CN114755341A - 检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学检测技术领域。本发明提供的离子色谱和质谱联用系统，包括离子抑制器、pH监测器、第一分流器、第二分流器、补液泵和补液池；所述离子抑制器的入口与离子色谱柱出口相连通；所述离子抑制器的出口分别与pH监测器的pH值探头和第一分流器的第一接口相连通；所述第一分流器的第一接口与离子抑制器的出口相连通、第二接口与补液池的补液泵相连通、第三接口与第二分流器的第一接口和pH监测器的pH值探头相连通；所述第二分流器的第一接口与第一分流器的第三接口和pH监测器的pH值探头相连通、第二接口与质谱入口相连通、第三接口与废液池相连通。本发明可以简化大量的预处理操作，提高检测效率。

Description

检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法
技术领域
本发明属于分析化学检测技术领域。
背景技术
短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)又称挥发性脂肪酸(Volatilefatty acids，VFA)，通常是指碳原子数小于6的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸。近年来，短链脂肪酸逐渐成为人们研究的热点，其作为肠道菌群的主要产物之一，短链脂肪酸对免疫应答、能量供给、糖脂代谢调节有重要作用，并且其作为饲料添加剂也具有重要前景。此外，乳酸作为肠道菌群重要的产物以及青储饲料的重要指标，也成为了近年来的研究热点之一。
目前，人们多采用气相色谱质谱联用方法以及离子色谱法检测短链脂肪酸。气相色谱质谱联用检测方法虽然能不经衍生化，直接分析样品中的短链脂肪酸，但其要求待测样品的溶剂为有机试剂，而人们的研究对象往往是微生物发酵液或血清样本等，其溶剂为水，直接气质进样分析会导致检测重复性差，无法进行准确定量分析。而采用乙酸乙酯萃取法进行预处理，由于进样时乙酸乙酯在气相进样口的高温条件下会有少量分解，导致分析乙酸乙酯的空白样品时，也会检测到乙酸峰，造成检测实际样品时乙酸测量误差。而离子色谱法虽然没有上述问题，但其一般使用电导检测器进行定量分析，导致其定量精度受到怀疑。此外，乳酸作为不易挥发的小分子有机酸，用气质联用技术对其进行检测时，需要进行衍生化预处理，该方法费时费力。而采用离子色谱法检测时又会出现定量不准确的问题。因此，人们急需开发一种更加高效准确的检测方法用于乳酸和短链脂肪酸的快速分析。
离子色谱质谱法是一种新兴检测方法，目前未见到相关的报道，本文采用离子色谱质谱技术对乳酸和短链脂肪酸进行分析，可以简化大量的预处理操作，提高检测效率，并有效地去除基体杂质干扰和假阳性现象，大大提高了灵敏度，适用于人体和动物尿液、粪便、组织、血清以及微生物发酵产物等多种生物样本中乳酸和短链脂肪酸的检测。
发明内容
有鉴于此，本发明利用离子色谱质谱联用，解决了离子色谱及气质联用等无法快速准确对人体和动物尿液、粪便、组织、血清以及微生物发酵产物等多种生物样本中的乳酸和短链脂肪酸进行定性定量分析的问题。
本发明提供了一种检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，包括如下步骤：离子色谱柱柱后流出的淋洗液经过抑制器后变为偏中性的抑制液；抑制液进入检测器；检测器流出的液体与补充液在第一分流器中混合；第一分流器的流出液体进入第二分流器，第二分流器的混合液体一部分以符合质谱要求的流速进入质谱仪器。
在本发明的具体实施例中，所述抑制器为阴离子抑制器；所述阴离子抑制器依据淋洗液确定。
在本发明的具体实施例中，所述检测器为电导检测器；所述电导检测器依据待测物确定。
在本发明的具体实施例中，所述补充液是依据检测器或抑制器出口溶液的pH值确定；所述补充液为乙腈、甲醇和甲酸中的一种或一种以上混合液。
在本发明的具体实施例中，所述离子色谱柱柱后流出的淋洗液是微生物发酵菌液经过离子色谱柱流出的淋洗液；所述微生物发酵菌液是乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸混合液。
在本发明的具体实施例中，所述离子色谱柱是SH-AP-4色谱柱。
在本发明的具体实施例中，所述质谱仪器为安捷伦6520B-QTOFMS。
本发明还提供了一种检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法的系统，包括离子抑制器、pH监测器、第一分流器、第二分流器、补液泵和补液池；所述离子抑制器的入口与离子色谱柱出口相连通；所述离子抑制器的出口分别与pH监测器的pH值探头和第一分流器的第一接口相连通；所述第一分流器的第一接口与离子抑制器的出口相连通、第二接口与补液池的补液泵相连通、第三接口与第二分流器的第一接口和pH监测器的pH值探头相连通；所述第二分流器的第一接口与第一分流器的第三接口和pH监测器的pH值探头相连通、第二接口与质谱入口相连通、第三接口与废液池相连通；所述离子抑制器用于对色谱柱流出的液体进行离子抑制；包括阴离子抑制器和阳离子抑制器；所述pH监测器检测离子抑制器的出口液体的pH值和第二分流器中流入液体的pH值；所述补液池用于为第一分流器补充一种或多种液体；所述pH监测器通过pH值探头获取被测溶液的pH值；所述第一分流器用于对两个流入的液体进行混合后流出；所述第二分流器用于对流入的液体进行分流成两个不同流速的液体。
在本发明的具体实施例中，在所述离子抑制器与PH监测器和第一分流器之间还设有检测器；所述离子抑制器的出口与检测器的入口相连通；所述检测器的出口与第一分流器的第一接口相连通；所述检测器包括安培检测器和电导检测器。
本发明无需冗繁的预处理过程，分析速度快，检测成本低，重复性好，稳定性高，具有高通量高灵敏的特点。
附图说明
图1是离子色谱和质谱联用系统示意图。
图2是离子色谱和质谱联用系统示意图。
其中，1为离子抑制器，2计算控制系统，3PH监测器，4为第一分流器，5为第二分流器，6为补液泵，7为补液池，8为检测器。
图3是8种小分子有机酸标准样品提取离子流图。
图4是微生物发酵样品提取离子流图。
具体实施方式
实施例1
离子色谱和质谱联用系统，包括离子抑制器、检测器、PH监测器、第一分流器、第二分流器、补液池；
所述离子抑制器的入口与离子色谱柱出口相连通。
所述离子抑制器的出口与PH监测器的pH值探头相连通。
当所述离子抑制器的出口与检测器入口相连通时，所述检测器的出口和第一分流器的第一接口相连通；所述第一分流器的第一接口与检测器的出口相连通、第二接口与补液池的补液泵相连通、第三接口与第二分流器的第一接口和pH监测器的pH值探头相连通；
或，当所述离子抑制器的出口与第一分流器的第一接口相连通，所述第一分流器的第一接口与离子抑制器的出口相连通、第二接口与补液池的补液泵相连通、第三接口与第二分流器的第一接口和pH监测器的pH值探头相连通。
所述第二分流器的第一接口与第一分流器的第三接口和pH监测器的pH值探头相连通、第二接口与质谱入口相连通、第三接口与废液池相连通；所述第二分流器的第二接口内还设置有流速控制装置，用于对流出液体的速度进行控制和调解。
所述离子抑制器用于对色谱柱流出的液体进行离子抑制；包括阴离子抑制器和阳离子抑制器。
所述pH监测器检测离子抑制器的出口液体的pH值和第二分流器中流入液体的pH值。
所述补液池用于为第一分流器提供一种或多种液体。
所述pH监测器通过pH值探头获取被测溶液的pH值。
所述第一分流器用于对两个流入的液体进行混合后流出；
所述第二分流器用于对流入的液体进行分流成两个不同流速的液体。
所述离子抑制器的出口与检测器的入口相连通；所述检测器的出口与第一分流器的第一接口相连通；所述检测器包括安培检测器和电导检测器。
实施例2
检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法：
1、样品收集
收集微生物发酵菌液样品。
乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸混合标准样品若干。
2、取100μL发酵液，加入400μL冷甲醇，剧烈涡旋30s。14 000rpm,4℃离心15min,取400μL上清待测。
取乳酸和短链脂肪酸标准品若干待测。
3、离子色谱分析
离子色谱仪器为青岛盛瀚离子色谱CIC-D150型，包括离子色谱主机、自动进样器、氢氧化钾淋洗液发生器、Shinelab软件和SCIENHOME柱温箱；柱后补充液和淋洗液发生器补充液色谱泵分别为安捷伦1260二元高压泵和1200四元低压泵。
具体分析条件如下：
色谱柱：SH-AP-4(250mm×4mm，青岛盛瀚)；
氢氧化钾(KOH)淋洗液发生器：自动发生器在线自动产生KOH淋洗液，以1.0mLmin-1的流速4mM浓度KOH等度淋洗60min。
柱温箱柱温：60℃。
25μL进样分析。
柱后流动相：乙腈，流速：0.1mL min-1。
淋洗液发生器补液流动相：超纯水，流速：1mL min-1。
三通分流器(安捷伦)
阴离子抑制器：抑制电流30mA。
选用高容量阴离子交换柱SH-AP-4(250mm×4mm)进行分离，以氢氧化钾为淋洗液，采用等度淋洗。
4.依据淋洗液确定抑制器类型，离子色谱柱柱后流出的淋洗液经过阴离子抑制器后得到实现离子抑制后的抑制液。
5.依据待测物确定检测器类型，抑制液进入电导检测器。
6.PH监测器检测电导检测器出口溶液的pH值，确定补充液的类型、数量和流速。
7.电导检测器流出的液体与补充液在第一分流器中混合；同时PH监测器检测分流器中混合液的pH值，依据质谱对溶液pH值的要求，进而矫正补充液的类型、数量和流速。
所述补充液为乙腈、甲醇和甲酸中的一种或一种以上混合液，本实施例依据被测物特点，确定为乙腈，通过乙腈(流速：0.1mL min-1)进行补充有机试剂以提高离子化效率，得到乙腈作为提高离子化效率的补充液。
8.第一分流器的流出液体进入第二分流器，第二分流器的混合液体一部分以符合质谱流速要求的液体进入质谱仪器，其与部分以废液形式排出。
进入质谱(ESI-MS)的液体进行质谱检测，测定方式为全扫描监测模式。
质谱仪器为安捷伦6520B-QTOFMS，具体分析条件如下：
离子源类型:电喷雾离子源，负离子模式；
毛细管电压：4000V；
雾化器流速：11L/min；
离子源温度：300℃；
锥孔电压均为80V；
扫描范围40-180m/z。
表1. 8种小分子有机酸的质核比和保留时间
化合物 质核比(m/z) 保留时间(min)
乳酸 89.0244 6.39
乙酸 59.0139 6.20
丙酸 73.0295 7.45
异丁酸 87.0452 8.87
丁酸 87.0452 9.35
异戊酸 101.0608 11.53
戊酸 101.0608 14.59
己酸 115.0765 26.15
4.标准品和实际样品分析：
分析操作参照上述描述方法。
采用本发明方法对乳酸及短链脂肪酸混合标准样品和微生物发酵菌液分别进行分析，离子色谱柱柱后流出液经阴离子抑制器后，得到乙腈作为提高离子化效率的补充液，随后经三通分流器后进入质谱检测，得到质谱提取流图。微生物发酵菌液和混标样品中的8种小分子有机酸都得到了很好地基线分离，由其是两对短链脂肪酸同分异构体(异丁酸、丁酸和异戊酸、戊酸)，更有利于我们对其进行准确的定性和定量分析。
本发明是基于离子色谱质谱串联技术所建立的新的乳酸和短链脂肪酸分析方法，可对人体和动物尿液、粪便、组织、血清以及微生物发酵产物等多种生物样本中的乳酸和短链脂肪酸进行准确的定性和定量分析。
本发明可以简化大量的预处理操作，提高检测效率，并有效地去除基体杂质干扰和假阳性现象，大大提高了灵敏度。
本发明无需冗繁的预处理过程，分析速度快，检测成本低，重复性好，稳定性高，具有高通量高灵敏的特点。

Claims (10)

1.检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，包括如下步骤：
离子色谱柱柱后流出的淋洗液经过抑制器后变为偏中性的抑制液；
抑制液进入检测器；
检测器流出的液体与补充液在第一分流器中混合；
第一分流器的流出液体进入第二分流器，第二分流器的混合液体一部分以符合质谱要求的流速进入质谱仪器。
2.依据权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述抑制器为阴离子抑制器；
所述阴离子抑制器依据淋洗液确定。
3.依据权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述检测器为电导检测器；
所述电导检测器依据待测物确定。
4.依据权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述补充液是依据抑制器出口溶液的pH值确定；
所述补充液为乙腈、甲醇和甲酸中的一种或一种以上混合液。
5.依据权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述离子色谱柱柱后流出的淋洗液是微生物发酵菌液经过离子色谱柱流出的淋洗液；
所述微生物发酵菌液是乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸混合液。
6.依据权利要求1所述离子色谱和质谱联用系统的检测方法，其特征在于，所述离子色谱柱是SH-AP-4色谱柱。
7.依据权利要求6所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述SH-AP-4色谱柱的控制条件为：在温度为60℃条件下，4mM浓度KOH以1.0mL min-1的流速淋洗60min。
8.依据权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法，其特征在于，所述质谱仪器为安捷伦6520B-QTOFMS。
9.权利要求1所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法的系统，其特征在于，包括离子抑制器、pH监测器、第一分流器、第二分流器、补液泵和补液池；
所述离子抑制器的入口与离子色谱柱出口相连通；
所述离子抑制器的出口分别与pH监测器的pH值探头和第一分流器的第一接口相连通；
所述第一分流器的第一接口与离子抑制器的出口相连通、第二接口与补液池的补液泵相连通、第三接口与第二分流器的第一接口和pH监测器的pH值探头相连通；
所述第二分流器的第一接口与第一分流器的第三接口和pH监测器的pH值探头相连通、第二接口与质谱入口相连通、第三接口与废液池相连通；
所述离子抑制器用于对色谱柱流出的液体进行离子抑制；包括阴离子抑制器和阳离子抑制器；
所述pH监测器检测离子抑制器的出口液体的pH值和第二分流器中流入液体的pH值；
所述补液池用于为第一分流器提供一种或多种液体；
所述pH监测器通过pH值探头获取被测溶液的pH值；
所述第一分流器用于对两个流入的液体进行混合后流出；
所述第二分流器用于对流入的液体进行分流成两个不同流速的液体。
10.依据权利要求9所述检测乳酸和短链脂肪酸的离子色谱和质谱联用方法的系统，其特征在于，在所述离子抑制器和第一分流器之间还设有检测器；
所述离子抑制器的出口与检测器的入口相连通；
所述检测器的出口与第一分流器的第一接口相连通；
所述检测器包括安培检测器和电导检测器。
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