表型对细胞进行分选，因此第二通用条形码区域的序列信息与细胞的表型(成像信息)相关联，也可以用作细胞的表型的指标。

此外，由于上述第二独特条形码区域的序列信息使得能够区分每个第二条形码核酸，同时能够确定与第二条形码核酸独立杂交的基因组相关核酸，所以能够分析基因组水平的反应，诸如在发生表型变化的细胞中哪些量的基因组相关核酸表达增加。

如图2中的(1)所示，第二条形码核酸的第二杂交区也可能够与第一条形码核酸杂交，因此，序列信息，诸如与测试靶标相关的第一条形码核酸的第一通用条形码区域也能够与上述第二条形码核酸的序列信息相关联。根据优选的实施方式，第二条形码核酸的第二杂交区域包括与第一杂交区域或基因组相关核酸互补的核酸。

例如，在基因组相关核酸为mRNA的情况下，第二条形码核酸中的第二杂交区域优选为由T组成的聚胸腺嘧啶。满足的是，聚胸腺嘧啶的长度足够长以能够与mRNA的聚腺嘌呤(A)末端重组(杂交)。

在基因组相关核酸是DNA，诸如基因组DNA的情况下，第二条形码核酸中的第二杂交区域优选包括与DNA的特定序列或者包括引入至DNA的DNA标记物的序列互补的序列。

作为完整的第二条形码核酸，每个第二条形码核酸可以具有彼此不同的序列。与珠子连接的多个第二条形码核酸优选为多种类型的第二条形码核酸。

珠子

从能够与大量基因组相关核酸杂交的观点来看，优选的是，1000至100000个第二条形码核酸与珠子连接。

在珠子为颗粒的情况下，其材料没有特别的限制，其示例包括：半导体，诸如由半导体材料诸如硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、氧化锌(ZnO)和二氧化硅(SiO₂)构成的量子点(半导体纳米颗粒)；无机材料，诸如重金属，诸如金；水凝胶，诸如丙烯酰胺、琼脂糖、胶原、藻酸盐/酯、纤维素、壳聚糖、透明质酸、硅酮水凝胶、PEG类水凝胶等；树脂，诸如聚苯乙烯、聚丙烯、亲水性乙烯基聚合物(诸如Toyopearl HW-65S(TosohCorporation)，或者化学交联的这些水凝胶材料，或者结合有PEG或其衍生物的亲水性乙烯基聚合物等；优选的示例包括水凝胶，更优选的示例包括丙烯酰胺和藻酸盐/酯。

产生第二条形码核酸连接珠的方法

可通过已知方法产生多种类型的第二条形码核酸连接珠。例如，可以根据E.Z.Macosko et al,Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)，或者Gierahn,T.M et al.,Seq-Well:A Portable,Low-Cost Platform for High ThroughputSingle-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples；Nat Methods.14,395-398(2017)中描述的方法来产生第二条形码核酸连接珠。

细胞或其衍生物

被封闭在上述隔室中的对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸包括从细胞破裂碎物、细胞内容物、细胞裂解物等获得的核酸。可以使用已知技术，诸如将细胞与细胞裂解缓冲液等放置在一起来获取细胞衍生物(例如，细胞破碎物、内容物、裂解物等)。

获取对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸的步骤可通过在产生隔室时将标记有第一条形码核酸的细胞与细胞裂解缓冲液封在一起来进行，或者通过将细胞裂解缓冲液与标记有第一条形码核酸的细胞和第二条形码核酸连接珠一起封在隔室中来进行。此时，封在隔室中的细胞的数量没有限制，只要不影响本申请的效果即可，但是从单细胞分析的观点来看，优选每个隔室一个细胞。

获取杂交的复合物的步骤

此外，根据本申请的实施方式，在上述对基因组相关信息进行分析的步骤中，进行将基因组相关核酸和第一条形码核酸中的每一个与第二条形码核酸杂交的步骤，以得到杂交的复合物。

该步骤可通过已知方法来进行。例如，可根据E.Z.Macosko et al,HighlyParallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using NanoliterDroplets.Cell.161,1202-1214(2015)，或者Zheng GX et al.,Massively paralleldigital transcriptional profiling of single cells.Nat Commun.6；8:14049(2017)中描述的方法来进行该步骤。随后，可通过已知的方法来破坏隔室。

制备源自杂交的复合物的扩增产物的步骤

另外，根据本申请的实施方式，在上述对基因组相关信息进行分析的步骤中，进行由在源自上述杂交的复合体的扩增产物的步骤，其中，该杂交的复合体得自于在上述获取杂交的复合体步骤。

该步骤可通过已知方法来进行。例如，可根据E.Z.Macosko et al,HighlyParallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using NanoliterDroplets.Cell.161,1202-1214(2015)，或者Zheng GX et al.,Massively paralleldigital transcriptional profiling of single cells.Nat Commun.6；8:14049(2017)中描述的方法来进行该步骤。

根据一个具体实施方式，互补链DNA的合成和逆转录反应相对于上述获取杂交的复合物步骤中获得的杂交的复合物来进行。通过合成和逆转录反应，合成了相对于细胞来源的mRNA的cDNA和相对于第一条形码核酸的互补链DNA。随后，可进行模板转换。

随后，优选进行PCR反应。通过该PCR反应可以产生两种类型的扩增产物，其中第一扩增产物源自于第一条形码核酸与第二条形码核酸的杂交的复合物，第二扩增产物源自于细胞来源的mRNA和第二条形码核酸的杂交的复合物。在基因组相关核酸是DNA的情况下，可进行延伸PCR法作为上述PCR反应。随后，基于获得的扩增产物，可生成扩增产物的文库，其中扩增产物包括第一扩增产物和第二扩增产物，源自于测试靶标的处理。

测试靶标与细胞共存后读取核酸信息的步骤

此外，根据本申请的实施方式，包括使用在上述制备源自杂交的复合物的扩增产物的步骤中获得的扩增产物的表达模式作为指标来识别与细胞共存的测试靶并检测细胞的基因组相关信息的步骤。上述扩增产物的表达模式的示例包括通过测序获得的扩增产物的序列信息，例如序列信息中的第一条形码核酸的序列信息(例如，第一通用条形码区域的序列信息)，第二条形码核酸的序列信息(例如，第二通用条形码区域的序列信息，第二独特条形码区域的序列信息)，基因组相关核酸的序列信息(每个细胞的mRNA序列)等。

不受特别的限制，以下将描述在测试靶标与细胞共存之后读取核酸信息的步骤的一个方面。

通过测序仪确定在上述制备源自杂交的复合物的扩增产物的步骤中获得的扩增产物(第一扩增产物和第二扩增产物)的序列，并对扩增产物的序列信息进行分析。在第二扩增产物的分析中，使用第二通用条形码区域的序列信息作为指标，分配每种扩增产物来源的细胞。此外，由于可以通过第二独特条形码区域的序列信息单独地识别每个mRNA分子，因此使用序列信息作为指标来获得诸如每个细胞的mRNA序列及其表达量等信息成为可能。基于通过上述分析第二扩增产物获得的信息，可获得每个细胞的转录组信息。

接下来，进行对与上述细胞共存的测试靶标的识别。这里，如上所述，第一条形码核酸对应于测试靶标。因此，在上述识别中，基于第一条形码核酸的第一通用条形码区域的序列信息，可以将与细胞共存的测试靶标分配给每个第一扩增产物。

接下来，进行与细胞共存的测试靶标和转录组信息的匹配。因此，可将每个隔室中的细胞的基因组相关信息与与其共存的测试靶标在一对一的基础上关联起来。

因此，通过检测与一种或多种类型的测试靶标共存的细胞或其衍生物的基因组相关信息，诸如转录组信息，可以相对于与细胞共存的测试靶标来评价该细胞的反应。

可使用例如10x Genomics制造的Chromium Controller仪器和Single Cell 3'Reagent Kits v3来进行上述读取核酸信息的步骤，其中Single Cell 3'Reagent Kits v3为使用液滴技术的单细胞分析技术。

成像细胞分选仪

在本申请中，如上所述，使用成像细胞分选仪基于细胞的细胞表型对多个细胞进行分选。在本申请中，使用成像细胞分选仪使得能够快速且准确地分析响应于测试靶标而发生的细胞表型变化并分选呈现出期望的表型的细胞。成像细胞分选仪是流式细胞仪，其快速获取并分析观察对象(诸如细胞)的形态信息，并能够基于分析结果选择性地获取所需的观察对象。

第一实施方式的成像细胞分选仪

根据本申请的实施方式，成像细胞分选仪是设置有分析单元的分析装置。分析单元基于从光接收单元输出的电信号按时间顺序提取的信号来分析观察对象。光接收单元接收来自观察对象的散射光、透射光、荧光或电磁波，并将它们转换为电信号，其中该观察对象存在于由来自光源的光照射的光照射区域中。以下，本实施方式的成像细胞分选仪也被称为“第一实施方式中的成像细胞分选仪”。第一实施方式中的成像细胞分选仪使用动态重影成像(Ghost Motion Imaging)技术，该技术利用光学结构和观察对象的相对运动。例如，可以根据WO2017/073737中的描述使用第一实施方式中的成像细胞分选仪进行分析。

根据本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪，将单细胞流式细胞仪的每个关键点委托给机器学习，使得能够智能地测量细胞信息，并且智能、快速且准确地分析和分类细胞信息。可以实现(1)不受人类知识偏见限制的细胞分类方法，(2)无需获得细胞“照片图像”的细胞空间信息的高速成像/分析方法，以及(3)根据对象自动优化的光学捕获方法。

图3为本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪的实施方式的示意图。作为示例，本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪具有：

光源1；

由来自光源1的光照射的光照射区域3；

光接收单元7，其接收来自存在于光照射区域3中的观察对象5的散射光(包括拉曼散射)、透射光、荧光或电磁波，并将光或电磁波转换为电信号；

存储单元9，其接收来自光接收单元7的电信号并记录该电信号；

分析单元11，其分析存储单元9记录的与散射光、透射光、荧光或电磁波有关的电信号并记录分析结果；以及

光学系统控制单元13，其基于分析结果优化光源1或光照射区域3。

在本发明第一实施方式中的成像细胞分选仪中，照射在光照射区域3中的光具有结构化的照明图案。作为示例，结构化的照明图案由光调制单元提供，该光调制单元包括空间光调制器、滤光器等，布置在从光源1至光照射区域3的光学路径的中间。这里，结构化的照明是具有多个光学特性不同的区域的照明，并且将照射光照射区域3中的观察对象的照明光调制为例如带状光(cingulate light)，在该带状光中，具有彼此不同光学特性的多个区域以网格状方式布置并且该多个区域至少包括具有第一光学特性的区域和具有第二光学特性的区域。还可能的是，将本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪配置为不包括上文所述图3的配置中的光学系统控制单元13。

此外，作为第一实施方式中的成像细胞分选仪的另一实施方式，还可能具有这样的配置：将来自观察对象5的散射光(包括拉曼散射)、透射光、荧光或电磁波在被光接收单元7检测到之前结构化，而不结构化照射光照射区域3中的光。在该配置中，作为示例，通过在光照射区域3至光接收单元7的光学路径的中间布置光调制单元(诸如滤光器)，能够结构化并检测来自观察对象5的光(上述来自观察对象5的散射光、透射光、荧光或电磁波)。作为示例，在结构化的检测配置中使用的光调制单元具有以网格状方式布置的多个区域，并且该多个区域通过透光区域和不透光区域的布置而具有图案。来自观察对象5的光通过上述光调制单元。然后，具有光学特性不同的多个区域的光通过光接收单元7来检测。

本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪优选通过机器学习对分析单元11的分类算法进行优化。在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，可能的是，使用包括呈现出期望的表型的细胞的训练样品来获取训练数据，以生成使用训练数据对呈现出所需表型的细胞进行分类的分类模型，以测量测试样品，并基于该模型从测试样品中获取呈现出期望的表型的细胞。

在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，分析单元11分析观察对象，而无需由与散射光、透射光、荧光或电磁波有关的电信号来重构观察对象的图像。也就是说，与散射光、透射光、荧光或电磁波有关的电信号用作分析中的时序波形数据。更优选地，本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪获取使用包括呈现出期望的表型的细胞的训练样品获取的波形数据(电信号)作为训练数据，并且生成分类模型，该分类模型用于使用训练数据对呈现出期望的表型的细胞进行分类。然后，更优选地，在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，在依赖于模型的情况下，基于在测试样品时获取的波形数据(电信号)，从测试样品中获取呈现出期望表型的细胞。

在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，光学系统控制单元13通过机器学习来优化光源1。

在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，来自光源1的光具有多个光学区域21，并且光学系统控制单元13控制该多个光学区域的光学结构。因此，优选地，本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪具有多个光学区域，并且光学系统控制单元控制光学区域的光学结构。此外，根据实施方式，在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，在光源和光照射区域之间的光学路径上设置光调制单元，该光调制单元具有彼此不同光学特性的多个区域。来自光源1的光通过光调制单元而结构化，并且观察对象5在光照射区域3中被结构化的照明照射。

在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，光学系统控制单元13基于电信号分析观察对象3所在的区域，并对光照射区域3进行控制和限制。

在本申请第一实施放置中的成像细胞分选仪中，优选地，光学系统控制单元13基于电信号分析观察对象5的粗糙度(roughness)以获得观察对象的粗糙度信息，并基于粗糙度信息控制光源1或光照射区域3。因此，根据一个实施方式，分析单元基于分析结果更新分类算法。在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，基于分析单元分析的结果控制光和光照射区域。

优选地，本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪进一步具有光接收系统控制单元27，该光接收系统控制单元接收来自光接收单元7的电信号并且优化光接收区域25，其中该光接收区域为光接收单元7被光照射的区域。在本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，光接收系统控制单元27通过机器学习优化光接收区域25。

在优选的使用形式中，本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪具有包括光照射区域3的流通池。观察对象5随着流过流通池的流体移动并且在光照射区域3中被来自光源1的光照射。

本申请第一实施方式中的成像细胞分选仪优选地具有分选单元，该分选单元基于分析单元11的分析结果对经分类的观察对象5进行分选。

第二实施方式的成像细胞分选仪

此外，根据本申请的优选实施方式，成像细胞分选仪是设置有分析单元的分析装置。分析单元基于从光接收单元输出的电信号按时间顺序提取的信号来分析观察对象。光接收单元接收来自观察对象的散射光、透射光、荧光或电磁波，并将它们转换为电信号，其中该观察对象存在于由来自光源的光照射的光照射区域中。以下，本实施方式的成像细胞分选仪也被称为“第二实施方式中的成像细胞分选仪”。可以根据WO2018/199080中的描述使用第二实施方式中的成像细胞分选仪进行分析。

根据第二实施方式中的成像细胞分选仪，能够高速生成观察对象的三维图像，这有利于快速确定作为观察对象的细胞的表型。

第二实施方式中的成像细胞分选仪优选为成像流式细胞仪，其设置有：供观察对象流过的至少一条流动路径；用带状激发光照射流动路径的光源；成像单元，该成像单元通过获得来自经过激发光照射位置的观察对象的荧光，来获得观察对象的特定横截面的照片图像；和，三维图像生成单元，其基于由成像单元获得的横截面的多个照片图像来生成观察对象的三维照片图像。

另外，在第二实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，基于由成像单元获得的横截面照片图像中示出的观察对象的形态所表示的信息来分选观察对象。

此外，在第二实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，流动路径是平行排列的多条流动路径，该多条流动路径被所述激发光照射，并且成像单元获得观察对象流经该多条流动路径中的每一条的横截面照片图像。

此外，在第二实施方式中的成像细胞分选仪中，优选地，光学调制单元具有光学特性彼此不同的多个区域，布置在光源和检测荧光强度的图像传感器之间的光学路径上，并且成像单元基于图像传感器检测到的荧光强度和光调制单元的光学特性来将观察对象横截面的图像重构为拍摄的照片图像。

根据本申请，可提供一种快速生成观察对象的三维图像的成像流式细胞仪。

根据一方面，本申请的方法在上述制备步骤之后可按照以下实施例中描述的方法来进行。

此外，日本专利No.5441142、日本专利No.5540359、日本专利No.6544600、WO2017/073737、WO2018/181458、WO2018/199080和WO2018/203575中描述的内容通过引用成为本说明书的一部分。

根据本申请的实施方式，提供了以下。

[1]一种用于筛选测试靶标的方法，所述方法包括：制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有与测试靶标相关的第一条形码核酸并且用所述测试靶标处理；使用成像细胞分选仪基于细胞表型来分选所述多个细胞的步骤；以及使用所述第一条形码核酸作为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。

[2]根据[1]所述的方法，其中，所述用于处理每个细胞的测试靶标与每个细胞的表型相关联。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，识别步骤进一步包括识别靶标位点的步骤，在所述靶标位点处，由所述测试靶标产生所述细胞期望的表型变化。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，进一步包括：对每个细胞的基因组相关信息进行分析的步骤。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，制备细胞的步骤包括：通过将包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的液态介质与所述细胞混合来使所述第一条形码核酸与细胞相关联的步骤。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，制备细胞的步骤包括：通过将水凝胶珠加入到包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的液态介质中以产生包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的第一子隔室来使所述第一条形码核酸与所述测试靶标相关联的步骤。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，制备细胞的步骤包括：使包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的第一子隔室与包括所述细胞的第二子隔室融合，以产生包括所述测试靶标、所述第一条形码核酸和所述细胞的隔室。

[8]根据[7]所述的方法，其中，所述制备细胞的步骤包括：在所述隔室中，用所述测试靶标处理所述细胞。

[9]根据[6]至[8]中任一项所述的方法，其中，所述隔室和所述子隔室是液滴。

[10]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，所述制备细胞的步骤包括：从所述隔室中回收细胞的步骤。

[11]根据[1]至[10]中任一项所述的方法，其中，分选的步骤包括：基于细胞表型对由于测试靶标而发生预定反应的细胞进行分选的步骤。

[12]根据[4]至[11]中任一项所述的方法，其中，对基因组相关信息进行分析的步骤包括：

制备多个隔室的步骤，所述多个隔室包括对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸、第一条形码核酸和第二条形码核酸连接珠，其中，所述第二条形码核酸连接珠包括能够与细胞基因组或对应于其衍生物的基因组相关核酸或所述第一条形码核酸杂交的多个第二条形码核酸；

通过使所述基因组相关核酸和所述第一条形码核酸中的每一个与所述第二条形码核酸杂交来获得杂交的复合物的步骤；

产生源自所述杂交的复合物的扩增产物的步骤；以及

在所述细胞与所述测试靶标共存后，使用所述扩增产物的表达模式作为指标来检测所述细胞的基因组相关信息的步骤。

[13]根据[12]所述的方法，其中，所述基因组相关核酸是细胞基因组DNA，或者源自所述细胞基因组的RNA或其cDNA。

[14]根据[12]或[13]所述的方法，其中，每个第一条形码核酸包括第一通用条形码区域和第一杂交区域，所述第一通用条形码区域对于相同测试靶标是共有的，所述第一杂交区域能够与所述第二条形码核酸杂交。

[15]根据[12]至[14]中任一项所述的方法，其中，所述第一通用条形码区域的序列信息是用于确定所述测试靶标的指标。

[16]根据[12]至[15]中任一项所述的方法，其中，与所述第二条形码核酸连接珠连接的所述多个第二条形码核酸中的每一个包括：彼此共有的第二通用条形码区域、能够彼此区分的第二独特条形码区域，以及能够与所述基因组相关核酸或所述第一条形码核酸杂交的第二杂交区域。

[17]根据[12]至[16]中任一项所述的方法，其中，所述第二独特条形码区域的序列信息是用于确定所述基因组相关核酸的指标。

[18]根据[11]至[16]中任一项所述的方法，其中，所述第二条形码核酸进一步包括PCR引物区域。

[19]根据[12]至[17]中任一项所述的方法，其中，所述第二杂交区域包括与所述第一杂交区域或所述基因组相关核酸互补的核酸。

[18]根据[1]至[19]中任一项所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪是设置有分析单元的分析装置，其中通过光接收单元接收来自观察对象的散射光、透射光、荧光或电磁波并转化为电信号，并且基于从所述光接收单元输出的电信号按时间顺序提取的信号对所述观察对象进行分析，其中所述观察对象存在于由来自光源的光所照射的光照射区域中。

[21]根据[20]所述的方法，其中，在所述光源或所述光照射区域之间的光学路径上布置有光调制单元，所述光调制单元具有光学特性彼此不同的多个区域。

[22]根据[20]或[21]所述的方法，进一步包括：光学系统控制单元，所述光学系统控制单元基于由所述分析单元进行分析的分析结果来控制所述光源。

[23]根据[22]所述的方法，其中，来自所述光源的光具有多个光学区域，并且所述光学系统控制单元控制所述光学区域的光学结构。

[24]根据[20]至[23]中任一项所述的方法，其中，所述分析单元基于分析结果更新分类算法。

[25]根据[20]至[24]中任一项所述的方法，其中，基于由所述分析单元进行分析的结果控制所述光和所述光照射区域。

[26]根据[20]至[25]中任一项所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪包括流通池，所述流通池包括所述光照射区域。

[27]根据[20]至[26]中任一项所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪具有分选单元，所述分选单元基于所述分析单元的分析结果，对所述观察对象进行分类并分选所述观察对象。

[28]根据[20]至[27]中任一项所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪进一步设置有：流线宽度控制单元，通过所述流线宽度控制单元可变地控制所述观察对象在流动路径中移动的流线宽度；以及

教导信息生成单元，基于以时间顺序提取的信号和获取所述信号时的流线宽度生成教导信息，所述教导信息通过机器学习指示用于对所述观察对象的状态进行分类的标准；

所述分析单元基于所述信号和所述教导信息生成单元生成的教导信息估算在所述流线上移动的所述观察对象的状态。

[29]根据[28]所述的方法，其中，所述流线宽度控制单元将所述流线宽度控制为第一流线宽度，所述第一流线宽度为对应于所述观察对象的直径的宽度；

所述教导信息生成单元基于在由所述流线宽度控制单元控制的所述第一流线宽度下，由所述光接收单元检测的第一观察结果信号生成第一教导信息作为所述教导信息；以及

所述分析单元基于所述信号和由所述教导信息生成单元生成的所述第一教导信息来估算在所述流线上移动的所述观察对象的状态。

[30]根据[28]或[29]所述的方法，其中，所述流线宽度控制单元将所述流线宽度控制为第二流线宽度，所述第二流线宽度为基于所述观察对象的直径的宽度并且比所述第一流线宽度宽；

所述教导信息生成单元基于在由所述流线宽度控制单元控制的所述第二流线宽度下，由所述光接收单元检测的第二观察结果信号进一步生成第二教导信息作为所述教导信息；以及

所述分析单元基于所述信号、由所述教导信息生成单元生成的所述第一教导信息和由所述教导信息生成单元生成的所述第二教导信息来估算在所述流线上移动的所述观察对象的状态。

[31]根据[1]至[30]中任一项所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪设置有：

供所述观察对象流经的至少一条流动路径；

具有带状激发光的用于照射所述流动路径的光源；

成像单元，所述成像单元通过获得来自观察对象的荧光而获得所述观察对象的特定横截面的照片图像，所述观察对象穿过所述激发光照射的位置；和

三维图像生成单元，所述三维图像生成单元基于由所述成像单元获得的横截面的多个照片图像生成所述观察对象的三维照片图像。

[32]根据[31]所述的方法，其中，所述成像细胞分选仪基于由所述成像单元获得的横截面照片图像中示出的表示观察对象的形态的信息，对所述观察对象进行分选。

[33]根据[31]或[32]所述的方法，其中，所述流动路径是平行排列的多条流动路径；所述多条流动路径被所述激发光照射；并且所述成像单元获得流经多条流动路径中的每一条的所述观察对象的横截面照片图像。

[34]根据[1]至[33]中任一项所述的方法，其中，在所述光源和检测荧光的强度的图像传感器之间的光学路径上布置有光调制单元，所述光调制单元具有光学特性彼此不同的多个区域；并且，所述成像单元基于由所述图像传感器检测到的荧光的强度和所述光调制单元的光学特性，将所述观察对象的横截面的图像重构为拍摄的照片图像。

[35]根据[1]至[34]中任一项所述的方法，其中，所述测试靶标包括测试物质。

[36]根据[1]至[35]中任一项所述的方法，其中，所述测试靶标是测试物质。

[37]根据[1]至[36]中任一项所述的方法，其中，对基因组相关信息进行分析的步骤包括：

制备多个隔室的步骤，所述隔室包括使用成像细胞分选仪分选的呈现出期望的表型变化的细胞、第一条形码核酸和第二条形码核酸连接珠，其中第二条形码核酸连接珠包括能够与对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸或者第一条形码核酸杂交的多个第二条形码核酸；

通过将基因组相关核酸和第一条形码核酸中的每一个与第二条形码核酸杂交来获得杂交的复合物的步骤；

产生源自上述杂交的复合物的扩增产物的步骤；以及

[实施例]

以下，将基于实施例对本申请进行具体描述，但本申请不限于这些实施例。此外，除非特别注明，否则本申请的测量方法和单位均符合日本工业标准(JIS)的规定。

参考例1：第一条形码核酸与细胞连接的初步测试

根据Multi-seq方法(记载于Nature Methods，16卷，第619-626页，(2019))，使用与下文描述的实施例1中相同的细胞、锚定子CMO、共锚定子CMO和寡核苷酸进行以下初步测试。也就是说，将细胞和锚定子CMO在4℃下于磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中孵育5分钟，然后向其中加入共锚定子CMO并进一步4℃下孵育5分钟，最后，将红色荧光染料(Cy5)缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)混合与其中，并在4℃下孵育5分钟。

结果，如图4中的A和B所示，在PBS溶液中，红色荧光染料(Cy5)缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)在短时间孵育后(孵育30分钟后)保留在细胞中。但是，经证实，在经过较长时间(孵育3小时或更长时间)后，出现几乎所有细胞都死亡或添加的条形码核酸从细胞上脱落的情况(未示出)。

参考例2：第一条形码核酸与细胞连接的初步测试

另外，除了使用含有血清或牛血清白蛋白(BSA)作为溶剂的细胞培养基进行孵育之外，使用与参考例1相同的方法进行该初步实验。结果，证实了红色荧光染料(Cy5)缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)对细胞的附着率降低，如图4中C和D的照片所示。

参考例3：将第一条形码核酸与细胞相关联的初步测试

此外，除了当添加锚定子CMO和共锚定子CMO时，将溶液改为无血清Opti-MEM培养基(由Thermo Fisher制造)并且在室温下进行孵育之外，使用与参考例1相同的方法进行该初步实验。结果，证实了荧光染料缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)可以充分地附着到细胞上，如图4中E和F的照片所示。结果证明了，在保持荧光染料缀合的寡核苷酸对细胞高效附着(100％)的条件下，能够进行适合于液滴筛选的反应。然后，进行以下实施例1的实验。

实施例1：在隔室(管)中将第一条形码核酸与细胞的相关联

在本实验中，首先，在管1中，将两种类型的胆固醇修饰的寡核苷酸接头，即锚定子CMO(5'-胆固醇-TEG-GTAACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'(序列号1))和共锚定子CMO(5'-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-TEG胆固醇-3'(序列号2))进行混合。在此，作为寡核苷酸接头中的“胆固醇-TEG”，使用https://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Product/2555中列出的商业产品。在上述混合过程中，使用无血清Opti-MEM培养基作为溶剂，并且锚定子CMO和共锚定子CMO的终浓度均设定为250nM。管1在室温下孵育5分钟。

接下来，将第一条形码核酸A添加到管1中，混合并孵育。包括第一条形码核酸A序列(8个碱基)的寡核苷酸是5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCACCACAATGA30-3(序列号3)。此处，添加到第一条形码核酸A末端的A30是由30个残基形成的聚腺嘌呤(聚(A₃₀))。第一条形码核酸A的终浓度设定为250nM，并且孵育在室温下进行5分钟。

接下来，将预先通过离心收集的细胞添加到管1中并进行孵育。此时使用的细胞为THP1细胞，并且细胞浓度设定为1×10⁷细胞/mL。孵育在室温下进行5分钟。

另一方面，在管2中，除了使用包括第一条形码核酸B(8个碱基)的寡核苷酸代替包括第一条形码核酸A(8个碱基)的寡核苷酸之外，根据描述管1时相同的方法和条件，用第一条形码核酸B来标记细胞。包括第一条形码核酸B(8个碱基)的寡核苷酸是5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCATGAGACCTA30-3'(序列号4)。

实施例2：在隔室(管)中将测试物质、第一条形码核酸和细胞的相关联

在管1和管2中，将细胞分别重新悬浮在具有10％FBS和50μM 2-巯基乙醇的RPM1-1640培养基中。接下来，作为药物，将悬浮在二甲亚砜(DMSO)中的脂多糖(LPS)以2μg/mL的终浓度仅添加到管1。在管2中，仅添加用于药物的溶剂DMSO。接下来，将管1和管2分别在37℃、CO₂中孵育2小时。通过至此的实验，通过将每个细胞与第一条形码核酸A型或第一条形码核酸B型对应来将药物LPS是否存在的药物条件分别与每个细胞相关联。

在实施例2的方法中，还证实了通过在具有10％FBS和50μM 2-巯基乙醇的RPM1-1640培养基中重新悬浮和培养细胞，能够避免长时间孵育过程中附着至细胞的条形码核酸从细胞脱落的问题。

具体地，分别制备用绿色荧光染料FAM缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)标记的细胞和用红色荧光染料(Cy5)缀合的寡核苷酸(具有对应于部分序列的序列第一条条形码核酸)标记的细胞，并在PBS溶液中混合，孵育1小时。当使用荧光显微镜通过绿色荧光(图5中的A)和红色荧光(图5中的B)的相应通道观察该孵育后的混合细胞样品时，许多细胞同时发出绿色和红色的光。也就是说，在PBS溶液中长时间培养细胞时(这是以前的方法)，条形码核酸从细胞上脱落，并且两种类型条形码核酸混合在一起。

接下来，以相同的方式，分别制备用绿色荧光染料FAM缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)标记的细胞和用红色荧光染料(Cy5)缀合的寡核苷酸(具有对应于第一条形码核酸的部分序列的序列)标记的细胞，并在具有10％FPS和50μM2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中混合，孵育1小时。当使用荧光显微镜通过绿色荧光(图5中的C)和红色荧光(图2中的D)的相应通道观察该孵育后的混合细胞样品时，证实了条形码没有从细胞脱落，解决了两种条形码核酸混合在一起的问题。

此外，上述添加至细胞的条形码核酸在添加后约1小时仍附着于细胞膜的表面，然后观察添加了条形码核酸的细胞随时间(1小时、2小时、3小时和6小时后)的变化。结果，如图6所示，一部分条形码核酸被吸收到细胞中，并且细胞保持该条形码核酸原样。此外，证实了，在具有10％FBS和50μM 2-巯基乙醇的RPM1-1640培养基中培养细胞能够防止添加了条形码核酸的细胞的死亡。

实施例3：响应测试物质的细胞的固定、蛋白标签化和染色实验

接下来，从管1和管2分别收集一些细胞。通过在室温下于悬浮于PBS中的4％福尔马林溶液中孵育15分钟，或者在室温下于1mg/mL DTSSP溶液(二硫代双磺基琥珀酰亚胺基丙酸二钠盐(DTSSP)(由DOJINDO制造)中孵育30分钟，然后用冰冷的甲醇处理5分钟来固定所获得细胞。将固定化的细胞置换到PBS溶液中。然后使用针对NFκB蛋白的一抗(NFκB p65(D14E12)，由CST制造)进行免疫染色。一抗在100倍稀释后使用，并且反应溶液在4℃下用含有1％BSA的PBS处理16小时至20小时。接下来，用与荧光染料(Alexa Fluor 488)缀合的二抗进行反应。二抗在200倍稀释后使用，并且反应溶液在室温下用含有1％BSA的PBS处理1小时。

如图7所示，使用荧光显微镜进行证实时，在仅添加了药物溶剂DMSO的管2的细胞中，几乎所有的NFκB蛋白都定位在细胞质中，而添加了LPS药物的管1的细胞中，几乎所有的NFκB蛋白都定位在细胞核中。

接下来，用可固定红外(Fixable Far Red)对管1收集的一些细胞进行染色。然后，将这些经染色的细胞与从管2收集的未用可固定红外染色的一些细胞混合，以获得混合细胞溶液A，其中这两种类型的细胞都以1:1的浓度包括在混合细胞溶液中。

另外，从仅添加了DMSO(为药物的溶剂)的管2中收集一些部分细胞，得到细胞溶液B，作为阴性对照。

此外，还准备一部分混合细胞溶液A，来获得成像细胞分选仪的训练数据。

实施例4：通过成像细胞分选仪基于细胞图像表型分选响应测试物质的细胞的实验

使用成像细胞分选仪，基于NFκB蛋白的核定位，从混合细胞溶液中分选和回收细胞，其中NFκB蛋白的核定位是响应添加LPS药物而观察到的细胞图像表型。本实验中使用的成像细胞分选仪是Science,15 Jun 2018:Vol.360,Issue 6394,pp.1246-1251中所描述的分选仪。

首先，开发了机器学习模型来对发生NFκB蛋白的核定位的细胞进行分类，其中NFκB蛋白的核定位是要分类和回收的细胞图像表型。具体地，使用其中来自管1的细胞和来自管2的细胞(只有来自管1的细胞用可固定红外染色)以已知比例混合的混合细胞溶液A的一部分进行训练，生成有监督的机器学习模型(SVM：支持向量机)。将混合细胞溶液A的一部分引入到成像细胞分选仪，以获得源自于用于标签化NFκB蛋白的Alexa Fluor 488的图像信号。使用图像信号和基于可固定红外标签的正确答案数据作为训练数据，生成预测NFκB蛋白的核定位的分类模型。

接下来，利用成像细胞分选仪，基于NFκB蛋白的核定位来分选细胞溶液A的细胞，并回收其中发生NFκB蛋白的核定位的细胞，其中在细胞溶液A中，添加LPS药物的细胞和未添加药物的细胞以1:1的细胞浓度混合，其中NFκB蛋白的核定位是添加LPS药物的细胞的细胞图像表型。回收率为总细胞的90％或更多。

对于在4％福尔马林固定后进行蛋白标签化的样品，从图像信号数据预测NFκB蛋白的核定位，并基于源自可固定红外的标签信号将预测与正确答案相关联。由此，对于acc(准确度)，得到为0.95的分类准确度，对于roc-auc(接收器操作特性曲线下的面积)，得到0.997。此外，在基于图像信号数据分选后，通过流式细胞术基于源自可固定红外的标签信号测量和量化分选后回收的样品的纯度。结果如图8所示，并且分选后回收的样品中接受药物添加的细胞的比率(阳性纯度)为0.995。

对于在DTSSP固定后进行蛋白标签化的样品，从图像信号数据预测NFκB蛋白的核定位，并基于源自可固定红外的标签信号将预测与正确答案相关联。结果如图9所示。在1mgDTSSP的固定化条件下，对于acc(准确度)，得到0.87的分类准确度，对于roc-auc，得到0.91。在10mg DTSSP的固定haul条件下，对于acc(准确度)，得到0.90的分类准确度，对于roc-auc，得到0.96。

从上述结果可以看出，本方法使用成像细胞分选仪基于图像表型能够快速分选细胞，而现有技术的方法中基于图像表型的细胞分选耗时且成本高。

实施例5：证实测试物质和通过成像细胞分选仪分选和回收的细胞的细胞表型之间的信息连通性的实验

由通过成像细胞分选仪分选的回收的细胞(阳性纯度：0.995)和对照混合细胞(存在LPS药物与不存在药物的比例为1:1)，提供包括约4800个细胞的溶液，并对每个细胞进行单细胞分析。为了读取修饰每个细胞的DNA条形码，使用液滴技术的单细胞分析技术，尤其是10x Genomics制造的Chromium Controller仪器和Single Cell 3'Reagent Kit v3。

图10示出了试剂盒中包括的试剂的示意图。在该技术中，在微流路中产生大量液滴，并且在每个液滴中，以1:1的比例在每个液滴中随机地包括第二条形码核酸连接珠和一个细胞，第二条形码核酸连接株对于每个液滴是不同的。多个第二条形码核酸通过接头连接至第二珠。此外，与第二珠连接的多个第二条形码核酸中的每一个包括：只要液滴中包括的细胞是相同的则彼此共有的第二通用条形码区域(16个碱基)、对于每个独立液滴能够彼此区分的第二独特条形码区域(12个碱基)，以及能够与细胞的基因组来源的核酸或第一条形码核酸杂交的第二杂交区域。

具体而言，首先，在每个液滴中，添加到第二独特条形码区域端部的第二杂交聚(dT)序列与附着于细胞表面的第一条形码核酸的聚(A)端部结合。此外，使用逆转录酶等进行逆转录反应，并且使用第一条形码引物5'-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3'(序列号5)和包括在10x Genomics制造的Single Cell 3'Reagent Kit v3的互补链DNA引物来产生与第二条形码核酸序列结合的第一条形码核酸的互补链DNA。

然后，将每个所产生的液滴以混合状态破坏，并通过PCR反应扩增从每个液滴提取的与第二独特条形码的互补链DNA组，并用由Invitrogen制造的Qubit Fluorometer测量DNA浓度。对于图像分选和回收的细胞溶液，结果为23.4ng/μl，对于对照细胞溶液，结果为30.4ng/μl。

接下来，如图11中所示，通过PCR反应生成第一条形码核酸的下一代序列文库，其中第一条形码核酸结合有对每个细胞不同的第二条形码核酸序列。使用的引物如下：

读长1侧(通用I5引物)

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(序列号6)，

读长2侧(TruSeq RPI引物)

在图像分类和回收的细胞溶液中，

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'(序列号7)，以及

在对照细胞溶液中，

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'(序列号8)。

对于获得的下一代序列文库，使用Agilent制造的D5000筛选带(screen tape)测量DNA大小和浓度，以确认文库的质量。

使用Illumina制造的MiSeq Reagent Kit v3生成P5和P7序列文库，并且使用Illumina制造的MiSeq下一代测序仪来进行下一代测序。将获得的序列数据作为基于文本的FASTQ文件在读长1(Read1)侧和读长2(Read1)侧读取，并使用Python3、DropseqTools和UMITools进行分析。

结果，对于图像分选和回收的细胞，第二通用条形码区域序列(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)的读长总数量为19912682。此外，可以与第二通用条形码区域序列(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)关联的第一条形码核酸序列数量为16354670。其中，与药物LPS存在相关的第一条形码核酸A的读长数量为第一条形码核酸读取总数量的85.1％，与不存在药物相关的第一条形码核酸B的读长数量为第一条形码核酸读长总数量的0.8％。

对于对照混合细胞(存在LPS药物的细胞与不存在药物的细胞比例为1:1)，第二通用条形码区域(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)的读长总数量为10795154，可以与第二通用条形码区域(16个碱基)和第二独特条形码(12个碱基)关联的第一条形码核酸序列数量为7587061。其中，与药物LPS存在相关的第一条形码核酸A的读长数量为第一条条形码核酸读长总数量的51.3％，与不存在药物相关的第一条形码核酸B的读长数量为第一条形码核酸读长总数量的35.6％。

通过这一系列实验，证实了使用成像细胞分选仪，可以通过基于响应于测试物质观察到的细胞图像表型来分选其上附着有与测试物质相关的核酸条形码的细胞并且读取附着至经分选的细胞的核酸条形码序列来进行测试物质的细胞表型筛选。

实施例6：证实测试物质和细胞表型信息与混合细胞中基因表达信息的关联性的实验

通过上述固定、标签化和染色固定条件，制备模拟通过成像细胞分选仪分选和回收的细胞混合物样品(存在LPS药物的细胞与不存在药物的细胞的比率为9:1)(阳性纯度：0.9)的样品。从样品中提供包括大约4800个细胞的溶液，并对其进行单细胞分析。为了读出修饰每个细胞的DNA条形码和源自细胞的遗传信息，使用液滴技术的单细胞分析技术，尤其是10x Genomics制造的Chromium Controller仪器和Single Cell 3'Reagent Kit v3，如实施例5中所述。

首先，在每个液滴中，添加到第二独特条形码区域端部的聚(dT)序列的第二杂交区域与附着于细胞表面的第一条形码核酸的聚(A)端部结合。此外，使用逆转录酶等进行逆转录反应，并且使用用于第一条形码核酸的引物5'CTTGGCACCCGAGAATTCC-3'(序列号5)和包括在10x Genomics制造的Single Cell 3'Reagent Kit v3的互补链DNA引物来产生与第二条形码核酸序列结合的第一条形码核酸的互补链DNA。

此外，在产生第二独特条形码的互补链DNA的同时，对于每个细胞的内源性cDNA，添加到第二独特条形码区域端部的第二杂交聚(dT)序列与源自细胞的mRNA的聚(A)端部结合。此外，使用逆转录酶等进行逆转录反应，并且使用包括在10x Genomics制造的SingleCell 3'Reagent Kit v3的互补链DNA引物来产生源自细胞的互补链DNA。

然后，将每个所产生的液滴中以混合状态破坏，并从每个液滴提取第二独特条形码的第一条形码核酸的互补链DNA和源自细胞的互补链DNA组。之后，通过PCR反应扩增每个互补链DNA，并且用由Invitrogen制造的Qubit Fluorometer测量它们的DNA浓度。对于测量的结果，图像分选后回收的细胞的条形码互补链DNA浓度为57.8ng/μl，源自细胞的互补链DNA浓度为0.676ng/μl。

使用相同的方法，也分别从未给予LPS药物刺激的阴性对照细胞中回收条形码互补链DNA和源自细胞的互补链DNA，并用Invitrogen制造的Qubit Fluorometer类似地测量DNA浓度。根据测量的结果，条形码互补链DNA的浓度为45.6ng/μl，源自细胞的互补链DNA的浓度为0.658ng/μl。

接下来，通过PCR反应生成第一条形码核酸和源自细胞的互补链DNA的下一代序列文库，其中第一条形码核酸和源自细胞的互补链DNA结合有对每个细胞不同的第二条形码核酸序列：

读长1侧(通用I5引物)

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(序列号6)；以及

用于阴性对照细胞的读长2侧(TruSeq RPI引物)

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'(序列号7)以及

用于图像分选并回收的细胞的读长2侧

对于获得的下一代序列文库，使用Agilent制造的D5000筛选带和qPCR反应测量DNA大小和DNA浓度，并确认文库的质量。

结果，来自混合样品细胞(存在LPS药物的细胞与不存在药物的细胞的比例为9:1)的第二通用条形码区域序列(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)的读长总数量是251958。此外，通过同时读取与第二通用条形码区域序列(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)相关联的第一条形码核酸序列数量为249793。其中，与药物LPS存在对应的第一条形码核酸A的读长数数量为第一条形码核酸读长总数量的86.8％。与对应于药物不存在的第一条形码核酸B的读长数量为第一条形码核酸读长总数量的3.1％。进一步地，在进行读长错误校正后，在与第一条形码核酸序列A或第一条形码核酸序列B对应读出的第二条通用条形码区域序列的读长数量中，其中依次布置具有大量读长的第二通用条形码区域序列的上列表与同时读出的第一条形码核酸序列A或第一条形码核酸序列B的读长数量一起示出(图12A中的表1-1和图12A中的表1-2)。此外，在互补链DNA的594个第二独特条形码区域序列中，在第一条形码序列文库中发现了550个与第二独特条形码区域序列相同的序列，并且几乎所有(92.6％)其中发现第二个独特条形码区域序列的第一核酸条形码序列的文库归属于第一条形码核酸A(图13，图表1)。

不含LPS药物的阴性对照细胞的第二通用条形码区序列(16个碱基)和第二独特条形码区(12个碱基)的读长总数量为185858。此外，可以与第二通用条形码区域序列(16个碱基)和第二独特条形码区域(12个碱基)关联的第一条形码核酸序列数量为184181。其中，对应于药物LPS存在的第一条形码核酸A的读长数量占第一条形码核酸读长总数量的0％，对应于药物不存在的第一条形码核酸B占第一条形码核酸读长总数量的83.3％。此外，在进行读取错误校正后，在示出的上列表中，依次排列了分别与第一条形码核酸序列A和第一条形码核酸序列B一致的第二通用条码区域序列的读长总数量较多的第二独特条码区域(图14A中的表2-1和图14B中的表2-2)。此外，在互补链DNA的197个第二独特条形码区域序列中，在第一条形码序列库中发现了172个与第二独特条形码区域序列相同的序列，并且几乎所有(>99％)的第一条形码核酸序列归属于第一条形码核酸B(图15，图表2)。

实施例7：隔室(液滴)中细胞表型筛选方法

对于其中细胞、测试物质和对应于测试物质的第一条形码核酸被封闭在隔室(液滴)中并在隔室(液滴)中接触来细胞表型筛选测试物质，可以使用例如以下方法。

7-1

可根据Anal.Chem.2018,90,16,9813-9820所述的下列方法来生成封闭测试物质和对应于测试物质的第一条形码核酸的第一子隔室。具体而言，使用不含FBS的Opti-MEM培养基，并且将测试物质溶解在水性相中。接下来，在孔或管中，将水性相、使用微流体装置或类似物预先产生的水凝胶颗粒(例如，琼脂糖1.1wt％浓度的凝胶珠，直径尺寸约70μm)、对应于测试物质的第一条形码核酸、锚定子CMO和共锚定子CMO进行混合。接下来，通过向孔中添加有机溶剂和表面活性剂(例如，Triton-100)并通过涡旋混合器进行搅拌和振荡处理可得到包括测试物质和对应于测试物质的第一条形码核酸的液滴(作为第一子隔室)。图16中的显微照片是在不添加测试物质和第一条形码核酸的情况下产生的第一子隔室的显微照片。然而，在液滴中包括测试物质和对应于测试物质的第一条形码核酸的情况下，可以类似地生成直径尺寸约70μm的液滴。通过这种处理，测试物质在第一子隔室中与第一条形码核酸相关联。

例如，作为这里的有机溶剂，可以使用EvaGreen的液滴发生器油(由BioRadLaboratories,Inc.制造)。用于EvaGreen的液滴发生器油具有透氧性，适用于细胞的液滴内培养。实际上，结果，在细胞在由该有机溶剂和不含FBS的Opti-MEM培养基产生的液滴中培养24小时的情况下，细胞(THP1细胞)的存活率为88％。

7-2

接下来，制备悬浮在不含FBS的Opti-MEM培养基中的细胞(THP1细胞)。将细胞悬浮液与有机溶剂一起倒入微流体装置中，并且在通过微流体装置期间产生包括细胞的第二子隔室。控制细胞悬浮液和有机溶剂的流速，并将包括细胞的第二子隔室的尺寸调整到约100μm。此外，通过施加350V至500V的电压以使第一子隔室和第二子隔室在微流体装置中合并以产生同时包括测试物质、细胞和第一条形码核酸的液滴(隔室)。也就是说，在微流体装置中，从一个通道注入包括测试物质和对应于测试物质的第一条形码核酸的一组液滴(第一子隔室)，从另一通道注入细胞悬浮液，每一个都与有机溶剂一起注入，从而最终产生同时封闭测试物质、细胞和第一条形码核酸的液滴(隔室)。例如，对于液滴的产生，可以使用根据E.Z.Macosko et al.,Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets,Cell.161,1202-1214(2015)中描述的流动聚焦装置(flow focusing device)。

另一方面，也可以通过使用微流体装置预先生成第一子隔室来生成液滴(隔室)，而不是使用带有凝胶珠的涡旋混合器进行搅拌和摇动处理，然后合并第一子隔室与包括细胞的第二子隔室。更具体地，根据Anal.Chem.2018,90,2,1273-1279中所描述的方法，在微流控装置中，从一个通道倾倒包括待测物质和对应于测试物质的第一条形码核酸的一组液滴(第一子隔室)，细胞悬液与有机溶剂一起从另一个通道倾倒，从而可以产生同时包括测试物质、细胞和第一条形码核酸的液滴(隔室)。例如，作为在微流体装置中将包括第一条形码核酸的液滴组(第一子隔室，直径约70μm的大小)和包括细胞的第二子隔室(直径约100μm大小)之间依次进行一对一的液滴融合的结果，如图17中的显微照片所示，证实了稳定地产生均匀的液滴(隔室)(直径约110μm)。

7-3

在上述有机溶剂相的液滴(隔室)中，细胞受到测试物质的影响，使得对应于测试物质的第一条形码核酸附着在细胞表面并且同时第一条形码核酸标记细胞成为可能。

7-4

接下来，可通过以下过程从隔室(液滴)中回收细胞。使用微芯片或类似物，收集100μL液滴(包括受测试物质影响并标记有第一条形码核酸的细胞的隔室)并转移到在下层容纳有500μL氟溶剂(例如，氢氟醚(HFE)，Novec(商标)7200High Performance Liquid(由3M Japan制造))的微管中。为了破坏液滴，将300μL的另一种有机溶剂(例如，全氟正辛醇)添加到该混合物中，并剧烈摇动微管10秒，然后静置。因此，混合物被分成了包括标记有第一条形码核酸的细胞的水性相和有机溶剂相这两层，并且可从水性相中回收标记有第一条形码核酸的细胞并制备细胞混合液。

当从隔室(液滴)回收细胞时，除了使用有机溶剂的方法外，还可以使用防静电枪(例如，Zerostat 3)来破坏液滴。使用微芯片或类似物，收集100μL液滴(包括受测试物质影响并标记有第一条形码核酸A的细胞的隔室)并转移到在下层容纳有100μL氟溶剂(例如，氢氟醚(HFE)，Novec(商标)7200High Performance Liquid(由3M Japan制造))的微管中。可通过将防静电枪的扳机向该微管拉回约10次来破坏液滴。从水性相中回收标记有第一条形码核酸A的细胞以制备细胞混合液。例如，使用防静电枪来破坏液滴的方法可根据例如Biomicrofluidics.22(4):044107,2017中描述的方法来进行。

7-5

接下来，使用成像细胞分选仪，基于响应于测试物质的添加观察到的细胞图像表型(例如，响应于刺激或药物处理的蛋白的核定位)，从细胞混合液中分选并回收细胞。具体而言，利用成像细胞分选仪对细胞图像表型发生变化的细胞进行分选的方法可通过例如与实施例4中相同的方法进行。

7-6

接下来，与实施例6相同，对由成像细胞分选仪分选并回收的细胞混合液进行单细胞分析，并且将测试物质的信息与通过成像细胞分选仪分选并回收的细胞的细胞表型信息相关联。当读取修饰每个细胞的DNA条形码和源自细胞的遗传信息时，可使用10x Genomics制造的Chromium Controller仪器和Single Cell 3'Reagent Kit v3，这是一种使用液滴技术的单细胞分析技术，如实施例5所述。此外，也可使用相同的试剂盒来读取回收细胞的基因表达信息。

实施例8：使用96-孔微板的细胞表型筛选方法

根据图18所示的示意图，对引起所需的表型变化的测试靶标进行寻找(在图18的实施例中，测试物质抑制LPS诱导的NF-κB的核定位)。

具体而言，在96孔微板的各孔中，按照参考例1中所描述的方法使第一条形码核酸附着于细胞(THP1细胞)，进而使其与测试物质接触。此时，在每个孔中，使用不同类型和浓度的测试物质以及不同类型的第一条形码核酸。由此，使96种测试靶标(24种测试物质×4种浓度)与附着于细胞(THP1细胞)的96种第一条形码核酸相关联。

本实验中使用的96种测试靶标(24种测试物质×4种浓度)和测试物质的功能(已知作用机制)示出在图19中。此外，图20A至图20C示出了在本实验使用的第一条形码核酸(条形码#)的序列。所使用的每个第一条形码核酸的序列对于每个测试靶标来说是独立不同的，并且第一条形码核酸与测试靶标相关联。

在该测试中，测试通过使96孔微孔板的各孔中的各测试物质、对应于该测试物质的第一条形码核酸和细胞接触的方法来进行。

接下来，使用成像细胞分选仪，基于响应于测试物质的添加而观察到的细胞图像表型(响应于LPS刺激，存在或不存在NF-κB蛋白的核定位)从细胞混合液中分选并回收细胞。

接下来，以与上述实施例相同的方式，对通过成像细胞分选仪分选和回收的细胞混合液进行单细胞分析。具体而言，当读取修饰每个细胞的DNA条形码和源自细胞衍生的遗传信息时，使用由10x Genomics制造的Chromium Controller仪器和Single Cell 3'Reagent Kit v3，这是一种使用液滴技术的单细胞分析技术，如实施例5和实施例6所述。

图21中示出了分选出的细胞的第一条形码核酸序列的富集水平。这里，纵轴的值超过1意味着样品比分选前的样品更浓缩。

阳性对照(LPS(-)：未发生NF-κB的核定位)通过图像分选富集了约20倍。

使用已知的NF-κB核定位抑制剂(TAK242：30μM)作为测试物质的细胞组通过图像分选富集了约1.5倍。

此外，在随机添加的受试物质中，使用木香烃内酯(Costunolide)作为测试物质的细胞组显著富集(木香烃内酯：抗炎活性)。

此外，分选出的样品中几乎没有阴性对照(LPS(+)：发生NF-κB的核定位)。

图22是其中证实通过成像细胞分选仪分选并回收的细胞是否确实呈现表型的照片。通过成像流式细胞术捕获细胞的照片图像，并且还通过成像流式细胞术计算核定位分数。关于核定位分数，值越高表示核定位程度越高。A是对应于阳性对照的细胞(LPS(-)：未发生NF-κB的核定位)，B是用LPS和已知的NF-κB核定位抑制剂(TAK242：30μM)作为测试物质处理的细胞，C是用LPS和木香烃内酯处理的细胞，其中木香烃内酯是通过细胞表型筛选被选为候选物的测试物质，D是对应于阴性对照的细胞(LPS(+)：发生NF-κB的核定位)。对应于阳性对照的细胞(LPS(-)：未发生NF-κB的核定位)、用LPS和已知的NF-κB核定位抑制剂(TAK242：30μM)作为测试物质处理的细胞、用LPS和通过细胞表型筛选被选为候选物的测试物质的木香烃内酯处理的细胞和对应于阴性对照的细胞D(LPS(+)：发生NF-κB的核定位)的核定位分数分别为1.58、0.92、0.23和0.30。

如上所述，根据本公开，使用成像细胞分选仪，能够如下进行测试靶标的细胞表型筛选：通过基于根据测试靶标观察到的细胞图像表型来分选附着有对应于各测试物质的核酸条形码的细胞；读取所附着的条形码核酸序列；以及进一步读取每个细胞的基因。

[附图标记列表]

1：光源

3：光照射区域

5：观察对象

7：光接收单元

9：存储单元

11：分析单元

13：光学系统控制单元

25：光接收区域

27：光接收系统控制单元

序列表

<110> 国立大学法人东京大学

新克赛特株式会社

国立研究开发法人理化学研究所

<120> 新型细胞表型筛选方法

<130> 235447PX

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头中的核酸

<400> 1

gtaacgatgg agctgtcact tggaattctc gggtgccaag g 41

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头中的核酸

<400> 2

agtgacagct ggatcgttac 20

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一条形码核酸A

<400> 3

ccttggcacc cgagaattcc accacaatga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一条形码核酸B

<400> 4

ccttggcacc cgagaattcc atgagaccta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cttggcaccc gagaattcc 19

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatattggc gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60

cca 63

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

caagcagaag acggcatacg agattacaag gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60

cca 63

Claims

1.一种用于筛选测试靶标的方法，所述方法包括：

制备多个细胞的步骤，所述多个细胞标记有与测试靶标相关联的第一条形码核酸并且用所述测试靶标处理；

使用成像细胞分选仪基于细胞表型来分选所述多个细胞的步骤；以及

使用所述第一条形码核酸作为指标来识别用于处理每个细胞的测试靶标的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中，所述用于处理每个细胞的测试靶标与每个细胞的表型相关联。

3.根据权利要求1或2所述的方法，

其中，识别的步骤进一步包括识别靶标位点的步骤，在所述靶标位点处，由所述测试靶标产生所述细胞期望的表型变化。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，进一步包括：

对每个细胞的基因组相关信息进行分析的步骤。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，

其中，制备细胞的步骤包括：通过将包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的液态介质与所述细胞混合来使所述第一条形码核酸与所述细胞相关联的步骤。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，

其中，制备细胞的步骤包括：通过将水凝胶珠加入到包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的液态介质中以产生包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的第一子隔室来使所述第一条形码核酸与所述测试靶标相关联的步骤。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，

其中，制备细胞的步骤包括：使包括所述测试靶标和所述第一条形码核酸的第一子隔室与包括所述细胞的第二子隔室融合，以产生包括所述测试靶标、所述第一条形码核酸和所述细胞的隔室。

8.根据权利要求7所述的方法，

其中，所述制备细胞的步骤包括：在所述隔室中，用所述测试靶标处理所述细胞。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，

其中，所述隔室和所述子隔室是液滴。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，

其中，所述制备细胞的步骤包括：从所述隔室中回收细胞的步骤。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，

其中，分选的步骤包括：基于细胞表型对由于所述测试靶标而发生预定反应的细胞进行分选的步骤。

12.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，

其中，对基因组相关信息进行分析的步骤包括：

制备多个隔室的步骤，所述多个隔室包括对应于细胞基因组或其衍生物的基因组相关核酸、所述第一条形码核酸和第二条形码核酸连接珠，其中，所述第二条形码核酸连接珠包括能够与所述细胞基因组或对应于其衍生物的所述基因组相关核酸或者所述第一条形码核酸杂交的多个第二条形码核酸；

产生源自所述杂交的复合物的扩增产物的步骤；以及

13.根据权利要求12所述的方法，

其中，所述基因组相关核酸是细胞基因组DNA，或者源自所述细胞基因组的RNA或其cDNA。

14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，

其中，每个第一条形码核酸包括第一通用条形码区域和第一杂交区域，所述第一通用条形码区域对于相同测试靶标是共有的，所述第一杂交区域能够与所述第二条形码核酸杂交。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，

其中，所述第一通用条形码区域的序列信息是用于确定所述测试靶标的指标。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，

其中，与所述第二条形码核酸连接珠连接的所述多个第二条形码核酸中的每一个包括：彼此共有的第二通用条形码区域、能够彼此区分的第二独特条形码区域，以及能够与所述基因组相关核酸或所述第一条形码核酸杂交的第二杂交区域。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，

其中，所述第二独特条形码区域的序列信息是用于确定所述基因组相关核酸的指标。

18.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，

其中，所述第二条形码核酸进一步包括PCR引物区域。

19.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，

其中，所述第二杂交区域包括与所述第一杂交区域或所述基因组相关核酸互补的核酸。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪是设置有分析单元的分析装置，其中通过光接收单元接收来自观察对象的散射光、透射光、荧光或电磁波并转化为电信号，并且基于从所述光接收单元输出的电信号按时间顺序提取的信号对所述观察对象进行分析，其中所述观察对象存在于由来自光源的光所照射的光照射区域中。

21.根据权利要求20所述的方法，

其中，在所述光源或所述光照射区域之间的光学路径上布置有光调制单元，所述光调制单元具有光学特性彼此不同的多个区域。

22.根据权利要求20或21所述的方法，进一步包括：

光学系统控制单元，所述光学系统控制单元基于由所述分析单元进行分析的分析结果来控制所述光源。

23.根据权利要求22所述的方法，

其中，来自所述光源的光具有多个光学区域，并且所述光学系统控制单元控制所述光学区域的光学结构。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，

其中，所述分析单元基于分析结果更新分类算法。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，

其中，基于由所述分析单元进行分析的结果控制所述光和所述光照射区域。

26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪包括流通池，所述流通池包括所述光照射区域。

27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪具有分选单元，所述分选单元基于所述分析单元的分析结果，对所述观察对象进行分类并分选所述观察对象。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪进一步设置有：流线宽度控制单元，通过所述流线宽度控制单元可变地控制所述观察对象在流动路径中移动的流线宽度；和

29.根据权利要求28所述的方法，

其中，所述流线宽度控制单元将所述流线宽度控制为第一流线宽度，所述第一流线宽度为对应于所述观察对象的直径的宽度；

30.根据权利要求28或29所述的方法，

其中，所述流线宽度控制单元将所述流线宽度控制为第二流线宽度，所述第二流线宽度为基于所述观察对象的直径的宽度并且比所述第一流线宽度宽；

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪设置有：

供所述观察对象流经的至少一条流动路径；

具有带状激发光的用于照射所述流动路径的光源；

成像单元，所述成像单元通过获得来自所述观察对象的荧光而获得所述观察对象的特定横截面的照片图像，所述观察对象穿过所述激发光照射的位置；和

32.根据权利要求31所述的方法，

其中，所述成像细胞分选仪基于由所述成像单元获得的横截面照片图像中示出的表示所述观察对象的形态的信息，对所述观察对象进行分选。

33.根据权利要求31或32所述的方法，

其中，所述流动路径是平行排列的多条流动路径，

所述多条流动路径被所述激发光照射，并且

所述成像单元获得流经多条流动路径中的每一条的所述观察对象的横截面照片图像。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，

其中，在所述光源和检测所述荧光的强度的图像传感器之间的光学路径上布置有光调制单元，所述光调制单元具有光学特性彼此不同的多个区域；并且

所述成像单元基于由所述图像传感器检测到的所述荧光的强度和所述光调制单元的光学特性，将所述观察对象的横截面的图像重构为拍摄的照片图像。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，

其中，所述测试靶标包括测试物质。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，

其中，所述测试靶标是测试物质。