CN1147270A - 鉴定隐球菌病高危发性的免疫减弱病人的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴定隐球菌病高危发性个体的方法，其步骤包括测定所述个体的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖IgG抗体的水平。本发明还提供了多种检测血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的方法，和一套用于测定免疫减弱个体的血清中存在抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的试剂盒。

Description

鉴定隐球菌病高危发性的免疫减弱病人的方法
发明领域
本发明主要涉及免疫学、传染病及AIDS研究。更具体地说，本发明涉及一种新的鉴定具有隐球菌病高危发性的AIDS或其它免疫抑制的病人的方法。
相关技术的说明
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的突出特征之一是，实际上大多数死亡并不是由人免疫缺陷病毒(HIV)本身造成的。实际上，大多数死亡是由机会原生动物、真菌、细菌和病毒引起的，而这些病原体对正常的、健康人几乎是不致病的。最常见的机会感染由卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、鼠弓形体(Toxoplasmagondii)、spp分枝杆菌(Mycobacterium spp)、人巨细胞病毒和酵母新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)引起。
新型隐球菌是一种广泛存在于我们周围的酵母。很多人都可能被这种酵母感染，但他们的免疫系统能够防止出现明显的疾病。免疫功能的丧失很可能导致这种酵母由原先的潜伏部位(可能是肺)扩散到血液，最后到脑膜。
在AIDS病人的护理方面已有一些进步。病人寿命几乎延长了一倍，而且生存质量也有所改善。在治疗AIDS病人方面最大的进步是预防性使用抗生素来防止肺囊虫性肺炎。对所有的AIDS病人进行抗肺囊虫病预防是一种有效的方法，因为大多数(70％)AIDS病人可能出现肺囊虫性肺炎。
在AIDS病人中进行预防性隐球菌病治疗有很大的潜力，但是此方法必须不同于用于治疗卡氏肺囊虫的方法。5至15％的AIDS病人可能发生隐球菌病。如果只有5至15％的AIDS病人出现了隐球菌病，而对所有AIDS病人进行隐球菌病的预防性治疗是不现实的。取而代之的是，对AIDS病人的预防性治疗将依赖于开发一种鉴定出最具隐球菌病发病危险性的AIDS病人的方法。
现有技术缺乏鉴定最可能发生隐球菌病的AIDS或其它严重免疫减弱病人的有效手段。本发明满足了本领域这一长期以来的需求。
                         发明概述
在本发明的一个实施例中，提供了一种鉴定具有出现隐球菌病危险性的个体的方法，其步骤包括测定所述个体血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖(glucuronoxylomannan)抗体的水平。
在本发明的另一实施例中，提供了将多糖葡糖醛酸木糖聚甘露糖与固相偶联的方法，此方法可用于分析与抗原结合的抗体，其步骤包括在pH约8.5时用苯醌激活多糖；在pH约7.5时将活化的多糖与疏水性配基偶联；在pH约7.0时使修饰的GXM与所述的固相结合。
在本发明的另一实施例中，提供了一种检测血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的方法，其步骤包括：将涂有抗原的微滴板格与以PBS-Tween稀释的血清一起在25℃孵育90分钟；从格中去除病人血清，并用PBS-Tween洗涤所述格以去除未结合的抗体；洗涤后的格与稀释的对人IgG具有特异性的酶结合抗体一起在25℃孵育30分钟；从格中去除酶结合抗体，并通过用PBS-Tween洗格去除未结合的酶结合抗体；加入酶结合抗体的合适底物，然后在25℃孵育30分钟；加人终止溶液，并测定酶产物的光密度。
在本发明的另一实施例中，提供了一套试剂盒(kit)，它用于分析隐球菌病危发病人血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的存在，它包括一种固体相；一种能使葡糖醛酸木糖聚甘露糖与固相疏水性结合的疏水性配基；一种酶指示剂系统；和针对酶联抗体的合适底物。
在本发明的另一实施例中，提供了一种治疗隐球菌病危发个体的方法，其步骤包括：测定所述个体血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体水平；给以抗新型隐球菌剂。
为了公开，以下给出本发明优选实施例的说明，由此可明了本发明的其它方面及进一步的内容、特征和优点。
                        附图简述
为了达到或详细理解上述本发明的特征、优点、目的及将会看到的其它内容，对被简要概括如上的本发明的更为具体的说明将参考某些特定的实施例，所附的附图中对这些实施例进行了描述。这些附图构成说明书的一部分。但是必须指出，附图描述的是本发明的优选实施例，所以不应理解为限制了实施的范围。
图1显示涂覆缓冲液制剂对125I-标记的酪胺化葡糖醛酸木糖聚甘露糖(T-GXM)与Immulon I板结合的影响。数据表示为加入不同量的T-GXM后的结合T-GXM量(图左)或加入的与测试格结合的T-GXM百分比(图右)。T-GXM被稀释在0.05M的碳酸盐缓冲液(上图)、磷酸盐缓冲液(中图)或柠檬酸盐缓冲液(下图)中。缓冲液的使用为，原缓冲液(三角)，补充0.1M的NaCl(方块)或补充0.95M的NaCl(圆形)。所示结果是4个重复格的平均值。
图2显示孵育时间和温度对T-GXM与Immulon I板结合的影响。将结合动力学绘制成各时间间隔的结合量(左图)或准一级图，图中的Ao为期望的最大T-GXM结合量，A为各时间段的实得结合能力。测试格在4℃(圆形)、20℃(方块)或37℃(三角)，与100μl的10μg/ml放射性标记的酪胺化GXM的磷酸盐涂覆缓冲液溶液(含0.95M NaCl)一起孵育不同的时间。所示结果是3个重复格的平均值。
图3显示保存时间和条件对T-GXM在Immulon I微滴板上滞留的影响。测试格被涂以T-GXM，然后(i)用PBS-Tween洗涤并干燥保存(圆形)，(ii)用PBS-Tween洗涤后再水洗，然后干燥保存(方块)或(iii)用PBS-Tween洗涤后PBS-Tween覆盖保存(三角)。在所示的保存时间后，测试格全部用PBS-Tween洗涤，然后测定结合T-GXM的量。所示结果是4个重复格的平均值。
图4显示40个正常成年供者血清中的抗GXM抗体。每一点代表一份进行带IgG、IgM或IgA重链或κ或λ轻链抗体分析的血清样品。
图5显示的是正常人血清中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类的抗GXM抗体分析。被选用于分析的血清其抗GXM IgG抗体效价≥1/50。
图6显示由HIV感染发展至AIDS不同阶段获得的血清中抗GXM抗体的产生与特征。血清取自10个CD4计数＞500/μl的HIV阳性患者(图左)，20个CD4计数为200至499/μl的患者(图中)和10个CD4计数＜200/μl的患者(右图)。
                  本发明的详细说明
根据本发明，“免疫减弱”指病人体内T淋巴细胞功能的丧失提高了病人对传染性隐球菌病的易感性。
新型隐球菌是一种被多糖被膜所包围的机会性酵母。被膜的主要结构成份是一种多糖，被称为葡糖醛酸木糖聚甘露糖(GXM)，由甘露糖、木糖、葡糖醛酸和O-乙酰基构成。抗被膜和/或抗GXM抗体具有多种生物活性，其中包括补体结合，对小鼠腹膜巨噬细胞和人中性白细胞吞噬作用的调理素作用，加强人天然杀伤细胞的抗隐球菌病活性、和利用被动免疫体内清除隐球菌。
带负电的被膜多糖，例如隐球菌的GXM，与常用于固相免疫分析的聚苯乙烯微滴板的粘附性很差。有报道的促进多糖与聚苯乙烯结合从而可进行抗被膜抗体测定的现有技术方法包括：(i)将微滴板预涂以聚-L-赖氨酸，它可与带负电的多糖形成多个静电键；(ii)将多糖与聚-L-赖氨酸共价偶联，然后与聚苯乙烯微滴板结合；(iii)将多糖与能够极大地加强粘附的酪胺共价偶联；(iV)将带负电的多糖与带正电的甲基化蛋白质复合；(V)将多糖与固相衍生的蛋白质共价偶联或先与蛋白质偶联再将其加入聚苯乙烯微滴板；(Vi)生物素标记多糖，然后与涂有亲和素的微滴板结合；(vii)多糖在促进固定化的涂覆条件下被动结合。
多糖与促进固定的反应试剂的共价偶联通常涉及为与含氨基的化合物连接而活化多糖。活化步骤包括(i)用溴化氰处理多糖，在多糖的羟基位置引入活性基团，多数可能为亚氨碳酸酯和氰酸酯；(ii)多糖的限制性高碘酸氧化作用以产生能与合适的亲核物质缩合的醛基；(iii)氰脲酰氯处理多糖。
苯醌活化作用比其它方法(例如溴化氰活化作用)具有突出的优点，因为活化作用可以在pH≤8.5时完成。隐球菌多糖被O-乙酰基所修饰，这些基团易于被溴化氰活化所需的更高的碱性pH或高碘酸氧化的多糖与氨基偶联时常用的硼氢化钠所产生的碱性pH水解。
本发明引入了酪胺与苯醌活化的多糖的偶联，并明确了有利于酪胺化GXM(T-GXM)与聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板结合的条件。
本发明说明了：(i)在对-组正常成年志愿者中抗GXM抗体的产生几率和免疫球蛋白种类的描述；(ii)在正常志愿者血清中发现的IgG抗体亚类的测定；(iii)有关HIV感染向AIDS的发展伴随着对抗GXM抗体的量与质的影响的测定。本发明显示，有些正常受试者具有高浓度的抗GXM IgG，而基本上所有受试者中都易测得抗GXM IgM。抗被膜IgG主要为IgG2亚类，但在有些个体的血清中出现有IgG1抗体。最后，HIV感染向AIDS的发展伴随着IgM类抗GXM抗体的选择性丧失；但是，几乎没有或完全没有IgG类抗GXM抗体的丧失。
在本发明中，提供了一种鉴定出现隐球菌病的高危发性个体的方法，其步骤包括测得所述个体血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体水平。还提供了一种治疗隐球菌病高危发性个体的方法，其步骤包括：测得所述个体血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体水平；然后给以抗新型隐球菌剂。
很明显，本发明的方法虽然能够施用于全部个体，但最理想的是用于由于免疫减弱而易于出现隐球菌病的个体。通常，可对所有具有T淋巴细胞功能缺陷或抑制的个人实施本发明的方法。一种免疫减弱个体是被人免疫缺陷病毒感染的个体。另一种是处于某种病理生理学状态的免疫减弱个体，这种病理生理学状态选自获得性免疫缺陷综合征、使用超生理剂量的肾上腺皮质激素、结节病和淋巴癌。
通常，本发明方法测得选定个体的血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体水平。较好的是，被测的抗体是IgG。
本发明还提供了一套用于测定免疫减弱个体的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体存在的试剂盒，它包括某种固体相；能使GXM与固相疏水性结合的疏水性配基；酶指示剂系统；酶联抗体的合适底物。
在本发明提供的试剂盒的使用中，隐球菌葡糖醛酸木糖聚甘露糖被固定在固相上，从而无需修饰、封闭或降解能被抗隐球菌抗体识别的表位就能使GXM与固相牢固结合。通常，固相可以是能够与GXM结合的任何一种。较好地固相是聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板；其它固相为硝酸纤维素或其它形式的纸、磁性珠或塑料插棒。
较好的固定化方式是GXM与能够使GXM与固相疏水性结合的疏水性配基偶联。此疏水性配基必须不被人血清中的抗体所识别。酪胺是较为理想的配基。GXM与疏水性配基的结合必须是共价的，而且其进行方式不能使对碱敏感的0-乙酰基侧链水解。利用本发明的概括内容，本领域的熟练技术人员将很容易发现涂覆微滴板的最佳抗原浓度，以及涂覆微滴板的最佳pH和最佳温度。
本发明的试剂盒还包括一套酶指示剂系统，例如对人IgG重链具有特异性的抗体。较好的是，抗体是辣根过氧化物酶标记的山羊(或绵羊)抗体。其它酶指示剂系统是本领域所熟知的。通常，还包括一种酶联抗体的合适底物。这种底物的图1显示，将GXM加入碳酸盐或磷酸盐缓冲液中时，有大量的GXM被结合。在碳酸盐和磷酸盐缓冲液中的最大结合约100-150ng/格。使用柠檬酸盐缓冲液使得结合量显著下降，观察到的最大结合约50ng/格。加入NaCl至0.1M与在相同缓冲液中不加NaCl相比，显著加强了使用磷酸盐缓冲液发生的结合。与之类似的，在磷酸盐缓冲液中，用0.95M NaCl产生的结合量大大多于在相同缓冲液中使用0.1M NaCl时的。在碳酸盐或柠檬酸盐缓冲液中，提高离子强度并不产生类似的加强作用。
                      实施例5
                  时间与温度要求
对涂覆时间和温度进行了检测。加入100mμl 10μg/ml放射性标记的T-GXM磷酸盐涂覆缓冲液(含0.95M NaCl)溶液，孵育Immulon I微滴板。微滴板在4℃、20℃或37℃孵育1、2、4、8、24或48小时。洗涤微滴板并测定T-GXM结合量。
图2显示，在不同的测试时间，在20℃或37℃之间没有明显的结合水平差异。在20℃或37℃孵育48小时的结合并不明显高于在24小时观察到的。当孵育时间≥2小时，在4℃孵育的微滴板产生的结合明显少于在20℃或37℃涂覆的微滴板。因此，此后均使用在20℃用T-GXM涂覆微滴板24小时。
ln(A/A0)对时间的绘图，其中A是给定时刻的非充分结合能力，A0是总结合能力(在此定义为在20℃或37℃孵育48小时时的T-GXM结合量)，对在0℃、20℃或37℃涂覆的微滴板来说是线性的。这表明，结合的发生在各涂覆温度具有单一一级速度常数特征。4℃时的结合(准一级速度常数≈3.2×10-4)比20℃(准一级速度常数≈2.7×10-3)或37℃(准一级速度常数≈2.6×10-3)时的低得多。
                      实施例6
       T-GXM在聚苯乙烯微滴板上固定化的稳定性
为了评价T-GXM与Immulon I微滴板结合的稳定性，检测了多种洗脱剂和解离剂。测试格加入100mμl 10μg/ml放射性标记的T-GXM磷酸盐涂覆缓冲液(含0.95M NaCl)溶液，室温下孵育24小时。测试格用PBS-Tween洗涤6次，在每格中加入100μl洗脱剂，在20℃孵育1小时。测试格用PBS-Tween洗涤6次，然后测定结合的酪胺化GXM量。结果被表示成与用PBS处理的测试格相比的被去除的酪胺化GXM百分比。
表1显示，结合后的酪胺化GXM对用强解离剂洗脱具有突出的耐受性。明显的洗脱出现在用碱性缓冲液或离液序列高的盐处理时。但是，从微滴板上洗脱的T-GXM与以PBS处理的微滴板相比从不高出35％以上。
图1显示，将GXM加入碳酸盐或磷酸盐缓冲液中时，有大量的GXM被结合。在碳酸盐和磷酸盐缓冲液中的最大结合约100-150ng/格。使用柠檬酸盐缓冲液使得结合量显著下降，观察到的最大结合约50ng/格。加入NaCl至0.1M与在相同缓冲液中不加NaCl相比，显著加强了使用磷酸盐缓冲液发生的结合。与之类似的，在磷酸盐缓冲液中，用0.95M NaCl产生的结合量大大多于在相同缓冲液中使用0.1M NaCl时的。在碳酸盐或柠檬酸盐缓冲液中，提高离子强度并不产生类似的加强作用。
                      实施例5
                  时间与温度要求
对涂覆时间和温度进行了检测。加入100mμl 10μg/ml放射性标记的T-GXM磷酸盐涂覆缓冲液(含0.95M NaCl)溶液，孵育Immulon I微滴板。微滴板在4℃、20℃或37℃孵育1、2、4、8、24或48小时。洗涤微滴板并测定T-GXM结合量。
图2显示，在不同的测试时间，在20℃或37℃之间没有明显的结合水平差异。在20℃或37℃孵育48小时的结合并不明显高于在24小时观察到的。当孵育时间≥2小时，在4℃孵育的微滴板产生的结合明显少于在20℃或37℃涂覆的微滴板。因此，此后均使用在20℃用T-GXM涂覆微滴板24小时。
ln(A/A0)对时间的绘图，其中A是给定时刻的非充分结合能力，A0是总结合能力(在此定义为在20℃或37℃孵育48小时时的T-GXM结合量)，对在0℃、20℃或37℃涂覆的微滴板来说是线性的。这表明，结合的发生在各涂覆温度具有单一一级速度常数特征。4℃时的结合(准一级速度常数≈3.2×10-4)比20℃(准一级速度常数≈2.7×10-3)或37℃(准一级速度常数≈2.6×10-3)时的低得多。
                      实施例6
       T-GXM在聚苯乙烯微滴板上固定化的稳定性
为了评价T-GXM与Immulon I微滴板结合的稳定性，检测了多种洗脱剂和解离剂。测试格加入100mμl 10μg/ml放射性标记的T-GXM磷酸盐涂覆缓冲液(含0.95M NaCl)溶液，室温下孵育24小时。测试格用PBS-Tween洗涤6次，在每格中加入100μl洗脱剂，在20℃孵育1小时。测试格用PBS-Tween洗涤6次，然后测定结合的酪胺化GXM量。结果被表示成与用PBS处理的测试格相比的被去除的酪胺化GXM百分比。
表1显示，结合后的酪胺化GXM对用强解离剂洗脱具有突出的耐受性。明显的洗脱出现在用碱性缓冲液或离液序列高的盐处理时。但是，从微滴板上洗脱的T-GXM与以PBS处理的微滴板相比从不高出35％以上。
在不同保存条件下保存后测定了固定化T-GXM的稳定性。聚苯乙烯微滴板的测试格在室温下用100mμl 10μg/ml放射性标记的T-GXM磷酸盐涂覆缓冲液(含0.95M NaCl)溶液涂覆24小时。测试格用PBS-Tween洗涤，然后(i)去除PBS-Tween，干燥保存；(ii)测试格再用蒸馏水洗涤两次，干燥保存；或者(iii)100μlPBS-Tween覆盖保存。间隔不同的时间取出4个测试格，用PBS-Tween洗涤，然后测定被结合的酪胺化多糖。不论在PBS-Tween洗涤后干燥保存(半寿期≈ 46天)或PBS-Tween覆盖保存(半寿期≈47天)的微滴板都发生了T-GXM的逐渐丢失。通过蒸馏水洗涤来去除PBS-Tween使微滴板在干燥保存64天后丢失的T-GXM较少(估计半寿期＞100天)。
                              表1
              T-GXM从聚苯乙烯微滴板上的洗脱洗脱剂                                   pH   被洗脱的GXM百分比a 对PBS的P甘油(35％)                               8.0  1±11               0.83甘氨酸，0.5M HCl，0.5M HCl               2.0  -5.2±8.0           0.26硫氰酸胍，6.0M，0.05M Hepes/NaOH         7.2  19±3               ＜0.001盐酸胍，6.0M，0.05M Hepes/NaOH           7.2  22±5.6             ＜0.001H2O                                    ndb 1.9±12             0.75MgCl2·H2O(4.0M)，0.1 M Hepes/NaOH    6.3  9.2±3.4            0.02MgCl2·H2O，3.0M，0.075M Hepes/NaOH， 7.2  8.3±7.8            0.083
25％乙二醇Na2CO3(1.0M)，0.5M NaCl               11.6 31±8.4             ＜0.001NaCl(3.0M)                              nd   11±14              0.13NaI(4.0M)                               7.6  33±11              ＜0.001NH4OH(1.0M)                            11.5 18±5.7             ＜0.001PBS-0.01％Tween                         7.0  10±11              0.10PBS-1％SDS                              7.0  2.2±6.2            0.47硫氰酸钠，6.0M，0.05M Hepes/NaOH         7.2  19±8.1             0.003脲，8.0M，0.05M Tris/HCl                 8.0  9.2±17             0.66
a洗脱量计算为与只用PBS的相比，被各种洗脱剂去除的T-GXM量。以上报道的数据是5个重复测试格的平均值±SD。b表示未测定。
使用CNBr、氰脲酰氯和高碘酸氧化反应活化被膜多糖以便与酪胺偶联。本发明显示，为了酪胺化多糖以便用于免疫测试，使用苯醌活化也是一种有效手段。苯醌活化有几个与其活化步骤有关的特征。首先，进行苯醌活化的pH(≤8.5)低于其它方法所要求的。这对隐球菌多糖来说尤其重要，因为O-乙酰化是GXM的重要抗原特征之一。当pH＞8.5时，O-乙酰基很容易从多糖上脱落。其次，苯醌活化在多糖中引入了生色团，从而有助于对活化步骤的监测。
将T-GXM与聚苯乙烯微滴板结合的量与用蛋白质观察的结合量进行了比较。用含0.95M NaCl的磷酸盐缓冲液中的T-GXM涂覆，在50至100ng/cm2时开始出现结合饱和的位置。GXM的高水合性特性很容易说明用蛋白质与用T-GXM获得的结果间的差异。多糖是高水合性的，这一事实可预见，以重量分析为基础时，充满全部可及位置所需的多糖量较少。
温度可能成为影响T-GXM与聚苯乙烯结合效率的一个重要因素。在4℃时的准一级速度常数约比20℃或37℃时的结合速度常数低8倍。
本发明表明，T-GXM与聚苯乙烯结合具有突出的牢度。洗脱剂几乎都不能从微滴板上明显洗脱T-GXM。此结合强度使得微滴板能够长期保存而几乎不丢失已结合的T-GXM。酪胺基团的引入无疑使得分子更具有疏水性，同时更易被聚苯乙烯所吸引。但是，由于每mol GXM结合约30mol的酪胺，单个GXM分子结合的多价特性可能是结合强度中的一个重要因素。与疏水性部分多数位于分子内部的蛋白质不同，很可能，GXM的伸展特性使得大多数(如果不是全部)酪胺基团能够与聚苯乙烯表面结合。
                       实施例7
                   隐球菌细胞与GXM
如实施例1和2所述分离GXM。如实施例2所述使GXM与酪胺共价结合。
将活化的多糖(约4mg/ml)与等体积的盐酸酪胺(1mg/ml的0.1M磷酸钠缓冲液溶液，pH7.5)混合，室温下孵育过夜，如此进行苯醌活化的GXM与酪胺的偶联。如前所述加入乙酸钠晶体和冰醋酸，加入2倍体积95％乙醇来沉淀酪胺偶联的GXM。离心收集沉淀，以4mg/ml的浓度溶解在含0.5M NaCl的0.1M磷酸钠(pH7.5)中，然后依次对含0.5M NaCl的0.1M磷酸钠(pH7.5)和0.1M磷酸钠(pH7.5)透析。利用Dubois等在Anal.Chem.28：350-356(1956)所述的苯酚-硫酸试验来测定GXM的浓度，然后将酪胺偶联的GXM稀释成2mg/ml，过滤灭菌，保存于4℃。
                       实施例8
              对抗隐球菌抗体的ELISA测定
Immulon I微滴板(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，Va)的测试格用100ng酪胺化GXM(T-GXM)在100μl涂覆缓冲液(0.05M磷酸钠，pH7.4，含10mMEDTA)中形成的溶液在4℃涂覆过夜。测试格用封闭缓冲液(0.05M磷酸钠，pH7.4)洗涤3次，用300μl含0.05％ Tween20的封闭缓冲液封闭90分钟。涂有酪胺化GXM的微滴板用PBS-Tween(含0.05％Tween20的PBS)洗涤3次，然后用连续两倍稀释的人血清的PBS-Tween溶液孵育90分钟，起始稀释比为1∶5。作为阴性对照，将全部血清在含4μg GXM/ml的PBS-Tween中并在加入涂有酪胺化GXM(GXM中和的血清)的测试格前孵育30分钟。在用血清或GXM-中和的血清孵育后，测试格用PBS-Tween洗涤3次，用辣根过氧化物酶(HRPO)标记的第二抗体在室温下孵育90分钟。
第二抗体为HRPO标记的、亲和纯化的山羊抗人IgG重链(1/16,000；SouthernBiotechnology，Cat.no.2040-05)，HRPO标记的、亲和纯化的山羊抗人IgM重链(1/15,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2020-05)，HRPO标记的、亲和纯化的山羊抗人IgA重链(1/12,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2050-05)，HRPO标记的、亲和纯化的山羊抗人κ抗体(1/10,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2060-05)或HRPO标记的、亲和纯化的山羊抗人λ抗体(1/5000；SouthernBiotechnology，Cat.no.2070-05)。第二抗体使用时稀释8倍，使用纯IgG(抗IgG、抗κ或抗λ)、IgM(抗IgM)或IgA(抗IgA)涂覆的微滴板格产生的OD450值为2.5。微滴板用PBS-Tween洗涤3次，然后用100μl TMB Microwell过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard & Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MD)孵育30分钟。加入100μl 1M的H3PO4终止反应。用一台Ceres 900酶联免疫吸附测定仪(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)在450nm处读取30分钟内的吸光度。全部ELISA测定均重复进行，包括GXM中和对照。计算重复测试格的平均值，用不与GXM预孵育的血清获得的OD450减去用GXM中和的血清获得的OD450，计算出比OD450。用Kineticalc EIA Application Software 2.2版(Bio-Tek Instruments，Inc.)以滴定度众数分析数据。用4参数计算法测定数据的最佳拟合，并将滴定度阈值设定为0.5。在此条件下，将产生的OD450为0.5(对背景(GXM中和的)进行了校正)的血清稀释比作为终点。将血清稀释比为1/5时OD450低于0.5的血清作为阴性。以鼠单克隆IgG1抗体为标准物，约500pg抗体产生的OD450为0.5。
对上述ELISA测定进行修改，将其用于测定抗GXM IgG抗体的IgG亚类。在此修改后的测定中，用GXM涂覆微滴板，如前所述，用血清稀释液或稀释在含GXM的PBS-Tween中的血清孵育。测试格在洗涤后与以最佳稀释比稀释的针对人IgG1(1/2,000；Calbiochem，La Jolla；Cat no.411451)、IgG2(1/8000；Calbiochem，La Jolla；Cat no.411461)、IgG3(1/40,000；Calbiochem，La Jolla；Catno.411481)或IgG4(1/1500；Calbiochem；Cat no.411492)的鼠单克隆抗体在室温下孵育90分钟。然后如前所述，用PBS-Tween洗涤微滴板，用100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1/4500；Southern Biotechnology Assoc.，Inc.；Cat.no.1030-05)孵育，洗涤后，用底物孵育。报道的结果为对背景(GXM中和的)进行了校正的，产生的OD450为0.5的血清稀释比。
                       实施例9
     正常供者的血清中抗GXM抗体的产生与免疫球蛋白种类
对血清进行检查，测定IgG、IgM和IgA抗体的水平。血清获得自40个正常的成年志愿者。还检查估定了具有κ或λ轻链的抗体的产生与水平。图4显示，28％的血清具有效价≥1/10的IgG抗体，98％的血清具有效价≥1/10的IgM抗体，只有一份血清样品具有效价≥1/10的IgA抗体。99％的血清具有效价≥1/10的带κ链抗体，45％的血清具有效价≥1/10的带λ链抗体。
对IgG抗体效价＞1/50的的5份血清进行了进一步的检测，以测定抗GXM IgG抗体的IgG亚类。结果(图5)显示，每份血清中都含有可测量的IgG2亚类的抗GXM抗体。其中两份血清还含有可测量的IgG1抗体。全部血清都不含可测量的IgG3或IgG4亚类的抗GXM抗体。
                    实施例10
        HIV阳性供者的血清中抗GXM抗体的特征
对病人血清中具有各种重链及轻链同种型的抗GXM抗体的产生几率和水平进行检测，这些病人为(i)HIV阳性，CD4数量≥500细胞/ml；(ii)HIV阳性，CD4数量为200至499细胞/mi；(iii)HIV阳性，CD4数量＜200细胞/ml。阳性效价定义为抗体效价≥1/10。
图6显示了HIV阳性供者血清分析的结果。表II给出正常供者(图4)与HIV阳性供者(图6)之间阳性效价几率的比较。抗GXM IgG在CD4少于200的病人中出现几率较低。但是，这一差别并不显著。正常受试者中的IgG类抗GXM抗体的产生几率显著高于HIV阳性供者，这与CD4水平无关。与之类似的，HIV阳性供血者中的具有κ轻链的抗GXM抗体产生几率显著低于正常受试者中的。如果用实际抗体水平而不是用效价≥1/10的受试者的出现几率进行比较，可能会发现其它差异。最后，利用Mann-Whitney级数总数测试对各受试组中的个体效价进行了比较。除了一个例外，用后一测试测得的明显差异与根据阳性效价的几率来评价数据时所发现的相同。这一个例外是，在CD水平低于200的HIV阳性病人血清中发现了显著(P≤0.01)的抗体(带λ轻链)效价抑制(与正常受试者相比)。
                         表II
正常供者的血清和具有不同CD4水平的HIV阳性个体的血清中各种免疫球蛋白种类的抗GXM抗体
抗体种类    正常血清          HIV阳性，CD4＞500
           阳性1/总数     阳性/总数    对正常的P2
IgG          11/40          5/10         ＝0.27
IgM          39/40          5/10         ＜0.001
IgA          1/40           0/10         ＞0.99
κ                        39/40          3/10         ＜0.001
λ                        19/40          6/10         ＝0.51  抗体      HIV阳性，C1)4200-499        HIV阳性，CD4＜200
      阳性/总数    对正常的P2  阳性/总数     对正常的P2IgG     6/20           ＞0.99       1/10          ＝0.42IgM     7/20           ＜0.001      4/10          ＜0.001IgA     1/20           ＞0.99       0/10          ＞0.99κ              2/20           ＜0.001      1/10          ＜0.001λ              8/20           ＝0.78       5/10          ＞0.99
1将比抗体效价≥1/10的血清归为阳性。
2利用Fisher Exact测定进行的统计学分析。
                          实施例11
                 对AIDS病人血清的回顾性分析
本发明提供了一种高敏感性的测定方法，用于检测能够与新型隐球菌的主要被膜多糖反应的抗体。本发明的方法能够测定潜伏感染的存在，因为此种酵母留下了一个IgG抗体形式的“印迹”，此抗体能够与多糖反应。这样，抗体的存在指示出潜伏的隐球菌感染的存在，而且由此指示出AIDS病人中的隐球菌病高发危险性。
抗体的测定
测定血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的存在，此为新型隐球菌的主要血清型特异多糖。这种多糖是包围酵母的被膜多糖的主要成份。在酶联免疫吸附测定中测定抗GXM的抗体，此测定中，将GXM固定在标准微滴板上。固定化作用要求对GXM进行某种方式的化学修饰，这种修饰作用在保留多糖的抗原结构的同时提高与微滴板牢固结合所需的疏水性。此测定使用了可使酪胺与GXM结合的苯醌偶联法。如此修饰后的多糖与聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板的结合特别牢固。
病人血清测定
采集血清，然后分为两类：当HIV感染发展为ADIS时(1)出现隐球菌病的和(2)不出现隐球菌病的HIV感染病人。出现隐球菌病组病人中测得的IgG抗体产生几率显著高于没有出现隐球菌病组的病人中测得的。
本发明提供了新的有关正常成年供者血清中抗GXM抗体的信息。正常供血者产生抗隐球菌抗体IgM的几率为98％，正常供者中产生IgG抗体的几率为28％。本发明显示了各种HIV阳性病人中IgM类抗体产生的显著降低。对于具有κ轻链的抗体也可观察到类似的产生几率的降低。相反，产生具有λ轻链的抗体的HIV阳性病人的百分比并没有降低。在HIV感染的各阶段都没有发现IgG抗体产生的明显减少。这表明，作为隐球菌病危发性标志的IgG抗体在AIDS发展过程中并不随免疫系统的衰退而丢失。
过去已发现，在HIV感染的较早期阶段出现对2型T细胞依赖性抗原的应答减弱。对肺囊虫疫苗的免疫应答的已有研究发现，在患有全身性淋巴结病的HIV阳性病人中，IgG、IgM和IgA应答减弱。所以，抗GXM IgG抗体的减少可能是因为IgG2的选择性丢失。这与被检的5份正常血清中有2份产生IgG1相一致。
正常人血清中对抗GXM抗体的抗原刺激尚不清楚。抗体可能是受在环境中遇到的交叉反应性抗原的刺激。能够与几种细菌的被膜反应的“天然”抗体被认为与不致病的肠道或鼻咽微生物抗原接触有关。葡糖醛酸和O-乙酰基是许多多糖的常见组份。所以，有可能，广泛存在的抗GXM IgG抗体能够与这些成份中的一种反应。另一方面，木糖虽然常见于植物中，但并不特征性地常见于细菌的被膜中。IgG抗GXM抗体可能表明与实质性的或亚临床表现的感染状态的隐球菌接触。这样，抗GXM IgG抗体将成为潜伏的隐球菌感染以及HIV感染病人或其它免疫减弱病人中隐球菌病发病危险性提高的标志。
本说明书中提到的专利和公开文献都表明了本发明所涉及领域中熟练技术人员的研究水平。所有的专利和公开文献在此均作了相同程度的引用与参考，每一篇文献都被具体、单独地说明，以在此引用参考。
本领域中熟练技术人员将很容易理解，本发明适合于实现本发明的目的，并获得文中提到或其它隐含的效果和优点。本文中描述的实施例以及方法、步骤、治疗方法、分子和具体化合物在本文中代表优选实施方式，它们是举例性质的，而不是对本发明范围的限定。本领域的技术人员将能够发现其中的改变和其它用途，这些都包含在本发明权利要求所限定的范围内。

Claims (16)

1.一种鉴定隐球菌病高危发性个体的方法，其特征在于，其步骤包括测定所述个体的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的个体是免疫减弱的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述的免疫减弱个体处于某种病理生理学状态，这种状态选自：获得性免疫缺陷综合征，超生理剂量的肾上腺皮质激素，结节病和淋巴癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的个体感染了人免疫缺陷病毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的抗体为IgG。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述的IgG抗体是IgG1或IgG2亚类的抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过酶联免疫吸附测定来测定其中所述的抗体。
8.用于测定隐球菌病高危发性个体的血清中存在抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的试剂盒，其特征在于，它包含某种固体相；能够使GXM与固相疏水性结合的疏水性配基；酶指示剂系统；和酶联抗体的合适底物。
9.一种检测血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的方法，其特征在于，其步骤包括：
用稀释在PBS-Tween中的血清在25℃与涂有抗原的微滴板测试格一起孵育90分钟；
从测试格中去除病人的血清，用PBS-Tween洗涤所述的测试格以去除未结合的抗体；
洗涤后的测试格用对人IgG具有特异性的稀释的酶联抗体在25℃孵育30分钟；
通过PBS-Tween洗涤从测试格中去除酶联抗体；
加入酶联抗体的合适底物，然后在25℃孵育30分钟；
加入终止溶液，然后测定酶产物的光密度。
10.一种治疗隐球菌病高危发性个体的方法，其特征在于，其步骤包括：
测定所述个体的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗体的水平；
给以抗新型隐球菌剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的个体是免疫减弱的。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，其中所述的免疫减弱个体处于某种病理生理学状态，这种状态选自：获得性免疫缺陷综合征，超生理剂量的肾上腺皮质激素，结节病和淋巴癌。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的个体感染了人免疫缺陷病毒。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的抗体为IgG。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，其中所述的IgG抗体是IgG1或IgG2亚类的抗体。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过酶联免疫吸附测定来测定其中所述的抗体。
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