CN114746118A - 用于治疗血液病症的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、冷抗体溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA))、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、新生儿同种免疫性血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮(SEE)、肾小球肾炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、感染或药物诱导的血液学病症),其包括向受试者施用补体途径的抑制剂。
Description
相关申请
本专利申请要求2019年10月17日提交的美国临时专利申请第62/916,492号的优先权,所述美国临时专利申请据此通过引用以其整体并入。
背景技术
血液病症每年影响全球数百万人,跨越了年龄、种族、性别和社会经济地位的界限。各种背景的男性、女性和儿童都患有与这些疾患相关的并发症,其中许多可能危及生命。血液病症(通常被称为血液学病症)在治疗上具有挑战性,并且在死亡率和患者的护理成本方面也是日益增长的健康问题。据估计,每年死于深静脉血栓(DVT)并发症的人数超过乳腺癌、机动车事故和HIV的总和。
血液病症可能影响血液的三种主要组分中的任何一种:红血细胞、白血细胞或血小板。血液病症也可能影响血液中的液体部分,即称为血浆。一些血液病症造成血液中的细胞数量减少。例如,患白细胞减少症的个体白血细胞数量减少,并且更容易受到感染。需要新型疗法来治疗血液病症。
目前,没有治愈血液病症的方法。尚不清楚血细胞内稳态的分子机制和血液病症的病理学。因此,需要新型疗法来预防血液病症、降低发展血液病症的风险并治疗血液病症。
发明内容
本公开总体上涉及预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征(Evan’ssyndrome)、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征(Felty's syndrome)、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素(penicillin)、奎宁(quinine)或肝素(heparin)的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症)),其包括向受试者施用补体途径的抑制剂。
血液病症可以被称为血液学病症。尽管血液学病症的病因各不相同,但有几种可能由使补体调节蛋白失活的突变和/或自身抗体以及直接活化补体级联的突变引起。例如,补体突变通常触发血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞及其聚集物以及红血细胞和内皮细胞上发生的不受抑制的补体活化。这些细胞上的补体活化引起可表达补体和组织因子的细胞衍生微泡脱落,从而促进炎症。红血细胞上的补体沉积触发溶血和血栓前期的红血细胞衍生的微泡的释放。补体沉积也可发生在脉管系统内的细胞上,例如内皮细胞,或发生在高度血管化的组织内,例如毛细血管床、肾小球、肺泡等,这会引起许多器官的血管损伤。阻断补体级联活化的抑制剂可以阻止补体活化。此类抑制剂可以阻断血细胞或相关细胞和血管化组织中特定补体蛋白的表达,干扰诱导补体活化的信号传导分子,上调血细胞或相关细胞和血管化组织中补体抑制剂的表达,或干扰血液病症或血液学病症中补体的作用。
因此,使用抗体抑制补体活化的早期阶段(包括补体活化途径),抑制补体活化途径可以是用于预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的有前途的治疗策略。具体来说,抗C1q、抗C1r和抗C1s抗体可能会阻止自身抗体触发补体活化。
本公开总体上涉及通过抑制经典补体活化,例如通过抑制补体因子C1q、C1r或C1s,例如通过施用抗体,例如结合一种或多种这些补体因子的单克隆、嵌合、人源化抗体、人抗体、抗体片段、抗体衍生物等来预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段
在一些实施方案中,抑制补体因子(例如C1q、C1r或C1s)的活性以阻断经典补体途径的活化并减缓或预防血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))。经典补体途径的抑制使凝集素和替代补体途径保持完整,以执行其正常的免疫功能。本文公开与中和血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))中的补体因子(例如C1q、C1r或C1s)相关的方法。
在某些方面,本文公开了一种预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法。
本文公开了一种抑制血液病症中的补体活化的方法,其包括向患有不利补体活化的患者施用抗体,例如抗C1q抗体、抗C1r抗体或抗C1s抗体。所述方法还可以包括施用治疗剂。在某些优选的实施方案中,抗体结合C1q、C1r或C1s并抑制补体活化。
在一些方面,公开了预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法。这些方法包括向受试者施用C1q抑制剂。还提供了许多实施方案,这些实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如,在一些实施方案中,C1q抑制剂是抗体、适体、反义核酸或基因编辑剂。在一些实施方案中,抑制剂是抗C1q抗体。抗C1q抗体可以抑制C1q与自身抗体之间或C1q与C1r之间或C1q与C1s之间的相互作用,或可以促进C1q从循环或组织中的清除。在一些实施方案中,抗C1q抗体的解离常数(KD)为100nM至0.005nM或小于0.005nM。在一些实施方案中,抗C1q抗体以范围介于20:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量、范围介于6:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量或范围介于2.5:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。所述抗体可特异性结合并中和C1q的生物活性,例如(1)C1q与自身抗体的结合,(2)C1q与C1r的结合,(3)C1q与C1s的结合,(4)C1q与IgM的结合,(5)C1q与磷脂酰丝氨酸的结合,(6)C1q与五聚蛋白-3的结合,(7)C1q与C-反应蛋白(CRP)的结合,(8)C1q与球状C1q受体(gC1qR)的结合,(9)C1q与补体受体1(CR1)的结合,(10)C1q与β-淀粉样蛋白的结合,(11)C1q与钙网蛋白的结合,(12)C1q与凋亡细胞的结合,或(13)C1q与B细胞的结合,或(1)经典补体活化途径的活化,(2)裂解的减少和/或C3沉积的减少,(3)抗体和补体依赖性细胞毒性的活化,(4)CH50溶血,(5)红血细胞裂解的减少,(6)红血细胞吞噬作用的减少,(7)树突细胞浸润的减少,(8)补体介导的红血细胞裂解的抑制,(9)淋巴细胞浸润的减少,(10)巨噬细胞浸润的减少,(11)抗体沉积的减少,(12)嗜中性粒细胞浸润的减少,(13)血小板吞噬作用的减少,(14)血小板裂解的减少,(15)移植移植物存活的改善,(16)巨噬细胞介导的吞噬作用的减少,(17)自身抗体介导的补体活化的减少,(18)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(19)由同种抗体所致的红血细胞裂解的减少,(20)由输血反应所致的溶血的减少,(21)同种抗体介导的血小板裂解的减少,(22)贫血的改善,(23)嗜酸性粒细胞增多的减少,(24)红血细胞上C3沉积的减少(例如,RBC上C3b、iC3b等的沉积的减少),(25)血小板上C3沉积的减少(例如,血小板上C3b、iC3b等的沉积的减少),(26)过敏毒素产生的减少,(27)自身抗体介导的水疱形成的减少,(28)自身抗体诱导的红斑的减少,(29)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(30)由输血反应所致的血小板裂解的减少,(31)肥大细胞活化的减少,(32)肥大细胞组胺释放的减少,(33)血管通透性的降低,(34)移植移植物内皮上补体沉积的减少,(35)B细胞抗体产生,(36)树突细胞成熟,(37)T细胞增殖,(38)细胞因子产生,(39)小胶质细胞活化,(40)阿瑟反应(Arthus reaction),(41)移植移植物内皮中过敏毒素产生的减少,或(42)补体受体3(CR3/C3)表达细胞的活化。在一些实施方案中,CH50溶血包括人CH50溶血。抗体可能能够中和至少约50%至约100%的人CH50溶血。抗体可能能够中和约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%的人CH50溶血。抗体可能能够以小于150ng/ml、小于100ng/ml、小于50ng/ml或小于20ng/ml的剂量中和至少50%的CH50溶血。
在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、单价抗体、多特异性抗体或抗体片段或其抗体衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。抗体片段的实例是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体(diabody)和单链抗体分子。在一些实施方案中,抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。在一些实施方案中,抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。在一些实施方案中,抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。在一些实施方案中,所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。在一些实施方案中,所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体是包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗体片段。可以通过肠胃外注射或输注,例如皮下或肌内注射,或静脉内注射或输注来施用抗体。
在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与50mg/kg、50mg/kg与60mg/kg、60mg/kg与70mg/kg、70mg/kg与80mg/kg、80mg/kg与90mg/kg、90mg/kg与100mg/kg、100mg/kg与110mg/kg、110mg/kg与120mg/kg、120mg/kg与130mg/kg、130mg/kg与140mg/kg或140mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg与100mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg或150mg/kg的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次、每三周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与3mg/kg、3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与7mg/kg或7mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次、每三周一次或每月一次施用抗体。
在一些实施方案中,抗体是抗体片段。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注、肌肉注射或皮下注射向受试者施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与1mg/kg、1mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.3mg/kg与10mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体片段。在一些实施方案中,以高于每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次剂量的初始预剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与20mg/kg之间。在一些实施方案中,抗体片段与其相应的全长抗体相比具有较短的半衰期,例如,所述抗体片段被迅速清除,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性,或所述抗体选择性抑制受试者的血液空间内的C1q活性,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性。在一些实施方案中,血液空间被限制在血管内,例如动脉、小动脉、毛细血管、小静脉或静脉。血液空间可以包括血清、血小板、内皮细胞、血细胞或造血细胞。在一些实施方案中,抑制受试者的血液空间内的C1q减少了高度血管化组织中的组织损伤。高度血管化组织的实例是肾、肺泡、毛细血管床或肾小球。
在一些实施方案中,血液病症是补体介导的血液病症。在一些实施方案中,血液病症是冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、冷抗体溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球肾炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、感染或药物诱导的血液学病症。感染可以是肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)或冠状病毒。冠状病毒的实例选自SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV、HKU1和SARS-CoV-2。在一些实施方案中,冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方案中,受试者患有SARS-CoV-2感染,这已通过来自呼吸道或血液样本的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到证实。血液病症可以是冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、狼疮性肾炎、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)或免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。药物诱导的血液学病症的实例是再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血和血小板减少症。
在一些方面,公开了预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法。这种方法包括向受试者施用经典补体途径的抑制剂,其中受试者包括血液空间;并且所述抑制剂选择性地抑制受试者的血液空间内的经典补体途径,从而保留组织内的补体活性。还提供了许多实施方案,这些实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。
附图说明
图1A至1B显示抗C1q抗体(Mab1)有效地阻止了与CAD的血管内和血管外RBC裂解相关的过程。图1A显示,在存在来自患有CAD的患者的血清的情况下,抗C1q抗体抑制RBC表面上的C1q、C4d和C3b结合/活化,以防止血管外裂解。图1B显示,抗C1q抗体阻断由来自CAD患者的血清引发的C5-C9介导的红血细胞溶解,以防止血管内裂解。
图2A至2B显示抗C1q抗体(例如,Mab1)和抗C1s(例如,TNT009)抗体抑制补体介导的溶血。图2A显示抗C1q抗体和TNT009都抑制抗体/补体诱导的红血细胞裂解。图2B显示只有抗C1q抗体抑制C1q与靶细胞的上游结合。C1q与RBC的结合不受TNT009的影响。C1q是沉积在红血细胞上的三种主要调理素(opsonin)/免疫细胞配体中的一种。
图3显示了抗C1q抗体(例如,Mab1)选择性抑制经典补体级联,并且与抗C5不同,保持凝集素和替代途径完整以执行正常的免疫功能。
图4显示了CAD患者中补体耗尽/消耗的血清生物标志物。C4和C2(而不是C5)的减少显示了伴随早期补体组分的消耗的早期补体级联的过度活化。
图5显示了在灵长类动物中皮下施用抗C1q抗体片段(例如,FabA)对RBC裂解的抑制。
图6A至6B显示了在来自CAD患者的样品中抗C1q抗体(Mab2)和FabA对血清溶血和补体沉积的剂量依赖性抑制。图6A显示了Mab2的作用。图6B显示了FabA的作用。
图7A至7G显示PF4/肝素通过经典途径活化补体。图7A是显示不同孵育条件下补体活化的图。将来自健康供体的血浆与EDTA(10mM)或EGTA(10mM)±MgCl2(10mM)或与缓冲液一起孵育,然后与PF4/肝素一起孵育,并且通过抗原C3e捕获ELISA测定来测量补体活化。***p<0.0001。显示了在三个不同场合测试的三个供体的代表性实验的结果。图7B是显示不同孵育条件下补体活化的图。将来自健康供体的血浆与或不与Cl-抑制剂(10和20IU/mL)一起孵育,然后与PF4/肝素一起孵育,并且通过抗原C3c捕获ELISA测定来测定PF4/肝素的补体活化。***p<0 0001。图7C是显示在各种孵育条件下抗PF4/肝素(KKO)与B细胞的结合的直方图。重叠的峰代表缓冲液对照(条纹线),然后是PF4、PF4/肝素+EDTA、PF4/肝素+EGTA+MgCl2和PF4/肝素+EGTA。峰1代表PF4/肝素。图7D是显示在各种孵育条件下抗C3e与B细胞结合的直方图。重叠峰代表PF4/肝素+EDTA、PF4/肝素+EGTA、PF4/肝素+EGTA+MgCl2、缓冲液对照(条纹线)和PF4。峰1代表PF4/肝素。图7E是显示在各种抗体存在下补体活化的图。将来自健康供体的血浆与各种浓度的抗C1q抗体、抗MBL抗体或对照抗体(0-100ug/mL)一起孵育,然后添加PF4/肝素,并且通过抗原C3c捕获ELISA测定来测定PF4/肝素的补体活化。与没有添加抗体的条件相比,*p<0.05,**p<0.001,***p<0.0001。显示了在三个不同场合测试的三个供体的代表性实验的结果。图7F是显示在各种孵育条件下抗PF4/肝素与B细胞的结合的直方图。峰代表缓冲液对照(条纹线)、抗C1q+PF4/肝素(峰1)、抗MBL+PF4/肝素(峰2)、PF4/肝素(峰3)和MS IgG 1+PF4/肝素(峰4)。图7G是显示在各种孵育条件下抗C3c与B细胞的结合的直方图。峰代表缓冲液对照(条纹线)、抗C1q+PF4/肝素(峰1)、抗MBL+PF4/肝素(峰2)、PF4/肝素(峰3)和MS IgG 1+PF4/肝素(峰4)。
图8显示PF4/肝素的补体活化与血浆/血清IgM水平相关。图8是显示不同供体的PF4/肝素诱导的C’活化(通过基于ELISA的抗原捕获测定来测定)和其血浆IgM水平(通过蛋白质组学分析来定量)的图。对于x轴上的每个点,左边的条表示C3e,并且右边的条表示IgM。
图9显示了以5+1mg/kg和5+2mg/kg给药的动物的血清游离FabA水平。定量的下限=5ng/mL。
图10显示了用5+2mg/kg FabA治疗的动物血浆中游离C1q的减少。定量的下限=1.1μg/mL。
图11显示,每天重复皮下给药FabA后,血清溶血得到抑制。
图12A至12C显示了Mab1和FabA的清除数据。图12A显示Mab1 15mpk IV产生250,000ng/mL的峰值无血清Mab1水平。游离药物水平保持升高直至第4天,并且在第5天清除至低于检测的水平。图12B显示FabA 10mpk IV产生12000ng/mL的峰值药物水平,并且随着药物水平在8小时内降至低于检测极限而非常迅速地清除。Fab分子的估计半衰期为2-3小时。图12C显示FabA 3mpk SC显示游离药物水平非常缓慢地增加,并且在单剂量后24小时可测量。
图13显示了来自wAIHA患者的样品中的补体沉积和抗C1q抗体(Mab2)对沉积的抑制。
具体实施方式
总则
本公开总体上涉及预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法,方法包括向受试者施用补体途径的抑制剂。
在本发明的血液病症中有多种病因;然而,本发明的血液病症通常以血液组分和细胞以及脉管系统和高度血管化组织内的相关细胞上的不受抑制的补体活化为特征。这些细胞上的补体活化引起补体组分的沉积,此引起免疫细胞募集攻击。其还可引起表达补体和组织因子的细胞衍生微泡的脱落,因此促进炎症。红血细胞上的补体沉积可触发血管内或血管外溶血和/或血栓前期的红血细胞衍生的微泡的释放。补体沉积也可发生在脉管系统内的细胞上,例如内皮细胞,或高度血管化的组织内,例如毛细血管床、肾小球、肺泡等,这会引起许多器官的血管损伤。红血细胞上的补体沉积也可引起血管外清除增强。阻断补体级联活化的抑制剂可以阻止补体活化。此类抑制剂可以阻断血细胞或血管系统和高度血管化组织的相关细胞中特定补体蛋白的表达,干扰诱导补体活化的信号传导分子,上调血细胞或相关细胞和血管化组织中补体抑制剂的表达,或干扰血液病症或血液系统疾病中补体的作用。
例如,慢性溶血性疾病患者经常表现出严重的贫血。在冷凝集素疾病(CAD)和温自身免疫性溶血性贫血(wAIHA)中,针对红血细胞(RBC)的自身反应性抗体触发C1q结合和经典补体活化。补体活化引起RBC清除,从而导致慢性贫血。当C1q识别与红血细胞结合的自身抗体时,补体介导的红血细胞损伤随后发生,触发经典途径以用活化的补体组分(C1q、C4b、C3b)包被红血细胞,并且补体包被的RBC从循环中去除,从而导致贫血。在CAD和wAIHA中,RBC变得被三种主要的经典补体“调理素”C1q、C4b和C3b包被,这三种补体通过“血管外裂解”驱动RBC清除。C1q、C4b和C3b在脾脏和肝脏中被网状内皮系统识别以用于去除RBC。同样,在CAD和wAIHA中,RBC变得被C5b包被以启动膜攻击复合物(MAC)介导的红血细胞裂解,从而引起直接的血管内RBC裂解。抗C1q有效地阻止与CAD的RBC裂解相关的血管内和血管外过程(图1A至图1B)。抗C1q抗体可以抑制补体级联的主要“调理素”/免疫细胞配体(C1q、C4b和C3b)的沉积。抗C1q(例如,包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:7的轻链可变结构域的Mab1抗体)和抗C1s(例如,TNT009)抗体都抑制直接补体介导的溶血(与抑制血管内裂解一致)(图2A),而只有抗C1q抗体抑制C1q与靶细胞的上游结合(图2B),这是参与血管外裂解的调理素。抗C1s抗体不阻断C1q结合,而抗C3不会阻断C1q或C4b与RBC的结合,并且抗C5抗体不抑制C1q、C4b或C3b与RBC的结合。只有抗C1q抑制参与血管外溶血的所有三种调理素对RBC的包被。
抑制补体途径(例如,通过抗C1q抗体)停止了补体在脉管系统内或高度血管化组织内的细胞上的沉积。在血液病症中,C1q与受损组织或由受损组织暴露的组分结合,从而引起补体活化与细胞表面上的C1q、C4b和C3b沉积和另外的损伤。通过阻断C1q与血液空间或高度血管化组织内的细胞的结合,其阻止了对组织或器官的另外的补体介导的损伤。例如,狼疮肾炎可以通过阻断肾脏高度血管化组分(血液过滤发生的地方)内的细胞表面上的C1q活化来治疗。
抗C1q抗体(例如,包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:7的轻链可变结构域的Mab1抗体)选择性地抑制经典途径,以保持凝集素和替代途径的正常免疫功能(图3)。相比之下,抗-C5抑制所有三种途径的溶血活性(图3),如同抗C3一样。与抗C3和抗C5抗体不同,抗C1q抗体留下凝集素和替代途径来执行正常的免疫功能。CAD患者中的补体耗尽/消耗的血清生物标志物提供了额外的评估。C4和C2(而不是C5)的减少与早期补体级联的慢性过度活化一致,伴随早期补体组分的消耗(图4)。可通过皮下施用抗C1q抗体(例如FabA,一种包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗C1q Fab)来治疗CAD,以抑制灵长类动物中的RBC裂解(图5)。
施用抗C1q的Fab抗体与全抗体之间的区别在于全身性C1q抑制的程度。鉴于全长抗体的半衰期长,在施用全长抗体后,抗体在血液空间中停留很长时间(例如,几天)。这使得抗体渗透至组织中,从而阻断全身的C1q活性。例如,10mg/kg的全长抗体将在血液空间中持续几天,并且有时间渗透至全身阻断C1q的组织中。在某些情况下,在治疗血管疾病时,可能倾向于将C1q抑制限制在血管区室(本质上是对疾病的“局部治疗”),同时允许C1q在其它地方发挥作用。为此,皮下或静脉内施用具有高亲和力和较短半衰期的Fab片段。例如,当IV给予10mg/kg(或0.3mg/Kg–20mg/Kg)的Fab时,游离药物被迅速清除(≤8小时),然而,与循环中的C1q结合的药物持续存在,因此C1q保持被抑制约24小时,直至其被替换。
在一个这样的应用中,CAD是一种慢性的但通常不威胁生命的疾病,主要发生在老年人中。在这种情况下,选择性抑制血管空间中的C1q以保护RBC,同时允许C1q在身体其它地方执行其正常的免疫功能,这可能具有安全优势。此目标可以通过皮下自身施用抗C1q单价Fab(例如,包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗C1 q抗体Fab片段(“FabA”))来实现。由于单价Fab(10pM)的极高亲和力,当C1q在循环中行进时,药物保持与C1q紧密结合。游离药物(未结合C1q)迅速从循环中清除,并且不会进入组织。循环C1q功能恢复,血液中C1q更新(24-48小时)(图5)。抗C1q单价Fab可以皮下给药,例如每天给药。抗C1q单价Fab可以每24小时皮下给药0.3-10mg/kg(或,取决于Fab构建体从皮肤吸收的速度,每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次),以完全抑制循环中RBC表面上的补体活化,从而防止血管内和血管外RBC裂解(在CAD中,通过Kupfer细胞捕获被补体包被的循环RBC,在肝脏中发生“血管外”裂解)。然而,在施用后,抗C1q单价Fab(例如,包含SEQID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗C1 q抗体Fab片段)选择性地抑制血液空间中的C1q,从而防止循环RBC上的补体沉积,同时允许组织C1q保留正常的免疫功能。
抗C1q的高亲和力抗体的Fab片段具有短的循环半衰期,每日皮下施用可在24小时内完全抑制血液中C1q的活性。其短的循环半衰期将限制全身性抑制(即组织中C1q的抑制)的程度,从而在血液空间外保持C1q功能。
中和补体因子(例如C1q、C1r或C1s)的活性抑制经典补体活性,并且减缓或预防血管室的补体介导的病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒,例如SARS-CoV-2(COVID))、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))。经典补体途径的抑制使凝集素和替代补体途径保持完整,以执行其正常的免疫功能。本文公开与中和血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))中的补体因子(例如C1q、C1r或C1s)相关的方法。
本公开中提到的所有序列都通过引用并入美国专利申请第14/933,517号、美国专利申请第14/890,811号、美国专利第8,877,197号、美国专利第9,708,394号、美国专利申请第15/360,549号、美国专利第9,562,106号、美国专利第10,450,382号、美国专利第10,457,745号、国际专利申请第PCT/US2018/022462号,这些专利中的每一个公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
在某些方面,本文公开了一种预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法,方法包括向受试者施用补体途径的抑制剂。
全长抗体可以通过使用重组DNA工程化技术来制备。此类工程化版本包括例如通过在天然抗体的氨基酸序列中插入、缺失或改变天然抗体可变区而产生的版本。这种类型的特定实例包括含有至少一个CDR和任选的一个或多个来自一种抗体的框架氨基酸以及来自第二种抗体的可变区结构域的剩余部分的那些工程化可变区结构域。编码抗体的DNA可以通过缺失编码全长抗体的DNA中除所需部分之外的所有部分来制备。编码嵌合抗体的DNA可以通过重组基本上或专门编码人恒定区的DNA和编码基本上或专门来源于除人以外的哺乳动物的可变区序列的可变区的DNA来制备。编码人源化抗体的DNA可以通过重组编码除基本上或专门来源于相应的人抗体区的互补决定区(CDR)以外的恒定区和可变区的DNA和编码基本上或专门来源于除人以外的哺乳动物的CDR的DNA来制备。
编码抗体的DNA分子的合适来源包括表达全长抗体的细胞,例如杂交瘤。例如,抗体可以从表达编码抗体的重链和/或轻链的表达载体的宿主细胞中分离。
抗体片段和/或抗体衍生物也可以通过使用重组DNA工程化技术来制备,包括编码抗体可变区和恒定区的DNA的操作和再表达。标准分子生物学技术可用于根据需要修饰、添加或缺失更多的氨基酸或结构域。如本文所用的术语“可变”和“恒定”区域仍然涵盖对可变或恒定区域的任何改变。在一些情况下,通过在编码CH1的链间半胱氨酸的密码子后立即引入终止密码子,使用PCR来产生抗体片段,使得CH1结构域的翻译在链间半胱氨酸处终止。设计合适的PCR引物的方法是本领域众所周知的,并且抗体CH1结构域的序列是容易获得的。在一些实施方案中,可以使用定点诱变技术引入终止密码子。
本公开的抗体可以衍生自任何抗体同种型(“类”),包括例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE及其亚类,包括例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些优选的实施方案中,抗体的重链和轻链来自IgG。抗体的重链和/或轻链可以来自鼠IgG或人IgG。在某些其它优选的实施方案中,抗体的重链和/或轻链来自人IgG1。在又其它优选的实施方案中,抗体的重链和/或轻链来自人IgG4。
在一些实施方案中,抑制剂是抗体,例如抗C1q抗体、抗C1r抗体或抗C1s抗体。抗C1q抗体可以抑制C1q与自身抗体之间、或C1q与C1r之间、或者C1q与C1s之间的相互作用。抗C1r抗体可以抑制C1r与C1q之间或C1r与C1s之间的相互作用。抗C1r抗体可以抑制C1r的催化活性,或抗C1r抗体可以抑制前C1r加工成活性蛋白酶。抗C1s抗体可以抑制C1s与C1q之间、或C1s与C1r之间、或C1s与C2或C4之间的相互作用,或抗C1s抗体可以抑制C1s的催化活性,或其可以抑制前C1s加工成活性蛋白酶。在一些情况下,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体促使从循环或组织中清除C1q、C1r或C1s。
本文公开的抗体可以是例如结合哺乳动物C1q、C1r或C1s,优选人C1q、C1r或C1s的单克隆抗体。抗体可以是小鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体片段或其抗体衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。抗体可以是具有足够人类序列的嵌合抗体,其适于施用于人类。抗体可以是糖基化的或非糖基化的;在一些实施方案中,抗体例如,以在CHO细胞中通过翻译后修饰产生的糖基化模式被糖基化。在一些实施方案中,抗体在大肠杆菌(E.coli)中产生。
本公开的抗体也可以共价连接至治疗剂,例如抗炎蛋白、神经治疗剂、抗病毒、抗寄生虫、抗细菌、内分泌药物、代谢药物、有丝分裂毒素(mitotoxin)、化疗药物或siRNA。
在一些实施方案中,本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体减少C3在红血细胞上的沉积;例如,在一些实施方案中,本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体减少C3b、iC3b等在RBC上的沉积。在一些实施方案中,本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体抑制补体介导的红血细胞裂解。本文公开的抗体可以减少C3在血小板上的沉积;例如,在一些实施方案中,本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体减少C3b、iC3b等在血小板上的沉积。
本公开的抗体可以结合并抑制C1q、C1r或C1s的生物活性。例如,(1)C1q与自身抗体的结合,(2)C1q与C1r的结合,(3)C1q与C1s的结合,(4)C1q与磷脂酰丝氨酸的结合,(5)C1q与五聚蛋白-3的结合,(6)C1q与C-反应蛋白(CRP)的结合,(7)C1q与球状C1q受体(gC1qR)的结合,(8)C1q与补体受体1(CR1)的结合,(9)C1q与β-淀粉样蛋白的结合,或(10)C1q与钙网蛋白的结合。在其它实施方案中,C1q的生物活性是(1)经典补体活化途径的活化,(2)裂解的减少和/或C3沉积的减少,(3)抗体和补体依赖性细胞毒性的活化,(4)CH50溶血,(5)红血细胞裂解的减少,(6)红血细胞吞噬作用的减少,(7)树突细胞浸润的减少,(8)补体介导的红血细胞裂解的抑制,(9)淋巴细胞浸润的减少,(10)巨噬细胞浸润的减少,(11)抗体沉积的减少,(12)嗜中性粒细胞浸润的减少,(13)血小板吞噬作用的减少,(14)血小板裂解的减少,(15)移植移植物存活的改善,(16)巨噬细胞介导的吞噬作用的减少,(17)自身抗体介导的补体活化的减少,(18)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(19)由同种抗体所致的红血细胞裂解的减少,(20)由输血反应所致的溶血的减少,(21)同种抗体介导的血小板裂解的减少,(22)贫血的改善,(23)嗜酸性粒细胞增多的减少,(24)红血细胞上C3沉积的减少(例如,RBC上C3b、iC3b等的沉积的减少),(25)血小板上C3沉积的减少(例如,血小板上C3b、iC3b等的沉积的减少),(26)过敏毒素产生的减少,(27)自身抗体介导的水疱形成的减少,(28)自身抗体诱导的红斑的减少,(29)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(30)由输血反应所致的血小板裂解的减少,(31)肥大细胞活化的减少,(32)肥大细胞组胺释放的减少,(33)血管通透性的降低,(34)移植移植物内皮上补体沉积的减少,(35)B细胞抗体产生,(36)树突细胞成熟,(37)T细胞增殖,(38)细胞因子产生,(39)小胶质细胞活化,(40)阿瑟反应,(41)移植移植物内皮中过敏毒素产生的减少,或(42)补体受体3(CR3/C3)表达细胞的活化。
在一些实施方案中,CH50溶血包括人、小鼠和/或大鼠CH50溶血。在一些实施方案中,抗体能够中和至少约50%至至少约95%的CH50溶血。在一些实施方案中,抗体能够中和50%、60%、70%、80%、90%或100%的CH50溶血。抗体还能够在小于150ng/ml、小于100ng/ml、小于50ng/ml或小于20ng/ml的剂量下中和至少50%的CH50溶血。
测量补体活性的其它体外测定包括用于测量补体活化过程中形成的补体组分或复合物的裂解产物的ELISA测定。通过经典途径进行的补体活化可以通过跟踪血清中C4d和C4的水平来测量。可以在ELISA中通过评估循环中Bb或C3bBbP复合物的水平来测量替代途径的活化。体外抗体介导的补体活化测定也可以用于评估对C3a产生的抑制。
本公开的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、其抗体片段或其衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。
本公开的抗体也可以是抗体片段,例如Fab片段、Fab’片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
本文公开了向受试者施用第二种药剂,例如第二种抗体或第二种抑制剂的方法。抗体可以是抗C1q抗体、抗C1r抗体或抗C1s抗体。抑制剂可以是抗体依赖性细胞毒性、选择性补体活化途径的抑制剂;和/或自身抗体与自身抗原之间的相互作用的抑制剂。
在一些实施方案中,提供了确定受试者发展血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法,其包括:(a)向受试者施用抗体(即抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体),其中抗体与可检测标记偶合;(b)检测可检测标记以测量受试者中C1q、C1r或C1s的量或位置;和(c)将C1q、C1r或C1s中的一种或多种的量或位置与参照进行比较,其中基于C1q、C1r或C1s中的一种或多种的量或位置与参照的比较来表征发展血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的风险。可检测标记可以包括核酸、寡核苷酸、酶、放射性同位素、生物素或荧光标记。在一些情况下,可以使用生物素化过程用辅酶(例如生物素)标记抗体。当生物素用作标记时,通过添加蛋白质(例如抗生物素蛋白或其细菌对应物链霉抗生物素蛋白)来完成抗体的检测,其中任一种都可以与可检测的标志物(例如上述染料)、荧光标志物(例如荧光素)、放射性同位素或酶(例如过氧化物酶)结合。在一些实施方案中,抗体是抗体片段(例如,Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或F(ab’)2片段)或其抗体衍生物。
本文公开的抗体也可以与标记基团偶合,例如放射性同位素、放射性核素、酶基团、生物素基团、核酸、寡核苷酸、酶或荧光标记。标记基团可以通过任何合适长度的间隔臂与抗体偶合,以减少潜在的空间位阻。标记蛋白质的各种方法在本领域是已知的,并且可用于制备这种标记的抗体。
考虑了各种施用途径。这种施用方法包括但不限于局部、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鞘内、鼻内和病变内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。合适的抗体包括结合补体组分C1q、C1r或C1s的抗体。此类抗体包括单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段和/或其抗体衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。
在一些实施方案中,抗体是可通过重组手段制备、表达、产生或分离的人单克隆抗体,例如(a)从对人免疫球蛋白基因为转基因或跨染色体的动物(例如,小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体,(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如来自转染瘤)中分离的抗体,(c)从重组、组合的人抗体文库中分离的抗体,和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来自人种系和/或非种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而,在某些实施方案中,可以使此类重组人抗体经受体外诱变(或,当使用人Ig序列的转基因动物时,进行体内体细胞诱变),并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列,其虽然来源于人种系VH和VL序列并与其相关,但可能不天然存在于体内的人抗体种系库内。
在一些实施方案中,抗体是人源化和/或嵌合单克隆抗体,其可以通过用(1)来源于酶消化来自人血浆或血清的纯化补体组分的天然补体组分(例如,C1q、C1r或C1s),或(2)由真核或原核系统表达的重组补体组分或其衍生片段免疫啮齿动物(例如,小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)来产生。其它动物可用于免疫,例如非人灵长类动物、表达人免疫球蛋白的转基因小鼠和移植有人B淋巴细胞的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。
多克隆和单克隆抗体作为免疫球蛋白(Ig)分子在免疫系统对病原体的反应中自然产生。约150kDa的IgG1分子是人血清中浓度为8mg/ml的主要形式,由两条相同的约50kDa重链和两条相同的约25kDa轻链构成。
杂交瘤可以通过常规程序,通过来自将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合来产生。此外,通过在噬菌体展示系统中从人B淋巴细胞中筛查重组单链Fv或Fab文库,可以产生抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western immunoblotting)或其它免疫化学技术来检测MAb对人C1q、C1r或C1s的特异性。
可以通过溶血测定,针对替代补体途径使用未致敏的兔或豚鼠RBC或针对经典补体途径使用致敏的鸡或羊RBC来评估筛查过程中鉴定的抗体对补体活化的抑制活性。通过有限稀释克隆展现对经典补体途径具有特异性的抑制活性的那些杂交瘤。通过上述测定纯化抗体以用于表征对人C1q、C1r或C1s的特异性。
基于抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体可变区的分子结构,分子建模和合理的分子设计可用于产生并筛查模拟抗体结合区分子结构并抑制C1q、C1r或C1s活性的小分子。这些小分子可以是肽、肽模拟物、寡核苷酸或有机化合物。模拟分子可以用作炎性适应症和自身免疫性疾病中补体活化的抑制剂。替代地,可以使用本领域常用的大规模筛查程序以从组合化合物文库中分离合适的小分子。
合适的剂量可以由技术人员使用各种众所周知的方法来确定,包括使用动物模型以及临床试验,然后遵循确定最佳剂量的常规方法,即施用各种剂量并确定哪些剂量提供合适的疗效而没有不合需要的副作用。
在重组DNA技术出现之前,裂解多肽序列的蛋白水解酶(蛋白酶)用于解剖抗体分子的结构并确定分子的哪些部分负责其各种功能。蛋白酶木瓜蛋白酶的有限消化将抗体分子裂解成三个片段。被称为Fab片段的两个片段是同一的,并且含有抗原结合活性。Fab片段对应于抗体分子的两条同一的臂,每条臂由与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链组成。其它片段不含抗原结合活性,但最初观察到容易结晶,并且因此命名为Fc片段(可结晶的片段)。
Fab分子是Ig分子的大约50-kDa的人工片段,其重链缺少恒定结构域CH2和CH3。两个异嗜性(VL-VH和CL-CH1)结构域相互作用是Fab分子的双链结构的基础,其通过CL与CH1之间的二硫键进一步稳定。Fab和IgG具有由六个互补决定区(CDR)形成的相同抗原结合位点,VL和VH各三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3)。CDR定义了抗体的高变抗原结合位点。在LCDR3和HCDR3中发现了最高的序列变异,其在天然免疫系统中分别由VL和JL基因或VH、DH和JH基因的重排产生。LCDR3和HCDR3通常形成抗原结合位点的核心。连接并显示六个CDR的保守区域被称为框架区。在可变结构域的三维结构中,框架区形成了两个反向平行的β-折叠的夹层,其通过外部的高变CDR环和内部的保守二硫键连接。
本文公开了用于保护或治疗患有血液病症的个体的方法,所述血液病症例如冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症)。血液和内皮细胞上的补体活化活化血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞、红血细胞以及内皮细胞,从而促进血栓和炎性损伤。这些发现对各种临床疾患,特别是涉及补体活化的血液病症具有广泛的意义。通过使补体蛋白与补体途径的抑制剂或拮抗剂接触来抑制补体活化。例如,抑制剂可以阻断补体级联的活化,可以阻断血细胞中特定补体蛋白的表达,可以干扰诱导补体活化的信号传导分子,可以上调血细胞中补体抑制剂的表达,以及以其它方式干扰血液病症中补体的作用。防止补体活化的能力对于在各种血液病症中维持正常的血液功能具有重要意义。
本公开还提供了通过以下检测个体中的补体活化的方法:(a)向受试者施用来自任一实施方案的抗体,其中抗体与可检测标记偶合;(b)检测可检测标记以测量受试者中抗体的量或位置;和(c)将抗体的量或位置与参照进行比较,其中基于抗体的量与参照的比较来表征发展与补体活化相关的血液病症的风险。例如,可检测标记可以包括核酸、寡核苷酸、酶、放射性同位素、生物素或荧光标记(例如,荧光素、罗丹明(rhodamine)、花青染料或BODIPY)。可检测的标记可以使用用于x射线、CT、MRI、超声波、PET和SPECT的成像剂来检测。
应当理解,本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有特性可以组合以形成本文提供的组合物和方法的其它实施方案。关于本发明的实施方案的所有组合被明确地包括在本发明中并公开于本文中,就如同每个和每一个组合被个别地且明确地公开。此外,各种实施方案的所有子组合及其元素也被明确地包括在本发明中并公开于本文中,就如同每个和每一个此类子组合被个别地且明确地公开于本文中。本文提供的组合物和方法的这些和其它方面对本领域技术人员来说将变得显而易见。
本文所论述的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开内容而提供。本文没有任何内容被解释为承认本发明没有资格先于现有发明的这种出版物。此外,所提供的出版日期可不同于可能需要独立确认的实际出版日期。
抗补体C1q抗体
本文公开的抗C1q抗体是有效的C1q抑制剂,并且可以在任何时期给药以持续抑制C1q功能,然后任选地停药,以允许在其活性可能重要时恢复正常的C1q功能。用本文公开的抗C1q抗体在动物研究中获得的结果可以容易地与人源化或人抗体以及其片段和/或衍生物一起带入临床。
C1q是一种460kDa的大多聚体蛋白,由18条多肽链(6条C1q A链、6条C1q B链和6条C1q C链)组成。C1r和C1s补体蛋白与C1q尾区结合以形成C1复合物(C1qr2s2)。
本公开的抗体特异性识别补体因子C1q和/或经典补体活化途径的C1复合物中的C1q。结合补体因子可以非限制性地来源于具有补体系统的任何生物,包括任何哺乳动物生物,例如人、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、牛、马、骆驼、绵羊、山羊或猪。
如本文所用,“C1复合物”是指蛋白质复合物,其可包括但不限于一种C1q蛋白质、两种C1r蛋白质和两种C1s蛋白质(例如,C1qr2s2)。
本文公开的抗C1q抗体可以抑制C1复合物形成。
如本文所用,“补体因子C1q”是指野生型序列和天然存在的变体序列。
由本公开的抗体识别的补体因子C1q的非限制性实例是人C1q,包括三条多肽链A、B和C:
C1q,链A(智人(homo sapiens)),登录号蛋白质
数据库:NP_057075.1;基因库编号:NM_015991:
>gi|7705753|ref|NP_057075.1|组分C1q
子组分亚单位A前体[智人]
(SEQ ID NO:1)
MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIRTGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGSEADSVFSGFLIFPSA。
C1q,链B(智人),登录号蛋白质
数据库:NP_000482.3;基因库编号:NM_000491.3:
>gi|87298828|ref|NP_000482.3|组分C1q
子组分亚单位B前体[智人]
(SEQ ID NO:2)
MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDISQAQLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIKGEKGLPGLAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPKGGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTINVPLRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCKVPGLYYFTYHASSRGNLCVNLMRGRERAQKVVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQATDKNSLLGMEGANSIFSGFLLFPDMEA。
C1q,链C(智人),登录号蛋白质
数据库:NP_001107573.1;基因库编号:
NM_001114101.1:
>gi|166235903|ref|NP_001107573.1|组分C1q
亚组分亚单位C前体[智人]
(SEQ ID NO:3)
MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGEPGIPAIPGIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQSVFTVTRQTHQPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGFLLFPD。
因此,本公开的抗C1q抗体可以结合C1q蛋白的多肽链A、多肽链B和/或多肽链C。在一些实施方案中,本公开的抗C1q抗体结合人C1q或其同源物的多肽链A、多肽链B和/或多肽链C,所述同源物例如小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、牛、马、骆驼、绵羊、山羊或猪C1q。在一些实施方案中,抗C1q抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其片段或其衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。
合适的抗体包括结合补体C1q蛋白的抗体(即,抗补体C1q抗体,本文也称为抗C1q抗体和C1q抗体)和编码这种抗体的核酸分子,其用于预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法。
以下二十个段落中提到的所有序列都通过引用并入美国专利第9,708,394号,其公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
抗体M1(Mab2)的轻链和重链可变结构域序列
使用标准技术,确定了编码抗体M1的轻链可变结构域和重链可变结构域的核酸和氨基酸序列。抗体M1轻链可变结构域的氨基酸序列是:
轻链可变结构域的高可变区(HVR)以粗体和下划线标出。在一些实施方案中,M1轻链可变结构域的HVR-L1具有序列RASKSINKYLA(SEQ ID NO:5),M1轻链可变结构域的HVR-L2具有序列SGSTLQS(SEQ ID NO:6),并且M1轻链可变结构域的HVR-L3具有序列QQHNEYPLT(SEQ ID NO:7)。
抗体M1重链可变结构域的氨基酸序列是:
重链可变结构域的高可变区(HVR)以粗体和下划线标出。在一些实施方案中,M1重链可变结构域的HVR-H1具有序列GYHFTSYWMH(SEQ ID NO:9),M1重链可变结构域的HVR-H2具有序列VIHPNSGSINYNEKFES(SEQ ID NO:10),并且M1重链可变结构域的HVR-H3具有序列ERDSTEVLPMDY(SEQ ID NO:11)。
编码轻链可变结构域的核酸序列被确定为:
GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAACAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAACATAATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:12)。
编码重链可变结构域的核酸序列被确定为:
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTACCATTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTCATCCTAATAGTGGTAGTATTAACTACAATGAGAAGTTCGAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCGGCGGTCTATTATTGTGCAGGAGAGAGAGATTCTACGGAGGTTCTCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:13)。
物质保藏
以下物质已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),ATCC专利保管处,10801 University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209,USA(ATCC):
产生M1抗体的杂交瘤细胞系(小鼠杂交瘤C1qM1 7788-1(M)051613)已在确保在专利申请未决期间可获得培养物的条件下保藏在ATCC,期限为30年,或最近请求后的5年,或专利的有效期限,以较长者为准。如果在此期间保藏物变得不可行,那么将替换保藏物。根据主题申请的对应物或其后代提交的国家的外国专利法的要求,保藏物是可用的。然而,应该理解的是,保藏物的可用性并不构成在减损由政府行为授予的专利权的情况下实践主题发明的许可。
本文公开了施用包含轻链可变结构域和重链可变结构域的抗C1q抗体的方法。抗体可以至少结合人C1q、小鼠C1q或大鼠C1q。抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。抗体可以是单克隆抗体、其抗体片段和/或其抗体衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。轻链可变结构域包含由以登录号PTA-120399保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体M1的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。重链可变结构域包含由以ATCC登录号PTA-120399保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体M1的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
在一些实施方案中,轻链可变结构域和重链可变结构域的氨基酸序列包含HVR-L1的SEQ ID NO:5、HVR-L2的SEQ ID NO:6、HVR-L3的SEQ ID NO:7、HVR-H1的SEQ ID NO:9、HVR-H2的SEQ ID NO:10和HVR-H3的SEQ ID NO:11中的一个或多个。
抗体可包含与SEQ ID NO:4至少85%、90%或95%同一的轻链可变结构域氨基酸序列,优选地同时保留HVR-L1 RASKSINKYLA(SEQ ID NO:5)、HVR-L2 SGSTLQS(SEQ ID NO:6)和HVR-L3 QQHNEYPLT(SEQ ID NO:7)。抗体可包含与SEQ ID NO:8至少85%、90%或95%同一的重链可变结构域氨基酸序列,优选地同时保留HVR-H1 GYHFTSYWMH(SEQ ID NO:9)、HVR-H2 VIHPNSGSINYNEKFES(SEQ ID NO:10)和HVR-H3 ERDSTEVLPMDY(SEQ ID NO:11)。
本文公开了施用抗C1q抗体的方法,所述抗体抑制C1q与自身抗体之间的相互作用。在优选的实施方案中,抗C1q抗体促使从循环或组织中清除C1q。
在一些实施方案中,本公开的抗C1q抗体抑制C1q与C1s之间的相互作用。在一些实施方案中,抗C1q抗体抑制C1q与C1r之间的相互作用。在一些实施方案中,抗C1q抗体抑制C1q与C1s之间和C1q与C1r之间的相互作用。在一些实施方案中,抗C1q抗体抑制C1q与另一种抗体(例如自身抗体)之间的相互作用。在优选的实施方案中,抗C1q抗体促使从循环或组织中清除C1q。在一些实施方案中,抗C1q抗体以小于2.5:1、2.0:1、1.5:1或1.0:1的化学计量抑制各自的相互作用。在一些实施方案中,C1q抗体在大约等摩尔浓度的C1q和抗C1q抗体下抑制相互作用,例如C1q-C1s相互作用。在其它实施方案中,抗C1q抗体以小于20:1、小于19.5:1;小于19:1、小于18.5:1、小于18:1、小于17.5:1、小于17:1、小于16.5:1、小于16:1、小于15.5:1、小于15:1、小于14.5:1、小于14:1、小于13.5:1、小于13:1、小于12.5:1、小于12:1、小于11.5:1、小于11:1、小于10.5:1、小于10:1、小于9.5:1、小于9:1、小于8.5:1、小于8:1、小于7.5:1、小于7:1、小于6.5:1、小于6:1、小于5.5:1、小于5:1、小于4.5:1、小于4:1、小于3.5:1、小于3:1、小于2.5:1、小于2.0:1、小于1.5:1或小于1.0:1的化学计量结合C1q。在某些实施方案中,抗C1q抗体以20:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。在某些实施方案中,抗C1q抗体以6:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。在某些实施方案中,抗C1q抗体以2.5:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。在一些实施方案中,抗C1q抗体抑制C1q与C1r之间、或C1q与C1s之间、或C1q与C1r和C1s两者之间的相互作用。在一些实施方案中,抗C1q抗体抑制C1q与C1r之间、C1q与C1s之间和/或C1q与C1r和C1s两者之间的相互作用。在一些实施方案中,抗C1q抗体结合C1q A链。在其它实施方案中,抗C1q抗体结合C1q B链。在其它实施方案中,抗C1q抗体结合C1q C链。在一些实施方案中,抗C1q抗体结合C1q A链、C1q B链和/或C1q C链。在一些实施方案中,抗C1q抗体结合C1q A链、B链和/或C链的球状结构域。在其它实施方案中,抗C1q抗体结合C1q A链、C1q B链和/或C1qC链的胶原样结构域。
当本公开的抗体抑制两种或更多种补体因子之间的相互作用,例如C1q与C1s之间的相互作用或C1q与C1r之间的相互作用时,相对于其中不存在本公开的抗体的对照,在抗体的存在下发生的相互作用可以减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些实施方案中,本公开的抗体将两种或更多种补体因子之间的相互作用减少50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些实施方案中,相对于其中不存在本公开的抗体的对照,在抗体的存在下发生的相互作用减少了范围介于至少30%至至少99%的量。
在一些实施方案中,相对于其中不存在本公开的抗体的对照,本公开的抗体使C2或C4裂解抑制至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%,或抑制范围介于至少30%至至少99%的量。测量C2或C4裂解的方法是本领域众所周知的。本公开的抗体关于C2或C4裂解的EC50值可以小于3μg/ml;2.5μg/ml;2.0μg/ml;1.5μg/ml;1.0μg/ml;0.5μg/ml;0.25μg/ml;0.1μg/ml;0.05μg/ml。在一些实施方案中,本公开的抗体在大约等摩尔浓度的C1q和相应的抗C1q抗体下抑制C2或C4裂解。
在一些实施方案中,相对于其中不存在本公开的抗体的对照,本公开的抗体使自身抗体依赖性和补体依赖性细胞毒性(CDC)抑制至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%,或抑制范围介于至少30%至至少99%的量。本公开的抗体关于抑制自身抗体依赖性和补体依赖性细胞毒性的EC50值可以小于3μg/ml;2.5μg/ml;2.0μg/ml;1.5μg/ml;1.0μg/ml;0.5μg/ml;0.25μg/ml;0.1μg/ml;0.05μg/ml。
在一些实施方案中,相对于其中不存在本公开的抗体的对照,本公开的抗体使补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDCC)抑制至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%,或抑制范围介于至少30%至至少99%的量。测量CDCC的方法在本领域是众所周知的。本公开的抗体关于CDCC抑制的EC50值可以小于3μg/ml;2.5μg/ml;2.0μg/ml;1.5μg/ml;1.0μg/ml;0.5μg/ml;0.25μg/ml;0.1μg/ml;0.05μg/ml。在一些实施方案中,本公开的抗体抑制CDCC,但不抑制抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
人源化抗补体C1q抗体
本公开的人源化抗体特异性结合经典补体途径的C1复合物中的补体因子C1q和/或C1q蛋白。人源化抗C1q抗体可特异性结合人C1q、人和小鼠C1q、大鼠C1q或人C1q、小鼠C1q和大鼠C1q。
以下十六个段落中提到的所有序列都通过引用并入美国专利申请第14/933,517号,其公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
在一些实施方案中,人重链恒定区是人IgG4重链恒定区,其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:47具有至少70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%同源性。根据Kabat编号,人IgG4重链恒定区可以包含具有一个或多个修饰和/或氨基酸取代的Fc区。在这种情况下,Fc区包含位置248处的亮氨酸至谷氨酸的氨基酸取代,其中这种取代抑制Fc区与Fc受体相互作用。在一些实施方案中,Fc区包含位置241处的丝氨酸至脯氨酸的氨基酸取代,其中这种取代防止抗体中的臂转换。
人IgG4(S241P L248E)重链恒定结构域的氨基酸序列是:ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:47)。
抗体可包含重链可变结构域和轻链可变结构域,其中重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:31-34中的任一个的氨基酸序列,或与选自SEQ ID NO:31-34中的任一个的氨基酸序列具有至少约90%同源性的氨基酸序列。在某些这样的实施方案中,轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:35-38中的任一个的氨基酸序列,或与选自SEQ ID NO:35-38中的任一个的氨基酸序列具有至少约90%同源性的氨基酸序列。
抗体可包含与SEQ ID NO:35-38至少85%、90%或95%同一的轻链可变结构域氨基酸序列,同时保留HVR-L1 RASKSINKYLA(SEQ ID NO:5)、HVR-L2 SGSTLQS(SEQ ID NO:6)和HVR-L3 QQHNEYPLT(SEQ ID NO:7)。抗体可包含与SEQ ID NO:31-34至少85%、90%或95%同一的重链可变结构域氨基酸序列,同时保留HVR-H1 GYHFTSYWMH(SEQ ID NO:9)、HVR-H2 VIHPNSGSINYNEKFES(SEQ ID NO:10)和HVR-H3 ERDSTEVLPMDY(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:35的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQID NO:31的重链可变结构域氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:36的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:32的重链可变结构域氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:37的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:33的重链可变结构域氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:38的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:34的重链可变结构域氨基酸序列。
在一些实施方案中,本公开的人源化抗C1q抗体包括含有Fab区的重链可变区和含有Fc区的重链恒定区,其中Fab区特异性结合本公开的C1q蛋白,但Fc区不能结合C1q蛋白。在一些实施方案中,Fc区来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中,Fc区不能诱导补体活性和/或不能诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中,Fc区包含一个或多个修饰,包括但不限于氨基酸取代。在某些实施方案中,本公开的人源化抗C1q抗体的Fc区包含根据Kabat编号惯例的位置248或根据Kabat编号惯例的对应于位置248的位置和/或根据Kabat编号惯例的位置241或根据Kabat编号惯例的对应于位置241的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中,位置248或对应于位置248的位置处的氨基酸取代抑制Fc区与Fc受体相互作用。在一些实施方案中,位置248或对应于位置248的位置处的氨基酸取代是亮氨酸至谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中,位置241或对应于位置241的位置处的氨基酸取代防止抗体中的臂转换。在一些实施方案中,位置241或对应于位置241的位置处的氨基酸取代是丝氨酸至脯氨酸的氨基酸取代。在某些实施方案中,本公开的人源化抗C1q抗体的Fc区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%同源性的氨基酸序列。
抗C1q Fab片段
在重组DNA技术出现之前,裂解多肽序列的蛋白水解酶(蛋白酶)已被用于解剖抗体分子的结构并确定分子的哪些部分负责其各种功能。蛋白酶木瓜蛋白酶的有限消化将抗体分子裂解成三个片段。被称为Fab片段的两个片段是同一的,并且含有抗原结合活性。Fab片段对应于抗体分子的两条同一的臂,每条臂由与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链组成。其它片段不含抗原结合活性,但最初观察到容易结晶,并且因此命名为Fc片段(可结晶的片段)。当将Fab分子与IgG分子进行比较时,发现Fab对于某些体内应用中优于IgG,因为其具有更高的移动性和组织穿透能力,其的循环半衰期缩短,其能够单价结合抗原而不介导抗体效应子功能,并且其的免疫原性较低。
Fab分子是Ig分子的大约50-kDa的人工片段,其重链被恒定结构域CH2和CH3缩短。两个异嗜性(VL-VH和CL-CH1)结构域相互作用是Fab分子双链结构的基础,其通过CL与CH1之间的二硫键进一步稳定。Fab和IgG具有由六个互补决定区(CDR)形成的相同抗原结合位点,VL和VH各三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3)。CDR定义了抗体的高变抗原结合位点。在LCDR3和HCDR3中发现了最高的序列变异,其在天然免疫系统中分别由VL和JL基因或VH、DH和JH基因的重排产生。LCDR3和HCDR3通常形成抗原结合位点的核心。连接并显示六个CDR的保守区域被称为框架区。在可变结构域的三维结构中,框架区形成了两个反向平行的β-折叠的夹层,其通过外部的高变CDR环和内部的保守二硫键连接。Fab和IgG的抗原结合位点的稳定性和多功能性的独特组合是其在疾病诊断、监测、预防和治疗的临床实践中成功的基础。
所有抗C1q抗体Fab片段序列通过引用并入美国专利第15/360,549号,其公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
在某些实施方案中,本公开提供了结合包含重链(VH/CH1)和轻链(VL/CL)的C1q蛋白的抗C1q抗体Fab片段,其中抗C1q抗体Fab片段具有六个互补决定区(CDR),VL和VH各三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3)。抗体Fab片段的重链在IgG1的第一重链结构域(SEQ ID NO:39)后被截短,并且包含以下氨基酸序列:
SEQ ID NO:1的互补决定区(CDR)以粗体和下划线标出。
抗体Fab片段的轻链结构域包含以下氨基酸序列(SEQ ID NO:40):
SEQ ID NO:2的互补决定区(CDR)以粗体和下划线标出。
抗补体C1s抗体
合适的抑制剂包括结合补体C1s蛋白的抗体(即,抗补体C1s抗体,本文也称为抗C1s抗体和C1s抗体)和编码这种抗体的核酸分子。补体C1s是一个有吸引力的靶标,因为其位于补体级联的上游并具有窄范围的底物特异性。此外,有可能获得特异性结合活化形式的C1s的抗体(例如但不限于单克隆抗体)。
以下两个段落中提到的所有序列都通过引用并入美国专利申请第14/890,811号,其公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
在某些方面,本文公开了施用抗C1s抗体的方法。抗体可以是鼠抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中,轻链可变结构域包含鼠抗人C1s单克隆抗体5A1的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3,并且重链包含鼠抗人C1s单克隆抗体5A1的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,所述抗体由2013年5月15日保藏于ATCC的杂交瘤细胞系或其后代(ATCC登录号PTA-120351)产生。在其它实施方案中,轻链可变结构域包含鼠抗人C1s单克隆抗体5C12的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3,并且重链可变结构域包含鼠抗人C1s单克隆抗体5C12的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,所述抗体由2013年5月15日保藏于ATCC的杂交瘤细胞系或其后代(ATCC登录号PTA-120352)产生。
在一些实施方案中,抗体特异性结合至C1s或C1s酶原并抑制C1s或C1s酶原的生物活性,例如C1s与C1q的结合、C1s与C1r的结合或C1s与C2或C4的结合。生物活性可以是C1s的蛋白水解酶活性、C1s酶原向活性蛋白酶的转化或C2或C4的蛋白水解裂解。在某些实施方案中,生物活性是经典补体活化途径的活化、抗体和补体依赖性细胞毒性的活化或C1F溶血。
以下六十二个段落中的所有序列通过引用并入Van Vlasselaer的美国专利美国专利第8,877,197号,其公开的抗体和相关组合物在此通过引用并入。
本文公开了施用人源化单克隆抗体的方法,所述抗体特异性结合涵盖补体组分C1s的结构域IV和V的区域内的表位。在一些情况下,抗体抑制C1s与补体组分4(C4)的结合和/或不抑制C1s的蛋白酶活性。在一些实施方案中,所述方法包括施用以高亲和力结合C1复合物中的补体组分C1s的人源化单克隆抗体。
本文公开了施用具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的抗体轻链可变区的一个或多个互补决定区(CDR)和/或包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的抗体重链可变区的一个或多个CDR的抗C1s抗体的方法。抗C1s抗体可以结合人或大鼠补体C1s蛋白。在一些实施方案中,抗C1s抗体抑制至少一种由补体C1s蛋白裂解的底物的裂解。
在某些实施方案中,抗体包含:a)具有选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列的互补决定区(CDR);和/或b)具有选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR。
所述抗体可以包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:51的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQID NO:52的CDR-L2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:53的CDR-L3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:55的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:56的CDR-H3。
在其它实施方案中,抗体可包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的可变区的轻链CDR和/或具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的可变区的重链CDR。
抗体可以是特异性结合补体组分C1s的人源化抗体,其中抗体与包含一个或多个包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:67的抗体轻链可变区的CDR和/或一个或多个包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:68的抗体重链可变区的CDR的抗体竞争结合表位。
在其它情况下,抗体可以是特异性结合补体C1s的人源化抗体,其中抗体选自:a)特异性结合补体C1s蛋白内的表位的人源化抗体,其中抗体与包含具有选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR的抗体竞争结合所述表位;和b)特异性结合补体C1s蛋白内的表位的人源化抗体,其中所述抗体与包含具有选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR的抗体竞争结合所述表位。在一些情况下,抗体与包含重链和轻链CDR的抗体竞争结合表位,所述重链和轻链CDR包含:a)SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56;或b)SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66。
抗体可以包含存在于单独多肽中的轻链区和重链区。抗体可以包含Fc区。
本文公开了抗C1s抗体,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:57 90%同一的氨基酸序列的轻链可变区,和包含与氨基酸序列SEQ ID NO:58 90%同一的氨基酸序列的重链可变区。
抗C1s抗体可以选自抗原结合片段、Ig单体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、scFv、scAb、dAb、Fv、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
本文公开了施用竞争结合由抗体IPN003(本文也称为“IPN-M34”或“M34”或“TNT003”)结合的表位的抗体的方法,例如包含抗体IPN003的可变结构域的抗体,例如抗体IPN003。
在一些实施方案中,所述方法包括施用特异性结合补体C1s蛋白内的表位的抗体。在一些实施方案中,分离的抗C1s抗体结合活化的C1s蛋白。在一些实施方案中,分离的抗C1s抗体结合无活性形式的C1s。在其它情况下,分离的抗C1s抗体结合活化的C1s蛋白和非活化形式的C1s。
在一些实施方案中,所述方法包括施用抑制C4的裂解的单克隆抗体,其中分离的单克隆抗体不抑制C2的裂解。在一些实施方案中,所述方法包括施用抑制C2的裂解的单克隆抗体,其中分离的单克隆抗体不抑制C4的裂解。在一些情况下,分离的单克隆抗体是人源化的。在一些情况下,抗体抑制经典补体途径的组分。在一些情况下,由抗体抑制的经典补体途径的组分是C1s。本公开还提供了通过向有需要的个体施用抑制C4的裂解的分离的单克隆抗体或包含分离的单克隆抗体的药物组合物来治疗补体介导的疾病或病症的方法,其中分离的单克隆抗体不抑制C2的裂解。
在一些实施方案中,所述方法包括施用抑制C1s裂解C2或C4的单克隆抗体,即抑制C1s介导的C2或C4的蛋白水解裂解。在一些情况下,单克隆抗体是人源化的。在一些情况下,抗体通过抑制C2或C4与C1s的结合来抑制C1s对C2或C4的裂解;例如,在一些情况下,抗体通过抑制C2或C4与C1s的C2或C4结合位点的结合来抑制C1s介导的C2或C4的裂解。因此,在一些情况下,抗体用作竞争性抑制剂。本公开还提供了通过向有需要的个体施用抑制C1s裂解C2或C4,即抑制C1s介导的C2或C4的蛋白水解裂解的分离的单克隆抗体来治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的方法。
在一些实施方案中,所述方法包括施用抑制C1s裂解C4的单克隆抗体,其中所述抗体不抑制C1s裂解补体组分C2;即抗体抑制C1s介导的C4裂解,但不抑制C1s介导的C2裂解。在一些情况下,单克隆抗体是人源化的。在一些情况下,单克隆抗体抑制C4与C1s的结合,但不抑制C2与C1s的结合。在一些实施方案中,所述方法包括通过向有需要的个体施用抑制C1s裂解C4的分离的单克隆抗体来治疗补体介导的疾病或病症,其中所述抗体不抑制C1s裂解补体组分C2;即抗体抑制C1s介导的C4裂解,但不抑制C1s介导的C2裂解。在所述方法的一些实施方案中,抗体是人源化的。
在一些实施方案中,所述方法包括施用特异性结合涵盖C1s的结构域IV和V的区域内的表位的人源化单克隆抗体。例如,人源化单克隆抗体特异性结合图1中所描绘的氨基酸序列的氨基酸272-422内的表位并在SEQ ID NO:70中示出。在一些情况下,人源化单克隆抗体特异性结合图1中所描绘且SEQ ID NO:70中所示出的氨基酸序列的氨基酸272-422内的表位并抑制C4与C1s的结合。在一些实施方案中,所述方法包括通过向有需要的个体施用特异性结合图1中所描绘且SEQ ID NO:70中所示出的氨基酸序列的氨基酸272-422内的表位并抑制C4与C1s的结合的人源化单克隆抗体来治疗补体介导的疾病或病症。
在一些实施方案中,所述方法包括施用特异性结合涵盖C1s的结构域IV和V的区域内的构象表位的人源化单克隆抗体。例如,特异性结合图1中所描绘的氨基酸序列的氨基酸272-422内的构象表位并在SEQ ID NO:70中示出的人源化单克隆抗体。在一些情况下,人源化单克隆抗体特异性结合图1中所描绘且SEQ ID NO:70中所示出的氨基酸序列的氨基酸272-422内的构象表位并抑制C4与C1s的结合。在一些实施方案中,所述方法包括血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症)),所述方法包括向有需要的个体施用特异性结合图1中所描绘且SEQ ID NO:70中所示出的氨基酸序列的氨基酸272-422内的构象表位并抑制C4与C1s的结合的人源化单克隆抗体。
在一些实施方案中,所述方法包括施用结合C1复合物中的补体组分C1s的单克隆抗体。C1复合物由6个C1q分子、2个C1r分子和2个C1s分子构成。在一些情况下,单克隆抗体是人源化的。因此,在一些情况下,结合C1复合物中的补体组分C1s的人源化单克隆抗体。在一些情况下,抗体以高亲和力结合存在于C1复合物中的C1s。
在一些实施方案中,抗C1s抗体(例如,特异性结合补体C1s蛋白中的表位的主题抗体)包含:a)包含IPN003抗体的一个、两个或三个VL CDR的轻链区;和b)包含IPN003抗体的一个、两个或三个VH CDR的重链区;其中VH和VL CDR如Kabat所定义(Kabat 1991)。
在其它实施方案中,抗C1s抗体(例如,特异性结合补体C1s蛋白中的表位的主题抗体)包含:a)包含IPN003抗体的一个、两个或三个VL CDR的轻链区;和b)包含IPN003抗体的一个、两个或三个VH CDR的重链区;其中VH和VL CDR如Chothia所定义(Chothia 1987)。
在一些实施方案中,抗C1s抗体(例如,特异性结合补体C1s蛋白中的表位的主题抗体)包含:a)包含选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的一个、两个或三个CDR的轻链区;和b)包含选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的一个、两个或三个CDR的重链区。在一些实施方案中,抗C1s抗体包括人源化VH和/或VL框架区。
SEQ ID NO.51:SSVSSSYLHWYQ;
SEQ ID NO.52:STSNLASGVP;
SEQ ID NO.53:HQYYRLPPIT;
SEQ ID NO.54:GFTFSNYAMSWV;
SEQ ID NO.55:ISSGGSHTYY;
SEQ ID NO.56:ARLFTGYAMDY。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含具有选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:51的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:52的CDR-L2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:53的CDR-L3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:54的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:55的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:56的CDR-H3。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
SEQ ID NO.57:
DIVMTQTTAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTFYSLTISSMEAEDDATYYCHQYYRLPPITFGAGTKLELK。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO.58中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
SEQ ID NO.58:
QVKLEESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQIPEKRLEWVATISSGGSHTYYLDSVKGRFTISRDNARDTLYLQMSSLRSEDTALYYCARLFTGYAMDYWGQGTSVT。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:57 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:58 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:57 90%同一的氨基酸序列,所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:58 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的轻链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的重链可变区。
在一些实施方案中,抗C1s抗体特异性结合补体C1s蛋白内的表位,其中所述抗体与包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的抗体轻链可变区的轻链CDR和含有氨基酸序列SEQID NO:58的抗体重链可变区的重链CDR的抗体竞争结合所述表位。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的抗体轻链可变区的轻链CDR和含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的抗体重链可变区的重链CDR。
在一些实施方案中,抗C1s抗体(例如,特异性结合补体C1s蛋白中的表位的主题抗体)包含:a)包含选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:53的一个、两个或三个CDR的轻链区;和b)包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的一个、两个或三个CDR的重链区。
SEQ ID NO.62:TASSSVSSSYLH;
SEQ ID NO.63:STSNLAS;
SEQ ID NO.53:HQYYRLPPIT;
SEQ ID NO.64:NYAMS;
SEQ ID NO.65:TISSGGSHTYYLDSVKG;
SEQ ID NO.66:LFTGYAMDY
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含具有选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:53、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:53。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:62的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:63的CDR-L2、具有氨基酸序列SEQ ID NO:53的CDR-L3、具有氨基酸序列SEQ ID NO:64的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQ ID NO:65的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQ ID NO:66的CDR-H3。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
SEQ ID NO.67:
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTFYSLTISSMEAEDDATYYCHQYYRLPPITFGAGTKLELK。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
SEQ ID NO.68:
EVMLVESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQIPEKRLEWVATISSGGSHTYYLDSVKGRFTISRDNARDTLYLQMSSLRSEDTALYYCARLFTGYAMDYWGQGTSVTVSS。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:67 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:68 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:67 90%同一的氨基酸序列,所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:68 90%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:67 95%同一的氨基酸序列,所述重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:68 95%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变区。
在一些实施方案中,抗C1s抗体特异性结合补体C1s蛋白内的表位,其中抗体与包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:67的抗体轻链可变区的轻链CDR和含有氨基酸序列SEQ IDNO:68的抗体重链可变区的重链CDR的抗体竞争结合所述表位。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:67的抗体轻链可变区的轻链CDR和含有氨基酸序列SEQ ID NO:68的抗体重链可变区的重链CDR。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗C1s抗体包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:79中所示并描绘于图2中的氨基酸序列(VH变体1)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:80中所示并描绘于图3中的氨基酸序列(VH变体2)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:81中所示并描绘于图4中的氨基酸序列(VH变体3)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含重链可变区,其包含与SEQ ID NO:82中所示并描绘于图5中的氨基酸序列(VH变体4)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:83中所示并描绘于图6中的氨基酸序列(VK变体1)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:84中所示并描绘于图7中的氨基酸序列(VK变体2)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
抗C1s抗体可包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:85中所示并描绘于图8中的氨基酸序列(VK变体3)85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
相对于IPN003亲本抗体FR氨基酸序列,抗C1s抗体可包含重链可变区,所述重链可变区包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个框架(FR)氨基酸取代,如表3中所示(图9)。
定义
如本文中说明书中所用,“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以意指一个/种或多个/种。如本文在一条或多条权利要求中所用,当与词语“包含”结合使用时,词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或一个/种以上。例如,对“抗体”的提及是从一个到多个抗体的提及。如本文中所用,“另一个/种(another)”可以指至少第二个/种或更多个/种。
如本文所用,与另一种化合物或组合物“联合”施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用还涵盖作为共同配制物施用或作为单独组合物施用,包括以不同的给药频率或间隔,并且使用相同的施用途径或不同的施用途径。
“补体介导的血液病症”是由循环C1q和补体活化引起的血管室或高度血管化组织的疾病。补体活化可以通过经典途径开始。可以通过补体蛋白C1q直接与表面结合抗体或表面蛋白的贴片结合来活化经典途径。
术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与“抗体”互换使用。术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用,并且具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、抗体片段(只要其展现生物活性)和抗体衍生物。
基本的4链抗体单位是由两条%同一的轻链(L)和两条%同一的重链(H)组成的异源四聚糖蛋白。将VH和VL配对在一起形成单一抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性,参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链都可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型,称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”)。取决于其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列,免疫球蛋白可分为不同的类别或同种型。有五种类别免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其重链分别命名为阿尔法(“α”)、德尔塔(“δ”)、艾普斯龙(“ε”)、伽马(“γ”)和缪(“μ”)。基于CH序列和功能的相对较小差异,γ和α类进一步分为亚类(同种型),例如,人类表达以下亚类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的,并且通常描述于例如在例如Abbas等人,Cellular andMolecular Immunology,第4版(W.B.Saunders Co.,2000)中。
“全长抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白,其包含两条%同一的轻(L)链和两条%同一的重(H)链。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链,而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数量各不相同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变结构域(VH),后面是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL),并且在另一端具有恒定结构域;轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域比对,并且轻链可变结构域与重链可变结构域比对。据信特定的氨基酸残基形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。
“分离的”分子或细胞是从至少一种污染物分子或细胞中鉴定并分离出来的分子或细胞,所述污染物分子或细胞通常在其产生的环境中与其相关。优选地,分离的分子或细胞不与产生环境相关的所有组分缔合。分离的分子或细胞的形式不同于其在自然界中的形式或环境。因此,分离的分子不同于细胞中天然存在的分子;分离的细胞不同于组织、器官或个体中天然存在的细胞。在一些实施方案中,分离的分子是本公开的抗C1s、抗C1q或抗C1r抗体。在其它实施方案中,分离的细胞是产生本公开的抗C1s、抗C1q或抗C1r抗体的宿主细胞或杂交瘤细胞。
“分离的”抗体是已经从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体(例如,天然地或重组地)。优选地,分离的多肽不与来自其产生环境的所有其它污染组分缔合。来自其产生环境的污染组分(例如来自重组转染细胞的污染组分)是通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质,并且可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些优选的实施方案中,多肽将被纯化:(1)达至大于抗体的95重量%,如通过例如Lowry方法所测定,在一些实施方案中,达至大于抗体的99重量%;(2)通过使用旋转杯测序仪达至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(3)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选银染达至均一性。分离的抗体包括重组T细胞中原位的抗体,因为抗体天然环境中的至少一种组分将不存在。然而,通常,分离的多肽或抗体将通过包括至少一个纯化步骤的方法来制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最易变部分(相对于同类别的其它抗体),并且含有抗原结合位点。
术语“可变的”是指抗体中可变结构域的某些区段在序列上有很大差异。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,可变性并不是均匀地分布在可变结构域的整个跨度上。相比之下,其集中在轻链和重链可变结构域中被称为高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区,其大多采用β-折叠构型,由三个HVR连接,其形成连接β-片层结构的环,并且有时形成β-片层结构的部分。每条链中的HVR通过FR区紧密结合在一起,并且与来自另一条链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出各种效应子功能,例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用,术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977);Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins of immunologicalinterest”(1991)(本文也称为Kabat 1991);Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)(本文也称为Chothia 1987);和MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述CDR,其中在相互比较时,定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而,应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的CDR意图都在本文所定义和使用的术语的范围内。
如本文所用,术语“CDR-L1”、“CDR-L2”和“CDR-L3”分别指轻链可变区中的第一、第二和第三CDR。如本文所用,术语“CDR-H1”、“CDR-H2”和“CDR-H3”分别指重链可变区中的第一、第二和第三CDR。如本文所用,术语“CDR-1”、“CDR-2”和“CDR-3”分别指任一链可变区的第一、第二和第三CDR。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,即所述群体中的单个抗体是相同的,除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如,异构化、酰胺化)。单克隆抗体具有高度特异性(针对单一抗原位点)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其的特异性之外,单克隆抗体是有利的,因为其通常由杂交瘤培养物合成,未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示作为基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征并且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如,根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备,包括例如杂交瘤方法(例如,Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975);Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995);Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988);Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如,美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如,Clackson等人,Nature,352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 101(34):12467-472(2004);和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或类人抗体的技术(参见例如,WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993);美国专利第5,545,807号;第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;和第5,661,016号;Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild等人,NatureBiotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”可互换使用以指基本上完整形式的抗体,与抗体片段或抗体衍生物相对。具体来说,全抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的那些抗体。恒定区可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下,完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。
抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”或“功能片段”包含完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合和/或可变区,或保留或具有修饰的FcR结合能力的抗体的F区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段;双抗体;和线性抗体(参见美国专利5,641,870,实施例2;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))。抗体片段的其它实例包括抗体衍生物,例如单链抗体分子、单价抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体
“抗体衍生物”是包含抗体的抗原结合区的任何构建体。抗体衍生物的实例包括单链抗体分子、单价抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个%同一的抗原结合片段,称为“Fab”片段,和一个残留的“Fc”片段,这一名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由一条完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。就抗原结合而言,每个Fab片段都是单价的,即其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab')2片段,其大致相当于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段,并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中将其中恒定结构域的(多个)半胱氨酸残基具有游离硫醇基的Fab'称为Fab'-SH。F(ab')2抗体片段起初以Fab'片段对的形式产生,所述Fab'片段对在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
Fc片段包含由二硫化物结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区的序列决定,所述Fc区也被某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域,包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同,但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可例如在产生或纯化抗体期间或通过重组工程化编码抗体的重链的核酸来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统,残基447)。因此,完整抗体的组合物可以包含所有K447残基被去除的抗体群体、没有K447残基被去除的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。适用于本公开的抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
“天然序列Fc区”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列%同一的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型);天然序列人IgG2 Fc区;天然序列人IgG3 Fc区;和天然序列人IgG4 Fc区,以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含以至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而区别于天然序列Fc区氨基酸序列的氨基酸序列。优选地,变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代,例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中存在约一个至约十个氨基酸取代,优选约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80%同源性,最优选与其具有至少约90%同源性,更优选与其具有至少约95%同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR,包括这些受体的等位基因变体和替代剪接形式,FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),其具有主要不同之处在于其胞质结构域的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(“ITAM”)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(“ITIM”)。(参见例如,M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其它的FcR(涵盖将在未来被鉴定的那些FcR)都涵盖在术语“FcR”中。FcR还可以增加抗体的血清半衰期。
可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽在体内与FcRn的结合和血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了与FcRs结合增强或减弱的抗体变体。也参见例如Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“Fv”是含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域紧密非共价缔合的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中衍生出六个高变环(H链和L链各3个环),其为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而,即便是单一可变结构域(或是仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力,尽管其亲合力低于完整的结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”,是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,sFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头,所述接头使sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述,参见Plückthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指通过在VH与VL结构域之间构建具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段(见上一段)而制备的小抗体片段,使得实现V结构域的链间配对而非链内配对,从而产生二价片段,即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体,其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体详细描述于例如EP 404,097;WO 1993/011161;WO/2009/121948;WO/2014/191493;Hollinger等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)中。
如本文所用,“嵌合抗体”是指一种抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列%同一或同源,而链的其余部分与来源于其它物种或属于其它抗体类别或亚类的抗体中的相应序列%同一或同源,只要其展现所需的生物学活性(美国专利第4,816,567号;和Morrison等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,81:6851-55(1984))。本文的所关注嵌合抗体包括抗体,其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用所关注抗原免疫猕猴产生的抗体。如本文所用,“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
非人(例如,鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体,其含有来源于非人免疫球蛋白的最少序列。在一些实施方案中,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的HVR的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的HVR的残基替换。在一些情况下,人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。另外,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能,例如结合亲和力。一般而言,人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环,并且所有或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些FR区,但FR区可以包括一个或多个单独的FR残基取代,所述取代可改善抗体性能,例如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中这些氨基酸取代的数目在H链中通常不超过6,并且在L链中不超过3。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于另外的细节,参见例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);和美国专利第6,982,321号和第7,087,409号。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体,和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体,包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985);Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中的方法。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过向转基因动物施用抗原来制备,所述转基因动物已经被修饰以响应抗原攻击产生此类抗体,但是其内源基因座已经被禁用,例如免疫的异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术,参见例如美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体,还参见例如Li等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时是指序列高变和/或形成结构确定的环的抗体可变结构域的区域。通常,抗体包含六个HVR,三个在VH(H1、H2、H3)中,三个在VL(L1、L2、L3)中。在天然抗体中,H3和L3在六个HVR中显示出最大的多样性,尤其是H3被认为在赋予抗体良好特异性中起着独特的作用。参见例如Xu等人,Immunity 13:37-45(2000);Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003))。事实上,仅由重链组成的天然存在的骆驼科抗体在不存在轻链的情况下是有功能的和稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)和Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描绘正在使用并涵盖在本文中。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR基于序列的可变性,并且是最常用的(Kabat等人,同上)。Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表了Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷,并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于对可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基如下所示。
HVR可以包括如下“扩展的HVR”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3),VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(优选的实施方案)(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些扩展的HVR定义中的每一个,可变结构域残基根据Kabat等人,同上进行编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
短语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体指的是用于Kabat等人,同上中的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统,实际的线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸,对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变结构域可以包括H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后的插入的残基(例如,根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体,残基的Kabat编号可以通过将抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。
当涉及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时,通常使用Kabat编号系统(例如,Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时,通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如,Kabat等人,同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明,否则提及抗体可变结构域中的残基编号是指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文另有说明,否则提及抗体恒定结构域中的残基编号是指通过EU编号系统进行的残基编号(参见例如美国专利公开第2010-280227号)。
如本文所用的“受体人框架”是包含来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架的氨基酸序列的框架。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其%同一的氨基酸序列,或其可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中,预先存在的氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。当预先存在的氨基酸变化存在于VH中时,优选的这些变化仅发生在位置71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置处;例如,那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一些实施方案中,VL受体人框架序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
“人共有框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最通常存在的氨基酸残基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常,序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的亚组。实例包括对于VL,亚组可以是如Kabat等人,同上中的亚组κI、κII、κIII或κIV。此外,对于VH,亚组可以是如Kabat等人,同上中的亚组I、亚组II或亚组III。
特定位置处的“氨基酸修饰”是指特定残基的取代或缺失,或特定残基附近插入至少一个氨基酸残基。“邻近”特定残基的插入是指在其一个至两个残基内的插入。插入可以是特定残基的N末端或C末端。本文优选的氨基酸修饰是取代。
“亲和力成熟”抗体是指其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体,与不具有那些改变的亲本抗体相比,其引起抗体对抗原的亲和力提高。在一些实施方案中,亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法生产亲和力成熟的抗体。例如,Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变描述于例如:Barbas等人ProcNat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier等人Gene 169:147-155(1995);Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用,术语“特异性识别”或“特异性结合”是指可测量和可重复的相互作用,例如靶标和抗体之间的吸引或结合,其决定了在包括生物分子在内的异质分子群的存在下靶标的存在。例如,特异性或优先结合靶标或表位的抗体是以比结合其它靶标或靶标的其它表位更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合靶标或表位的抗体。还应理解,例如,特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此,“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(但其可以包括)排他性结合。特异性结合靶标的抗体可以具有至少约103M-1或104M-1,有时约105M-1或106M-1,在其它情况下约106M-1或107M-1、约108M-1至109M-1或约1010M-1至1011M-1或更高的缔合常数。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如,固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。关于可以用来确定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述,参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Publications,New York。
如本文所用的“同一性”表示在比对序列的任何特定位置处,序列之间的氨基酸残基是%同一的。本文所用的“相似性”指示,在比对序列的任何特定位置处,序列之间的氨基酸残基具有相似的类型。例如,亮氨酸可以代替异亮氨酸或缬氨酸。经常可以相互取代的其它氨基酸包括但不限于:
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸);
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸);
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸);
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸);和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算出同一性和相似性的程度。(参见例如,ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M编,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,NewYork,1993;Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M Stockton Press,New York,1991)
如本文所用,补体蛋白与第二种蛋白质之间的“相互作用”涵盖但不限于蛋白-蛋白相互作用、物理相互作用、化学相互作用、结合、共价结合和离子结合。如本文所用,当抗体破坏、减少或完全消除两种蛋白质之间的相互作用时,抗体“抑制”两种蛋白质之间的相互作用。当本公开的抗体或其片段与两种蛋白质中的一种结合时,所述抗体或其片段“抑制”两种蛋白质之间的相互作用。
“阻断”抗体、“拮抗”抗体、“抑制”抗体或“中和”抗体是抑制或降低其结合的抗原的一种或多种生物活性的抗体,例如与一种或多种蛋白质的相互作用。在一些实施方案中,阻断抗体、拮抗抗体、抑制抗体或“中和”抗体基本上或完全抑制抗原的一种或多种生物活性或相互作用。
术语“抑制剂”是指能够通过降低靶标生物分子的活性或表达来抑制靶标生物分子(例如,mRNA或蛋白质)的生物功能的化合物。抑制剂可以是抗体、小分子或核酸分子。术语“拮抗剂”是指与受体结合并阻断或抑制受体的生物反应的化合物。术语“抑制剂”也可以指“拮抗剂”。
抗体“效应子功能”是指归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性,并且随着抗体同种型而变化。
如本文所用,术语“亲和力”是指两种试剂(例如,抗体和抗原)可逆地结合的平衡常数,并表示为解离常数(KD)。亲和力可以比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍或大至少1,000倍或更多倍。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文所用,术语“亲和力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段,术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中可互换使用。
术语“结合”是指两个分子之间的直接缔合,这是由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用,包括例如盐桥和水桥的相互作用。例如,受试抗C1s抗体特异性结合补体C1s蛋白内的表位。“特异性结合”指亲和力为至少约10-7M或更大,例如5×10-7M、10-8M、5×10-8M和更大。“非特异性结合”指亲和力小于约10-7M,例如,以10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力结合。
本文使用的术语“kon”是指抗体与抗原缔合的速率常数。
本文使用的术语“koff”是指抗体从抗体/抗原复合物中解离的速率常数。
本文使用的术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用,关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”和“同源性”是指在序列比对和引入缺口(如果必要)以达到最大序列同一性百分比之后,候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基%同一的氨基酸残基的百分比,并且不考虑作为序列同一性的部分的任何保守取代。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现,例如,使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数,包括本领域已知的在被比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
“生物样品”涵盖从个体获得的多种样品类型,并且可用于诊断或监测测定。所述定义涵盖血液和其它生物来源的液体样品、固体组织样品(例如活组织检查标本或组织培养物或由其衍生的细胞)及其后代。所述定义还包括在获得后以任何方式处理过的样品,例如通过用试剂处理、溶解或富集某些组分,例如多核苷酸。术语“生物样品”涵盖临床样品,并且也包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊液、间质液、眼液、滑液、血液成分(例如血浆和血清)等。术语“生物样品”还包括固体组织样品、组织培养样品和细胞样品。
如本文所用的术语“血液空间”是指受试者心血管系统的内容物,包括血清、血小板、内皮细胞、血细胞和其它造血细胞,以及自然流经受试者循环系统的其它物质。靶向血液空间可能对高度血管化的组织有影响,例如肾、肺泡、毛细血管床或肾小球。
“分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出来的核酸分子,所述污染核酸分子通常在其产生的环境中与其缔合。优选地,分离的核酸不与产生环境相关的所有组分缔合。编码本文多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中发现的形式或环境。因此,分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码任何多肽和抗体的核酸。
如本文所用,术语“载体”是指能够转运已与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”,其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体为病毒载体,其中可将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如,非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,由此随宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够引导与其可操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物,并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物,或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在,可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可能被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以包含合成后进行的修饰,例如与标记缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”(用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸);核苷酸间修饰,例如带有不带电的键(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰;含有侧基部分,例如蛋白质(例如,核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)的那些修饰;具有嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)的那些修饰;含有螯合剂(例如,金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些修饰;含有烷基化剂的那些修饰;具有修饰的键(例如,α异头核酸等)的那些修饰;以及未修饰形式的多核苷酸。此外,糖中通常存在的任何羟基可被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换,被标准保护基团保护,或被活化以制备与额外核苷酸的额外连接,或可与固体或半固体载体缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被1个至20个碳原子的胺或有机封端基团部分取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式,包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、无环类似物和碱性核苷类似物(例如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团替换。这些替代的连接基团包括但不限于这样的实施方案,其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲乙缩醛”)替换,其中每个R或R’独立地是H或任选含有醚(-O-)键的取代或未取代的烷基(1-20 C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物,其可以是或已经是用于并入多核苷酸插入物的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代,并且由于自然、意外或有意的突变,后代不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补方面)。宿主细胞包括用本公开的多核苷酸在体内转染的细胞。
本文所用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂,其在所用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲液,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,例如EDTA;糖醇,例如甘露醇或山梨醇;成盐抗衡离子,例如钠;和/或非离子型表面活性剂,例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
术语“预防”是本领域公认的,并且当关于例如血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的疾患使用时,在本领域中是众所周知的,并且包括施用组合物,相对于未接受所述组合物的受试者,所述组合物降低了受试者的医学疾患的一种或多种症状的频率或严重性或者延迟其发作。因此,预防血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))包括例如相对于未接受治疗的对照群体,增加接受治疗的患者群体的血小板计数,例如增加统计学上和/或临床上显著的量。类似地,预防血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))包括相对于未接受治疗的患者,降低接受治疗的患者发展血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))或相关症状的可能性。
本文使用的术语“受试者”是指活的哺乳动物,并且可以与术语“患者”互换使用。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类别的任何成员:人类;非人灵长类动物,例如黑猩猩和其它猿和猴物种;家畜,例如牛、马、绵羊、山羊、猪;家养动物,如兔、狗和猫;实验动物,包括啮齿动物,例如大鼠、小鼠和豚鼠等。所述术语不表示特定的年龄或性别。
如本文所用,术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括减轻疾患、阻止疾患或逆转疾患的症状、临床体征或潜在病理,以稳定或改善受试者的疾患,或降低受试者的疾患恶化的可能性,如同受试者没有接受治疗一样。
关于主题治疗方法的术语化合物的“治疗有效量”是指制剂中的化合物的量,当作为所需给药方案的部分(向哺乳动物,优选人)施用时,根据待治疗的病症或疾患的临床可接受标准或美容目的,例如以适用于任何药物治疗的合理效益/风险比,所述量减轻症状、改善疾患或减缓疾病疾患的发作。本文中的治疗有效量可根据例如疾病状态、年龄、性别和患者体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力的因素而变化。
如本文所用,处于发展特定疾病、病症或疾患的“风险”下的个体可以具有或不具有可检测的疾病或疾病症状,并且在本文所述的治疗方法之前可以具有或不具有可检测的疾病或疾病症状。“处于风险下”表示个体具有一种或多种风险因素,如本领域所已知,所述风险因素是与特定疾病、病症或疾患的发展相关的可测量参数。具有一种或多种这些风险因素的个体与不具有一种或多种这些风险因素的个体相比具有更高的发展特定疾病、病症或疾患的可能性。
“慢性”施用是指以连续而非急性的方式施用,从而在一段延长的时间内保持最初的治疗效果(活性)。“间歇”施用是指不是不间断地连续施用的治疗,而是本质上是循环/周期性的。
如本文所用,与另一种化合物或组合物“联合”施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用还涵盖作为共同共同配制物施用或作为单独组合物施用,包括不同的给药频率或间隔,并且使用相同的施用途径或不同的施用途径。
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然还可在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料,但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文,以公开并描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编(2003));系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995)),Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,andAnimal Cell Culture(R.I.Freshney编,(1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley和Sons;Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991);ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty编,IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995);和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.LippincottCompany,1993)中描述的广泛使用的方法。
核酸、载体和宿主细胞
适用于本公开方法的抗体可以使用重组方法和组合物产生,例如,如美国专利第4,816,567号中所述。在一些实施方案中,提供了具有编码本公开的任何抗体的核苷酸序列的分离的核酸。此类核酸可以编码含有VL/CL的氨基酸序列和/或含有抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体的VH/CH1的氨基酸序列。在一些实施方案中,提供了含有此类核酸的一种或多种载体(例如,表达载体)。也可以提供含有此类核酸的宿主细胞。宿主细胞可以含有以下(例如,已用以下转导):(1)含有编码含有抗体的VL/CL的氨基酸序列和含有抗体的VH/CH1的氨基酸序列的核酸的载体,或(2)含有编码含有抗体的VL/CL的氨基酸序列的核酸的第一载体,和含有编码含有抗体的VH/CH1的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如,Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中,宿主细胞是细菌,例如大肠杆菌。
本文公开了制备抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体的方法。所述方法包括在适于抗体表达的条件下,培养含有编码抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体的核酸的本公开的宿主细胞。在一些实施方案中,随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
为了重组产生本公开的人源化抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体,分离编码抗体的核酸,并且将其插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序将此类核酸容易地分离并进行测序(例如,通过使用寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因)。
在某些实施方案中,本公开提供了分别结合C1q、C1s和C1r蛋白的抗C1q抗体Fab片段、抗C1s抗体Fab片段和抗C1r抗体Fab片段。这些抗体的高亲和力Fab片段适于选择性抑制血液空间内的补体活化。这些抗体的高亲和力Fab片段适于施用,例如皮下、肌内和血管内施用。
含有编码本公开的任何抗体或其片段多肽(包括抗体)的核酸序列的合适载体包括但不限于克隆载体和表达载体。合适的克隆载体可以根据标准技术构建,或可以从本领域可获得的大量克隆载体中选择。虽然选择的克隆载体可以根据打算使用的宿主细胞而变化,但是有用的克隆载体通常具有自我复制的能力,可以具有特定限制性核酸内切酶的单一靶标,和/或可以携带可用于选择含有所述载体的克隆的标志物的基因。合适的例子包括质粒和细菌病毒,例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体,例如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商,例如BioRad、Stratagene和Invitrogen获得。
含有所关注核酸的载体可以通过许多合适的方法中的任何一种引入宿主细胞中,包括电穿孔;使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE葡聚糖或其它物质的转染;微粒轰击;脂质感染;和感染(例如,当载体是传染剂,例如痘苗病毒时)。引入载体或多核苷酸的选择将通常取决于宿主细胞的特征。在一些实施方案中,载体包含核酸,所述核酸含有编码本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体的一个或多个氨基酸序列。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括原核或真核细胞。例如,本公开的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体可以在细菌中产生,特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。用于在细菌中表达抗体片段和多肽(例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号;和Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254页描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在其它实施方案中,本公开的抗体可以在真核细胞中产生,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如,Y0、NS0、Sp20细胞)(例如,美国专利申请第14/269,950号;美国专利第8,981,071号;Eur J Biochem.1991年1月1日;195(1):235-42)。表达后,可以将抗体在可溶性级分中从细菌细胞团糊中分离,并可以进一步纯化。
抗体筛查
可以筛查候选抗体调节补体活化的能力。这种筛查可以使用体外模型、基因改变的细胞或动物或纯化的蛋白质来进行。为此目的,可以使用多种测定,例如体外培养系统。
候选抗体也可以使用基于计算机的建模、通过结合测定等来鉴定。各种体外模型可用于确定抗体是否结合或以其它方式影响补体活性。可以通过接触来自健康供体的血浆来测试此类候选抗体,并且确定补体活化(例如,通过抗原C3c捕获ELISA)。可以在体内模型中进一步测试此类抗体对血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的影响。
通常,用不同的抗体浓度平行运行多个测定混合物,以获得对不同浓度的不同反应。通常,这些浓度中的一种用作阴性对照,即浓度为零或低于检测水平。
药物组合物和施用
本公开的补体抑制剂(例如,抗体)可以以药物组合物的形式施用。
本公开的抑制剂(例如,抗体、抗体片段和/或抗体衍生物)的治疗配制物可以通过将具有所需纯度的抑制剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以冻干配制物或水溶液的形式来制备以用于储存(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A编[1980])。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的,并且包括缓冲液,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚、丁基或苄基醇;对羟基苯甲酸烷基酯,例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(小于约10个残基)的多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖及其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,例如EDTA;糖类,例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子,例如钠离子;金属络合物(例如,Zn-蛋白质络合物);和/或非离子型表面活性剂,例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
脂转染或脂质体也可用于将抗体或抗体片段或抗体衍生物递送至细胞中,其中特异性结合靶蛋白的结合结构域的表位或最小片段是优选的。
抑制剂也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如,分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳剂中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A编(1980)中。
用于施用的制剂可以是无菌的。这易于通过经由无菌过滤膜过滤来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制备剂的合适实例包括包含抑制剂的固体疏水性聚合物的半透过性基质,所述基质为成形制品形式,例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如,聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOTTM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。
本公开的抗体、抗体片段和/或抗体衍生物和组合物通常通过各种途径施用,包括但不限于局部、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和病变内施用。肠胃外施用途径包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下施用。
药物组合物还可包含(取决于所需的配制物)药学上可接受的、无毒的稀释剂载体,所述稀释剂载体被定义为通常用于配制针对动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合的生物活性。此类稀释剂的实例为蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及汉克溶液(Hank's solution)。另外,药物组合物或配制物可以包括其它载体、佐剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂、赋形剂等。组合物还可包括接近生理条件的额外物质,例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、湿润剂及去污剂。
组合物还可以包括任何各种稳定剂,例如抗氧化剂。当药物组合物包括多肽时,多肽可以与各种众所周知的化合物复合,这些化合物增强多肽的体内稳定性,或增强其药理学特性(例如,增加多肽的半衰期,降低其毒性,增强其它药代动力学和/或药效学特征,或增强溶解度或吸收)。此类修饰或复合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐以及磷酸盐。组合物的多肽也可以与增强其体内属性的分子复合。此类分子包括例如碳水化合物、多胺、氨基酸、其它肽、离子(例如,钠、钾、钙、镁、锰)以及脂质。适用于各种类型施用的另外关于配制物的指导可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace PublishingCompany,Philadelphia,Pa.,第17版(1985)中。对于用于药物递送的方法的简要综述参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
活性成分的毒性和治疗功效可根据细胞培养物和/或实验动物中的标准药物工序来确定,包括例如确定LD50(50%群体致死剂量)和ED50(50%群体有效治疗剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且其可表示为LD50/ED50比。展现出高治疗指数的治疗剂为优选的。
从细胞培养和/或动物研究和/或人类临床试验中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。活性成分的剂量通常处于包括具有低毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。
本文所述的药物组合物可以多种不同方式施用。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法施用含有药学上可接受的载体的组合物。
适于胃肠外施用的配制物包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制物与预期接受者的血液等渗的溶质,以及水性和非水性的无菌悬浮液,其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
用来配制药物组合物的组分优选地具有高纯度并且大致上不含潜在有害的污染物(例如,至少国家食品(NF)级、通常至少分析级并且更通常至少药物级)。此外,意图用于肠胃外使用的组合物通常为无菌的。为了达到在使用之前必须合成给定的化合物的程度,所得到的产物通常大致上不含任何潜在的毒性剂、具体为任何内毒素,所述毒性剂可在合成或纯化过程期间存在。用于肠胃外施用的组合物通常也是基本等渗的,并且在GMP条件下制得。
本公开的组合物可以使用任何医学上合适的方法施用,例如血管内(静脉内、动脉内、毛细血管内)施用、肌内或皮下施用。组合物可以通过自动注射器或输注装置,例如微型泵或体内输注器施用。
给予特定患者的治疗组合物的有效量可取决于多种因素,其中的若干因素可能在患者与患者之间不同。有能力的临床医生将能够确定施用于患者的治疗剂的有效量。药剂的剂量将取决于治疗、施用途径、治疗性质、患者对治疗的敏感性等。利用LD50动物数据和其它信息,临床医生可以根据施用途径确定个体的最大安全剂量。利用普通技术,有能力的临床医生将能够在常规临床试验的过程中优化特定治疗组合物的剂量。组合物可以以一系列多于一次的施用方式施用于受试者。对于治疗组合物,有时需要或可能希望定期施用。治疗方案因药剂而异;例如,一些药剂可以每日或半日服用一段时间,而更多的选择性药剂可以在更确定的时间过程内施用,例如一天、两天、三天或更多天、一周或更多周、一个月或更多个月等,每日、半日、半周、每周等服用。
在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与50mg/kg、50mg/kg与60mg/kg、60mg/kg与70mg/kg、70mg/kg与80mg/kg、80mg/kg与90mg/kg、90mg/kg与100mg/kg、100mg/kg与110mg/kg、110mg/kg与120mg/kg、120mg/kg与130mg/kg、130mg/kg与140mg/kg或140mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg与100mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次、每三周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与3mg/kg、3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与7mg/kg或7mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体。
在一些实施方案中,抗体是抗体片段。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注、肌肉注射或皮下注射向受试者施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与1mg/kg、1mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.3mg/kg与10mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体片段。在一些实施方案中,以高于每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次剂量的初始预剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与20mg/kg之间。在一些实施方案中,抗体片段与其相应的全长抗体相比具有较短的半衰期,例如,所述抗体片段被迅速清除,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性,或所述抗体选择性抑制受试者的血液空间内的C1q活性,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性。在一些实施方案中,血液空间被限制在血管内,例如动脉、小动脉、毛细血管、小静脉或静脉。血液空间可以包括血清、血小板、内皮细胞、血细胞或造血细胞。在一些实施方案中,抑制受试者的血液空间内的C1q减少了高度血管化组织中的组织损伤。高度血管化组织的实例是肾、肺泡、毛细血管床或肾小球。
可以对配制物进行优化,以便在体内(包括在血液空间中)保持和稳定。在一些实施方案中,当将药剂施用于血液空间中时,希望药剂保留在血液空间中,并且不扩散或以其它方式分布在血管外(例如,在周围组织中)。稳定技术包括交联、多聚化或连接至例如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、中性蛋白载体等的基团,以实现分子量的增加。
增加保留的其它策略包括将药剂包埋在可生物降解或可生物侵蚀的植入物中。治疗活性剂的释放速率由通过聚合物基质的转运速率和植入物的生物降解性来控制。药物通过聚合物屏障的转运也将受到化合物溶解度、聚合物亲水性、聚合物交联程度、聚合物吸水膨胀以使聚合物屏障对药物更具渗透性、植入物的几何形状等的影响。植入物的尺寸与选择作为植入部位的区域的大小和形状相当。植入物可以是颗粒、薄片、贴片、斑块、纤维、微胶囊等,并且可以是与所选插入部位相容的任何尺寸或形状。
植入物可以是单片的,即活性剂均匀分布在整个聚合物基质中,或被包封,其中活性剂的贮库被聚合物基质包封。待使用的聚合物组合物的选择将随着施用部位、所需治疗时间、患者耐受性、待治疗的疾病的性质等而变化。聚合物的特征包括在植入部位处的生物降解性、与所关注药剂的相容性、易于封装、在生理环境中的半衰期。
可以使用的可生物降解的聚合物组合物可以是有机酯或醚,其在降解时会产生生理上可接受的降解产物,包括单体。酸酐、酰胺、原酸酯或类似物本身可使用或与其它单体组合使用。聚合物可以是缩合聚合物。聚合物可以是交联的或非交联的。尤其关注的是羟基脂族羧酸的聚合物(均聚物或共聚物)和多糖。所关注聚酯包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、聚己内酯及其组合的聚合物。通过使用L-乳酸盐或D-乳酸盐,获得了缓慢生物降解的聚合物,而外消旋物显著增强降解。乙醇酸和乳酸的共聚物尤其受关注,其中生物降解速率由乙醇酸与乳酸的比例控制。降解最快的共聚物含有大致等量的乙醇酸和乳酸,其中任一种均聚物更耐降解。乙醇酸与乳酸的比例也将影响植入物的脆性,对于较大的几何形状,更柔软的植入物是合乎需要的。所关注多糖包括藻酸钙和功能化的纤维素,特别是羧甲基纤维素酯,其特征在于不溶于水,分子量为约5kD至500kD等。可生物降解的水凝胶也可以用于本公开的植入物中。水凝胶通常是共聚物物质,其特征在于吸收液体的能力。可以使用的示例性生物可降解水凝胶描述于Heller,Hydrogels in Medicine and Pharmacy,N.A.Peppes编,第III卷,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1987,第137-149页。
试剂盒
本公开也提供了包括一个或多个容器的药学包装或试剂盒,所述容器填充有药物组合物的一种或多种成分。与这种容器相关的可以是由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知,其反映了所述机构对用于人类施用的制造、使用或销售的批准。
本公开的试剂盒可以包括一个或多个容器,所述容器包括纯化的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体以及根据本领域已知方法的使用说明书。通常,这些说明书包含根据本领域已知的任何方法施用抑制剂来治疗或诊断疾病的描述。所述试剂盒可进一步包括基于对个体是否患有血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))的鉴定来选择适合治疗的个体的描述。
说明书通常包括关于剂量、给药方案和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如,多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书(例如,试剂盒中包括的纸片),但是机器可读的说明书(例如,磁或光存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
标签或包装插页可以指示所述组合物用于治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))。可以提供用于实践本文描述的任何方法的说明书。
本公开的试剂盒优选置于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如,密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。还考虑了与特定装置联合使用的包装,所述特定装置例如吸入器、鼻腔施用装置(例如,雾化器)、自动注射器或输注装置,例如微型泵或体内输注器。试剂盒可以具有无菌接入端口(例如,容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述容器还可以具有无菌接入端口(例如,所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是经典补体途径的抑制剂。所述容器可以进一步包括第二药物活性剂。
试剂盒可以选择性地提供额外的组分,例如缓冲液和解释信息。通常,试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
所关注的疾患
所关注的代表性疾患包括各种血液病症和其它血液学疾病。
术语“血液病症”或“血液学疾病”以最广泛的意义使用,并且包括涉及急性或慢性血液疾患的任何病理状态。此类疾病一般以血栓、炎症和溶血为特征。
本发明预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法所关注的各种血液疾患,包括施用结合补体组分C1q、C1r或C1s的抗体、抗体片段和/或抗体衍生物。此类疾患包括冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症)。
自身免疫性溶血性贫血(或自身免疫性溶血性贫血(AIHA))(也称为“免疫溶血性贫血”)在针对受试者自身红血细胞(RBC)的抗体造成红血细胞破裂(裂解)从而引起血浆浓度不足时发生。红血细胞的寿命从正常的100-120天减少到严重情况下的几天。RBC的细胞内组分被释放到循环血液和组织中,从而引起这种疾患的一些特征性症状。抗体通常针对高发生率抗原,并且通常作用于同种异体RBC(源于人体外部的RBC,例如在输血的情况下)。AIHA分为温自身免疫性溶血性贫血或冷自身免疫性溶血性贫血,包括冷凝集素疾病和阵发性冷血红蛋白尿。这些分类是基于参与疾病发病机制的自身抗体的特征。每种疾病都有不同的潜在病因、治疗和预后,从而使得在治疗患有AIHA的患者时分类很重要。
冷凝集素疾病是一种类型的自身免疫性溶血性贫血,其中身体的免疫系统错误地攻击和破坏自己的红血细胞。当受影响的人的血液暴露于低温(32℉至50℉)时,通常攻击细菌的某些蛋白质(IgM抗体)自身附着在红血细胞上并将其结合成团(凝集)。这最终造成红血细胞被过早破坏(溶血),从而产生贫血和其它相关的体征和症状。冷凝集素疾病可以是原发性的(原因不明)或继发性的,由于潜在的疾患,例如感染、另一种自身免疫性疾病或某些癌症。治疗取决于许多因素,包括疾患的严重程度、每个人出现的体征和症状和潜在原因。
症状包括例如疼痛、发热、苍白、黄疸、荨麻疹性皮肤疹、血红蛋白尿、血红蛋白血症、贫血和肾病或急性肾衰竭。这些症状可能在暴露于低温后出现。
使用检测与红血细胞上的“I抗原”结合的凝集自身抗体的存在或数量(滴度)的测定,可以将受试者鉴定为患有CAD。抗体可以是单克隆的(例如,单克隆IgM或IgA)或多克隆的。还可以使用全血细胞计数(CBC)、尿液分析、生化研究和库姆斯氏试验(Coombs test)中的一种或多种来测试血液中的溶血而将受试者诊断为患有CAD。例如,可以使用生化研究来检测升高的乳糖酶脱氢酶水平、升高的未缀合的胆红素水平、低触珠蛋白水平和/或游离血浆血红蛋白的存在,所有这些都可以指示急性溶血。可用于检测CAD的其它测试包括检测血清中的补体水平。例如,由于溶血急性期的消耗,测量的血浆补体水平(例如,C2、C3和C4)在CAD中降低。
温凝集素溶血性贫血是自身免疫性病症,以自身抗体过早破坏健康红血细胞为特征。在大多数病例中,温抗体溶血性贫血的原因是未知的。这些病例可被称为原发性温抗体溶血性贫血或特发性温抗体溶血性贫血。所述病症也可能作为更大病症的部分出现。此类病例被称为继发性温抗体溶血性贫血。出现的具体症状可能不同,并且可能取决于发作速率、健康红血细胞的破坏速度和潜在病症的存在。一些个体,特别是那些逐渐发生贫血的个体,可能没有任何明显的症状(无症状)。受影响的个体最终可能会出现皮肤异常苍白(苍白)、疲劳、用力时呼吸困难、头晕和心悸。皮肤和眼白变黄(黄疸)和脾脏增大(脾肿大)也是患有温抗体溶血性贫血的个体的常见表现。脾肿大可能会导致受影响的个人有腹部浮肿或饱胀感。偶尔,在一些病例中也会出现肝脏肿大(肝肿大)。在严重病例的个体中,特别是那些快速(急性)发作的个体,可能会出现更严重的并发症,包括意识丧失(晕厥)、胸痛(心绞痛)、心跳异常加快(心动过速)和心力衰竭。一些个体患有由IgM抗体引起的罕见形式的温抗体溶血性贫血(与由IgG抗体引起的更常见形式相反)。
自身免疫性血小板减少症(ITP)通常被认为是一种孤立的低血小板计数(血小板减少症),骨髓正常,并且没有其它原因引起的血小板减少症。其引起典型的紫癜性皮疹和出血倾向增加。两种不同的临床综合征表现为儿童的急性疾患和成人的慢性疾患。急性形式通常在感染后出现并在两个月内自然消退。慢性免疫性血小板减少症持续超过六个月,具体病因未知。
通过全血细胞计数(一种常见的血液检查)中的低血小板计数来诊断ITP。然而,由于诊断依赖于排除其它病因的低血小板计数,在一些病例,额外的调查(例如骨髓活检)可能是必要的。
在轻度病例中,可能只需要仔细观察,但极低的计数或显著的出血可能提示使用皮质类固醇、静脉内免疫球蛋白、抗D免疫球蛋白或免疫抑制药物进行治疗。难治性ITP(对常规治疗无效)可能需要脾切除术。血小板输注可用于严重出血和非常低的计数。有时身体可能通过制造异常大的血小板来进行补偿。
体征包括自发形成瘀伤(紫癜)和瘀点(微小瘀伤),特别是在四肢,从鼻孔和/或牙龈出血,以及月经过多(过量的月经出血),如果血小板计数低于20,000/μl,任何一种都可能发生。非常低的计数(<10,000/μl)可能会导致口腔或其它粘膜上自发形成血肿(血块)。轻微割伤或擦伤的出血时间通常会延长。由于极低的计数(<5,000/μl)所致的严重且可能致命的并发症包括蛛网膜下腔出血或脑内出血(颅骨或脑内的出血)、下消化道出血或其它内出血。计数极低的ITP患者易受钝性腹部创伤引起的内出血的影响,就像在机动车辆碰撞中可能经历的那样。当血小板计数高于20,000/μl时,不太可能出现这些并发症。
抗磷脂综合征(APS)(也称为休斯综合征)是通常由抗磷脂抗体引起的自身免疫性高凝状态。APS引起动脉和静脉中的血凝块(血栓)以及妊娠相关的并发症,例如流产、死产、早产和严重的先兆子痫。
诊断标准需要一个临床事件,即血栓或妊娠并发症,以及通常间隔至少三个月的两次抗体血液检查,以确认存在狼疮抗凝剂或抗β2-糖蛋白-I,由于β2-糖蛋白-I抗体是抗心磷脂抗体的子集,可以进行抗心磷脂测定作为不太特异的替代物。
抗磷脂综合征可能是原发性的或继发性的。原发性抗磷脂综合征在不存在任何其它相关疾病的情况下发生。继发性抗磷脂综合征与其它自身免疫性疾病,例如系统性红斑狼疮(SLE)一起发生。在极少数病例中,APS会因全身血栓而引起快速器官衰竭;这被称为“灾难性抗磷脂综合征”(CAPS),并且与高死亡风险有关。抗磷脂综合征通常需要用抗凝药物,例如肝素进行治疗,以降低血栓进一步发作的风险并改善妊娠预后。
埃文斯综合征是慢性血液病症,其通常特征在于同时或依次伴有自身免疫性溶血性贫血和免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。所述综合征可能在儿童期或成年期出现。血小板减少症的发作可能在AIHA发作之前、与其同时或在其之后发生。症状的严重程度和AIHA和/或ITP发作之间的延迟是可变的。在成人非同时性病例中,发作间隔平均为4年。ITP通常表现为皮肤粘膜出血,伴有鼻出血、瘀点、紫癜和瘀斑。在严重血小板减少症的病例中,在极少数病例中可能会观察到血尿、胃肠道和/或脑膜出血。
埃文斯综合征是一种自身免疫性病症,其中非交叉反应性自身抗体靶向红血细胞、血小板并且有时嗜中性粒细胞上的不同抗原决定簇;然而,确切的病理生理机制尚不清楚。由于观察到辅助性T淋巴细胞减少,T抑制子淋巴细胞群增多,提示血细胞减少可能与T细胞异常有关。埃文斯综合征经常与其它疾病相关,例如系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、自身免疫性淋巴增生综合征和常见的变异免疫缺陷。
诊断基于显示贫血(血红蛋白水平<12g/dL)和血小板减少症(血小板计数<100,000/微升)的全血细胞计数,伴有或不伴有中性粒细胞减少症(中性粒细胞计数<1500/微升)。乳酸脱氢酶(LDH)和/或直接胆红素水平升高以及触珠蛋白水平降低可能指示溶血。阳性直接抗球蛋白试验(库姆斯氏试验)证实存在靶向红血细胞(RBC)抗原的抗体。也可以观察到靶向血小板和中性粒细胞的自身抗体的存在。
鉴别诊断主要包括微血管病(例如血栓性或血小板减少性紫癜)。大多数病例是散发的。已例外地观察到家族性病例,主要是在潜在的原发性免疫缺陷的情况下。
免疫抑制疗法可以与静脉内注射免疫球蛋白联合,作为ITP的一线治疗。施用皮质类固醇(泼尼松(prednisone))是治疗的主要手段,但其它药物也可用于难治性病例,例如利妥昔单抗(rituximab)、环孢霉素(cyclosporine)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和达那唑(danazol)。脾切除术作为第三线治疗进行;然而,长期缓解不太常见,并且患者显示败血症的高风险。在严重病例中,可能需要造血干细胞移植。尽管经过治疗,埃文斯综合征可能具有AIHA和/或ITP的缓解期和复发期的交替,这可能与在严重血小板减少症和中性粒细胞减少症的病例中由严重出血和感染所致的显著发病率和死亡率相关。
新生儿同种免疫性血小板减少症(NAIT)(也称为胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(FNAIT))是影响胎儿和新生儿的血液病症,其中血小板计数减少(血小板减少症)。血小板抗原遗传自母亲和父亲。FNAIT通常由从父亲遗传并且在母亲中不存在的血小板抗原特异性抗体引起。母胎输血(或母胎出血)使得母亲的免疫系统将这些抗原识别为非自身抗原,随后产生穿过胎盘的同种反应性抗体。NAIT通常由母体血小板特异性同种抗体和罕见的人类白细胞抗原(HLA)同种抗体(由血小板表达)经胎盘传递至血小板表达相应抗原的胎儿而引起。
一般来说,血小板减少症是轻微的,并且受影响的新生儿大多没有症状。在这些病例中,治疗干预是没有必要的。在严重的血小板减少症中,新生儿可能在分娩时或分娩后几小时出现出血并发症。最严重的并发症是颅内出血,导致约10%的死亡或20%的病例出现神经后遗症。
约80%的NAIT病例由抗血小板抗原HPA-1a的抗体引起,15%由抗HPA-5b引起,5%由其它抗体(例如HPA-1b、HPA-15、HPA-3和HPA-9b)引起。HPA-1a存在于98%的美国人口中,从而表明大约2%的HPA-1a阴性的妇女在妊娠期间可能处于FNAIT的风险下。
与胎儿和新生儿溶血病(HDFN)不同,NAIT在第一次妊娠期间发生的病例高达50%,并且受影响的胎儿可能在妊娠早期(早至妊娠20周,与血小板抗原的发育一致,大部分时间在子宫内)出现严重的血小板减少症(<50,000/μL)。通常,血小板减少症会随着妊娠的进展而增加。在第一次妊娠期间,NAIT通常直到出生时才被发现,此时新生儿出现血小板减少症的典型症状,包括瘀点、瘀伤或颅内出血。子宫内颅内出血发生在约10%至30%的受影响病例中。NAIT被认为是是大多数由血小板减少症所致的颅内出血病例的根本原因。出血的风险与血小板计数呈负相关,当血小板计数低于100,000/μL时风险最大。
据估计,在具有不相容胎儿的后续妊娠(即,也携带靶血小板抗原的后续妊娠)中,NAIT的复发率超过80%。随后的NAIT病例可能相当或更严重。胎儿对FNAIT的反应是可变的,并且可能包括代偿性髓外造血。很少会出现胎儿水肿。也可能发生胎儿贫血(在没有红血细胞不相容的情况下)。
治疗方法
通过施用抑制补体活化的药剂,将防止补体在血细胞上的沉积。此类药物包括抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体抑制剂。其它药物可包括上调天然补体的表达的抑制剂,或下调血小板或血细胞(例如,红血细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)中C1q、C1r或C1s合成的药剂,阻断补体活化的药剂,阻断补体活化的信号的药剂等。
在一些方面,公开了预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法。这些方法包括向受试者施用C1q抑制剂。还提供了许多实施方案,这些实施方案可以应用于本文描述的本发明的任何方面。例如,在一些实施方案中,C1q抑制剂是抗体、适体、反义核酸或基因编辑剂。在一些实施方案中,抑制剂是抗C1q抗体。抗C1q抗体可以抑制C1q与自身抗体之间或C1q与C1r之间或C1q与C1s之间的相互作用,或可以促进C1q从循环或组织中的清除。在一些实施方案中,抗C1q抗体的解离常数(KD)为100nM至0.005nM或小于0.005nM。在一些实施方案中,抗C1q抗体以20:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量、6:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量或2.5:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。
所述方法抑制C1q、C1r或C1s的生物活性。例如,(1)C1q与自身抗体的结合,(2)C1q与C1r的结合,(3)C1q与C1s的结合,(4)C1q与磷脂酰丝氨酸的结合,(5)C1q与五聚蛋白-3的结合,(6)C1q与C-反应蛋白(CRP)的结合,(7)C1q与球状C1q受体(gC1qR)的结合,(8)C1q与补体受体1(CR1)的结合,(9)C1q与B-淀粉样蛋白的结合,或(10)C1q与钙网蛋白的结合。在其它实施方案中,C1q的生物活性是(1)经典补体活化途径的活化,(2)裂解的减少和/或C3沉积的减少,(3)抗体和补体依赖性细胞毒性的活化,(4)CH50溶血,(5)红血细胞裂解的减少,(6)红血细胞吞噬作用的减少,(7)树突细胞浸润的减少,(8)补体介导的红血细胞裂解的抑制,(9)淋巴细胞浸润的减少,(10)巨噬细胞浸润的减少,(11)抗体沉积的减少,(12)嗜中性粒细胞浸润的减少,(13)血小板吞噬作用的减少,(14)血小板裂解的减少,(15)移植移植物存活的改善,(16)巨噬细胞介导的吞噬作用的减少,(17)自身抗体介导的补体活化的减少,(18)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(19)由同种抗体所致的红血细胞裂解的减少,(20)由输血反应所致的溶血的减少,(21)同种抗体介导的血小板裂解的减少,(22)贫血的改善,(23)嗜酸性粒细胞增多的减少,(24)红血细胞上C3沉积的减少(例如,RBC上C3b、iC3b等的沉积的减少),(25)血小板上C3沉积的减少(例如,血小板上C3b、iC3b等的沉积的减少),(26)过敏毒素产生的减少,(27)自身抗体介导的水疱形成的减少,(28)自身抗体诱导的红斑的减少,(29)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(30)由输血反应所致的血小板裂解的减少,(31)肥大细胞活化的减少,(32)肥大细胞组胺释放的减少,(33)血管通透性的降低,(34)移植移植物内皮上补体沉积的减少,(35)B细胞抗体产生,(36)树突细胞成熟,(37)T细胞增殖,(38)细胞因子产生,(39)小胶质细胞活化,(40)阿瑟反应,(41)移植移植物内皮中过敏毒素产生的减少,或(42)补体受体3(CR3/C3)表达细胞的活化。
在一些实施方案中,CH50溶血包括人CH50溶血。抗体可能能够中和至少约50%至约100%的人CH50溶血。抗体可能能够中和约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%的人CH50溶血。抗体可能能够以小于150ng/ml、小于100ng/ml、小于50ng/ml或小于20ng/ml的剂量中和至少50%的CH50溶血。
在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、单价抗体、多特异性抗体或抗体片段或其抗体衍生物。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fab片段。抗体片段的实例是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体(diabody)和单链抗体分子。在一些实施方案中,抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。在一些实施方案中,抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。在一些实施方案中,抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。在一些实施方案中,所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。在一些实施方案中,所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗体是包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗体片段。可以通过肠胃外注射或输注,例如皮下或肌内注射,或静脉内注射或输注来施用抗体。
在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以10mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与50mg/kg、50mg/kg与60mg/kg、60mg/kg与70mg/kg、70mg/kg与80mg/kg、80mg/kg与90mg/kg、90mg/kg与100mg/kg、100mg/kg与110mg/kg、110mg/kg与120mg/kg、120mg/kg与130mg/kg、130mg/kg与140mg/kg或140mg/kg与150mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg与100mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次、每三周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以75mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每两周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每三周一次向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注以100mg/kg的剂量每月一次向受试者施用抗体。可以每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,通过皮下或肌内注射以1mg/kg与3mg/kg、3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与7mg/kg或7mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用抗体。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体。
在一些实施方案中,抗体是抗体片段。在一些实施方案中,通过静脉内注射或输注、肌肉注射或皮下注射向受试者施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.1mg/kg与1mg/kg、1mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,以0.3mg/kg与10mg/kg之间的剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次施用抗体片段。在一些实施方案中,以高于每天、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次剂量的初始预剂量施用抗体片段。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与5mg/kg、5mg/kg与10mg/kg、10mg/kg与15mg/kg、15mg/kg与20mg/kg、20mg/kg与25mg/kg、25mg/kg与30mg/kg、30mg/kg与35mg/kg、35mg/kg与40mg/kg、40mg/kg与45mg/kg或45mg/kg与50mg/kg之间。在一些实施方案中,初始预剂量在3mg/kg与20mg/kg之间。在一些实施方案中,抗体片段与其相应的全长抗体相比具有较短的半衰期,例如,所述抗体片段被迅速清除,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性,或所述抗体选择性抑制受试者的血液空间内的C1q活性,从而保留受试者的血液空间外的C1q活性。在一些实施方案中,血液空间被限制在血管内,例如动脉、小动脉、毛细血管、小静脉或静脉。血液空间可以包括血清、血小板、内皮细胞、血细胞或造血细胞。在一些实施方案中,抑制受试者的血液空间内的C1q减少了高度血管化组织中的组织损伤。高度血管化组织的实例是肾、肺泡、毛细血管床或肾小球。
在一些实施方案中,血液病症是补体介导的血液病症。在一些实施方案中,血液病症是冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、冷抗体溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球肾炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、感染或药物诱导的血液学病症。感染可以是肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)或冠状病毒。冠状病毒的实例选自SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV、HKU1和SARS-CoV-2。在一些实施方案中,冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方案中,受试者患有SARS-CoV-2感染,这已通过来自呼吸道或血液样本的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到证实。血液病症可以是冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、狼疮性肾炎、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)或免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。药物诱导的血液学病症的实例是再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血和血小板减少症。
所述方法促进了在与补体活化相关的血液学疾患中血细胞活化的改善维持。相对于未经治疗的患者,血液功能的维持提供了血液学病症的功能改善。补体抑制剂(例如,C1q抑制剂,例如抗C1q抗体、抗体片段和/或抗体衍生物)可以有效维持受试者的全身性补体抑制的量和频率施用。
预期可以在医生的指导下获得和使用用于体内使用的组合物。根据疾病的性质、施用频率、施用方式、药物从宿主体内的清除情况等,治疗配制物的剂量可以广泛地变化。
如本文所用,“长期施用”、“长期治疗”、“长期地治疗”或其类似的语法变体是指一种治疗方案,其用于维持患者血液中治疗剂的某一阈值浓度,以便在延长的时间内完全或基本上抑制患者的全身性补体活性。因此,用补体抑制剂长期治疗的患者可以治疗大于或等于2周的一段时间(例如,3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周或52周;1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月;或1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、5.5年、6年、6.5年、7年、7.5年、8年、8.5年、9年、9.5年、10年、10.5年或12年或患者的余生),所述抑制剂的量和给药频率足以维持患者血液中抑制或基本抑制患者全身性补体活性的抑制剂浓度。在一些实施方案中,可以有效维持血清溶血活性低于或等于20%(例如,19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%或甚至低于5%)的量和频率向有需要的患者长期施用补体抑制剂。在一些实施方案中,可以有效维持血清乳酸脱氢酶(LDH)水平在LDH的正常范围的至少20%(例如,19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%或甚至低于5%)内的量和频率向患者施用补体抑制剂。
在一些实施方案中,以有效维持血清LDH水平低于550IU/L(例如,低于540IU/L、530IU/L、520IU/L、510IU/L、500IU/L、490IU/L、480IU/L、470IU/L、460IU/L、450IU/L、430IU/L、420IU/L、410IU/L、400IU/L、390IU/L、380IU/L、370IU/L、360IU/L、350IU/L、340IU/L、330IU/L、320IU/L、310IU/L、300IU/L、290IU/L、280IU/L或低于270IU/L)的量和频率向患者施用补体抑制剂。为了维持患者的全身性补体抑制,可以向患者长期施用补体抑制剂,例如每周一次、每两周一次、每周两次、每天一次、每月一次或每三周一次。在本文所述的任何方法的一些实施方案中,可以以有效维持患者血液中每个C1q分子至少0.7(例如,至少0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更大)二价C1q、C1r或C1s抑制剂分子(例如,完整的抗C1q抗体)的浓度的量和频率频率向患者施用补体抑制剂(例如,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体)。关于C1q、C1r或C1s抑制剂的“二价(Divalent)”或“二价(bivalent)”是指包含C1q、C1r或C1s分子的至少两个结合位点的C1q、C1r或C1s抑制剂。当C1q、C1r或C1s抑制剂是单价的(例如,结合C1q、C1r或C1s的单链抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体或Fab)时,可以有效维持血液中每一C1q、C1r或C1s分子至少1.5(例如,至少2、2.5、3、3.5、4、4.5或5或更多)单价C1q、C1r或C1s抑制剂的浓度的量的量和频率向患者施用抑制剂。在一些实施方案中,可以有效维持单价C1q、C1r或C1s抑制剂与C1q、C1r或C1s的比例为至少2:1(例如,至少3:1、至少4:1、至少5:1或至少6:1或更高)的量和频率向患者施用单价C1q、C1r或C1s抑制剂。在一些实施方案中,以有效维持每毫升患者血液至少40μg(例如,41μg、42μg、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg或120μg或更大)抗体的浓度的量和频率向患者施用完整的(二价)抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体。在优选的实施方案中,以维持抗体浓度为每毫升患者血液至少50μg的量和频率施用完整的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体。在优选的实施方案中,以维持抗体浓度为每毫升患者血液至少100μg的量和频率施用完整的抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体。在一些实施方案中,可以有效维持每毫升患者血液至少80μg(例如,81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、91μg、92μg、93μg、94μg、95μg、96μg、97μg、98μg、99μg、100μg、110μg、115μg、120μg、125μg、130μg、135μg、140μg、145μg、150μg、155μg、160μg、165μg或170μg或更大)抗体的浓度的量和频率向患者施用单价抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体(例如,单链抗体或Fab片段)。
给予特定患者的治疗组合物的有效量可取决于多种因素,其中的若干因素可能在患者与患者之间不同。利用普通技术,有能力的临床医生将能够在常规临床试验的过程中调适特定治疗剂或成像组合物的剂量。
治疗剂(例如补体抑制剂、基因表达活化剂等)可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂联合并入用于治疗性施用的各种配制物中,并且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂,例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。因此,化合物的施用可以通过各种方式实现,包括口服、口腔、直肠、肠胃外、皮下、腹膜内、皮内、经皮、鞘内、鼻内、气管内施用等。活性剂可在施用之后为全身性的或可通过使用区域施用、内部施用或使用起到在植入部位处保持活性剂量作用的植入物而为局部的。
联合治疗
本公开的补体抑制剂可以无限制地与任何额外的治疗(例如免疫抑制治疗)联合使用,以用于治疗血液病症。
在一些实施方案中,本文公开的抗体、抗体片段和/或抗体衍生物与补体活化替代途径的抑制剂联合施用。此类抑制剂可包括但不限于因子B阻断抗体;因子D阻断抗体;阻断C3裂解的可溶性、膜结合、标记或融合蛋白形式的CD59、DAF、CR1、CR2、Crry或坎普他汀(Compstatin)样肽;非肽C3aR拮抗剂,例如SB 290157;眼镜蛇毒液因子(Cobra venomfactor);或非特异性补体抑制剂,例如甲磺酸那莫司他(nafamostat mesilate)(FUTHAN;FUT-175);抑肽酶(aprotinin);K-76单羧酸(MX-1);和肝素(参见例如,T.E.Mollnes&M.Kirschfink,Molecular Immunology 43(2006)107–121)。在一些实施方案中,本公开的抗体与自身抗体和其自身抗原之间相互作用的抑制剂联合施用。此类抑制剂可以包括纯化的可溶形式的自身抗原,或抗原模拟物,例如肽或RNA衍生的模拟表位,包括AQP4抗原的模拟表位。替代地,此类抑制剂可以包括阻断剂,其识别自身抗原并防止自身抗体结合,而不触发经典的补体途径。此类阻断剂可包括例如自身抗原结合RNA适体或在其Fc结构域中缺乏功能性C1q、C1r或C1s结合位点的抗体(例如,Fab片段或以其它方式工程化为不结合C1q、C1r或C1s的抗体)。
在一些实施方案中,本文所述的补体抑制剂(例如,C1q、C1r或C1s的抑制剂,例如抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体或抗原结合片段,或其抗体衍生物)可以与一种或多种适用于治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))或改善其症状的额外活性剂一起配制。例如,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体可以与抗高血压药、抗凝血剂和/或类固醇(例如,皮质类固醇)一起配制。抗凝剂的实例包括例如华法林(Coumadin)、阿司匹林(aspirin)、肝素、苯茚二酮(phenindione)、磺达肝癸钠(fondaparinux)、艾屈肝素钠(idraparinux)和凝血酶抑制剂(例如,阿加曲班(argatroban)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)或达比加群(dabigatran))。C1q、C1r或C1s的抑制剂(例如,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体)也可与纤维蛋白裂解剂(例如,恩克罗特(ancrod)、ε-氨基己酸、抗纤溶酶-ai、环前列腺素(prostacyclin)和去纤苷(defibrotide))、环磷酰胺或抗细胞因子剂一起配制。抗细胞因子药剂包括例如结合并调节细胞因子(例如,促炎细胞因子,例如IL-13)的活性的抗体或可溶性受体。在一些实施方案中,抑制剂可以与抗CD20剂,例如利妥昔单抗(RituxanTM;Biogen,Cambridge,MA)一起配制。在一些实施方案中,C1q、C1r或C1s的抑制剂可被配制成与静脉内免疫球蛋白疗法(IVIG)或血浆置换(plasma exchange)一起施用于受试者。
当C1q、C1r或C1s的抑制剂与第二种活性剂联合(例如,结合)使用时,或当使用两种或更多种C1q、C1r或C1s的抑制剂(例如,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体)时,可以单独或一起配制药剂。例如,可以混合相应的药物组合物,例如就在施用之前,并且一起施用,或可以例如在相同或不同的时间单独施用。
可以配制包含抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体的组合物,使得其包括治疗有效量的C1q、C1r或C1s的抑制剂(例如,抗C1q、抗C1r或抗C1s抗体或抗原结合片段,或其抗体衍生物)或所述组合物可经配制以包括亚治疗量的所述抑制剂和亚治疗量的一种或多种额外活性剂,使得所述组分总体上对治疗血液病症(例如,冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、ABO不相容急性溶血反应、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎和/或抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性病症(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、感染(例如,肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、冠状病毒)、免疫复合物疾病(例如,冷球蛋白血症、血清病、肾小球肾炎),或由例如青霉素、奎宁或肝素的药物引起的药物诱导的血液学病症(例如,再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、血小板减少症))是治疗有效的。在一些实施方案中,可以将组合物配制成包含两种或更多种C1q、C1r或C1s的抑制剂,每种抑制剂呈亚治疗剂量,使得抑制剂总体上呈对治疗血液病症治疗有效的浓度。确定治疗有效剂量(例如,抗C5抗体的治疗有效剂量)的方法是本领域已知的,并且描述于本文中。
在一些实施方案中,本公开的抗体可以与用于血液病症的其它疗法联合施用。例如,所述组合物可以在血浆除去法(plasmapheresis)、IVIG疗法、血浆输注或血浆置换的同时、之前或之后施用于受试者。
实施例
实施例1:抗C1q抗体抑制来自CAD的血液样品中的补体介导的溶血
将各个CAD血清样品合并在一起以用抗C1q抗体滴定进行溶血和FAC实验。通过用合并的CAD血清(4℃下1小时-10μL血清+10μL RBC)致敏RBC来进行溶血。在37℃下添加200μL的20x正常人血清,触发裂解持续35分钟。在裂解之后,去除上清液,并且将hRBC用抗C3抗体(CT-C3)、抗C1q抗体和抗C4抗体染色30分钟,洗涤一次,用荧光二级抗山羊抗体染色以用于FACS分析。
在CAD中,RBC被三种主要的经典补体“调理素”(C1q、C4b和C3b)包被,这三种补体通过“血管外裂解”驱动RBC清除。C1q、C4b和C3b在脾脏和肝脏中被网状内皮系统识别以用于去除RBC。同样在CAD中,RBC变得被C5b包被,这触发了膜攻击复合物的形成以用于直接的“血管内”RBC裂解。抗C1q抗体有效地阻止了CAD血清样品中的血管内和血管外RBC裂解过程。抗C1q抑制补体级联的所有主要“调理素”/免疫细胞配体(C1q、C4b和C3b)的沉积(图1A)。全长抗C1q抗体(例如,包含SEQ ID NO:33的重链可变结构域和SEQ ID NO:37的轻链可变结构域的Mab1抗体)和抗C1s(例如,TNT009)抗体抑制补体介导的溶血(图1B)。抗C1q抗体在抑制溶血方面至少与TNT009一样有效(图2A),而只有抗C1q抗体抑制C1q与靶细胞的上游结合(图2B)。抗C1s抗体不阻断C1q与RBC的结合。选择性阻断C1q完全阻断由经典途径诱导的溶血,但保留通过凝集素和替代途径诱导的溶血。相比之下,抗C5阻断所有三种途径的溶血活性。(图3)。CAD患者中的补体耗尽/消耗的血清生物标志物提供了额外的评估。C4和C2而不是C5的减少显示了伴随早期补体组分的消耗的早期补体级联的过度活化(图4)。可通过皮下施用抗C1q抗体(例如,FabA,包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗C1q抗体Fab片段)来治疗CAD,以抑制灵长类动物中的RBC裂解(图5)。
实施例2:抗C1q抗体抑制来自CAD患者的血液样品中的溶血和补体沉积
CAD和对照血浆样品
根据IRB批准的方案,获得来自8名受试者的人CAD血浆样品。对照血清和血浆样品获自Innovative Research(Novi,MI)。
人RBC的离体致敏
将RBC(Innovative Research,MI)洗涤并悬浮于GVB++缓冲液(Comptech,TX)(80μL包装的RBC于2mL GVB++缓冲液中)。将25μL人RBC与25μL5x稀释的CAD或正常血清混合,并且在4℃下孵育30分钟。这个步骤允许来自CAD受试者的冷凝集素抗体与人RBC表面抗原结合。
三名受试者显示稳健的IgG沉积,而七名受试者显示稳健的IgM沉积。一名受试者显示细胞表面IgG和IgM的低信号。
溶血测定
将正常人血清添加至CAD致敏的RBC中引起补体募集和活化。将正常人血清(20x稀释于在GVB++缓冲液中)添加至GVB++或GVB-EDTA缓冲液中的致敏人RBC中。对于药理学研究,将抗C1q抗体(例如,包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的Mab2抗体)和FabA(例如,包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的Fab片段)以100ug/mL至0.3ug/mL的浓度范围滴定至血清中。将RBC在37℃下孵育30分钟以允许C1q募集并活化人RBC上的经典补体级联。
在稀释于GVB-EDTA缓冲液(Comptech,TX)中的血清中孵育的致敏RBC是阴性对照,因为EDTA通过补体级联引起溶血的完全抑制。在水中孵育的RBC是阳性对照,以确定在每次RBC制备和实验运行中可能的最大裂解。
在37℃下孵育30分钟后,将细胞在离心机中以2000rpm离心5分钟。将上清液转移至透明底部的96孔板中,并且在读板仪(Spectramax,CA)中读取415nm处的吸光度(血红蛋白特异性吸光度),以定量溶血。从所有其它孔中减去来自含在GVB-EDTA缓冲液中的血清的孔的吸光度信号,以便提供通过经典补体级联特异驱动的裂解的测量。绘制并评价EDTA校正的吸光度信号。对于药理学研究,也将每个孔中的信号归一化至缺乏抗C1q抗体的孔,并绘制信号的变化%(图6A和6B)。进行4PL逻辑拟合以确定使用抗C1q MAB2和FabA进行溶血抑制的IC50。对于抗C1q MAB2和FabA,溶血抑制的相对IC50为约10nM。
用于评价人RBC上的补体沉积的流式细胞术
将上述反应中未裂解的人RBC用含有1%BSA和2mM EDTA的dPBS(FACS缓冲液)洗涤,然后用抗C4山羊多克隆抗体(Abcam Ab47788)和抗C3d特异性多克隆兔抗体(AgilentA0063)在冰上染色30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤,离心,然后用二级抗体、抗山羊Alexa 647缀合物和抗兔Alexa 488缀合物(Thermo,CA)染色。在冰上孵育30分钟后,将细胞用FACS缓冲液洗涤,然后在流式细胞仪(Novocyte system,ACEA,CA)中运行。
在CAD致敏步骤后,用相应的荧光标记的抗人IgG/IgM抗体检测RBC细胞表面IgG和IgM,以便了解各个CAD受试者中抗RBC抗体的性质。
对于RBC的流动分析,前向散射(FSC)和侧向散射信号(SSC)用于鉴定RBC群体。通过沿着FSC面积相比于FSC宽度图的对角线选择细胞来分离单细胞RBC群体。绿色(488nm)和远红色(647nm)通道中荧光信号阳性的单细胞RBC用于定义分别被细胞表面C4和C3d阳性标记的细胞。评价GVB-EDTA缓冲液减去标记细胞%(用于C4和C3d染色)在CAD与对照受试者之间的差异。对于药理学研究,将含有MAB2或FabA的孔中的标记细胞%归一化至缺乏抗C1q抗体的孔并绘制为变化百分比(图6A和6B)。进行4PL逻辑拟合以确定在这些研究中使用MAB2和FabA抑制C4和C3d沉积的IC50。对于抗C1q MAB2和FabA两者,抑制补体沉积的相对IC50为约10nM。
实施例3:来自患有肝素诱导的血小板减少症(HIT)的患者的血浆中PF4/肝素通过经典途径进行的补体活化
在HIT中,RBC在患者产生针对与内源性循环蛋白PF4联合治疗性施用的肝素的抗体时被裂解。为了证实这种裂解由经典途径介导,而不是由替代途径介导,用来自HIT患者的血浆在体外进行使用EDTA和EGTA的差异螯合研究。对Mg2+敏感的替代途径被EDTA抑制,但不被EGTA抑制。如图7A中所示,在添加PF4/肝素之前向血浆中添加EDTA或EGTA消除了补体活化。此外,EGTA处理的血浆的Mg2+补充并不能挽救由PF4/肝素进行的补体活化。在与PF4/肝素一起孵育之前,将来自健康供体的血浆与或不与C1抑制剂(10和20IU/mL)一起孵育,并且通过抗原C3c捕获ELISA测定测定由PF4/肝素进行的补体活化。如图7B中所示,使用C1酯酶抑制剂降低了补体活化。使用流式细胞术在全血测定中获得了类似的结果(图7C-7D)。在与缓冲液或抗原(PF4;25μg/mL±肝素;0.25U/mL)一起孵育之前,将来自健康供体的全血与或不与EDTA(10mM)或EGTA(10mM)±MgCl2(10mM)一起孵育,并通过流式细胞术测定PF4/肝素和C3c与B细胞的结合。
为了检测凝集素和经典途径的参与,在添加PF4/肝素之前,将来自健康供体的血浆或全血与各种浓度的针对C1q的单克隆抗体(抗C1q Mab,Cell Sciences,Inc.,Newburyport,MA)或MBL的单克隆抗体或鼠同种型对照(0-100μg/mL)一起预孵育。通过免疫测定(图7E)或流式细胞术(图7F-7G)评估对PF4/肝素的补体活化响应。对于流式细胞术实验,在与PF4/肝素一起孵育之前,将来自健康供体的全血与100μg/mL小鼠IgG1或抗MBL抗体或抗C1q抗体一起孵育。通过流式细胞术测定PF4/肝素和C3c与B细胞的结合。
抗C1q Mab以浓度依赖性方式抑制由PF4/H进行的补体活化,而抗MBL抗体或小鼠同种型对照没有。此外,在未显示的数据中,排除了个别凝集素蛋白即纤维胶凝蛋白-2和-3参与由PF4/肝素复合物进行的补体活化。图8随附的质谱数据未显示凝集素蛋白与补体活化表型的相关性,免疫测定中纤维胶凝蛋白-2的功能抑制也与补体活化的丧失无关。
这些研究证实,PF4/肝素通过经典的补体途径活化补体。此外,这些研究显示,循环IgM水平的显著供体差异可能有助于对免疫活化的宿主易感性,并且为预防HIT的治疗干预提供了靶标。
实施例4:在激光微血管损伤模型中,抗C1q预防KKO诱导的血栓形成
表达人血小板FcγRIIA和hPF4的肝素诱导的血小板减少症/血栓转基因小鼠模型由Reilly等人,Blood.2001年10月15日;98(8):2442-7描述并用于这个实验中。将抗C1q抗体(抗C1q Mab1、Mab2以及Fab和同种型对照)静脉内注射至转基因小鼠中。基于接受抗C1qMab1、Mab2、Fab或同种型对照中的任一种,然后接受KKO的小鼠中荧光标记的血小板的结合,测量血栓大小的变化百分比。
实施例5:抗C1q抗体抑制来自wAIHA患者的血液样品中的补体沉积
根据IRB批准的方案获得来自2名受试者的人wAIHA血浆样品。对照血清和血浆样品获自Innovative Research,MI。
将人RBC(Innovative Research,MI)悬浮于GVB++缓冲液(Comptech,TX)(0.5mL O型+单一供体洗涤的RBC于10mL GVB++缓冲液中)中,以2000rpm离心5分钟,并且倾析上清液。用GVB++将细胞重悬至0.5mL,并且添加1mL含0.5%菠萝酶(Bromelain)的dPBS(w/v)。将细胞在37℃下孵育10分钟,然后添加10mL GVB++缓冲液,并且以2000rpm离心5分钟。倾析上清液并将细胞用GVB++重悬至0.5mL。通过将5μL重悬细胞添加至995uL GVB++中来制成0.5%RBC溶液。
使用透明底96孔板,并且在每个孔中添加以下试剂:健康供体血清(37.5μL);含200μg/mL依库珠单抗(Eculizumab)的GVB++(37.5μL);患者血清(7.5μL);GVB++(42.5μL),不含药物或含MAB2(1058μg/mL),最终浓度为300μg/mL;和含0.5%RBC的GVB++(25μL)。
在37℃下孵育两小时后,添加流动缓冲液(1%BSA w/v,2mM EDTA,dPBS)洗液,并且将细胞在离心机中以2000rpm离心5分钟。去除上清液,并且将沉淀重悬于100μL流式染色溶液(1:2000荧光素缀合的抗C1q(Dako)、1:1500藻红蛋白缀合的抗C3d(Dako)、1:1000别藻蓝蛋白缀合的抗C4(Abcam))中,并且在黑暗中在4℃下染色30分钟。孵育后,添加150uL流动缓冲液并将细胞以2000rpm离心5分钟。去除上清液,并将细胞重悬于125uL流动缓冲液中。
对于RBC的流动分析,前向散射(FSC)和侧向散射信号(SSC)用于鉴定RBC群体。通过沿着FSC面积相比于FSC宽度图的对角线选择细胞来分离单细胞RBC群体。在远红光(647nm)通道中荧光信号阳性的单细胞RBC用于定义对细胞表面C4阳性标记的细胞。GVBEDTA样品用作补体沉积的阴性对照。对于药理学研究,将含有MAB2的孔中的标记细胞%与缺乏抗C1q抗体的孔进行比较,并且绘制为变化百分比(图13)。此图显示来自患有wAIHA的患者的血清含有抗RBC的抗体,所述抗体引起补体活化和沉积(如通过C4所测量)。Mab 1完全阻止了C1q的活化和C4的沉积。
实施例6:抗C1q单克隆抗体(MAB1)在患有温自身免疫性溶血性贫血(wAIHA)的患 者中的临床试验。
该临床试验的主要目标是评价每周两次静脉内输注Mab1(30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg或100mg/kg)在患有温自身免疫性溶血性贫血(wAIHA)的受试者中的安全性、耐受性和功效。
研究设计:这是一项在患有wAIHA的成年男性和女性受试者中进行的重复剂量临床试验。本研究被设计用于评价Mab1在患有wAIHA的受试者中的安全性、耐受性和功效。受试者将在第1天和第8天接受Mab1(30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg或100mg/kg)的静脉内输注。
方法:每个队组将招募总共6名至12名患有wAIHA的受试者(即30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg Mab1)。所有受试者将在第1天接受静脉内输注,然后在第8天接受第二次静脉内输注。
筛查访视(第6周和第2周):所有受试者在用Mab1给药前42天内经历研究筛查程序。筛查包括获得知情同意、评估病史和研究资格、审查疫苗接种史、基线健康状况、进行FACIT疲劳问卷调查和临床实验室检查,包括DAT和溶血标志物(网织红细胞计数、触珠蛋白、LDH和间接胆红素)。研究访视:受试者将在第1天和第8天接受30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg或100mg/kg Mab1的静脉内输注。
第3天和第4天的安全性、PK和PD的研究评估可在门诊或家中完成。受试者将在第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天、第57天和第71天返回诊所以进行安全性、PK和PD的研究评估。
研究评估:药代动力学参数通过连续血清取样进行评估,并且药效学参数通过测量CH50和C4以及血液中的其它补体生物标志物、针对补体组分的血细胞流式细胞术以及疾病相关生物标志物(例如血红蛋白、网织红细胞计数、触珠蛋白、乳糖酶脱氢酶、胆红素等)的减少进行评估。
实施例7:食蟹猴中抗C1q抗体Fab片段(“FabA”)的每日皮下给药
给食蟹猴(2只雌性/组)在肩胛间间隙皮下给药一次抗C1q抗体Fab片段(包含SEQID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段)(“FabA”)持续一周--第1天5mg/kg,并且连续6天2mg/Kg。在以下时间点收集血液并处理为K2Edta血浆和血清:剂量前;剂量后1小时、3小时、6小时、12小时和24小时;以及第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天和第10天。在第2天至第7天进行血液采集,然后在那些天进行给药。
PK和PD ELISA测定:
使用夹心ELISA测量血清游离FabA(PK)、血浆游离C1q(PD)和血浆总C1q(PD)的水平。黑色96孔板(Costar#3925)在4℃下用于碳酸氢盐缓冲液(pH 9.4)中的75μL相应捕获蛋白/抗体(表1)包被过夜。第二天,将板用dPBS pH 7.4(杜尔贝克磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline))洗涤,然后用含有3%牛血清白蛋白(BSA)的dPBS缓冲液阻断。在测定缓冲液(含有0.3%BSA和0.1%Tween20的dPBS)中用纯化的蛋白质(表1)制备标准曲线。在测定缓冲液中以相应的稀释度制备研究血清或血浆样品。通过敲击从板去除阻断缓冲液。将标准品和样品以75μL/孔一式两份地添加,并且在室温下以300rpm振荡孵育1小时以进行PK测量,随后在4℃下过夜,然后在37℃下30分钟,并且在室温下1小时以进行C1q测定。将板用含有0.05%Tween20的dPBS洗涤三次,并且向所有孔中添加75μL碱性磷酸酶缀合的二级抗体(表1)。将板在室温下在振荡下孵育1小时。将板用含有0.05%Tween20的dPBS洗涤三次,并且使用75μL碱性磷酸酶底物(Life Technologies,T2214)显影。在室温下20分钟之后,使用光度计读取板。使用4PL逻辑拟合来拟合标准品并确定未知物的浓度。对分析物水平进行稀释校正,然后使用GraphPad Prism绘图。
表1.PK/PD ELISA测定中使用的标准品和抗体
在所有治疗动物的血清样品中测量游离FabA水平(图9)。在治疗动物的血浆样品中测量血浆游离C1q水平,其指示未结合于FabA的C1q的量(图10)。
离体溶血测定:
将来自食蟹猴的血清样品用作补体的来源,以跟踪抗体致敏的绵羊红血细胞(RBC)上的补体介导的裂解活性。将用抗RBC抗体(CompTech#B200)预致敏的绵羊RBC悬浮在含有钙和镁(GVB++)的明胶维罗纳缓冲盐水(CompTech#B102)中。通过在4-6℃下以2000rpm旋转5分钟,将RBC用GVB++洗涤三次,以从预裂解的RBC中去除任何非特异性信号。将细胞以约2亿细胞/mL的最终浓度重悬于GVB++中并保存在冰上。将在基线时和FabA给药后收集的食蟹猴血清样品在GVB++中稀释50倍,并且各自添加50μL至圆底透明板中。通过向血清样品中添加50μL RBC来触发裂解反应并在37℃下孵育20分钟。然后将板以2000rpm旋转5分钟;将上清液转移至透明的平底96孔板中并在读板仪中在415nm处读取吸光度。用不含血清的缓冲液对照或血清样品(在含EDTA的GVB缓冲液中制备)运行对照样品以估计本底信号。将样品信号减去本底,归一化至基线,然后绘制为基线的百分比,以确定溶血的时程和FabA给药后溶血的相对抑制。
每天重复皮下给药FabA后,血清溶血得到抑制(图11)。
猴皮下给药5mg/Kg FabA,然后每天一次2mg/Kg,导致两组动物体内出现可测量的游离药物水平的稳健PK,直到最后一剂后至少1天。在5mg/Kg剂量后,游离C1q水平被完全抑制,并且在每天重复一次2mg/Kg剂量的情况下,在给药时间段期间和最后一剂后至少一天,游离C1q水平被抑制在60-90%的范围内。在本研究时间段期间,两个剂量组中的血浆总C1q水平没有变化,这表明FabA没有显著影响C1q转换。这些结果证实,在猴中,以2mg/kg或更高的多次皮下给药FabA可以导致血液中稳健的游离药物水平,并且可以抑制游离C1q和血清溶血活性。
实施例8:评估抗C1q抑制剂的血液对比组织分布
此实施例用于证明,与通过静脉内输注或注射递送的抗C1q抑制剂相比,每日皮下(SC)施用限定剂量的抗C1q抑制剂(例如,抗C1q抗体Mab1、Mab2或FabA)导致血液(即,血管内空间)中C1q的完全饱和和抑制,而不足以完全饱和或抑制组织区室(即,血管外空间)中的C1q。
动物物种。首先鉴定了一种动物物种,其中一种或多种抗C1q抑制剂以高亲和力结合至C1q,并且其对血清中的经典补体级联展现出完全的功能抑制。
抗C1q抑制剂剂量选择:通过单次皮下注射,首先用1mg/Kg、3mg/Kg、5mg/Kg和10mg/Kg剂量的抗C1q FabA(例如,包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗C1q Fab),和/或用3mg/Kg、5mg/Kg、7mg/Kg和10mg/Kg剂量的抗C1q单克隆抗体(例如,包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的Mab2抗体,或包含SEQ ID NO:33的重链可变结构域和SEQ ID NO:37的轻链可变结构域的Mab2抗体)治疗动物。同时,用比较分子(即包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的Mab2抗体,或包含SEQ ID NO:33的重链可变结构域和SEQ ID NO:37的轻链可变结构域的Mab2抗体)以100mg/Kg IV的剂量治疗额外的动物。在基线、30分钟、1小时、4小时、8小时以及第2天、第3天、第4天、第5天和第8天收集血浆样品。评价血液样品中抗C1q抑制剂/比较分子的水平以及抑制C1q和血清溶血活性。测定血液中游离药物水平可测量的SC剂量,以及游离C1q持续至少24小时的完全抑制。以100mg/Kg的比较抗C1q单克隆抗体静脉内给药导致在单剂量后至少5-8天内完全抑制C1q。
抗C1q抑制剂的SC剂量的组织分布:接下来,用选定剂量的抗C1q抑制剂的单次皮下注射治疗动物,这导致在第一剂量选择研究中血液中的C1q完全饱和24小时。同时,用比较分子以100mg/Kg IV的剂量治疗额外的动物。在8小时、第2天、第3天和第4天的时间点对动物实施安乐死。在每个时间点,采集血液。然后用无菌盐水灌注动物,以将血液完全冲洗出血管室。获取包括皮肤、皮下脂肪、肝脏、肺脏和肌肉的组织。在每个时间点评价血液样品的抗C1q抑制剂/比较分子的水平以及抑制C1q和血清溶血活性。将组织样品(无血液)匀浆并在每个时间点评价抗C1q抑制剂/比较分子的水平及组织C1q的抑制。抗C1q抑制剂的单次皮下施用在24小时内(直到第2天)显示了血液中C1q的完全饱和和抑制,但在第3天和第4天没有。在组织样品中,游离药物水平低于定量限,并且在任何时间点都没有观察到对游离C1q的抑制。这些结果显示,单次皮下剂量的抗C1q抑制剂后,药物水平在血液中是可测量的,但在组织样品中是不可测量的。此外,C1q在血液中被完全抑制,但在组织样品中却没有。
抗C1q抑制剂的多次每日固定皮下剂量的组织分布:用选定剂量的抗C1q抑制剂的单次皮下注射治疗动物,每天一次,持续7天。用抗C1q比较分子以100mg/Kg IV的单剂量治疗额外的动物。在第2天、第3天、第7天和第9天(最后一剂后2天)对动物实施安乐死。在每个时间点,采集血液。然后用无菌盐水灌注动物,以将血液完全冲洗出血管室。获取包括皮肤、皮下脂肪、肝脏、肺脏和肌肉的组织。在每个时间点评价血液样品的抗C1q抑制剂/比较分子水平以及抑制C1q和血清溶血活性。将组织样品(无血液)匀浆并在每个时间点评价抗C1q抑制剂/比较分子的水平及组织C1q的抑制。抗C1q抑制剂分子的单次皮下施用在所有时间点都显示了血液中C1q的完全饱和和抑制,但在第9天的样品(在最终剂量后2天收集)中没有。在组织样品中,游离药物水平低于定量限,并且在所有时间点都没有观察到对游离C1q的抑制。这些结果显示,在抗C1q抑制剂分子的多次每日皮下施用后,药物水平在血液中是可测量的,但在组织样品中是不可测量的。此外,C1q在血液中被完全抑制,但在每天一次皮下给药限定剂量的抗C1q抑制剂分子的组织样品中未被抑制。
实施例9:Mab1和FabA清除率的评估
以下是来自Mab1 15mpk IV、FabA 10mpk IV和FabA 3mpk SC的数据。
给食蟹猴以单剂量的Mab1 15mpk IV、FabA 10mpk IV和FabA 3mpk SC给药。随着时间的推移,收集血液样品并处理血清。血清游离药物水平如下测量和说明。Mab1 15mpkIV导致250,000ng/mL的峰值无血清Mab1水平(图12A)。游离药物水平保持升高直至第4天,并且在第5天清除至低于检测水平。FabA 10mpk IV导致12000ng/mL的峰值药物水平,并且到8小时时在药物水平降至检测限以下迅速清除(图12B)。Fab分子的估计半衰期为2-3小时。FabA 3mpk SC显示游离药物水平非常缓慢地增加,并且在单剂量后24小时可测量(图12C)。
这些结果表明,静脉内给药的全IgG分子Mab1显示出约250μg/mL的血清峰值药物水平,并且在几天的时间范围内缓慢清除。FabA静脉内给药显示约12μg/mL的峰值血清药物水平,其在8小时内完全清除。相比之下,皮下给药的FabA显示血清游离药物水平缓慢逐渐增加,在24小时达到峰值并到约48小时清除。
快速清除是指与游离血清全长抗体水平相比,游离血清Fab片段水平的清除增加(图12)。由于其半衰期长,游离血清全长抗体水平在施用后几天保持升高。相比之下,由于其半衰期短,游离血清Fab水平在数小时内迅速下降,即被迅速清除。
通过引用并入
本文引用的每个专利、公开的专利申请和非专利参考文献通过引用整体并入本文。
等效方案
本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效物意图由以下权利要求涵盖。
Claims (75)
1.一种预防血液病症、降低发展血液病症的风险或治疗血液病症的方法,所述方法包括向受试者施用C1q抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述C1q抑制剂是抗体、适体、反义核酸或基因编辑剂。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述抑制剂是抗C1q抗体。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述抗C1q抗体抑制C1q与自身抗体之间或C1q与C1r之间或C1q与C1s之间的相互作用。
5.如权利要求3所述的方法,其中所述抗C1q抗体促进从循环或组织中清除C1q。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法,其中所述抗C1q抗体具有范围介于100nM至0.005nM或小于0.005nM的解离常数(KD)。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法,其中所述抗C1q抗体以范围介于20:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述抗体是以范围介于6:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q的抗C1q抗体。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述抗体是以范围介于2.5:1至1.0:1或小于1.0:1的结合化学计量结合C1q的抗C1q抗体。
10.如权利要求3-9中任一项所述的方法,其中所述抗体特异性结合至C1q并中和C1q的生物活性。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述生物活性是(1)C1q与自身抗体的结合,(2)C1q与C1r的结合,(3)C1q与C1s的结合,(4)C1q与IgM的结合,(5)C1q与磷脂酰丝氨酸的结合,(6)C1q与正五聚蛋白-3的结合,(7)C1q与C-反应蛋白(CRP)的结合,(8)C1q与球状C1q受体(gC1qR)的结合,(9)C1q与补体受体1(CR1)的结合,(10)C1q与β-淀粉样蛋白的结合,(11)C1q与钙网蛋白的结合,(12)C1q与凋亡细胞的结合,或(13)C1q与B细胞的结合。
12.如权利要求10或11所述的抗体,其中所述生物活性是(1)经典补体活化途径的活化,(2)裂解的减少和/或C3沉积的减少,(3)抗体和补体依赖性细胞毒性的活化,(4)CH50溶血,(5)红血细胞裂解的减少,(6)红血细胞吞噬作用的减少,(7)树突细胞浸润的减少,(8)补体介导的红血细胞裂解的抑制,(9)淋巴细胞浸润的减少,(10)巨噬细胞浸润的减少,(11)抗体沉积的减少,(12)嗜中性粒细胞浸润的减少,(13)血小板吞噬作用的减少,(14)血小板裂解的减少,(15)移植移植物存活的改善,(16)巨噬细胞介导的吞噬作用的减少,(17)自身抗体介导的补体活化的减少,(18)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(19)由同种抗体所致的红血细胞裂解的减少,(20)由输血反应所致的溶血的减少,(21)同种抗体介导的血小板裂解的减少,(22)贫血的改善,(23)嗜酸性粒细胞增多的减少,(24)红血细胞上C3沉积的减少(例如,RBC上C3b、iC3b等的沉积的减少),(25)血小板上C3沉积的减少(例如,血小板上C3b、iC3b等的沉积的减少),(26)过敏毒素产生的减少,(27)自身抗体介导的水疱形成的减少,(28)自身抗体诱导的红斑的减少,(29)由输血反应所致的红血细胞破坏的减少,(30)由输血反应所致的血小板裂解的减少,(31)肥大细胞活化的减少,(32)肥大细胞组胺释放的减少,(33)血管通透性的降低,(34)移植移植物内皮上补体沉积的减少,(35)B细胞抗体产生,(36)树突细胞成熟,(37)T细胞增殖,(38)细胞因子产生,(39)小胶质细胞活化,(40)阿瑟反应,(41)移植移植物内皮中过敏毒素产生的减少,或(42)补体受体3(CR3/C3)表达细胞的活化。
13.如权利要求12所述的方法,其中CH50溶血包括人CH50溶血。
14.如权利要求12或13所述的方法,其中所述抗体能够中和至少约50%至约100%的人CH50溶血。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法,其中所述抗体能够在小于150ng/ml、小于100ng/ml、小于50ng/ml或小于20ng/ml的剂量下中和至少50%的CH50溶血。
16.如权利要求3-15中任一项所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、单价抗体、多特异性抗体、抗体片段或其抗体衍生物。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述抗体是抗体片段,并且所述抗体片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
18.如权利要求3-17中任一项所述的方法,其中所述抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。
19.如权利要求3-18中任一项所述的方法,其中所述抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。
20.如权利要求3-19中任一项所述的方法,其中所述抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸的HVR-L2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的HVR-L3。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4和35-38的氨基酸序列。
22.如权利要求3-21中任一项所述的方法,其中所述抗体包含重链可变结构域,所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列具有至少约95%同源性的氨基酸序列,并且其中所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H1、具有SEQ ID NO:10的氨基酸的HVR-H2和具有SEQ ID NO:11的氨基酸的HVR-H3。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:8和31-34的氨基酸序列。
24.如权利要求3-23中任一项所述的方法,其中所述抗体是包含SEQ ID NO:39的重链Fab片段和SEQ ID NO:40的轻链Fab片段的抗体片段。
25.如权利要求3-24中任一项所述的方法,其中所述抗体通过肠胃外注射或输注来施用。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述胃肠外注射或输注是皮下或肌内注射。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述肠胃外注射或输注是静脉内注射或输注。
28.如权利要求3-23中任一项所述的方法,其中所述抗体是全长抗体。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述抗体以10mg/kg与150mg/kg之间的剂量通过静脉内注射或输注施用于所述受试者。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述抗体以75mg/kg与100mg/kg之间的剂量通过静脉内注射或输注施用于所述受试者。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法,其中所述抗体每周施用一次。
32.如权利要求28-30中任一项所述的方法,其中所述抗体每隔一周施用一次。
33.如权利要求28-30中任一项所述的方法,其中所述抗体每月施用一次。
34.如权利要求28所述的方法,其中所述抗体以1mg/kg与10mg/kg之间的剂量通过皮下或肌内注射施用于所述受试者。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述抗体以3mg/kg与5mg/kg之间的剂量通过皮下或肌内注射施用于所述受试者。
36.如权利要求34或35所述的方法,其中所述抗体每天施用。
37.如权利要求34或35所述的方法,其中所述抗体每隔一天施用一次。
38.如权利要求34或35所述的方法,其中所述抗体每周施用一次。
39.如权利要求34或35所述的方法,其中所述抗体每隔一周施用一次。
40.如权利要求34或35所述的方法,其中所述抗体每月施用一次。
41.如权利要求3-24中任一项所述的方法,其中所述抗体是抗体片段。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述抗体片段通过静脉内注射或输注施用于所述受试者。
43.如权利要求41所述的方法,其中所述抗体片段通过肌内注射施用于所述受试者。
44.如权利要求41所述的方法,其中所述抗体片段通过皮下注射施用于所述受试者。
45.如权利要求41-44中任一项所述的方法,其中所述抗体片段以0.1mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述抗体片段以0.3mg/kg与10mg/kg之间的剂量施用。
47.如权利要求41-46中任一项所述的方法,其中所述抗体片段每天施用。
48.如权利要求41-46中任一项所述的方法,其中所述抗体片段每隔一天施用一次。
49.如权利要求41-46中任一项所述的方法,其中所述抗体片段每周施用一次。
50.如权利要求41-46中任一项所述的方法,其中所述抗体片段每隔一周施用一次。
51.如权利要求41-46中任一项所述的方法,其中所述抗体片段每月施用一次。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法,其中所述抗体片段以高于每天一次、每隔一天一次、每周一次、每隔一周一次或每月一次剂量的初始预剂量施用。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述初始预剂量在3mg/kg与50mg/kg之间。
54.如权利要求53所述的方法,其中所述初始预剂量在3mg/kg与20mg/kg之间。
55.如权利要求41-54中任一项所述的方法,其中所述抗体片段与其对应的全长抗体相比具有较短的半衰期。
56.如权利要求41-55中任一项所述的方法,其中所述抗体片段被迅速清除,从而在所述受试者的血液空间外保留C1q活性。
57.如权利要求41-56中任一项所述的方法,其中所述抗体选择性抑制所述受试者的血液空间内的C1q,从而在所述受试者的血液空间外保留C1q活性。
58.如权利要求57所述的方法,其中所述血液空间限制在血管内。
59.如权利要求58所述的方法,其中所述血管是动脉、小动脉、毛细血管、小静脉或静脉。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法,其中所述血液空间包含血清、血小板、内皮细胞、血细胞或造血细胞。
61.如权利要求57-60中任一项所述的方法,其中抑制所述受试者的血液空间内的C1q减少高度血管化组织中的组织损伤。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述高度血管化的组织是肾、肺泡、毛细血管床或肾小球。
63.如权利要求1-62中任一项所述的方法,其中所述血液病症是补体介导的血液病症。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法,其中所述血液病症为冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)、冷抗体溶血性贫血、ABO不相容急性溶血反应、温凝集素溶血性贫血、温抗体溶血性贫血、温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少症、抗磷脂综合征、埃文斯综合征、新生儿同种免疫性血小板减少症、红血细胞同种免疫、费尔蒂综合征、抗体介导的血小板减少症、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血小板减少症、血栓、血管炎、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球肾炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、感染或药物诱导的血液学病症。
65.如权利要求64所述的方法,其中所述感染是肺炎、支原体、单核细胞增多症、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)或冠状病毒。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV、HKU1和SARS-CoV-2。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
68.如权利要求67所述的方法,其中所述受试者患有SARS-CoV-2感染,SARS-CoV-2感染已通过来自呼吸道或血液样本的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到证实。
69.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是冷凝集素溶血性贫血(冷凝集素疾病)。
70.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是温自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)。
71.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是狼疮性肾炎。
72.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是肝素诱导的血小板减少症(HIT)。
73.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是肝素诱导的血小板减少症和血栓(HITT)。
74.如权利要求64所述的方法,其中所述血液病症是免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。
75.如权利要求64所述的方法,其中所述药物诱导的血液学病症是再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血或血小板减少症。
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