CN114740166A - 一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法，该方法通过设置5个梯度的标准样品进行曲线绘制，同时引入质控样品，配制反应试剂，对待测样品进行脱脂处理后与标准品、质控样品一起进行分散、糊化处理，根据直链淀粉遇碘变蓝原理，通过设置针对甘薯粗淀粉样品的参数，使Skalar San++System连续流动分析仪蠕动泵和化学反应单元自动反应，由检测器测得标准样品在600nm处的吸光度绘制线性方程，来计算质控样品、待测样品的直链淀粉含量。本发明所提出的方法具有准确，便捷，稳定，高效，低成本等突出优点，在高品质甘薯淀粉品种筛选和育种方面具有良好的应用前景。

Description

一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，涉及一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法。
背景技术
甘薯是世界最重要的粮食作物之一，具有良好的保健作用，随着人们饮食结构改善，近年来甘薯在市场上受到广泛欢迎。淀粉作为甘薯主要营养品质，一直是甘薯育种的重点方向，而直链淀粉含量决定着甘薯的食用品质和加工品质，是评价甘薯淀粉品质优劣的重要指标，逐渐成为国内外学者研究的热点。
目前甘薯直链淀粉含量没有特定测定标准，常用的检测方法基本参考稻米直链淀粉含量测定方法，如碘比色法、二甲亚砜速溶法、碘亲和力法、近红外光谱分析法及试剂盒检测等。稻米直链淀粉含量检测最常用的方法是碘比色法，其原理是在一定酸度条件下淀粉与碘作用，由于样品中直链、支链淀粉比例不同，生成由紫红到深蓝的一系列显色反应，根据吸光度与直链淀粉浓度呈线性关系，用分光光度法测定，稻米直链淀粉含量测定行标NY/T 2639-2014也是应用此原理；试剂盒法基于碘比色法原理进行开发，不仅价格昂贵，测定过程对实验人员熟练程度要求也较高，易造成误差或重复性较差等问题；二甲亚砜速溶法处理样品需在DMSO溶液中加热过夜，DMSO毒性较强，使用过程中要避免挥发，操作安全性不高；碘亲和力法操作繁琐，须从样品中分离制取纯直链淀粉，技术要求高，不适于广泛应用；近红外光谱法应用前需进行建模和预测，建模质量和模型合理使用对分析结果有很大影响。
相比之下流动分析仪操作安全简便，通过蠕动泵吸取样品，化学反应单元混合反应，由检测器、数据处理器自动分析计算出结果，极大程度上节省了人工，也克服了因人为操作造成的误差较大和稳定性不佳等问题，同时成本较低，适合批量测定。吕祥敏(2011)等将流动分析法应用于烟草中总淀粉含量的测定，何秀芬(2012)等测定食品中可溶性糖含量，均体现出准确、灵敏、重复性良好、检测效率高等优点。此外，连续流动分析仪在水质分析、肥料中硝态氮检测、植物的全氮、全磷测定等检测领域已广泛应用，是一种稳定、可靠的分析手段。由于各类样品性质不同，流动分析仪的参数不能统一使用，尤其是淀粉类具有粘性的样品，不然会造成测定结果不准确、重复性差、堵塞管路、仪器元件损耗等问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法。能在准确、稳定的基础上极大程度上缩减人工，满足大批量甘薯直链淀粉含量测定的工作需求。
为了实现上述目的，本发明采用的一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法，具体包括以下步骤：
一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法，它包括以下步骤：
S1、取待测样品至离心管中备用；
S2、离心管中加入乙醚，充分震荡后进行离心操作，弃上清液；
S3、重复进行步骤S2三次后将离心管开盖直至乙醚挥发；
S4、向离心管中加入95％乙醇，手动振荡至样品充分分散，立即加入1M氢氧化钠溶液，继续手动振荡，直至样品不发生沉淀，室温中静置8-12min；
S5、沸水浴加热样品，加热过程中管盖不拧紧，沸水液面高于管内样品液面；
S6、沸水浴10-15min后，室温中静置24h以上后加超纯水定容获得待测样品溶液；
S7、标准品溶液制备：按照步骤S1-S6分别配置直链淀粉含量为4％、8％、16％、24％、32％的标准品溶液，用于标曲绘制；
S8、空白溶液制备：以空白样品的离心管进行步骤S2-S6，获取空白溶液；
S9、将配置好的不同梯度的标准品溶液、空白溶液、待测样品溶液放入连续流动分析仪的样品管中，确认泵头在试剂液面以下，设置仪器参数：
采样器冲洗液：1.2mL/min
酸中和溶液：1.0mL/min
碘/乙酸溶液：0.6mL/min
氢氧化钠溶液：0.8mL/min
系统稳定时间：40min
模块样品时间：60sec
冲洗时间：90sec
空气：3sec
S10、连续流动分析仪启动，生成分析结果：
直链淀粉含量(％)＝(测量值-空白值)/标准品纯度
其中测量值为待测样品溶液获得的检测数值，空白值为空白溶液获得的检测数值，标准品纯度为96％。
具体的：
采样器冲洗液为0.09M氢氧化钠溶液；
酸中和溶液为柠檬酸C6H8O7 5.60g和5mL 1.0M的醋酸原液配制；
碘/乙酸溶液为1：1体积比例的碘原液和1.0M乙酸原液配制；
氢氧化钠溶液的浓度为0.005M。
具体的：
S1中，待测样品质量为0.10000g；离心管为50mL；
S2中，加入乙醚1mL，4000rpm离心10min；
S4中，加入乙醇1mL，振荡30sec，加入氢氧化钠9mL，静置10min；
S6中，定容至100mL。
优选的，测定方法中所有的配液过程中，使用的水均是超纯水。
优选的，所述超纯水通过煮沸法获得。
优选的，称取直链淀粉含量6.8％、13.6％、34％的低、中、高质控样品，进行步骤S1-S10进行检测质控。
本发明的有益效果
本申请通过进样量、冲洗时间、空气间隔等一系列仪器参数的配置，解决了淀粉类的粘性样品易造成管路阻塞、仪器元件损耗的问题，并实现了稳定性、准确性、可重复性测量的目的。具体的：
(1)本发明用自动化分析仪代替人工测定，简化操作，节省时间和人工的同时提高了检测的稳定性。
(2)本发明根据甘薯样品特性，开发了专门的检测参数，同时适当延长冲洗时间和空气间隔，使样品间不产生交叉，重复性提高。
(3)本发明使用煮沸法脱气的超纯水，最大程度上避免试剂中或泵管运行过程中产生气泡对基线稳定性造成的影响，使峰图平滑稳定。
(4)引入质控样品对实验结果的准确性提供依据。
(5)本发明增加脱脂步骤，避免样品中脂肪对测定结果产生干扰。
附图说明
图1标准曲线及线性相关系数。
图2低、中、高质控样品峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法，具体包括以下步骤：
试剂配制：配制0.005M的氢氧化钠溶液、柠檬酸C6H8O7 5.60g和5mL 1.0M的醋酸原液配制成1L的酸中和溶液、25mL碘原液和25mL1.0M乙酸原液配制成的碘/乙酸溶液、采样器冲洗液(0.09M氢氧化钠溶液)。为防止试剂流动过程中气泡影响测定结果的稳定性，操作过程中所有用水均为煮沸法脱气的超纯水。
S1、样品称量：用十万分之一天平称取直链淀粉含量6.8％、13.6％、34％的低、中、高质控样品和甘薯粗淀粉样品0.1000g，于50mL离心管中备用；
S2、样品脱脂：向离心管中加入1mL乙醚，充分振荡后4000rpm离心10min，弃上清液，注意吸取上清液时不能吸到样品；
S3、重复3次后将离心管开盖置于通风橱中过夜，直至乙醚挥发；
S4、样品分散：向离心管中加入1mL 95％乙醇，手动振荡30sec使样品充分分散，立刻加入9mL 1M氢氧化钠溶液，继续手动振荡，直至样品不发生沉淀，室温静置8-12min；
S5、样品糊化：沸水浴加热样品10-15min，注意加入过程中不可将管盖拧紧，沸水液面要高于管内样品液面；
S6、样品定容：水浴后室温静置24h以上，加超纯水定容至100mL容量瓶中待测；
S7、标准品溶液制备：按照步骤S1-S6分别配置直链淀粉含量为4％、8％、16％、24％、32％的标准品溶液，用于标曲绘制；
S8、设置空白组，空白组不加样品，其余操作与样品组一致；
S9、将配置好的不同梯度的标准品溶液、空白溶液、待测样品溶液放入连续流动分析仪(Skalar San++System连续流动分析仪)的样品管中，确认泵头在试剂液面以下，设置仪器参数：
采样器冲洗液：1.2mL/min
酸中和溶液：1.0mL/min
碘/乙酸溶液：0.6mL/min
氢氧化钠溶液：0.8mL/min
系统稳定时间：40min
模块样品时间：60sec
冲洗时间：90sec
空气：3sec
S10、连续流动分析仪启动，生成分析结果：
直链淀粉含量(％)＝(测量值-空白值)/标准品纯度
其中测量值为待测样品溶液获得的检测数值，空白值为空白溶液获得的检测数值，标准品纯度为96％。
由于样品可能造成管路堵塞，测试完成后需将各泵管放入超纯水中清洗30min以上关机。
本发明提出的甘薯直链淀粉含量测定方法可应用于高品质甘薯淀粉品种筛选中。
首先给出了一组用于校验本发明提出的甘薯直链淀粉含量测定方法准确性的数据，包括5个梯度的标准曲线，3个质控参照(表1)，检出限和定量限，6组重复性试验。
表1质控样品理论值与实际值的相对标准偏差
Figure BDA0003547627660000051
当重复7次空白试验，测得数据0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.11，根据方法检出限的一般确定方法MDL＝3.143×7次平行测定的标准偏差，计算得方法检出限为0.12％；
当重复11次空白试验，测得数据0.06、0.04、0.04、0.09、0.03、0.11、0.02、0.00、0.02、0.04、0.08，仪器检出限＝3×11次平行测定的标准偏差，计算结果为0.10％，仪器定量限＝10×11次平行测定的标准偏差，计算结果为0.33；
选取6个甘薯品种，每个品种重复测定6次，各组数据中重复数值＜1％，相对标准偏差分别为1.62％、1.31％、1.05％、1.43％、1.04％、1.19％，符合现行稻米直链淀粉含量测定行标NY/T 2639-2014中的规定；
在另一组验证实验中，选取12个甘薯品种，直链淀粉含量变幅为22.31-25.76％，标准曲线线性相关系数r＝0.9999(图1)，低、中、高含量质控样品实际测得值分别是6.72％，13.32％，32.67％，与理论值RSD偏差分别为0.81％，1.46％，2.82％(图2)，质控样品实际值与理论值RSD偏差均不超过5％。
经过实验获得：
相关系数r2≥0.995；
测得质控样品实际值与理论值RSD偏差＜5％；
在样品含量大于10％时，重现性条件下两次独立测试结果的绝对值相差不超过1％；
样品含量≤10％时，重现性条件下两次独立测试结果的绝对值相差不超过0.5％。
从以上实验结果可以得知：根据质控样品实测值和理论值偏差小，可以看出本发明提供的这种检测方法结果准确可靠；根据两次独立重复绝对值偏差可说明本方法重复性好。综上，使用本方法的测定结果是精准、稳定的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种稳定便捷的甘薯直链淀粉含量测定方法，其特征在于它包括以下步骤：
S1、取待测样品至离心管中备用；
S2、离心管中加入乙醚，充分震荡后进行离心操作，弃上清液；
S3、重复进行步骤S2三次后将离心管开盖直至乙醚挥发；
S4、向离心管中加入95％乙醇，手动振荡至样品分散，立即加入1M氢氧化钠溶液，继续手动振荡，直至样品不发生沉淀，室温中静置8-12min；
S5、沸水浴加热样品，加热过程中管盖不拧紧，沸水液面高于管内样品液面；
S6、沸水浴10-15min后，室温中静置24h以上后加超纯水定容获得待测样品溶液；
S7、标准品溶液制备：按照步骤S1-S6分别配置直链淀粉含量为4％、8％、16％、24％、32％的标准品溶液，用于标曲绘制；
S8、空白溶液制备：以空白样品的离心管进行步骤S2-S6，获取空白溶液；
S9、将配置好的不同梯度的标准品溶液、空白溶液、待测样品溶液放入连续流动分析仪的样品管中，确认泵头在试剂液面以下，设置仪器参数：
采样器冲洗液：1.2mL/min
酸中和溶液：1.0mL/min
碘/乙酸溶液：0.6mL/min
氢氧化钠溶液：0.8mL/min
系统稳定时间：40min
模块样品时间：60sec
冲洗时间：90sec
空气：3sec
S10、连续流动分析仪启动，生成分析结果：
直链淀粉含量(％)＝(测量值-空白值)/标准品纯度
其中测量值为待测样品溶液获得的检测数值，空白值为空白溶液获得的检测数值，标准品纯度为96％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
采样器冲洗液为0.09M氢氧化钠溶液；
酸中和溶液为柠檬酸C6H8O7 5.60g和5mL 1.0M的醋酸原液配制；
碘/乙酸溶液为1：1体积比例的碘原液和1.0M乙酸原液配制；
氢氧化钠溶液的浓度为0.005M。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S1中，待测样品质量为0.10000g；离心管为50ml；
S2中，加入乙醚1mL，4000rpm离心10min；
S4中，加入乙醇1mL，振荡30sec，加入氢氧化钠9mL，静置10min；
S6中，定容至100mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于测定方法中所有的配液过程中，使用的水均是超纯水。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于所述超纯水通过煮沸法获得。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于称取直链淀粉含量6.8％、13.6％、34％的低、中、高质控样品，进行步骤S1-S10进行检测质控。
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