CN114752653A - 筛选酶分子稳定剂的方法 - Google Patents

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刘想
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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Abstract

本发明公开了一种筛选酶分子稳定剂的方法，其步骤包括：在待筛选的稳定剂中加入盐酸胍，混匀，在去离子水中加入盐酸胍作为对照；分别加入目标酶分子样品，室温下孵育一段时间；采用常规方法测定目标酶分子的酶活；根据公式(1)计算待筛选稳定剂的稳定性效率；比对各待筛选稳定剂的稳定性效率，选择稳定性效率高的待筛选稳定剂，作为目标酶分子的稳定剂。本发明方法可以方便快捷的筛选出合适的酶稳定剂，从而配置出稳定的缓冲液用于酶蛋白纯化过程中或长期存放。还可以筛选出合适的酶稳定剂添加条件，获得最佳的酶蛋白保存效果。

Description

筛选酶分子稳定剂的方法
技术领域
本申请涉及一种筛选酶分子稳定剂的方法，属于生物分子检测技术领域。
背景技术
生物技术发展至今，重组蛋白，酶分子，抗体等蛋白类产品的应用日益广泛。在生物蛋白类产品的表达，发酵，纯化，半成品制备，成品制备等方面，全程都需要稳定的缓冲液条件加以存放。而通常情况下，这一类稳定性条件都是以经验为导向而设计的稳定性条件，缺乏一种可靠有效的筛选稳定性条件的方式和方法。
蛋白质稳定剂的筛选在成功地获得重组蛋白，增强蛋白质的稳定性，防止其变性等方面发挥着重要的作用。尤其是对各种重组蛋白、抗体、酶分子等产品来说，筛选稳定性的条件变得尤为重要。稳定高效的蛋白产品是科研工作者、工业客户乃至医药界用户最为关切的。谁掌握了稳定性的缓冲条件，谁就掌握了市场的前瞻性和主动性。已经公开的蛋白质稳定剂有很多种，例如海藻糖是最广为人知的蛋白质稳定剂之一，在许多生物体(如昆虫，植物，藻类、真菌和细菌)体内均有发现，其在生物体的生命活动中起着许多关键性作用。另外还有部分氨基酸、表面活性剂等都有助于蛋白质的稳定性。但是，不同的稳定剂对不同的蛋白有着不同的作用。同一种稳定性的条件也不能机械性的去复制到另一种蛋白上。这就需要一套系统的分析方法来验证给定的稳定性条件是否合适。酶分子是一种有着特定催化活性的蛋白，稳定剂对其而言尤为重要。2012年由Life Technologies(美国)推出了一款用于延长蛋白质稳定性的常规存储试剂，该试剂10mL售价为大约2400元人民币，而且还不是一种通用性的重组蛋白稳定性试剂，其说明书中仅针对的蛋白类别包括激酶、磷酸酶、过氧化物酶、限制性内切酶、荧光素酶、细胞因子和抗体。因此，针对特定酶分子，筛选适配的酶分子稳定剂的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选酶分子稳定剂的方法，可以快速筛选出对特定酶分子有较好的稳定作用的稳定剂。
本发明采用的技术手段为：
一种筛选酶分子稳定剂的方法，其步骤包括：
(1)在待筛选的稳定剂中加入盐酸胍，混匀，在去离子水中加入盐酸胍作为对照；
(2)分别加入目标酶分子样品，室温下孵育一段时间；
(3)采用常规方法测定目标酶分子的酶活；
(4)根据公式(1)计算待筛选稳定剂的稳定性效率；
Figure BDA0003588336820000021
式(1)中酶活(变性剂)是指只加盐酸胍条件下酶分子在反应体系中的测定酶活，酶活(变性剂和稳定剂)是指加盐酸胍后再加稳定剂去稳定酶分子，酶分子在反应体系中的酶活，酶活(未处理样品)是指没有加盐酸胍和稳定剂处理样品的酶活；
(5)比对各待筛选稳定剂的稳定性效率，选择稳定性效率高的待筛选稳定剂，作为目标酶分子的稳定剂。
优选的，步骤(2)中室温孵育的时间为1小时。
优选的，还包括步骤(6)：选定稳定剂后，改变稳定剂与目标酶分子加入的比例，重复步骤(1)-(5)，筛选出稳定剂与目标酶分子的最佳添加比例。
本发明方法可以方便快捷的筛选出合适的酶稳定剂，从而配置出稳定的缓冲液用于酶蛋白纯化过程中或长期存放。还可以筛选出合适的酶稳定剂添加条件，获得最佳的酶蛋白保存效果。
附图说明
图1：本发明的流程示意图。
图2：酶分子1和2的稳定性效率。
具体实施方式
实施例1无甘油冻干PCR试剂反复冻融稳定性和热加速性能验证方法。
1.实验材料：
酶分子1：DNA polymeraseⅠ；
酶分子2：DNA polymeraseⅡ；
稳定剂的配制：
0.1M CaCl2，
1M葡萄糖,
0.5M脯氨酸,
0.05％Tween-20
10mM DTT
50％甘油,
50％丙二醇，
6M盐酸胍，
2.稳定剂筛选实验：
a)准备相同浓度的酶分子1和2。
b)取500uL稳定剂(对照为H2O)加入1.5mL tube中，然后添加300uL 6M盐酸胍,混合均匀后待用。
c)添加200uL酶分子样品。
d)室温孵育1小时。
e)采用相应的方法测定酶活，常规的酶活测定方法均可以用于本申请，本实施例中具体测活方法参照文献[1]。
f)根据公式(1)计算不同稳定剂的稳定性效率。
g)对比效率的高低，筛选出合适的稳定剂。
Figure BDA0003588336820000031
式(1)中酶活(变性剂)是指只加盐酸胍条件下酶分子在反应体系中的测定酶活，酶活(变性剂和稳定剂)是指加盐酸胍后再加稳定剂去稳定酶分子，酶分子在反应体系中的酶活，酶活(未处理样品)是指没有加盐酸胍和稳定剂处理样品的酶活。
3.实验结果：
图1所示为实验流程图。图2是稳定性效率结果图，结果显示甘油、丙二醇和CaCl2对酶分子1和2都有稳定性作用，葡萄糖对酶分子1的稳定性有帮助，Tween20能增强酶分子2的稳定性。本发明方法可以方便快捷的筛选出合适的酶稳定剂，从而配置出稳定的缓冲液用于酶蛋白纯化过程或长期存放。
上面结合附图和具体的实施案例对本发明的实施方式进行了进一步的说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
参考文献：
[1]Frances C.Lawyer,Susanne Stoffel,et.al,Isolation,Characterization,and Expression in Escherichia coli of the DNA Polymerase Gene from Thermusaquaticus,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.264,No.11.Issue of April15,1989。

Claims (3)

1.一种筛选酶分子稳定剂的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)在待筛选的稳定剂中加入盐酸胍，混匀，在去离子水中加入盐酸胍作为对照；
(2)分别加入目标酶分子样品，室温下孵育一段时间；
(3)采用常规方法测定目标酶分子的酶活；
(4)根据公式(1)计算待筛选稳定剂的稳定性效率；
Figure FDA0003588336810000011
式(1)中酶活(变性剂)是指只加盐酸胍条件下酶分子在反应体系中的测定酶活，酶活(变性剂和稳定剂)是指加盐酸胍后再加稳定剂去稳定酶分子，酶分子在反应体系中的酶活，酶活(未处理样品)是指没有加盐酸胍和稳定剂处理样品的酶活；
(5)比对各待筛选稳定剂的稳定性效率，选择稳定性效率高的待筛选稳定剂，作为目标酶分子的稳定剂。
2.根据权利要求1所述的筛选酶分子稳定剂的方法，其特征在于步骤(2)中室温孵育的时间为1小时。
3.根据权利要求2所述的筛选酶分子稳定剂的方法，其特征在于：还包括步骤(6)：选定稳定剂后，改变稳定剂与目标酶分子加入的比例，重复步骤(1)-(5)，筛选出稳定剂与目标酶分子的最佳添加比例。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017235A1 (en) * 1990-05-04 1991-11-14 Genencor International, Inc. Granules containing both an enzyme and an enzyme protecting agent and detergent compositions containing such granules
WO2011127217A1 (en) * 2010-04-06 2011-10-13 Genvault Corporation Stabilized chemical dehydration of biological material
CN112582021A (zh) * 2020-12-25 2021-03-30 枣庄市杰诺生物酶有限公司 一种壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017235A1 (en) * 1990-05-04 1991-11-14 Genencor International, Inc. Granules containing both an enzyme and an enzyme protecting agent and detergent compositions containing such granules
WO2011127217A1 (en) * 2010-04-06 2011-10-13 Genvault Corporation Stabilized chemical dehydration of biological material
CN112582021A (zh) * 2020-12-25 2021-03-30 枣庄市杰诺生物酶有限公司 一种壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的筛选方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANJEETA RANI等: "A Distinct Proof on Interplay between Trehalose and Guanidinium Chloride for the Stability of Stem Bromelain", J PHYS CHEM B, vol. 120, no. 34, pages 8863 - 8872 *
ELENA GANEA等: "Trehalose and 6-aminohexanoic acid stabilize and renature glucose-6-phosphate dehydrogenase inactivated by glycation and by guanidinium hydrochloride", BIOL CHEM, vol. 386, no. 3, pages 269 - 278, XP009142155 *
张静: "提高枯草芽孢杆菌氨肽酶稳定性的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑, no. 2, pages 1 - 3 *
汪艳华等: "产碱杆菌DN25纯化降氰酶稳定剂的选择", 广西科学院学报, vol. 29, no. 4, pages 220 - 223 *
陈巍等: "黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的纯化及性质分析", 工业微生物, vol. 42, no. 1, pages 68 - 73 *

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