CN114736913B

CN114736913B - 通过调节套索rna的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用

Info

Publication number: CN114736913B
Application number: CN202210481934.6A
Authority: CN
Inventors: 胡筑兵; 吴承云; 王行松
Original assignee: Sanya Research Institute Of Henan University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Henan University
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2024-07-09
Anticipated expiration: 2042-05-05

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抗旱基因，特别是指通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用。本发明公开了一种拟南芥富含脯氨酸蛋白编码基因SIC在调控植物耐旱中的应用，涉及基因工程技术领域，拟南芥富含脯氨酸蛋白编码基因SIC，通过影响套索RNA分支酶DBR1的核堆积，进而控制套索RNA在细胞内的堆积，从而影响miRNA的生物合成，最终调控气孔密度和开度及植物抗旱重要激素ABA的累积，调节植物耐旱性。

Description

通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抗旱基因，特别是指通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用。

背景技术

近年来，随着全球气候变暖的不断加剧，干旱已成为自然界中主要的非生物胁迫之一，严重影响着植物的生长和作物产量，解决干旱问题并提高作物产量是实现农业可持续发展的重要挑战。适度干旱利于植物发育，而过度干旱将造成植物发育不良和作物减产等危害。因此，植物如何响应干旱是一个根本性的生物学问题，提高植物抗旱对提高作物产量具有重要意义。拟南芥(Arabidopsis thaliana)是植物学基因工程研究的重要模式植物，因其生长周期短、形态特征明显、基因组小等特点被广泛研究，通过对拟南芥相关基因的研究，将为其他植物物种基因功能研究及通过基因工程指导遗传育种奠定基础。

植物中存在一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的蛋白质，其普遍特点是脯氨酸(Pro)残基含量高, 至少有2个连续的Pro排列在氨基酸链中，被称为富含脯氨酸蛋白。这类蛋白在双子叶植物及单子叶植物中广泛存在，并且在植物生长发育和逆境适应中扮演重要角色。

套索RNA呈现环状，是真核生物RNA转录后加工的产物。当真核生物mRNA的初级转录产物前体mRNA产生后，它必须进行5’-端和3’-端的修饰，以及内含子去除，才能形成成熟的mRNA，并被转运到核糖体，指导蛋白质合成。其中，当内含子去除时，剪接体使内含子区段弯曲成套索状，所以称之为套索RNA。DBR1是套索RNA降解的限速酶。

专利201310101230.2公开了一种富含脯氨酸蛋白基因及其表达载体和应用，该基因在抗病害中取得了较好的效果，申请人进一步以模式植物拟南芥为对象，对富含脯氨酸蛋白的基因功能进行研究，发现富含脯氨酸蛋白编码基因SIC和其编码蛋白质在植物育种中的新作用。

发明内容

本发明提出一种通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用，为植物育种提供了一种新的方向和途径。

本发明的技术方案是这样实现的：

通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因。

所述基因通过调控套索 RNA分支酶DBR1的细胞核累积，进而实现调控套索RNA的降解。

所述基因为富含脯氨酸蛋白基因SIC，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示或与具有与SEQ ID NO .1互补的核苷酸序列。

包含上述所示基因的表达载体。

所述表达载体为将所述的基因插入pCambia1300-GFP载体上获得的。

包含上述的表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为农杆菌细胞。

上述的基因、表达载体和/或宿主细胞在培育抗旱植物中的应用。

上述的基因、表达载体和/或宿主细胞在调控气孔密度和开度中的应用。

上述的基因、表达载体和/或宿主细胞在调控激素ABA的累积量中的应用。

上述的基因、表达载体和/或宿主细胞在调节植物耐旱性中的作用。

进一步，所述植物为双子叶植物。

优选的，所述植物为拟南芥。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过研究找到了一个能够影响植物抗旱性相关基因，命名为SIC，它是一种富含脯氨酸的蛋白。并且，拟南芥中T-DNA插入造成的SIC基因突变体植株，植物抗旱性增强，气孔密度和开度增加，植物激素ABA累积。

本发明提供的SIC基因在作物育种方面具有潜在的应用价值。在调控植物抗旱中的一种潜在机理：即通过调控套索RNA分支酶DBR1的细胞核累积，而影响套索RNA的降解，从而抑制miRNA的生物合成，最终影响植物抗旱性。

在科学研究中，需要构建抗旱性的植物，基于SIC基因功能缺失导致植物耐旱性提高的这一特点，本发明提供了该基因在构建植物耐干旱模型方面的应用。具体的，利用基因工程技术使植物SIC基因的表达降低或不表达。

本发明首次公开SIC基因编码的富含脯氨酸蛋白对植物耐旱性的影响，SIC基因的突变造成纯合突变体植物耐旱性增强的性状。该基因编码蛋白，能够通过调控套索RNA分支酶DBR1的细胞核累积，而影响套索RNA的降解，进而影响miRNA的生物合成，最终通过调控气孔密度和开度、植株抗旱重要激素ABA在植物体内的累积，而调节拟南芥抗旱性。

本发明为加深富含脯氨酸蛋白功能研究及植物耐旱性等性状的研究和应用提供了新的基因资源及理论指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为SIC基因构建完成的p35S:SIC-GFP载体示意图。

图2为突变体T-DNA插入位置示意图和纯合突变体验证及p35S:SIC-GFP植株验证；其中，A为T-DNA插入位置示意图,白色框表示UTR区域，黑色框表示外显子区域，黑线表示内含子区域；B为p35S:SIC-GFP验证引物位置图示，绿色框表示GFP编码区域，紫色箭头表示p35S启动子；C为利用特异性引物验证T-DNA插入和纯合及p35S:SIC-GFP植株的PCR电泳图。

图3为野生型、sic-4突变体和回补植株的气孔形态图及气孔开度和密度统计图；其中，A野生型、sic-4突变体和回补植株的气孔形态图；B为野生型、sic-4突变体和回补植株的气孔开度统计图；C为野生型、sic-4突变体和回补植株的气孔密度统计图；星号表示显著性分析（P<0.001）。

图4为野生型、sic-4突变体和回补植株的ABA含量测定图；星号表示显著性分析（P<0.001）。

图5为突变体在干旱条件下的植株表型图。

图6为DBR1-GFP在野生型和sic-4突变体中的定位分析；A图为pDBR1:DBR1-GFP在野生型和sic-4纯合突变体中的荧光分布（左边），右边为线条处的荧光灰度曲线图；B图为野生型和sic-4突变体DBR1-GFP在细胞核与细胞质相对荧光强度的比值。

图7为野生型、sic-4和Comp株系的套索RNA累积分析；A图为聚合引物（Fa，Ra）和反向引物（Fb，Rb）模式图，Fa、Ra用于线性RNA检测，Fb、Rb用于套索RNA检测，绿色和紫色方框代表外显子，红色细线代表内含子，红色的球状代表分支位点；（B）使用（A）中所展示的反向引物，通过RT-PCR检测套索的水平，UBQ5用作内参，线性RNA用作RNase R处理的阳性对照。

图8为野生型、sic-4和Comp株系的miRNA测序分析；A图为箱线图表示miRNA在野生型、sic-4和Comp株系中整体丰度差异分析；B图为散点图表示sic-4与野生型相比，及Comp与野生型相比的差异；C图为热图显示这些已知的miRNA在野生型、sic-4和Comp株系中的表达量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

拟南芥SIC基因的克隆和载体构建

通过实验室已有的pCAMBIA1300-GFP载体。根据SIC基因(如SEQ ID NO .1所示)的CDS序列设计引物，以拟南芥cDNA为模板，扩增出CDS序列。将扩增出的片段连接到YFP的N端。所用引物分别为SIC-GFP-F和SIC-GFP-R。

引物序列为：

SIC-GFP-F：(5 '>CCCAGATCAACTAGTATGGAAGATTCAGAG<3 ')

SIC-GFP-R：(5 '>GCTCACCATGGATCCATTGCTTGACTCATCG<3 ')

PCR反应条件为：

95℃、3min；95℃、15sec，58℃、15sec，72℃、1min，33个循环；72℃，5min。

采用琼脂糖凝胶电泳回收基因片段。

用SpeI和BamHI双酶切pCAMBIA1300-GFP载体，用同源重组法连接目的片段和线性化载体，得到p35S:SIC-GFP重组载体。

取1 μl重组产物，用冻融法转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布到卡那霉素抗性(50μg/ml)的LB培养基。37℃培养过夜，挑单克隆进行质粒提取。构建好的载体经测序，测序序列与所述SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列一致。将构建正确的p35S:SIC-GFP转化农杆菌，并经PCR验证正确后保存备用，构建的载体图如图1所示。

实施例2

1、T-DNA插入突变体鉴定

从Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC, https://abrc.osu.edu/)购买到一种T-DNA插入造成的SIC突变体，记为sic-4，T-DNA插入位置见图2。

用三引物法对sic-4突变体基因型进行鉴定。引物由T-DNA引物设计网站(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)设计。网站设计的引物分别记为sic-4-LP和sic-4-RP。LB引物为该网站提供的GK-LB。

引物序列为：

sic-4-LP：(5 '>TAGTGAGTATCAGGCACAGACC<3 ')

sic-4-RP：(5 '>CAGAGATGTTCATCATTCGCTG<3 ')

GK-LB：(5 '>ATATTGACCATCATACTCATTGC<3 ')

PCR反应条件为：

95℃、3min；95℃、15sec，53℃、15sec，72℃、1min，32个循环；72℃，5min。

经PCR 验证，已获得sic-4突变体纯合株系，如图2所示。

2、T-DNA插入突变体的性状分析

如图3所示，与野生型Col-0相比，sic-4突变体的气孔明显比变大，统计分析显示其气孔开度（图3B）和气孔密度（图3C）均显著变大。

实施例3

1、p35S:SIC-GFP载体遗传转化实验

为了验证T-DNA突变体株系气孔密度和开度变大、ABA含量升高及干旱耐受的性状是由于SIC基因缺失导致的，而不是由于未知的T-DNA插入造成的，将构建好的p35S:SIC-GFP载体进行遗传转化。

2、转基因阳性苗的筛选和表型分析

将T0代转基因种子播种在含潮霉素(50μg/ml)抗性的1/2MS培养基中进行筛选，在正常光照下培养约10天，观察并筛选阳性苗。将抗性苗移栽到营养土中，阳性苗用引物35S-SIC-F和GFP-SR进行阳性转基因检测。使用引物sic-4-LP、sic-4-RP和GK-LB进行sic-4的T-DNA基因型鉴定。

引物序列为：

35S-SIC-F：(5 '>GGATTGATGTGACATCTCCACT<3 ')

GFP-SR：(5 '>GGTGAACAGCTCCTCGCC<3 ')

PCR反应条件为：

95℃、3min；95℃、15sec，58℃、15sec，72℃、1min，32个循环；72℃，5min。

将收获的野生型Col-0、sic-4突变体和p35S:SIC-GFP（标记为Comp）植株种子，经过表面灭菌后，铺于1/2MS培养基平板中并放4度冰箱春化3天后，将平板置于植物培养箱（22度，8/16h光周期）培养7天后，移栽至土中，于22度，8/16h光周期继续正常培养3周，分别进行取样提取ABA及植物干旱实验。

ABA提取方法如下：

取拟南芥植物叶片0.1 g于1.5 mL离心管中，加入两粒小钢珠，液氮速冻，并用细胞破碎仪破碎；加入750 μL激素抽提液（甲醇：乙酸：水=80：1：19），于4℃避光震荡孵育过夜；13000 rpm，10 min 4℃离心，吸取上清，避光保存于4℃；向沉淀中再次加入450 μL激素抽提液，4℃避光震荡孵育4 h，1300 rpm，10 min，4℃离心，吸取上清；合并两次上清。合并后的上清过0.22 μm滤膜（津腾尼龙66）至新的1.5 mL离心管中；45℃真空浓缩6h。离心管中无液体残留后，加入200μL 40%甲醇复溶，将激素提取液转移至内插管，并转移至棕色进样瓶中，进行HPLC进样测定。

干旱实验如下：正常培养3周后，立即停止给植物浇水，观察植物生长变化，直到出现表型，并拍照记录。

结果如图3、4和5所示，p35S:SIC-GFP/sic-4（Comp）株系的气孔密度（图3B）、气孔开度（图3C）和ABA含量（图4）均与野生型无明显差别，表明sic-4突变体的这些性状确实是因SIC基因的缺失所引起的。在sic-4突变体中其ABA含量显著高于野生型和Comp株系（图4）。在停止浇水后2周，野生型和Comp株系出现明显植物萎蔫并开始死亡，而sic-4突变体则依然较为正常生长，显示sic-4突变体显著的耐干旱（图5）。筛选到的Comp互补植株能够成功的将这些sic-4突变体的表型恢复到野生型一致，说明突变体这些耐旱性表型是由SIC缺失造成的。

实施例4

本实施例主要分析SIC通过调控套索RNA分支酶DBR1在细胞核的累积，而影响套索RNA降解，进而影响miRNA的生物合成，最终参与植物耐旱的分子机理。

1、SIC的缺失影响套索RNA分支酶DBR1在细胞核的累积

将pDBR1：DBR1-GFP株系与sic-4突变体杂交，在分离F2代pDBR1：DBR1-GFP/sic-4纯合株系后进行激光共聚焦显微镜观察DBR1-GFP在野生型和sic-4突变体中的荧光分布，结果显示在sic-4突变体中DBR1-GFP在细胞核的累积显著降低（图6A），其细胞核与细胞质相对荧光强度的比值也表现为显著降低（图6B）。

2、SIC的缺失影响套索RNA在细胞中的堆积

选取了一些Col -0和sic-4中表达显著差异的套索RNA，并设计了一系列反向引物（图7A），结合RNase R酶处理（一种几乎能够消化所有线性RNA，但不能降解环状RNA的酶），利用这些反向引物通过反转录PCR（RT-PCR）验证了sic-4突变体中套索RNA的堆积情况（图7B）。结果显示，与Col-0和Comp株系相比，无论是否使用RNase R处理RNA样品，大部分被检测的lariat RNAs在sic-4突变体中均呈现明显的累积。

3、SIC的缺失影响miRNA的生物合成

通过miRNA建库测序分析了野生型、sic-4和Comp株系中miRNA丰度的差异，结果显示与Col-0和Comp株系相比，sic-4突变体中miRNA的整体丰度降低（图8A和B），进一步的对已知的一些miRNA的丰度进行分析，通过热图分析显示这些miRNA的丰度均显著下降（图8C）。

综合这些结果显示SIC通过调控调控套索RNA分支酶DBR1在细胞核的累积，而影响套索RNA降解，进而影响miRNA的生物合成。而目前已有的研究显示miRNA参与植物各种逆境胁迫，miRNA作物小分子抑制相关基因的表达而调控植物的逆境响应。有报道显示降低miR165/166的表达水平，破坏miR165/166介导的靶标抑制，可导致植物产生干旱和低温耐受表型以及ABA高灵敏度。降低miR165/166的表达水平，破坏miR165/166介导的靶标抑制，可导致植物产生干旱和低温耐受表型以及ABA高灵敏度（Yan et al., 2016）。而本例中SIC的缺失同样也导致miR165/166的表达显著下调，ABA含量升高，而ABA可以调控气孔运动，这均与已有的研究相符，因此可以预测SIC参与植物耐旱，可能也是通过影响miRNA的生物合成而实现的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南大学三亚研究院

<120> 通过调节套索RNA的降解实现植物抗旱的基因、表达载体和应用

<141> 2022-05-05

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggaagatt cagagaaaag aaaacagatg ttaaaagcaa tgcgaatgga agctgcagcg 60

cagaatgatg atgatgctac tacaggtact gaaacatcta tgagcacagg tcacctctcc 120

aatccattgg cagagacatc caatcaccag caggattcat ttgaaacgca aaggtttgat 180

tattataccg atcccatggc tgcttattct agtttcaaga aaaacaagac ccctaagcaa 240

caatacatct catctcctag tcatcaagga agctctcctg taccacctca gtttccacca 300

tcagttcctc caggatcatt atgtagtgag tatcaggcac agaccaatca tggtggcttt 360

catgcagctc attatgaacc aagagggatg gcacatcttt caccctcaca cagaggtcca 420

cccgccggtt ggaataacaa ctttaggcct ccaccagtta accattcagg tccacctcaa 480

tgggtacctc gcccttttcc attctctcaa gaaatgccga acatggggaa taatagattt 540

ggtggtcgag gcagctacaa caatactcct ccacagtttt ccaattatgg acgacaaaat 600

gcaaactggg gtggaaacac gtatcctaac tcaggaagag gcagaagtcg aggacgcggt 660

atgaacacaa gctttgggag agatggagga agaagaccca tggaaccagg ggcagaacga 720

ttttactcca actctatggc tgaagatcca tggaagcatc ttaagccagt cttatggaag 780

aattgctcag atgcttcgag cagcagctca acaggtcaag cctggcttcc caagtctata 840

gcaccaaaaa aatctgtgac ctcagaagct acccacaaaa ctagcagtaa tcagcagagc 900

cttgctgagt accttgctgc ttctctagat ggtgctacat gcgatgagtc aagcaattaa 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Glu Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Met Leu Lys Ala Met Arg Met

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Gln Asn Asp Asp Asp Ala Thr Thr Gly Thr Glu Thr

20 25 30

Ser Met Ser Thr Gly His Leu Ser Asn Pro Leu Ala Glu Thr Ser Asn

35 40 45

His Gln Gln Asp Ser Phe Glu Thr Gln Arg Phe Asp Tyr Tyr Thr Asp

50 55 60

Pro Met Ala Ala Tyr Ser Ser Phe Lys Lys Asn Lys Thr Pro Lys Gln

65 70 75 80

Gln Tyr Ile Ser Ser Pro Ser His Gln Gly Ser Ser Pro Val Pro Pro

85 90 95

Gln Phe Pro Pro Ser Val Pro Pro Gly Ser Leu Cys Ser Glu Tyr Gln

100 105 110

Ala Gln Thr Asn His Gly Gly Phe His Ala Ala His Tyr Glu Pro Arg

115 120 125

Gly Met Ala His Leu Ser Pro Ser His Arg Gly Pro Pro Ala Gly Trp

130 135 140

Asn Asn Asn Phe Arg Pro Pro Pro Val Asn His Ser Gly Pro Pro Gln

145 150 155 160

Trp Val Pro Arg Pro Phe Pro Phe Ser Gln Glu Met Pro Asn Met Gly

165 170 175

Asn Asn Arg Phe Gly Gly Arg Gly Ser Tyr Asn Asn Thr Pro Pro Gln

180 185 190

Phe Ser Asn Tyr Gly Arg Gln Asn Ala Asn Trp Gly Gly Asn Thr Tyr

195 200 205

Pro Asn Ser Gly Arg Gly Arg Ser Arg Gly Arg Gly Met Asn Thr Ser

210 215 220

Phe Gly Arg Asp Gly Gly Arg Arg Pro Met Glu Pro Gly Ala Glu Arg

225 230 235 240

Phe Tyr Ser Asn Ser Met Ala Glu Asp Pro Trp Lys His Leu Lys Pro

245 250 255

Val Leu Trp Lys Asn Cys Ser Asp Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Gly

260 265 270

Gln Ala Trp Leu Pro Lys Ser Ile Ala Pro Lys Lys Ser Val Thr Ser

275 280 285

Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Ser Asn Gln Gln Ser Leu Ala Glu Tyr

290 295 300

Leu Ala Ala Ser Leu Asp Gly Ala Thr Cys Asp Glu Ser Ser Asn

305 310 315

Claims

1.富含脯氨酸蛋白的编码基因SIC在调节植物气孔密度和开度中的应用，所述基因SIC序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于：基因SIC功能的缺失，提高气孔密度和开度；基因SIC功能的恢复，降低气孔密度和开度；所述植物为拟南芥。

2.富含脯氨酸蛋白的编码基因SIC在调控植物激素ABA的累积量中的应用，所述基因SIC序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于：基因SIC功能的缺失，提高激素ABA的累积量；基因SIC功能的恢复，降低激素ABA的累积量；所述植物为拟南芥。

3.富含脯氨酸蛋白的编码基因SIC在调节植物耐旱性中的作用，所述基因SIC序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于：基因SIC功能的缺失，提高植物的耐干旱性能；基因SIC功能的恢复，降低植物的耐干旱性能；所述植物为拟南芥。