CN1147296C - 牛磺酸制备抗缺血性脑血管病和颅脑外伤药物 - Google Patents
牛磺酸制备抗缺血性脑血管病和颅脑外伤药物Info
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Abstract
本发明涉及牛磺酸的新医药用途。具体地说,本发明涉及牛磺酸制备抗缺血性脑血管病和颅脑外伤药物的应用。
Description
本发明涉及牛磺酸的新医药用途。具体地说,本发明涉及牛磺酸制备抗缺血性脑血管病和颅脑外伤药物的应用。
因各种原因造成的神经损伤,例如脑缺血以及脑缺血继发性损伤等,如果不能及时得到有效治疗的话,将产生严重后果。
以脑缺血继发性损伤为例,脑缺血继发性损伤的病理生理机制非常复杂,涉及兴奋性神经毒性、氧化损伤、钙离子超负荷、渗透应激及炎性反应等(Dirnagl U,Iadecola C和Moskowitz MA,Trends Neurosci.1999,22,391-397;Kato H和Kogure K,Cell Mole.Neurobiol.1999,19,93-108)。
依据脑缺血继发性损伤机制,人们对缺血大脑的保护进行了广泛的研究(Barone FC and Feuerstein GZ,Cereb.Blood Flow,1999,19,819-834;Keyser JD,Sulter G and Luiten PG,Trends Neurosci. 1999,22,535-540),并发现了一些有效的缺血大脑保护剂。如抑制性氨基酸(主要有γ-氨基丁酸)、抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)、腺苷、抗氧化物(谷胱甘肽、维生素E、维生素C、金属硫蛋白、糖皮质激素等)和抗氧化剂(如甘露醇、消炎痛等)。
上述缺血大脑保护剂虽然有一定作用,但是大多数还没有实现实用。因此开发具有实用价值的保护剂仍然是一项有待研究的课题。
牛磺酸是动物体内含量很高的一种含硫的氨基酸,它具有复杂的生物学功能,如抗氧化、抗炎、膜稳定、抑制神经传递及调节渗透压、细胞内Ca++的移动和心血管活动等作用。具有抗心、肝和神经组织缺氧/再氧合及氧自由基损伤作用。(参见Huxtable RJ,Prog.Neurobiol.,1989,32,471-533;Huxtable RJ,Physiol.Rev.,1992,72,101-163等)。根据中国药典,它主要作为一种解热镇痛、保肝利胆类药物应用于临床,其主要适应症是急慢性肝炎、脂肪肝、胆囊炎、上呼吸道感染、风湿性关节炎和疼痛等,药理作用包括保肝利胆、清热解毒、消炎镇痛、抗惊厥、抗风湿及降压、强心和抗心律失常等。但利用牛磺酸作为一种新的抗脑缺血性损伤和颅脑外伤药物及其作用机制尚未见报告。
近年来,虽然有一些文献报道牛磺酸具有抗神经元缺氧作用以及用于治疗缺氧引起的酸中毒等(参见:Boldyrev,AA等,Neurosci.Lett.1999,263,169-172;WO 92/15546等),但是,这并不能推出它具有抗神经系统缺血作用,因为缺血和缺氧是两个不同的病理生理过程。单纯缺氧性脑病是指因低氧、贫血、组织中毒等原因引起的氧的供给达不到脑组织代谢所需要的最低水平而造成的脑组织损伤,而血流并没有阻断,因而其损伤机制较为简单。而在脑缺血时,由于阻断了血流,因而不仅引起脑组织的缺氧,而且阻断了血液中其他营养成分的供给,导致脑血流和脑代谢偶联的丧失,并且参与损伤的因素也多元化,不仅有血管外因素,而且还有血管内的因素(如炎性反应、血液动力学变化等)。因此,神经元缺血性损伤的机制较单纯缺氧性损伤的机制要复杂得多,由单纯性缺氧得出的结论仅可为脑缺血研究提供一些启示或佐证,而不能机械地套用到脑缺血损伤中。
欧洲专利申请EP 797992A2(1997年)及其美国专利US6015835中虽然公开了一种牛磺酸、高牛磺酸和/或甲硫氨酸(US6015835:牛磺酸、高牛磺酸和甲硫氨酸)在麻醉或镇痛中的应用,也提到也提到它对脊髓缺血的保护作用,但其依据来自牛磺酸和低温(30.58℃)联合应用的结果。虽然他们提供了单独使用不同低温(29.9℃和29.38℃)的结果,分别作阴性和阳性对照,但令人费解的是:“既然要证明牛磺酸的抗缺血作用,却恰恰没有提供单独使用牛磺酸的直接结果。”低温(30℃)和亚低温(32-34℃)对中枢缺血性损伤的保护作用已被公认,并已用于临床。因此,低温和牛磺酸二者联合应用的结果易于混淆,就此得出的“牛磺酸具有抗脑缺血作用”的结论,也显得十分牵强。因而可以认为他们没有提供牛磺酸抗中枢神经系统缺血的直接的确切依据。
综上,迄今为止,有关牛磺酸抗脑缺血和颅脑损伤作用尚未见报道。
从根本上讲,衡量一个抗脑缺血药物是否有效的最必要的条件是它能否改善脑血流、降低脑水肿、保护血脑屏障、减轻组织损伤,最终缩小梗塞灶。本发明人首次在整体动物水平上,从上述几个方面证实了牛磺酸具有明确的抗脑缺血作用,它可改善脑血流、降低脑水肿、保护血脑屏障、减轻组织损伤、缩小梗塞灶。另外,我们从脑血流、脑水肿、血脑屏障等方面,证实牛磺酸具有明确的抗颅脑外伤作用。在中枢神经系统,许多疾病,如神经系统变性病以及一些中毒性脑病,其病理生理机制,与脑缺血继发性损伤的机制有部分类似之处,另外,其他系统,如呼吸和循环系统的一些疾病也可引起中枢神经系统缺血、缺氧性损伤。因此,我们认为牛磺酸对中枢神经系统多种急、慢性损伤的治疗和预防均具有很大的意义。从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种牛磺酸的新医药用途。具体的说,本发明涉及牛磺酸制备抗中枢神经系统损伤药物,特别是牛磺酸制备抗脑缺血药物和颅脑外伤药物的应用。
因此,本发明涉及以下内容。
1.牛磺酸在制备治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的药物中的应用,尤其是0.1mg/kg体重-50mg/kg体重牛磺酸在制备治疗涉及缺血性脑血管病或颅脑外伤的药物中的应用。
2.根据1所述的应用,所述疾病是缺血性脑血管病。
3.根据2所述的应用,所述缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作(TIA)、腔隙性梗塞、脑血栓形成、脑栓塞、脑动脉盗血综合征等。
4.根据1所述的应用,所述疾病是发病机制与缺血、缺氧损伤机制部分相似的其他中枢神经系统疾病。
5.根据4所述的应用,所述中枢神经系统疾病包括神经系统变性性疾病。
6.根据5所述的应用,所述神经变性性疾病包括阿尔采默氏病、运动神经元病等。
7.根据1-6之一所述的应用,其中所述药物可减轻组织损伤或缩小梗塞灶。
8.根据1-6之一所述的应用,其中所述药物在缺血前或后使用均可改善脑血流。
9.根据1-6之一所述的应用,其中所述药物可减轻脑组织水肿。
10.根据1-6之一所述的应用,其中所述药物可降低缺血引起的血脑屏障破坏。
11.根据1-6之一所述的应用,其中所述药物在缺血前或缺血后8小时内使用有效。
12.根据1所述的应用,所述药物用于治疗颅脑外伤。
13.根据12所述的应用,所述颅脑外伤包括脑震荡、脑挫裂伤和颅内血肿等。
14.根据1所述的应用,所述疾病是其他系统疾病引起缺血、缺氧性脑病。
15.根据14所述的应用,其中所述缺血、缺氧性脑病是呼吸系统疾病和循环系统疾病引起的神经系统并发症、高血压脑病、心肺脑复苏等。
16.根据12-15之一所述的应用,其中所述药物可改善损伤周围的脑血流。
17.根据12-15之一所述的应用,其中所述药物可减轻颅脑外伤引起的脑组织水肿。
18.根据12-15之一所述的应用,其中所述药物可减轻颅脑外伤引起的血脑屏障破坏。
19.一种治疗哺乳动物中涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的方法,包括给予所述哺乳动物治疗有效量的牛磺酸。
以下详述本发明。
我们进行了后述有关牛磺酸抗脑缺血/再灌注损伤和颅脑外伤的实验研究,证实牛磺酸具有明确的抗脑缺血性损伤和颅脑外伤作用,为其作为一种新型抗中枢神经系统损伤药物及其临床应用提供了较完整的实验依据。
对于牛磺酸抗脑缺血作用,通过大鼠局灶性脑缺血模型,得到以下结论:
I、牛磺酸抗脑缺血作用:证实牛磺酸可明显减轻缺血性脑组织损伤,降低皮质、皮质下结构和半球的梗塞体积。
II、缺血前使用牛磺酸改善缺血半暗带脑血流,基本消除了缺血引起的迟发性低灌流。
III、缺血后应用牛磺酸可改善缺血半暗带脑血流,缩短了缺血后迟发性低灌注的持续时间。
IV、牛磺酸降低缺血引起的脑组织水肿和血脑屏障(BBB)的破坏:牛磺酸可明显降低缺血半球水分含量,缺血前应用牛磺酸可明显降低皮质、皮质下结构和半球的BBB的破坏。
V、牛磺酸抗脑缺血作用时间窗观察:在缺血后2h应用时可明显降低皮质和皮质下结构的梗塞体积,在4h应用仍具有抗脑缺血作用(p≈0.05)。
根据上述实验结果说明牛磺酸具有明确的抗局灶性脑缺血及再灌注损伤作用,它可改善区域性脑血流、降低缺血性脑组织水肿和缺血引起的血脑屏障的破坏,减轻缺血性脑组织损伤,缩小梗塞体积。
对于牛磺酸抗颅脑外伤作用,通过大鼠自由落体颅脑外伤模型,得到以下结论:
I、与外伤对照组相比,外伤后即刻应用牛磺酸可明显改善外伤后损伤周围区脑血流。
II、与外伤对照组相比,损伤后1h应用牛磺酸可明显改善损伤周围区脑血流。
III、与对照组相比,损伤后即刻和损伤后1h应用牛磺酸可明显降低外伤引起的全脑水分含量;外伤后即刻和1h应用牛磺酸可明显降低外伤引起的血脑屏障(BBB)的破坏。
因此,具体来说,牛磺酸可以有以下用途:
牛磺酸可用于制备治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的药物。
具体地说,牛磺酸在用于制备治疗涉及脑缺血继发性损伤性疾病的药物时,所述疾病包括缺血性脑血管病。
再具体地说,牛磺酸在用于制备治疗涉及脑缺血继发性损伤性疾病、特别是缺血性脑血管病的药物时,所述缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作(TIA)、腔隙性梗塞、脑血栓形成、脑栓塞、脑动脉盗血综合征等。
另外,牛磺酸在用于制备治疗涉及脑缺血继发性损伤性疾病的药物时,所述疾病还包括发病机制与缺血、缺氧损伤机制部分相似的其他中枢神经系统疾病。
具体地说,所述中枢神经系统疾病包括神经系统变性性疾病。再具体地说,所述神经变性性疾病包括但不限于阿尔采默氏病、运动神经元病等。
牛磺酸制得的上述治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病的药物的效果在于,所述药物可减轻脑组织损伤或缩小梗塞灶。
牛磺酸制得的上述治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病的药物的效果还在于,所述药物在缺血前或后使用均可改善脑血流。
牛磺酸制得的上述治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病的药物的效果还在于,所述药物可减轻脑组织水肿。
牛磺酸制得的上述治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病的药物的效果也在于,所述药物可降低缺血引起的血脑屏障破坏。
为获得上述牛磺酸制得的上述治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病的药物的效果,优选将所述药物在缺血前或缺血后8小时内使用。
另外,在牛磺酸在制备治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的药物的应用中,牛磺酸可特别用于制备治疗颅脑外伤的药物。
牛磺酸在用于制备治疗颅脑外伤的药物时,所述颅脑外伤包括但不限于脑震荡、脑挫裂伤和颅内血肿等。
另外,在牛磺酸在制备治疗涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的药物的应用中,所述疾病还包括其他系统疾病引起的缺血、缺氧性脑病。
在上述牛磺酸的用途中,所述缺血、缺氧性脑病包括但不限于呼吸系统疾病和循环系统疾病引起的神经系统并发症、高血压脑病、心肺脑复苏等。
由牛磺酸制备的治疗颅脑外伤或其它系统疾病引起的缺血、缺氧性脑病的药物的作用在于,所述药物可改善损伤周围的脑血流。
由牛磺酸制备的治疗颅脑外伤或其它系统疾病引起的缺血、缺氧性脑病的药物的作用在于,所述药物可减轻颅脑外伤引起的脑组织水肿。
由牛磺酸制备的治疗颅脑外伤或其它系统疾病引起的缺血、缺氧性脑病的药物的作用在于,所述药物可减轻颅脑外伤引起的血脑屏障破坏。
因此,本发明另外也涉及一种治疗哺乳动物中涉及脑缺血继发性损伤的疾病或颅脑外伤的方法,包括给予所述哺乳动物治疗有效量的牛磺酸。
牛磺酸已经是一种成药,因此可以根据国家的药品标准,根据患者的实际情况采用相应的制剂。也可以与合适的药用载体或稀释剂适当组合制成药品,采用通常的任意一种方法都可以制成制剂,可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、液体制剂等口服制剂,或皮下、静脉内、肌肉内、直肠内、鼻腔内给药的非口服制剂。
牛磺酸可以单独使用或适当组合后使用,另外,也可以与其它药物活性成分一同制成复方制剂。
对于口服制剂,可以直接或与合适的添加剂适当组合制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂。合适的添加剂例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、柠檬酸钙等常用的赋形剂,以及结晶纤维素、羟丙基纤维素等纤维素衍生物,阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等粘合剂,玉米淀粉、马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钙等崩解剂,滑石粉、硬脂酸镁等润滑剂,其它增量剂、润湿剂、缓冲剂、保存剂、香料等。
作为注射剂可以制成注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖注射液等的水性溶剂或植物油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯、丙二醇等非水性溶剂的溶液、悬浊液或乳化液,必要时也可以适当加入溶解辅助剂、等渗剂、悬浊化剂、乳化剂、稳定剂、保存剂等常用的添加剂。
而且根据疾病的种类和患者,可以制成适于其治疗的上述以外的剂型,如糖浆剂、栓剂、吸入剂、气雾剂、滴眼剂、外用剂型(软膏剂、凝胶剂、贴剂等)等。
本发明化合物优选的给药量可以根据给药对象、剂型、给药方法、给药时间等变化,为了得到所需的效果,一般对于成人可以口服有效成分量1日1~5000mg,优选100~2000mg。非口服给药(例如注射剂)的场合,由于一般用比口服给药少的量就可以达到其效果,可以认为上述口服给药量的3乃至10分之一的用量水平就足够了。
通常对于脑中风或颅脑外伤等急性病人,优选采用注射剂,如肌肉、静脉或动脉注射或滴注。对于慢性疾病,则可采取口服给药的方式以方便用药。
牛磺酸可与相应药用载体结合制备成用于缺血性脑血管病和颅脑外伤的治疗的代表性剂型总结如下表:
剂型 规格 辅料 给药途径 备注
注射剂 250mg-1000mg 注射用水或其他 肌肉注射,静脉 包括粉针剂及溶
溶媒 注射或滴注 液注射剂
片剂 250mg,500mg, 药用淀粉或其他 内服 包括糖衣片、薄
1000mg 辅料 膜衣片等
胶囊剂 250mg,500mg, 药用胶囊 内服 包括普通胶囊及
1000mg 微型胶囊
糖浆及溶液剂250mg/ml 糖浆或纯水 内服 包括其他口服液
通过下述实验证实牛磺酸的抗中枢神经系统损伤作用(抗脑缺血损伤和颅脑外伤作用)。
第一部分 牛磺酸抗脑缺血作用
I、牛磺酸抗脑缺血作用的观察及其剂量效应
一、实验材料和方法
1、实验材料:
Wistar大鼠,雄性,体重280-330g。试剂包括甲醛、苏木精、伊红、二甲苯等。牛磺酸配制:牛磺酸购自Sigma公司,用灭菌生理盐水配制0.1、1、5、50、100mg/ml浓度的牛磺酸。
2、实验方法:
1)、大鼠局灶性脑缺血模型的建立:采用大鼠大脑中动脉腔内插线的局灶性脑缺血模型,简述如下:
10%水合氯醛麻醉(10ml/kg,腹腔注射),同时给予硫酸阿托品(40μg/kg,腹腔注射),行颈正中切口,于右侧胸锁乳突肌和二腹肌之间,仔细分离颈总动脉(CCA)至颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)主干,电凝阻断ECA的分支并分离ECA至舌动脉和颌动脉分叉处,结扎ECA,分离ICA至发出翼腭动脉处,结扎翼腭动脉。动脉夹夹闭CCA和ICA,于ECA近心端穿线,疏松结扎。在ECA结扎端和近心端之间的ECA壁上剪一小口,插入尼龙线,结扎ECA近心端。缓缓插入尼龙线,约22mm,直至遇到阻力,松手后尼龙线弹回为止。
2)、组织学观察及其定量:脑缺血2h/再灌注22h后过量水合氯醛麻醉动物,在150cm水柱下经心灌注100ml生理盐水,再灌注10%福尔马林溶液400ml,然后于1分钟内取出全脑,立即浸于10%福尔马林溶液固定4天,石蜡包埋,连续切片,每间隔400μm留取连续的三张切片,厚8μm,常规HE染色,观察缺血引起的脑组织损伤,应用图象分析方法计算各切片皮层和皮质下结构梗塞灶的面积,依据下述公式计算皮层和皮质下结构梗塞灶的体积:V=∑A×d。
其中,V代表病变体积,∑A代表各切片病变的面积之和,d代表两张切片之间的距离。
3、实验设计:
1)、牛磺酸抗脑缺血作用的观察:于缺血前5min应用50mg/kg体重的牛磺酸(腹腔注射)以及HE染色方法,观察其对梗塞体积的影响。
2)、牛磺酸抗脑缺血作用的剂量-效应观察:于缺血前5min应用不同剂量的牛磺酸(0.1、1、5、50、100mg/kg体重,腹腔注射)以及HE染色方法,观察其对梗塞体积的影响。
4、统计方法:采用方差分析方法。
二、结果
1、牛磺酸抗脑缺血作用的观察:组织学定性观察发现50mg/kg体重牛磺酸可明显降低皮质、皮质下结构和半球的梗塞体积(p依次<0.01、0.05和0.01)。详见表1。
2、牛磺酸抗脑缺血作用的剂量-效应观察:组织学定性观察发现所用剂量的牛磺酸均可明显降低缺血引起的脑组织损伤,定量分析结果见表1。在0.1、1、5和50mg/kg剂量时牛磺酸可显著缩小皮层的梗塞体积(p依次<0.01,0.05,0.01和0.01),在0.1、5和50mg/kg剂量时牛磺酸可显著缩小皮质下结构的梗塞体积(p均<0.05)。除了1mg/kg剂量外,所用的剂量均可显著降低半球梗塞体积(p依次<0.01,0.01,0.01和0.05),其中,以5mg/kg剂量的作用最佳。
表1.不同剂量牛磺酸对缺血引起的梗塞灶的影响
梗塞灶(mm3)
皮层 皮质下结构 半球
缺血对照 95.08±35.16 40.78±19.68 135.86±51.79
100mg 76.07±14.84 27.75±14.36 103.82±29.00
50mg 56.39±37.61 30.07±12.39 86.46±51.40
5mg 27.97±8.39 24.83±14.19 52.80±20.08
1mg 79.37±25.65 39.65±16.24 119.02±35.03
0.1mg 59.98±26.08 22.67±8.00 82.65±32.26
II、缺血前使用牛磺酸改善缺血半暗带脑血流
一、实验材料和方法
1、实验材料:激光多普勒血流计(CPM2)及探针(CPM2,p443),余同实验I。
2、实验方法:
1)、大鼠局灶性脑缺血模型:同实验I。
2)、半暗带脑血流测定:头皮正中切口,暴露颅骨,于前囟前0.7mm,旁开4mm处,用牙钻在颅骨钻开一直径为2mm的颅窗,该点代表缺血半暗带区。利用激光多普勒血流计(美国CPM2,探头为CPM2,p443)测定半暗带区脑血流的变化,每间隔20min测定,观察时限为缺血2h及再灌注2h。
3、实验设计:分缺血对照和缺血前用药二组。缺血对照组腹腔注射生理盐水(1ml/kg体重),缺血前用药组于缺血前5min经腹腔给予牛磺酸(5mg/kg)。
4、统计方法:采用成组资料的t-检验方法。
二、结果:
与缺血对照组(n=8)相比缺血前5min应用牛磺酸(5mg/kg,腹腔注射,n=12)可改善整个缺血期间和再灌注期间半暗带的脑血流(各观察点p值依次为<0.001、0.001、0.001、0.005、0.005、0.005、>0.05、<0.01、0.005、0.005、0.002、0.01),基本消除了缺血引起的迟发性低灌流。结果见表2。
III、缺血后应用牛磺酸可改善缺血半暗带脑血流
一、实验材料和方法
1、实验材料:同实验II。
2、实验方法:同实验II。
3、实验设计:分缺血对照和缺血后用药二组。缺血对照组腹腔注射生理盐水(1ml/kg体重),用药组于缺血后1h经腹腔给予牛磺酸(5mg/kg)。
4、统计方法:采用成组资料的t-检验方法。
二、结果:
缺血后1h应用牛磺酸可改善半暗带缺血80和100min时的脑血流及再灌注40min和120min时的脑血流(缺血对照组:n=9,牛磺酸组:n=8,p依次<0.05,0.05,0.05和0.01),缩短缺血后迟发性低灌注的持续时间。结果见表3。
表2.缺血前应用牛磺酸对半暗带脑血流的影响
基线 CI 20min CI 40min CI 60min CI 80min CI 100min CI 120min |
缺血对照 100±0 22.74±5.56 22.91±7.12 25.27±5.34 29.32±6.7 29.25±5.37 31.52±7.43 |
牛磺酸 100±0 45.59±6.92 46.49±9.11 43.66±10.63 46.22±16.97 46.71±16.75 46.48±13.14 |
P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.005 <0.005 <0.005 |
基线 R20min R40min R60min R80min R100min R120min |
缺血对照 100±0 89.43±20.71 69.28±23.44 66.60±13.69 66.92±12.51 65.81±17.34 66.78±18.13 |
牛磺酸 100±0 94.13±18.80 107.04±36.37 95.44±23.86 94.12±23.25 99.05±24.20 106.49±40.79 |
P值 >0.05 <0.01 <0.005 <0.005 <0.002 <0.01 |
CI:脑缺血,R:再灌注
表3.缺血后应用牛磺酸对半暗带脑血流的影响
基线 CI 20min CI 40min CI 60min CI 80min CI 100min CI 120min |
缺血对照 100±0 22.74±5.56 22.91±7.12 25.27±5.34 29.32±6.7 29.25±5.37 31.52±7.43 |
牛磺酸 100±0 24.38±8.54 27.08±10.68 30.28±10.41 39.47±13.07 38.12±9.09 35.61±7.84 |
P值 >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 <0.05 >0.05 |
基线 R20min R40min R60min R80min R100min R120min |
缺血对照 100±0 89.43±20.71 69.28±23.44 66.60±13.69 66.92±12.51 65.81±17.34 66.78±18.13 |
牛磺酸 100±0 82.93±16.55 92.54±23.06 67.89±32.41 68.16±32.41 84.12±23.11 93.81±22.72 |
P值 >0.05 <0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.01 |
CI:脑缺血,R:再灌注
IV、牛磺酸降低缺血引起的脑组织水肿和血脑屏障(BBB)的破坏
一、实验材料和方法
1、实验材料:同实验I。
2、实验方法:
1)、大鼠线栓法局灶性脑缺血模型:同实验I。
2)、脑组织水分含量测定:采用湿重-干重法测定缺血半球水分含量的百分比,以确定牛磺酸对缺血引起的脑组织水肿的影响。待再灌注2h后,立即取出全脑,分离缺血半球,用电子天平测定其重量(湿重),将缺血半球置于120℃烤箱24h,干燥冷却后再用电子天平测定其重量(干重),依据下述公式计算脑组织水分的含量:
脑组织水分的含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100
3)、BBB破坏测定:在缺血2h/再灌注2h后经股静脉给予3%伊文氏蓝(2ml/kg,生理盐水配制),平衡3h后以150cm水柱经心灌注肝素生理盐水(肝素含量为5U/ml)100ml,再灌注10%福尔马林溶液100ml,然后断头取出全脑,振动切片机每间隔2mm切片,利用图象分析软件测定脑组织蓝染部分的体积,代表BBB破坏的体积。
3、实验设计:
1)、牛磺酸对脑组织水分含量的影响:分缺血对照、缺血前用药和缺血后用药三组。在缺血前用药组,牛磺酸(5mg/kg)于缺血前5min经腹腔给药,缺血后用药组牛磺酸于缺血后1h经腹腔给药。
2)、牛磺酸对BBB破坏的影响:分组同上。
4、统计方法:采用方差分析方法处理数据。
二、结果
1、牛磺酸对缺血半球水分含量的影响:缺血前5min和缺血后1h应用牛磺酸可明显降低缺血半球水分含量(缺血对照组:n=7,缺血前用药组:n=8,缺血后用药组:n=9,p依次<0.01和0.05)。结果见表4。
表4.牛磺酸对缺血引起的脑组织水分含量的影响
对照 缺血前 缺血后
脑组织水分含量(%) 80.4±0.51 79.24±0.47** 79.60±0.48*
与对照相比:*:p<0.05,**:p<0.01
2、牛磺酸对BBB破坏的影响:结果见表5。从结果看,缺血前应用牛磺酸可明显降低皮质、皮质下结构和半球的BBB的破坏(缺血对照组:n=9,缺血前用药组:n=12,p依次<0.01、0,05和0.01),缺血后应用牛磺酸可降低皮质和半球的BBB的破坏(缺血对照组:n=9,缺血后用药组:n=8,p均<0.05),虽然它也降低皮质下结构的BBB破坏,但无统计学意义。
表5.牛磺酸对缺血引起的血脑屏障破坏的影响
Evan′s蓝蓝染的脑组织体积(mm3) | |
皮质 皮质下结构 半球 | |
对照 | 137.57±54.12 63.29±33.74 200.86±78.09 |
缺血前 | 41.28±31.27** 19.42±8.51* 60.70±33.83** |
缺血后 | 90.33±40.31* 33.78±22.91a 124.11±49.92* |
与对照相比:*:p<0.05,**:p<0.01,a:p>0.05
V、牛磺酸抗脑缺血作用时间窗观察
一、实验材料和方法
1、实验材料:同实验I。
2、实验方法:同实验I。
3、实验设计:牛磺酸抗脑缺血作用的时间窗观察:依据剂量-效应实验结果,选择5mg/kg体重剂量,于缺血前5min、缺血后1h、2h、4h、8h应用(腹腔注射),观察牛磺酸对梗塞体积的影响,确定牛磺酸抗大鼠局灶性脑缺血的时间窗。
4、统计方法:采用方差分析方法。
二、结果:
组织学定性观察发现缺血后8h内应用牛磺酸可降低缺血引起的脑组织损伤,定量分析结果见表6。在缺血后2h应用这一剂量时它可明显降低皮质和皮质下结构的梗塞体积(p均<0.01),在4h应用仍具有抗脑缺血作用(p≈0.05)。
上述实验结果说明牛磺酸具有明确的抗局灶性脑缺血及再灌注损伤作用,它可改善区域性脑血流、降低缺血性脑组织水肿和缺血引起的血脑屏障的破坏,减轻缺血性脑组织损伤,缩小梗塞体积。从剂量-效应研究的结果看,以5mg/kg体重的效果最佳,从治疗时间窗的研究看,在缺血后8h应用牛磺酸可降低梗塞体积,但无统计学意义,这可能与样本量有关,在缺血后4h应用牛磺酸可明显降低梗塞体积(p≈0.05)。因此,本研究不仅表明牛磺酸可作为一种有效的抗脑缺血药物,而且为牛磺酸的临床应用提供了实验依据。
表6.不同缺血时间应用牛磺酸对缺血引起的梗塞灶的影响
梗塞灶(mm3) | |
皮层 皮质下结构 半球 | |
缺血对照 | 95.08±35.16 40.78±19.68 135.86±51.79 |
缺血前 | 27.97±8.39 24.83±14.19 52.8±20.08 |
缺血后1h | 63.48±25.35 23.32±9.96 86.8±33.79 |
缺血后2h | 65.57±23.06 24.27±4.46 89.84±24.39 |
缺血后4h | 73.46±14.30 29.19±7.65 102.65±21.53 |
缺血后8h | 77.7±27.58 34.2±6.37 111.91±32.62 |
第二部分 牛磺酸抗颅脑外伤作用
I、外伤后即刻应用牛磺酸可改善损伤周围区脑血流
一、实验材料和方法
1、实验材料:
Wistar大鼠,雄性,体重270-320g。牛磺酸配制:牛磺酸购自湖州生化试剂公司,依据牛磺酸抗脑缺血作用的剂量-效应研究结果,选用5mg/ml浓度的牛磺酸(用灭菌生理盐水配制)。
2、实验方法:
1)、大鼠颅脑外伤模型的建立:采用大鼠大鼠自由落体的颅脑外伤模型,简述如下:10%水合氯醛麻醉(10ml/kg,腹腔注射),同时给予硫酸阿托品(40μg/kg,腹腔注射),行头皮正中切口,分离组织至颅骨,于右侧人字缝前后用牙钻开一颅窗,直径为7mm,注意保持硬膜完整。用一铁球,于80cm高处以自由落体运动打击颅窗,打击速度为4m/s。
2)、外伤周围区脑血流测定:于所开颅窗的后缘(位置:前囟后4mm,旁开4mm)利用激光多普勒血流计(美国CPM2,探头为CPM2,p443)测定损伤周围区脑血流的变化,每间隔20min测定,观察时限为外伤后4h。
3、实验设计:分外伤对照和外伤后即刻用药二组。损伤对照组腹腔注射生理盐水(1ml/kg体重),外伤后即刻用药组于外伤后即刻经腹腔给予牛磺酸(5mg/kg)。
4、统计方法:采用方差分析方法。
二、结果:
与外伤对照组相比,外伤后即刻应用牛磺酸(5mg/kg,腹腔注射)可明显改善外伤后损伤周围区脑血流,详细结果见表7。
表7.外伤后即刻应用牛磺酸对损伤周围区脑血流的影响
基线1 | 基线2 | I1 | I2 | I3 | I4 | I5 | I6 | |
对照(n=9) | 100 | 99.61±4.94 | 28.31±10.52 | 28.03±15.24 | 22.29±10.48 | 23.13±16.28 | 18.59±8.96 | 21.41±8.32 |
即刻用药(n=8) | 100 | 103.53±8.68 | 42.02±19.55 | 38.01±16.87 | 36.64±12.44 | 30.75±12.68 | 50.34±32.22 | 44.06±19.14 |
P值 | - | - | >0.05 | >0.05 | <0.05 | >0.05 | <0.05 | <0.01 |
(表7续)
基线1 | 基线2 | I7 | I8 | I9 | I10 | I11 | I12 | |
对照(n=9) | 100 | 99.61±4.94 | 19.91±8.165 | 18.42±6.73 | 18.66±9.54 | 21.82±9.06 | 20.05±7.52 | 22.48±9.59 |
即刻用药(n=8) | 100 | 103.53±8.68 | 52.25±36.39 | 52.43±28.87 | 53.05±27.67 | 41.93±23.27 | 41.12±20.70 | 46.01±24.03 |
P值 | - | - | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
I:颅脑损伤
II、损伤后1h应用牛磺酸可改善损伤周围区脑血流
一、实验材料和方法
1、实验材料:同第二部分实验I。
2、实验方法:
1)、大鼠自由落体颅脑外伤模型:同第二部分实验1。
2)、半暗带脑血流测定:同第二部分实验I。
3、实验设计:分损伤对照和损伤后1h用药二组。缺血对照组腹腔注射生理盐水(1ml/kg体重),用药组于损伤后1h经腹腔给予牛磺酸(5mg/kg)。
4、统计方法:采用方差分析方法。
二、结果:
与外伤对照组相比,损伤后1h应用牛磺酸可明显改善损伤周围区脑血流,详细结果见表8。
表8.外伤后1h应用牛磺酸对损伤周围区脑血流的影响
基线 | 基线2 | I1 | I2 | I3 | I4 | I5 | I6 | |
Control(n=10) | 100 | 100.01±4.82 | 29.19±10.29 | 28.38±14.41 | 25.45±14.05 | 25.19±16.66 | 18.40±8.46 | 22.30±8.33 |
1h后用药(n=9) | 100 | 99.66±6.32 | 35.89±19.49 | 28.01±8.10 | 26.09±5.49 | 43.66±27.90 | 47.93±25.89 | 49.19±33.90 |
P值 | - | - | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.01 | <0.05 |
基线 | 基线2 | I7 | I8 | I9 | I10 | I11 | I12 | |
Control(n=10) | 100 | 100.01±4.82 | 19.86±7.69 | 18.36±6.36 | 18.76±9.00 | 21.75±8.54 | 20.17±7.10 | 22.33±9.06 |
1h后用药(n=9) | 100 | 99.66±6.32 | 48.73±27.51 | 47.05±33.09 | 47.94±35.31 | 50.46±28.23 | 46.33±22.17 | 43.98±25.44 |
P值 | - | - | <0.01 | <0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.01 | <0.05 |
I:颅脑损伤
III、牛磺酸降低颅脑外伤引起的脑组织水肿和BBB的破坏
一、实验材料和方法
1、实验材料:同第一部分实验IV。
2、实验方法:
1)、大鼠自由落体颅脑外伤模型:同第二部分实验I。
2)、脑组织水分含量测定:采用湿重-干重法测定全脑水分含量,方法同第一部分实验IV。
3)、BBB破坏测定:同第一部分实验IV。
3、实验设计:
1)、牛磺酸对脑组织水分含量的影响:分外伤对照、外伤后即刻用药和外伤后1h用药三组。对照组于外伤后即刻经腹腔给予生理盐水(1ml/kg),在外伤后即刻用药和外伤后1h用药二组,分别于外伤后即刻和1h时经腹腔给予牛磺酸(5mg/kg)。
2)、牛磺酸对BBB破坏的影响:分组同上。
4、统计方法:采用方差分析方法处理数据。
二、结果
1、牛磺酸对外伤后全脑水分含量的影响:损伤后即刻和损伤后1h应用牛磺酸可明显降低外伤引起的全脑水分含量(外伤对照组:n=13,外伤后即刻用药组:n=8,外伤后1h用药组:n=9,p依次<0.01和0.05)。结果见表9。
表9.牛磺酸对外伤引起的脑组织水分含量的影响
脑组织水分含量(%)
对照 | 78.02±0.31 |
即刻用药 | 77.66±0.20** |
1h后用药 | 77.70±0.17* |
与对照组相比:*:p<0.05,**:p<0.01。
2、牛磺酸对外伤引起的BBB破坏的影响:结果见表10。从结果看,外伤后即刻和1h应用牛磺酸可明显降低外伤引起的BBB的破坏(外伤对照组:n=10,外伤后即刻用药组:n=10,外伤后1h用药组:n=9,与对照组相比,p均<0.01)。
表10.牛磺酸对外伤引起的血脑屏障破坏的影响
组别 | Evan′s蓝蓝染的脑组织体积(mm3) |
对照 | 204.03±37.17 |
外伤后即刻 | 100.35±28.04* |
外伤后1h | 129.30±56.58* |
与对照组相比:*:p<0.01.
从上述实验结果看,牛磺酸具有明确的抗实验性脑缺血及颅脑外伤作用,因此,它可以用作为一种新的抗神经系统损伤药物。
Claims (6)
1.牛磺酸在制备以0.1mg/kg体重-50mg/kg体重的剂量治疗涉及缺血性脑血管病或颅脑外伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,所述缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作、腔隙性梗塞、脑血栓形成、脑栓塞、脑动脉盗血综合症。
3.根据权利要求1或2之一所述的应用,其中所述药物在脑血管缺血前或缺血后8小时内使用。
4.根据权利要求1或2所述的应用,所述药物是用于治疗颅脑外伤的药物。
5.根据权利要求4所述的应用,其中所述颅脑外伤包括脑震荡、脑挫裂伤和颅内血肿。
6.权利要求1或2的应用,其中牛磺酸的用量为5mg-50mg/kg体重。
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