CN114761571A - 可发酵糖组合物的制备方法及其发酵 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可发酵糖组合物的制备方法，其中用至少一种葡糖淀粉酶和至少一种寡‑1,6‑葡糖苷酶处理多糖组合物，并且其中在该过程中移出可发酵糖。因此，可以在发酵过程中利用其他不可发酵糖以产生发酵产物，比如醇或有机酸或氨基酸。

Description

可发酵糖组合物的制备方法及其发酵

技术领域

本发明涉及可发酵糖组合物的制备方法及其发酵。

背景技术

淀粉是可发酵糖的重要多糖来源之一。在淀粉处理过程中，淀粉被水解成糊精，并进一步水解成可发酵的糖，如葡萄糖或麦芽糖。用于这些水解过程的酶助剂是用于将包含直链淀粉和支链淀粉的高分子淀粉降解为包含较低分子量糊精的液化多糖(液化过程)的ɑ-淀粉酶(ɑ-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，以及切割那些糊精的ɑ-1,4糖苷键以释放葡萄糖(糖化过程)的葡糖淀粉酶(1,4-ɑ-D-葡聚糖葡糖水解酶，E.C.3.2.1.3)。

这种可发酵糖与食品行业高度相关，可以进一步处理，例如通过酵母发酵产生生物乙醇。

发明内容

淀粉的发酵可以通过在后续或单独的过程中进行糖化和发酵来实现，或者通过将两个步骤组合成单一的代表同步糖化和发酵的SSF过程(图1)。

在经济上理想的情况下，使用的液化多糖底物应几乎完全转化为发酵产物，损失尽可能少。然而，这种损失经常因不可发酵糖的不希望的积累而发生，从而引起经济和技术问题。那些不可发酵糖是不通过ɑ-1,4-糖苷键连接的寡糖，通常在发酵过程中不可使用。

这些不需要的糖苷的来源是(i)来自通过支链淀粉的剩余ɑ-1,6-键的多糖来源(ɑ-极限糊精)，(ii)来自作为长时间液化后不需要的副产物的淀粉酶，(iii)来自糖化中使用的葡糖淀粉酶的副活性或(iv)来自各个发酵生物体的新陈代谢。因此，非ɑ-1,4-键的糖苷，包括潘糖(ɑ-D-Glc-[1→6]-ɑ-D-Glc-[1→4]-D-Glc)、异麦芽三糖(ɑ-D-Glc-[1→6]-ɑ-D-Glc-[1→6]-D-Glc)、异麦芽糖(ɑ-D-Glc-[1→6]-ɑ-D-Glc)和/或海藻糖(ɑ-D-Glc-[1→1]-ɑ-D-Glc)在发酵过程中积累。这些积累的不可发酵糖在发酵过程中最多可占总糖苷的3％。因此，迫切需要一种在发酵或SSF期间利用α-1,4-键糖苷以及α-1,6-键糖苷的方法。这可以通过本发明的方法来实现。

本发明的一个方面是利用这些不可发酵糖，因此将它们从经济损失转变为增加的产量。

本发明的另一方面是使用寡-1,6-葡糖苷酶(寡糖ɑ-1,6-葡糖苷酶，E.C.3.2.1.10)作为上述发酵或SSF过程中问题的解决方案。

本发明的另一方面是提供可发酵糖组合物的制备方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且其中在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间(基本上)移出可发酵糖。

附图说明

图1：处理淀粉以获得发酵产物的方案。淀粉首先用ɑ-淀粉酶处理以液化获得糊精。然后将它们在含有如本发明所述的葡糖淀粉酶、寡-1,6-葡糖苷酶的混合物以及发酵生物体的SSF(同步糖化和发酵)中处理，以产生发酵产物。或者，分离过程将首先用葡糖淀粉酶将糊精糖化成糖浆，随后将其用作其中应用寡-1,6-葡糖苷酶的发酵步骤的底物。

图2：显示24小时后SSF中的乙醇产生(A)和潘糖的降解(B)。样品含有麦芽糖糊精和额外的2％潘糖。阴性对照(neg.)仅含有葡糖淀粉酶，+Agl1和+Gth分别含有葡糖淀粉酶加上187.5kU每吨糖/淀粉当量的所述寡-1,6-葡糖苷酶Agl1或Gth。阳性对照(pos.)含有额外的2％葡萄糖代替潘糖，和仅葡糖淀粉酶。

图3：显示24小时后来自麦芽糖糊精与额外的2％海藻糖(A)或2％异麦芽糖(B)或2％异麦芽三糖(C)或2％麦芽糖(D)或2％麦芽三糖(E)在SSF中的乙醇产生。阴性对照(neg.)仅含有葡糖淀粉酶，+Agl1和+Gth分别含有葡糖淀粉酶加上187.5kU每吨糖/淀粉当量的所述寡-1,6-葡糖苷酶Agl1或Gth。在(A)中，分别使用937.5kU每吨糖/淀粉当量的所述寡-1,6-葡糖苷酶Agl1或Gth。阳性对照(pos.)包含额外的2％葡萄糖代替各自的糖，和仅葡糖淀粉酶。

图4：示出当比较添加(o)或不添加(·)187.5kU每吨糖/淀粉当量的寡-1,6-葡糖苷酶(Agl1或Gth)的实验时，SSF期间乙醇浓度的过程。样品含有麦芽糖糊精和额外的2％潘糖。

图5：显示72小时后用液化淀粉在SSF中的乙醇产生。阴性对照(neg.)仅含有葡糖淀粉酶，+Agl1和+Gth分别含有葡糖淀粉酶加上187.5kU每吨糖/淀粉当量的所述寡-1,6-葡糖苷酶Agl1或Gth。

图6：显示SSF之前的液化淀粉(黑色)和含有5g/L葡萄糖①、麦芽糖②、异麦芽糖③、麦芽三糖④、潘糖⑤、异麦芽三糖⑥的标准品(虚线)的HPLC色谱图叠加图。液化淀粉不含可检测的不可发酵糖。R表示(HPLC流出物的)折射率。

图7：显示不含寡-1,6-葡糖苷酶(A)、含有Agl1(B)和含有Gth(C)以及比较含有5g/L葡萄糖①、麦芽糖②、麦芽三糖④、潘糖⑤、异麦芽糖③、异麦芽三糖⑥的标准品(黑色)在SSF后的残余糖的HPLC色谱图(虚线)。在SSF之后，未检测到不可发酵糖(潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、海藻糖)。R表示(HPLC流出物的)折射率。

图8：显示SSF期间使用液化淀粉在66小时和72小时后测量的潘糖浓度。阴性对照(neg.)仅含有葡糖淀粉酶，+Agl1和+Gth分别含有葡糖淀粉酶加上187.5kU每吨糖/淀粉当量的所述寡-1,6-葡糖苷酶Agl1或Gth。

图9：示出Agl1的生化特征。显示10mM和50mM的不同糖的活性。在本文中，术语“单位”(U)是指每分钟产生一微摩尔葡萄糖所需的酶量。误差线是至少三次的标准偏差。

图10：示出Gth的生化特征。显示100mM、50mM或10mM的不同糖和15mM的潘糖的活性。单位是指每分钟产生一微摩尔葡萄糖所需的酶量。误差线是至少三次的标准偏差。

图11：示出不同葡萄糖浓度(A)和不同麦芽糖浓度(B)对Agl1的产物抑制。Agl1在不同产物浓度下的残余活性与没有额外产物的活性有关。

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及用于制备可发酵糖组合物的SSF方法，其中通过至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质的酶混合物处理多糖组合物，并且其中在该过程中(基本上)移出可发酵糖。

如上所述，在实施方式中，在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间(基本上)移出可发酵糖。可以特别进行移出，以便防止具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的酶的抑制。因此，在可发酵糖组合物的制备方法的实施方式中，可以(基本上)移出可发酵糖。因此，在具体实施方式中，可能基本上没有可检测量的可发酵糖。

根据本发明的另一方面，首先用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，随后用至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理所得组合物，其中在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间(基本上)移出可发酵糖。

根据本发明的一个实施方式，通过在发酵过程中的消耗而除去可发酵糖。

在本文中，“发酵过程”是指通过代谢微生物的作用改变有机介质的生化组成的代谢过程。在所述过程中，有机介质的一部分(例如糖、蛋白质、营养物质)被微生物消耗以产生生物质、二氧化碳和其他发酵产物。

根据本发明的一个实施方式，发酵过程可以包括产生发酵产物。因此，在实施方式中，可发酵糖组合物可发酵以产生发酵产物。发酵产物可以包含由(发酵)微生物产生的任何分子。在另一实施方式中，发酵产物可以包含醇、有机酸或氨基酸中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式，可发酵糖组合物发酵以产生醇。对于这种醇发酵，酿酒酵母是工业乙醇生产中最常用的酵母，结合了高乙醇产生率和耐受性(18％v/v)以及在低pH环境中的生长(减少细菌污染)。然而，可以使用任何能够进行醇发酵的微生物，例如不同的酵母菌(例如有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、念珠菌属(Candida)、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、德克酵母属(Dekkera)/酒香酵母属(Brettanomyces))、细菌(细杆菌属(Microbacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、粘帚霉属(Gliocladium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter))和真菌(例如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus))。

根据另一方面，本发明涉及发酵产生醇的方法，其中用至少一种葡糖淀粉酶和至少一种寡-1,6-葡糖苷酶的酶混合物处理多糖组合物，从而提供一种可发酵糖组合物，其中可发酵糖同时发酵以产生醇。

根据本发明的另一实施方式，可发酵糖组合物发酵以产生有机酸或氨基酸。

可以通过发酵制备的有机酸是例如柠檬酸、葡糖酸、苹果酸、乳酸、乙酸、L-抗坏血酸、衣康酸、丙酸、琥珀酸和/或丙酮酸。

柠檬酸通常可以由曲霉(Aspergillus sp.)、青霉(Penicillium sp.)、念珠菌(Candida sp.)、黑粉菌属(Ustilago sp.)或棒状杆菌(Corynebacterium sp.)来制备。葡糖酸通常可以由葡糖杆菌属(Gluconobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、黑粉菌属(Ustilago)或粘帚霉属(Gliocladium)制备。乳酸通常可以由乳杆菌属(Lactobacillus)制备。乙酸通常可以由葡糖杆菌属(Gluconobacter)或醋杆菌属(Acetobacter)制备。L-抗坏血酸通常可由醋杆菌属(Acetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或棒状杆菌属(Corynebacterium)制备。衣康酸和苹果酸可以例如由曲霉属(Aspergillus)或黑粉菌属(Ustilago)制备。

根据另一方面，本发明涉及发酵产生有机酸的方法，其中用至少一种葡糖淀粉酶和至少一种寡-1,6-葡糖苷酶的酶混合物处理多糖组合物，从而提供一种可发酵糖组合物，其中可发酵糖同时发酵以产生有机酸。

可以通过发酵制备的氨基酸是例如丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸。

丙氨酸可以例如由嗜氨细杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)来制备。精氨酸可以适当地由某些粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens species)产生。谷氨酸可由谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)产生。谷氨酰胺可由谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)产生。赖氨酸可由乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)制备。脯氨酸可由醋酸棒杆菌(Corynebacteriumacetocidophylum)产生。苏氨酸和色氨酸可以由某些大肠杆菌物种产生。缬氨酸可以由某些乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum species)产生。

根据另一方面，本发明涉及发酵产生氨基酸的方法，其中用至少一种葡糖淀粉酶和至少一种寡-1,6-葡糖苷酶的酶混合物处理多糖组合物，从而提供一种可发酵糖组合物，其中可发酵糖同时发酵以产生氨基酸。

在另一个实施方式中，本发明还涉及由多糖组合物产生发酵产物的方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且其中在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间通过在发酵培养基中的发酵过程(基本上)除去所得的可发酵糖组合物，并且其中从发酵培养基中分离所需的发酵产物。

根据一个具体实施方式，在水性介质中，从发酵培养基中分离发酵产物(例如醇、有机酸或氨基酸)。

对于发酵产物的分离(任选在除去所有颗粒材料之后)，可以应用本领域已知的用于这些产物的任何方法，例如色谱法和(特别是对于低级醇)蒸馏。

在本文中，可发酵糖组合物包含葡萄糖、麦芽糖和其他β-1,4-键的寡糖(麦芽糊精)。

可以根据本发明使用的多糖组合物是包含麦芽糖糊精或其他糊精的任何组合物，并且可以例如是淀粉水解物。优选可以使用淀粉水解物，其可以通过酸处理或酶消化例如ɑ-淀粉酶从淀粉获得。淀粉可以源自任何多种植物来源(例如玉米、小麦、马铃薯、稻米和木薯)。

在本文中，具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质可以是指源自天然来源的天然葡糖淀粉酶或与源自天然来源的葡糖淀粉酶具有至少50％，例如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性，同时仍具有葡糖淀粉酶酶活性的变体或突变蛋白质。

为了用于根据本发明的发酵过程，酶类EC 3.2.1.3的葡糖淀粉酶可以选自多种微生物来源，主要是霉菌和酵母菌，还有细菌。工业用途来源的实例是曲霉属(Aspergillussp.)、根霉属(Rhizopus sp)和芽孢杆菌(Bacillus sp.)。已知从多糖链的非还原末端连续水解末端(1→4)-键的α-D-葡萄糖残基，释放β-D-葡萄糖。这种酶的系统名称是葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶。这种酶的等效名称可包括淀粉葡糖苷酶(AMG)、γ-淀粉酶、溶酶体α-葡糖苷酶、酸性麦芽糖酶、外-1,4-α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、γ-1,4-葡聚糖葡糖水解酶、酸性麦芽糖酶1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶。

在本文中，具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质可以意指源自天然来源的天然寡-1,6-葡糖苷酶或与源自天然来源的寡-1,6-葡糖苷酶具有至少50％，例如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性，同时仍具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的变体或突变蛋白质。

为了用于根据本发明的发酵过程，酶类EC 3.2.1.10的寡-1,6-葡糖苷酶可以选自不同来源，例如，来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)，但也来自人类或植物等高等生物。已知水解寡糖中的(1→6)-α-D-糖苷键。这种酶的系统名称是寡糖6-α-葡糖水解酶，这种酶也被称为寡-1,6-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、糊精6-α-D-葡聚糖水解酶、二糖酶、外-寡-1,6-葡糖苷酶、蔗糖酶、异麦芽糖酶、极限糊精酶、寡糖α-1,6-葡糖苷酶、蔗糖酶异麦芽糖酶。

几种寡-1,6-葡糖苷酶序列是公开可用的，但是并没有显示它们在工艺条件下(pH4.3-4.8、30-35℃用于发酵醇产生、伴随活微生物和高糖含量)的性能以及它们在发酵过程中使用的任何影响。

特别地，根据本发明的方法可以应用基于如WO2009/152285和US9127287中所述的热葡糖苷副芽孢杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)的寡-1,6-葡糖苷酶Gth或基于如US7268221B2和US7615365B2中所述的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003的寡-1,6-葡糖苷酶Agl1的酶。

根据本发明的方法的这种成功表现是特别令人惊讶的，因为(i)不可发酵糖的量非常低，导致酶活性低，(ii)可发酵糖以及因此的寡-1,6-葡糖苷酶反应产物的含量可能非常高，因此可能导致产物抑制，并且(iii)1,1-键的不可发酵糖(海藻糖)也可以转化为可发酵糖并导致发酵产物产量的增加。最令人惊讶的是，对SSF的糖谱和发酵产生的影响超过了不可发酵糖的预期含量。这在实施例3中进行了说明，其中我们发现发酵产物增加，尽管不含有寡-1,6-葡糖苷酶的对照没有可检测量的不可发酵糖。

我们在应用条件下的实验令人惊讶地表明，使用短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)UCC2003(Agl1；氨基酸序列SEQ ID NO:1)和热葡糖苷副芽孢杆菌(Parageobacillusthermoglucosidasius)(Gth；氨基酸序列SEQ ID NO:2)的寡-1,6-葡糖苷酶中任一种与葡糖淀粉酶的配合使发酵产量显著提高。

对于根据本发明的用途，具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质可以包括与短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003的寡-1,6-葡糖苷酶Agl1的氨基酸序列SEQ IDNO:1或与热葡糖苷副芽孢杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)的寡-1,6-葡糖苷酶Gth的氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少50％，例如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性，同时仍具有寡-1,6-葡糖苷酶活性的蛋白质。

已经发现，在实验室规模的运行的SSF中，添加Agl1和Gth后，乙醇产量增加了2％，其中32％糊精补充有潘糖，30℃，pH 4.8，进行72小时，使用商业葡糖淀粉酶(415g/t淀粉

GA L-E5)和醇酵母(6g/L发酵

AL-18)。

根据本发明的方法中使用的酶可以从天然产生这种酶的生物中获得。或者，酶可以由宿主细胞产生，宿主细胞通过本领域已知的重组技术转化以产生本发明方法中所需的酶或几种酶。

在一个实施方式中，在本发明的过程期间可以以产生酶的全细胞的形式应用酶。

在另一个的实施方式中，在本发明的方法中可以以产生酶的细胞的裂解物的形式应用酶。

在另一个实施方式中，在本发明的方法中可以以或多或少纯化的形式应用酶，例如以基本上不含来自产生细胞的颗粒材料的形式。酶的纯化可以通过本领域已知的任何方法进行。

在另一个实施方式中，在本发明的方法中可以以固定化形式应用酶。许多用于固定酶的有用方法是本领域已知的。酶可以例如通过共价结合到合适的表面或载体、通过吸附到合适的表面、通过包埋例如在微球中，通过交联例如与彼此和/或与合适的基质材料，或通过亲和结合来固定。

酶葡糖淀粉酶和寡-1,6-葡糖苷酶可以以选择为酶促转化最佳的浓度用于本发明的方法中，并且浓度可以在10kU和1000kU每吨干麦片之间的范围内，优选在50kU和200kU每吨干麦片之间的范围内。

考虑到用作根据本发明的方法的起始材料的多糖组合物的性质，该方法通常在水性工艺介质中，优选在水中进行。然而，工艺介质也可以包含任何水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或任何其他缓冲溶液，或缓冲溶液的混合物，或无缓冲的溶液，或含有有机溶剂，例如乙醇、甲醇、DMSO或任何有机溶剂或有机溶剂的组合。

在本发明的过程期间，培养基的pH值可以在4.0至8.0之间变化，最佳范围为4.0至5.5，更具体地为4.3至4.8，并且还可取决于通过发酵所产生产物的性质和浓度。

在本发明的过程期间，温度范围可以在20℃至70℃之间，最佳范围为30℃至50℃，更具体地为30℃至35℃。

本领域技术人员将清楚，可以基于发酵产物的性质和浓度以及发酵生物体来选择工艺条件。因此，可以特别选择工艺条件以适用于发酵生物体以产生(所需)发酵产物。

实施例

一般方法

克隆和表达

为了在本发明描述的方法中使用Agl1和Gth，酶需要以其酶活性形式应用。本领域技术人员将有能力使用由合适的表达宿主组成的合适的表达系统，例如微生物，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和适合表达宿主的合适表达构建体，以产生活性酶。

Agl1和Gth的基因来自公共数据库(美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI))[Agl1:GenBank FJ386389.1；Gth:GenBank NZ_CP012712.1Region:1287657-1289345]并克隆到本领域已知的合适的芽孢杆菌(Bacillus)表达载体中，例如pUB110(美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)

37015^TM,Zyprian&Matzura 1986)或pMA5(Dartois等人.1994)，包含基因上游的启动子序列，如Pveg、PhpaII、PamyE或P43，以及基因下游的终止序列，如rrnB。如果使用这种常见的穿梭载体，则需要存在用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中繁殖的复制起点和用于在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中复制的复制起点以及选择标志物，例如氨苄青霉素或卡那霉素。在本发明中，在转化到作为酶产生的示例性宿主的枯草芽孢杆菌之前，在大肠杆菌中构建和繁殖这种载体。

为了产生Agl1和Gth，枯草芽孢杆菌作为液体培养物在LB培养基中培养过夜。将1毫升液体培养物用作接种物，以在100mL A5低磷酸盐培养基(1.76g/L K₂HPO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄、3.63g/L Na₂HPO₄、10g/L葡萄糖、1.23g/L MgSO4*7H₂O、10g/L酪蛋白氨基酸，pH 6.8)添加微量元素(50mM FeSO₄、10mM MnSO₄、10mM ZnSO₄、2mM CoSO₄、2mM CuSO₄、2mM NiSO₄、2mMNa₂MoO₄、2mM Na₂SeO₃、2mM H₃BO₃)中表达。在16小时组成型表达后，通过以8000xg离心收集细胞并重悬于20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。在Branson超声仪中通过超声破碎细胞(占空比50％输出控制7-9，2分钟，最多重复5次)。使用无菌过滤的粗芽孢杆菌(Bacillus)提取物作为酶产品，或以17,000xg离心以除去细胞碎片并使用阴离子交换色谱法(XK-16柱，IEX-Q-Beads，Bio-Rad Laboratories,Inc.，US)，然后是尺寸排阻色谱法(Superdex 200Increase10/300GL，GE Healthcare)。

蛋白质的量的测定

酶产品(分别为Agl1和Gth)的量通过标准SDS-PAGE上的光密度测定和通过活性测量来确定。通过BCA测定法(Pierce，Thermo Fischer Scientific)测定全蛋白含量和纯化酶浓度。

活性测量

通过葡萄糖测定试剂盒(D-Glucose HK Assay Kit，Megazyme u.c.IRE)对葡糖苷酶活性进行定量。在50mM Britton-Robinson缓冲液(pH5)中，以15mM的浓度将潘糖添加到酶产品中。使反应在37℃下进行10分钟。加入60μL 1M NaOH终止反应。加入60μL 1M HCl中和pH。按照制造商的说明，使用葡萄糖测定试剂盒对产生的葡萄糖进行定量。一单位(U)是指每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

乙醇产量的定量

乙醇通过HPLC定量。在SSF结束时或在SSF期间在设定的时间点取样。样品以17,000xg离心1分钟并无菌过滤(0.2μm)。在测量之前将样品冷冻在-80℃。在Shimadzu HPLC系统上用Aminex 87C柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.，US)测定乙醇。

残留糖的定量

残留糖通过HPLC定量。在SSF结束时或在SSF期间在设定的时间点取样。将样品以17 000xg离心1分钟并无菌过滤(0.2μm)。在测量之前将样品冷冻在-80℃。在Agilent1200HPLC系统上使用Zorbax NH2柱(Agilent Technologies,Inc.，US)测定残留糖。

液化淀粉的分析

液化淀粉在使用前在Zorbax NH2柱(Agilent Technologies,Inc.，US)上分析单糖、二糖和三糖类型和含量，在Aminex 42A柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.，US)上分析聚合度(DP)，检测DP1-DP6含量。HPLC在Shimadzu HPLC系统上进行。

实施例1：

将不可发酵糖转化为乙醇以测试SSF设备中寡-1,6-葡糖苷酶的功能

同步糖化和发酵

对于同步糖化和发酵(缩写为SSF)，使用作为芽孢杆菌粗提物的寡-1,6-葡糖苷酶(Agl1或Gth)。将

麦芽糊精12(Roquette，FR)以300g/L溶解在SSF培养基(5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8)中。以20g/L添加潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、麦芽糖、麦芽三糖或海藻糖。作为阳性对照，加入20g/L葡萄糖代替相应的糖。含有淀粉水解物(麦芽糊精)和糖的SSF培养基经过无菌过滤(0.2μm)。酵母(

AL-18,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)在YINaC培养基(50g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/LK₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄*7H₂O、2g/LNH₄Cl在50mM柠檬酸钠中，pH 4.8)中在37℃下生长2天，然后在5100rpm和8℃下离心15分钟收获。将颗粒状酵母以6g/L的最终浓度添加到SSF培养基中。以40g每吨干淀粉当量添加葡糖淀粉酶(

GA L-E5,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)。添加酶产品Agl1或Gth至终浓度为187.5kU每吨干淀粉当量。对于含有海藻糖的SSF，Agl1或Gth的添加量为937.5kU每吨干淀粉当量。作为阴性对照，如上所述的SSF在没有寡-1,6-葡糖苷酶/酶产品的情况下运行。SSF在30℃下进行，不搅拌或摇动，进行24小时。

结果：

添加潘糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加1.01个百分点(v/v，增加92％)，使用Gth增加0.94％个百分点(v/v，增加85％)(图2A)。乙醇产量与阳性对照没有显著差异(-0.99个百分点v/v；90％)。使用Agl1时潘糖浓度降低96％，使用Gth时潘糖浓度降低96％，而在阴性对照中仅使用葡糖淀粉酶时降低29％(图2B)。

添加海藻糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加1.86个百分点(v/v，增加226％)，使用Gth增加0.26个百分点(v/v，增加31％)(图3A)。与阴性对照相比，阳性对照中的乙醇产量高1.95个百分点(v/v)(增加238％)。

添加异麦芽糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加0.98个百分点(v/v，增加74％)(图3B)。乙醇产量与来自阳性对照的没有显著差异。

添加异麦芽三糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加0.48个百分点(v/v，增加40％)，使用Gth增加0.57个百分点(v/v，增加48％)(图3C)。阳性对照的乙醇产量比阴性对照高1.00个百分点(v/v)(增加83％)。

当添加麦芽糖或麦芽三糖时，乙醇产量没有增加(图3D、E)。添加麦芽糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加0.03个百分点(v/v，增加1.5％)，使用Gth增加0.06个百分点(v/v，增加2.8％)。阳性对照的乙醇产量比阴性对照高0.11个百分点(v/v)(增加5.0％)。添加麦芽三糖后，与阴性对照相比，24小时后使用Agl1的乙醇浓度增加0.03个百分点(v/v，增加1％)，使用Gth增加0.00个百分点(v/v，增加0％)。阳性对照的乙醇产量比阴性对照高0.10个百分点(v/v)(增加4.0％)。

结论：

在SSF设备中，对于不可发酵糖潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和海藻糖，与不含寡-1,6-葡糖苷酶的对照相比，观察到乙醇产量增加，表明酶产品相对于在具有葡糖淀粉酶和发酵生物体的SSF中将不可发酵糖转化为葡萄糖的全功能。通过添加可发酵糖麦芽糖和麦芽三糖获得的产量不受寡-1,6-葡糖苷酶的影响。

实施例2：

将潘糖转化为乙醇以测试寡-1,6-葡糖苷酶在工业相关SSF设备中的功能

同步糖化和发酵

对于SSF，使用粗芽孢杆菌提取物作为酶产品。将

麦芽糊精12以300g/L溶解在SSF培养基(5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8)中。以20g/L添加潘糖。作为阳性对照，加入20g/L葡萄糖。含有淀粉和糖的SSF培养基经过无菌过滤(0.2μm)。酵母(

AL-18,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)在YINaC培养基(50g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/LK₂HPO₄、0.5g/LMg₂SO₄*7H₂O、2g/L NH₄Cl在50mM柠檬酸钠中，pH 4.8)中在37℃下生长2天，然后在5100rpm和8℃下离心15分钟收获。将颗粒状酵母以6g/L的最终浓度添加到SSF中。以400g每吨干淀粉当量添加葡糖淀粉酶(

GA L-E5,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)。添加酶产品Agl1或Gth至终浓度为187.5kU每吨干淀粉当量。作为阴性对照，没有寡-1,6-葡糖苷酶/酶产品添加。SSF在30℃下进行，不搅拌或摇动，进行72小时。

结果：

添加潘糖后，与阴性对照相比，72小时后使用Agl1的乙醇浓度增加1.16个百分点(v/v，增加8％)(图4A)，使用Gth增加1.77个百分点(v/v，增加15％)(图4B)。乙醇产量与阳性对照没有显著差异。

结论：

在SSF中，在使用产品推荐剂量的葡糖淀粉酶和发酵生物体的处理时间为72小时的情况下，对于不可发酵糖潘糖，与不含寡-1,6-葡糖苷酶的对照相比，观察到乙醇产量增加。尽管葡糖淀粉酶能够水解相应量的潘糖，但检测到寡-1,6-葡糖苷酶Agl1和Gth对乙醇产量的显著积极影响。寡-1,6-葡糖苷酶在pH 4.8和30℃下72小时稳定且有活性。

实施例3：

商业液化淀粉的乙醇产量增加，显示在工业相关工艺条件下使用工业相关底物的 功能

同步糖化和发酵

对于SSF，使用粗芽孢杆菌提取物作为酶产品。将来自商业工厂的不含可检测量的潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖或海藻糖的酸化液化淀粉(pH 2.0)调至pH 4.8。将SSF培养基组分(5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8)添加到液化淀粉(300g/L)中。含有淀粉的SSF培养基经过无菌过滤(0.2μm)。酵母(

AL-18,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)在YINaC培养基(50g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄*7H₂O、2g/L NH₄Cl在50mM柠檬酸钠中，pH 4.8)中在37℃下生长2天，然后在5100rpm和8℃下离心15分钟收获。将颗粒状酵母以6g/L的最终浓度添加到SSF中。以200g每吨干淀粉当量添加葡糖淀粉酶(

GA L-E10,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)。添加酶产品Agl1或Gth至终浓度为187.5kU每吨干淀粉当量。作为对照，没有寡-1,6-葡糖苷酶/酶产品添加。SSF在30℃下进行，不搅拌或摇动，进行72小时。

结果：

与没有寡-1,6-葡糖苷酶的阴性对照相比，72小时后使用Agl1的乙醇浓度增加0.30个百分点(v/v，增加2％)，使用Gth增加0.47个百分点(v/v，增加4％)(图5)。在用于SSF之前，在液化淀粉中未检测到不可发酵糖(图6)。有趣的是，在SSF后未检测到残留糖，既没有可发酵的也没有不可发酵的，并且在对照和含有寡-1,6-葡糖苷酶的SSF中都没有(在对照中举例说明，图7)。对于本领域技术人员来说，在SSF期间2％的乙醇产量增加是显著的。

结论：

在工业相关条件下，对商业液化淀粉进行糖化和发酵后，与不含寡-1,6-葡糖苷酶的对照相比，在SSF中添加寡-1,6-葡糖苷酶时，观察到乙醇产量增加。

有趣的是，在任何进行的SSF中，在SSF之前和之后都没有检测到不可发酵糖。特别是，在没有寡-1,6-葡糖苷酶的SSF中没有检测到残留糖，这表明即使在SSF之后没有可检测到的残留糖，酶产品的添加对SSF也有积极的影响。

实施例4：

使用商业液化淀粉进行SSF后DP3(潘糖)糖含量降低，以在行业相关工艺条件下显 示与行业相关底物的功能

同步糖化和发酵

对于SSF，使用粗芽孢杆菌提取物作为酶产品。将来自商业工厂的不含可检测量的潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖或海藻糖的酸化液化淀粉(pH 2.0)调至pH 4.8。将SSF培养基组分(5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8)添加到液化淀粉(300g/L)中。含有淀粉的SSF培养基经过无菌过滤(0.2μm)。酵母(

AL-18,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)在YINaC培养基(50g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、1g/L K₂HPO₄、0.5g/L Mg₂SO₄*7H₂O、2g/L NH₄Cl在50mM柠檬酸钠中，pH 4.8)中在37℃下生长2天，然后在5100rpm和8℃下离心15分钟收获。将颗粒状酵母以6g/L的最终浓度添加到SSF中。以200g每吨干淀粉当量添加葡糖淀粉酶(

GA L-E10,WeissBioTech GmbH,Ascheberg,Germany)。α-淀粉酶(

BASF)的添加量为200g每吨干淀粉当量，以模拟工业过程中α-淀粉酶的不完全除去，这通常是不可发酵糖增加的原因。添加酶产品Agl1或Gth至终浓度为187.5kU每吨干淀粉当量。作为对照，没有寡-1,6-葡糖苷酶/酶产品添加。SSF在30℃下进行，不搅拌或摇动，进行72小时。

结果：

60小时后在所有样品中检测到潘糖。在不含寡-1,6-葡糖苷酶的对照SSF中，60小时后检测到5.4g/L潘糖，72小时后降至3.8g/L(图8)。在含有Agl1的SSF中，60小时后检测到2.7g/L潘糖(与对照相比，潘糖减少50％)，72小时后完全水解。在含有Gth的SSF中，60小时后检测到2.3g/L潘糖(与对照相比潘糖减少57％)，72小时后完全水解。

结论：

在SSF期间，用最初不含不可发酵糖的商业液化淀粉产生不可发酵糖潘糖。与不含寡-1,6-葡糖苷酶的对照相比，添加寡-1,6-葡糖苷酶的潘糖水解进行得更快，并且在此过程中完全水解为可发酵糖，导致DP3残留糖的总体减少。

实施例5：

生化表征

活性测定

对于活性测量，在37℃下将酶Agl1与10mM和50mM潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、麦芽糖、麦芽三糖和海藻糖在Britton-Robertson缓冲液中孵育10分钟，pH 5。在37℃下将酶Gth与15mM潘糖、10mM和50mM异麦芽糖，以及10mM、50mM和100mM麦芽三糖和海藻糖，在Britton-Robertson缓冲液，pH 5中孵育10分钟。

用60μL的1M NaOH终止反应，然后加入60μL的1M HCl。

使用标准化葡萄糖测定试剂盒(D-Glucose HK Assay Kit，Megazyme u.c.IRE)对产生的葡萄糖的量进行定量。

按照说明书中的规定测定葡萄糖浓度。单位定义为每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

通过将Britton-Robinson缓冲液调节到相应的pH值，从pH 3至pH 9研究pH值范围。

通过孵育酶并测量它们在相应温度的活性，从30℃至80℃研究温度范围。

通过Agl1在50℃下和Gth在80℃下预孵育，并测量达到初始活性的50％所需的时间来确定温度稳定性。

通过在工艺条件(不含淀粉的SSF培养基，pH 4.8，30℃)下孵育酶72小时并测量剩余活性来确定工艺稳定性。

通过在4℃下测量12个月的时间段内储存在玻璃容器中的稳定制剂(50％v/v甘油)中酶的活性，测定储存稳定性。从这些数据推断储存稳定性。“没有活性损失”定义为大于初始活性95％的外推活性。

通过测量在0–50％(w/v)的葡萄糖或麦芽糖存在下，通过寡-1,6-葡糖苷酶活性的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，Megazyme u.c.，Ireland)的水解，测定产物抑制。pNPG通过光度计在405nm处进行定量。产物抑制定义为IC50，它描述在2mM pNPG下将酶活性降低50％所需的抑制量。

结果：

活性测量证实寡糖潘糖、异麦芽糖和异麦芽三糖的降解(图9、图10)。Agl1还分解海藻糖。在潘糖的情况下，产生一当量的葡萄糖和一当量的麦芽糖。对于异麦芽糖、异麦芽三糖和海藻糖，葡萄糖是两个、三个和两个当量的唯一产物。

Agl1的pH范围为4.5-8.0，温度范围为30-50℃。Gth的pH范围为4.5-8.0，温度范围为30-70℃。

在50℃下Agl1具有t1/2＝30分钟的热稳定性(50％酶变性所需的时间)，在30℃下72小时后的工艺稳定性为80％，在4℃下的储存稳定性为18-24个月没有活性损失。

在80℃下Gth具有t1/2＝30分钟的热稳定性，在30℃下72小时后的工艺稳定性为80％，在4℃下的储存稳定性为18-24个月没有活性损失。

Agl1的产物抑制显示对于葡萄糖的IC50为0.6％w/v或6g/L，对于麦芽糖的IC50为10％w/v或100g/L(图11A、B)。

结论：

酶Agl1和Gth在活性和稳定性方面具有不同的最佳温度范围。Agl1不太稳定，在50℃下30分钟后失去50％的活性，而Gth非常稳定，在80℃下30分钟后失去50％的活性。两种酶在30℃下在72小时的整个工艺持续时间内都是稳定的。这很重要，因为该工艺开始时的高葡萄糖和麦芽糖浓度抑制具有寡-1,6-葡糖苷酶活性的酶。生化表征显示不同的底物光谱和不同的底物特异性，这不影响上述发明中的表现。

定义

如本文所用，本领域技术人员将理解术语“基本上”，例如“基本上包括”。术语“基本上”还可以包括具有“完全”、“全部”、“所有”等的实施方式。因此，在实施方式中，形容词基本上也可以删除。在适用的情况下，术语“基本上”还可以涉及90％或更高，例如95％或更高，尤其是99％或更高，甚至更特别是99.5％或更高，包括100％。术语“包括”还包括其中术语“包括”意指“由……组成”的实施方式。术语“和/或”尤其涉及在“和/或”之前和之后提及的一项或多项。例如，短语“项1和/或项2”和类似的短语可以涉及项1和项2中的一项或多项。术语“包括”在一个实施方式中可以指“由...组成”，但在另一个实施方式中还可以指“包含至少定义的种类和任选的一种或多种其他种类”。

可以组合本专利中讨论的各个方面以提供额外的优点。此外，某些特征可以构成一个或多个分案申请的基础。

引用的非专利文献

Zyprian&Matzura 1986:Zyprian,E.,Matzura,H.:Characterization ofsignals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUB110and development of a gram-positive expression vector system.DNA 5:919-25(1986)。

Dartois et al.1994:Dartois,V.,Coppée,Y.-C.,Colson,C,Baulard,A.:Genetic analysis and overexpression of lipolytic activity in Bacillussubtilis.Applied and Environmental Microbiology 60,1670-1673(1994)。

实施方式

其中，本发明提供实施方式，比如也在上文所述，其中实施方式仅为参考而编号：

1.一种可发酵糖组合物的制备方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且其中在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间移出可发酵糖。

2.根据实施方式1的方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质的混合物处理多糖组合物。

3.根据实施方式1的方法，其中首先用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且随后用至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理所得组合物。

4.根据前述实施方式中任一项的方法，其中在发酵过程中消耗可发酵糖。

5.根据实施方式4的方法，其中将可发酵糖组合物发酵以产生醇。

6.根据实施方式4的方法，其中将可发酵糖组合物发酵以产生有机酸或氨基酸，所述有机酸比如为柠檬酸、葡糖酸、乳酸、乙酸、L-抗坏血酸、衣康酸、丙酸、琥珀酸和/或丙酮酸。

7.根据前述实施方式中任一项的方法，其中多糖组合物是淀粉水解物。

8.根据前述实施方式中任一项的方法，其中具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质是属于酶类别EC 3.2.1.3的葡糖淀粉酶。

9.根据前述实施方式中任一项的方法，其中具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质是属于酶类别EC 3.2.1.10的寡-1,6-葡糖苷酶酶。

10.根据前述实施方式中任一项的方法，其中使用来自短双歧杆菌UCC2003(Agl1)和/或来自热葡糖苷副芽孢杆菌(Gth)的具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质。

11.根据实施方式10的方法，其中具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质是与短双歧杆菌UCC2003(Agl1)的寡-1,6-葡糖苷酶或热葡糖苷副芽孢杆菌(Gth)的寡-1,6-葡糖苷酶中任一个具有至少50％，比如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％序列同一性的蛋白质。

12.根据前述实施方式中任一项的方法，其中由酶混合物的处理在水性工艺介质中进行。

13.根据前述实施方式中任一项的方法，其中由酶混合物的处理在4.0至8.0范围内的酸性pH下进行，最佳pH范围为4.0至5.5，更具体地在pH 4.3至4.8。

14.根据前述实施方式中任一项的方法，其中由酶混合物的处理在30℃至70℃的温度范围内进行，最佳范围为30℃至50℃，更具体地为30℃至35℃。

15.一种由多糖组合物产生发酵产物的方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且其中在用具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间在发酵培养基中通过发酵过程除去所得的可发酵糖组合物，并且其中从发酵培养基中分离所需的发酵产物。

16.根据实施方式15的方法，其中发酵产物选自醇、有机酸和氨基酸。

17.一种由多糖组合物产生发酵产物的方法，其特征在于根据实施方式1(或前述实施方式2-14中任一项)的方法处理多糖组合物，随后在发酵培养基中进行发酵过程，并且其中从发酵培养基分离所需的发酵产物。

18.根据前述实施方式，比如实施方式1-9和/或实施方式15-17中任一项的方法，其中使用来自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003(Agl1)和/或来自热葡糖苷副芽孢杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)(Gth)的具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质。

19.根据实施方式18的方法，其中具有寡-1，6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质是与由SEQ ID NO:1表示的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003(Agl1)的寡-1,6-葡糖苷酶或由SEQ ID NO:2表示的热葡糖苷副杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)(Gth)的寡-1,6-葡糖苷酶酶中任一个具有至少50％，比如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％序列同一性的蛋白质。

术语“多个”是指两个或多个。

此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的要素，而不一定用于描述次序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方式能够以除了本文描述或图示之外的其他顺序操作。

设备、装置或系统可以在本文中在操作期间进行描述。如本领域技术人员将清楚的，本发明不限于操作方法或操作中的设备、装置或系统。

应当注意，上述实施方式说明而不是限制本发明，并且本领域技术人员将能够在不脱离所附权利要求的范围的情况下设计许多替代实施方式。

在权利要求中，放置在括号之间的任何参考符号不应解释为限制权利要求。

动词“包括”及其结合的使用不排除权利要求中所述之外的要素或步骤的存在。除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应解释为包容性的含义，而不是排他性或穷举性的含义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上。

一个要素之前的冠词“一”或“一个”不排除多个这样要素的存在。

本发明可以通过包括几个不同要素的硬件以及通过适当编程的计算机来实现。在设备权利要求、或装置权利要求或系统权利要求中，列举了若干手段，这些手段中的若干可以由同一个硬件项来体现。在相互不同的从属权利要求中列举了某些措施这一事实并不表明这些措施的组合不能有利地使用。

本发明还提供一种控制系统，该控制系统可以控制设备、装置或系统，或者可以执行这里描述的方法或过程。此外，本发明还提供一种计算机程序产品，当在功能上耦合到设备、装置或系统或由其包括的计算机上运行时，控制此类设备、装置或系统的一个或多个可控要素。

本发明还适用于包括在说明书中描述和/或在附图中示出的一个或多个特征的设备、装置或系统。本发明还涉及一种方法或过程，包括在说明书中描述和/或在附图中示出的一个或多个特征。

可以组合本专利中讨论的各个方面以提供额外的优点。此外，本领域技术人员将理解实施方式可以组合，并且也可以组合多于两个的实施方式。此外，某些特征可以构成一个或多个分案申请的基础。

序列表

<110> 魏斯生物技术有限责任公司

<120> 可发酵糖组合物的制备方法及其发酵

<130> -

<160> 2

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 607

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌 UCC2003

<220>

<223> ACM89182.1 α-葡糖苷酶 1

<400> 1

Met Met Thr Thr Phe Asn Arg Ala Ile Ile Pro Asp Ala Ile Arg Thr

1 5 10 15

Asn Gly Ala Thr Pro Asn Pro Trp Trp Ser Asn Ala Val Val Tyr Gln

20 25 30

Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Gln Asp Thr Asn Gly Asp Gly Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Lys Gly Ile Thr Ser Arg Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Gly Val

50 55 60

Asp Val Leu Trp Leu Ser Pro Val Tyr Lys Ser Pro Gln Asp Asp Asn

65 70 75 80

Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Gln Asp Ile Asp Pro Leu Phe Gly Thr

85 90 95

Leu Asp Asp Met Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala His Lys Arg Gly Leu

100 105 110

Lys Val Val Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Ala

115 120 125

Trp Phe Glu Ala Ser Lys Asn Lys Asp Asp Glu His Ala Asp Trp Tyr

130 135 140

Trp Trp Arg Pro Ala Arg Pro Gly Thr Thr Pro Gly Glu Pro Gly Ser

145 150 155 160

Glu Pro Asn Gln Trp Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Ser Ala Trp Glu Tyr

165 170 175

Cys Pro Glu Arg Gly Glu Tyr Tyr Leu His Gln Phe Ser Lys Lys Gln

180 185 190

Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro Ala Val Arg Arg Ala Val Tyr Asp

195 200 205

Met Met Asn Trp Trp Leu Asp Arg Gly Ile Asp Gly Phe Arg Met Asp

210 215 220

Val Ile Thr Leu Ile Ser Lys Arg Thr Asp Ala Asn Gly Arg Leu Pro

225 230 235 240

Gly Glu Tyr Gly Ser Glu Leu Asp Asp Leu Pro Val Gly Glu Glu Gly

245 250 255

Tyr Ser Asn Pro Asn Pro Phe Cys Ala Asp Gly Pro Arg Gln Asp Glu

260 265 270

Phe Leu Lys Glu Met Arg Arg Glu Val Phe Ala Gly Arg Glu Gly Phe

275 280 285

Leu Thr Val Gly Glu Ala Pro Gly Ile Thr Pro Val Arg Asn Glu His

290 295 300

Ile Thr Asn Pro Ala Asn Gly Glu Leu Asp Met Leu Phe Leu Phe Asp

305 310 315 320

His Val Asp Phe Asp Cys Asp Gly Val Lys Trp Lys Pro Leu Pro Leu

325 330 335

Asp Leu Pro Gly Phe Lys Arg Ile Met Ala Gly Tyr Gln Thr Ala Val

340 345 350

Glu Asn Val Gly Trp Ala Ser Leu Phe Thr Gly Asn His Asp Gln Pro

355 360 365

Arg Val Val Ser Arg Trp Gly Asp Asp Ser Ser Glu Glu Ser Arg Val

370 375 380

Arg Ser Ala Lys Ala Leu Gly Leu Met Leu His Met His Arg Gly Thr

385 390 395 400

Pro Tyr Val Tyr Gln Gly Glu Glu Leu Gly Met Thr Asn Ala His Phe

405 410 415

Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Arg Asp Leu Glu Ser Leu Asn Ala Tyr Arg

420 425 430

Gln Arg Val Glu Glu Ala Lys Val Gln Ser Pro Glu Ser Met Leu Ala

435 440 445

Gly Ile Ala Ala Arg Gly Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp

450 455 460

Asp Gly Ser Ala Tyr Ala Gly Phe Thr Ala Pro Asp Ala Ala Thr Glu

465 470 475 480

Pro Trp Ile Ser Val Asn Pro Asn His Ala Glu Ile Asn Ala Ala Gly

485 490 495

Glu Phe Asp Asp Pro Asp Ser Val Tyr Ala Phe Tyr Lys Lys Leu Ile

500 505 510

Ala Leu Arg His Asn Ser Ser Ile Val Ala Ala Gly Glu Trp Gln Leu

515 520 525

Ile Asp Ala Asp Asp Ala His Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr Leu Gly

530 535 540

Asn Glu Arg Leu Leu Val Val Val Asn Leu Ser Gly Arg Thr Val Asp

545 550 555 560

Leu Pro Arg Glu Ser Thr Glu Leu Ile Ala Gly Gly Val Thr Glu Pro

565 570 575

Asp Ile Ile Leu Ser Thr Tyr Asp Ala Pro His Thr Val Val Ser Leu

580 585 590

Ala Asn Arg Glu Leu Asp Pro Trp Glu Ala Ala Ala Val Gln Leu

595 600 605

<210> 2

<211> 562

<212> PRT

<213> 热葡糖苷酶副芽孢杆菌

<220>

<223> WP_042386239.1 α-葡糖苷酶

<400> 2

Met Glu Arg Val Trp Trp Lys Glu Ala Val Val Tyr Gln Ile Tyr Pro

1 5 10 15

Arg Ser Phe Tyr Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Arg Gly

20 25 30

Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Val Asp Val Val

35 40 45

Trp Leu Ser Pro Val Tyr Lys Ser Pro Asn Asp Asp Asn Gly Tyr Asp

50 55 60

Ile Ser Asp Tyr Arg Asp Ile Met Asp Glu Phe Gly Thr Met Ala Asp

65 70 75 80

Trp Lys Thr Met Leu Glu Glu Met His Lys Arg Gly Ile Lys Leu Val

85 90 95

Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro Trp Phe Ile

100 105 110

Glu Ser Arg Lys Ser Lys Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Ile Trp

115 120 125

Arg Pro Gly Lys Asn Gly Lys Glu Pro Asn Asn Trp Glu Ser Val Phe

130 135 140

Ser Gly Ser Ala Trp Glu Tyr Asp Glu Met Thr Gly Glu Tyr Tyr Leu

145 150 155 160

His Leu Phe Ser Lys Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro Lys

165 170 175

Val Arg Arg Glu Val Tyr Glu Met Met Lys Phe Trp Leu Asp Lys Gly

180 185 190

Val Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ile Asn Met Ile Ser Lys Val Pro

195 200 205

Glu Leu Pro Asp Gly Glu Pro Gln Ser Gly Lys Lys Tyr Ala Ser Gly

210 215 220

Ser Arg Tyr Tyr Met Asn Gly Pro Arg Val His Glu Phe Leu Gln Glu

225 230 235 240

Met Asn Arg Glu Val Leu Ser Lys Tyr Asp Ile Met Thr Val Gly Glu

245 250 255

Thr Pro Gly Val Thr Pro Lys Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Asp Pro Ser

260 265 270

Arg Arg Glu Leu Asn Met Val Phe Gln Phe Glu His Met Asp Leu Asp

275 280 285

Ser Gly Pro Gly Gly Lys Trp Asp Ile Arg Pro Trp Ser Leu Ala Asp

290 295 300

Leu Lys Lys Thr Met Thr Lys Trp Gln Lys Glu Leu Glu Gly Lys Gly

305 310 315 320

Trp Asn Ser Leu Tyr Leu Asn Asn His Asp Gln Pro Arg Ala Val Ser

325 330 335

Arg Phe Gly Asp Asp Gly Lys Tyr Arg Val Glu Ser Ala Lys Met Leu

340 345 350

Ala Thr Phe Leu His Met Met Gln Gly Thr Pro Tyr Ile Tyr Gln Gly

355 360 365

Glu Glu Ile Gly Met Thr Asn Val Arg Phe Pro Ser Ile Glu Asp Tyr

370 375 380

Arg Asp Ile Glu Thr Leu Asn Met Tyr Lys Glu Arg Val Glu Glu Tyr

385 390 395 400

Gly Glu Asp Pro Gln Glu Val Met Glu Lys Ile Tyr Tyr Lys Gly Arg

405 410 415

Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp Asp Ser Glu Asn Ala Gly

420 425 430

Phe Thr Ala Gly Thr Pro Trp Ile Pro Val Asn Pro Asn Tyr Lys Glu

435 440 445

Ile Asn Val Lys Ala Ala Leu Glu Asp Pro Asn Ser Val Phe His Tyr

450 455 460

Tyr Lys Lys Leu Ile Gln Leu Arg Lys Gln His Asp Ile Ile Val Tyr

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Asp Leu Ile Leu Glu Asp Asp Pro Tyr Ile Tyr Ala Tyr

485 490 495

Thr Arg Thr Leu Gly Asn Glu Gln Leu Ile Val Ile Thr Asn Phe Ser

500 505 510

Glu Lys Thr Pro Val Phe Arg Leu Pro Asp His Ile Ile Tyr Lys Thr

515 520 525

Lys Glu Leu Leu Ile Ser Asn Tyr Asp Val Asp Glu Ala Glu Glu Leu

530 535 540

Lys Glu Ile Arg Leu Arg Pro Trp Glu Ala Arg Val Tyr Lys Ile Arg

545 550 555 560

Leu Pro

Claims (16)

1.一种可发酵糖组合物的制备方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理多糖组合物，并且其中在用所述具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理期间移出所述可发酵糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质和至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质的混合物处理所述多糖组合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中首先用至少一种具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质处理所述多糖组合物，并且随后用至少一种具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质处理所得组合物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在发酵过程中消耗所述可发酵糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其中将所述可发酵糖组合物发酵以产生醇。

6.根据权利要求4所述的方法，其中将所述可发酵糖组合物发酵以产生有机酸或氨基酸，所述有机酸例如为柠檬酸、葡糖酸、乳酸、乙酸、L-抗坏血酸、衣康酸、丙酸、琥珀酸和/或丙酮酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多糖组合物是淀粉水解物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有葡糖淀粉酶酶活性的蛋白质是属于酶类别EC 3.2.1.3的葡糖淀粉酶。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质是属于酶类别EC 3.2.1.10的寡-1,6-葡糖苷酶。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用来自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003(Agl1)和/或来自热葡糖苷酶副芽孢杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)(Gth)的具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有寡-1,6-葡糖苷酶酶活性的蛋白质是与由SEQ ID NO:1表示的短双歧杆菌UCC2003(Agl1)的寡-1,6-葡糖苷酶或由SEQ ID NO:2表示的热葡糖苷酶副芽孢杆菌(Gth)的寡-1,6-葡糖苷酶中任一个具有至少50％，比如至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％序列同一性的蛋白质。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述酶混合物的处理在水性工艺介质中进行。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述酶混合物的处理在4.0至8.0范围内的酸性pH下进行，最佳pH范围为4.0至5.5，更具体地在pH 4.3至4.8。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由所述酶混合物的处理在30℃至70℃的温度范围内进行，最佳范围为30℃至50℃，更具体地为30℃至35℃。

15.一种由多糖组合物产生发酵产物的方法，其特征在于根据权利要求1所述的方法处理多糖组合物，随后在发酵培养基中进行发酵过程，并且其中从所述发酵培养基分离所需的发酵产物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述发酵产物选自醇、有机酸、和氨基酸。

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