CN114717308A - 一种sfrp2甲基化检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种SFRP2甲基化检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；所述捕获寡核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；所述折叠序列与SFRP2甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5’末端序列至少部分相同；所述结合捕获序列与所检测的SFRP2甲基化位点所在的片段区域特异性结合。本发明基于甲基化依赖型限制性内切酶和通用引物荧光定量PCR技术，不需要重亚硫酸盐转化，实现了准确特异的SFRP2甲基化检测。

Description

一种SFRP2甲基化检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种SFRP2甲基化检测试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)是常见的胃肠道恶性肿瘤，随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率明显上升，严重威胁着人类健康。结肠直肠癌早期症状不明显，随着肿瘤增大而表现出排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则发展为贫血、体重减轻等全身症状。

目前，临床主要采用粪便隐血试验(FOBT)和结肠镜检查进行结直肠癌筛查。作为常规的筛查方法，FOBT易受食物、药物和其他因素的影响，假阳性率高、稳定性较差。结肠镜检查是侵入性检查手段，需要肠道准备确保大肠管腔视野良好，同时，结肠镜检查存在一系列并发症，如肠活检部位容易出现肠穿孔、腹膜炎等。因此，结肠镜检查患者依从性较差。目前急需依从性高、检测方便、结果准确的结直肠癌检测方法以提高筛查准确性。

DNA甲基化是指在不改变DNA序列的前提下，在CpG岛5’端胞嘧啶修饰甲基化基团，造成DNA表达沉默，是目前公认的肿瘤发生机制之一。DNA异常甲基化的发生通常早于细胞癌变，因此及时检测DNA甲基化可以实现恶性肿瘤的早期预警，为肿瘤的早期筛查、早期诊断、预后和治疗评估提供重要依据。

最近研究发现，SFRP2基因是肿瘤发生通路—Wnt信号通路中的可溶性调整基因之一，在大肠癌、结肠腺瘤和隐窝病灶中发生频繁的甲基化，从而使基因沉默。正常肠道黏膜每天都有大量细胞更新脱落进入肠腔，通过粪便排出体外，而大肠癌细胞的增殖代谢较正常肠道黏膜细胞更加旺盛。采取适当的方法提取粪便DNA，PCR扩增甲基化SFRP2基因并进行分析，在腺瘤和大肠癌的早期筛查领域具有重要前景。

虽然SFRP2甲基化可以作为CRC早期筛查的有效生物标记物，但是与甲基化正常的野生型基因相比，SFRP2异常甲基化的比例较低，SFRP2甲基化检测的最大难题在于如何在高野生型基因背景下检测到痕量甲基化异常基因。

重亚硫酸盐转化法是最常用的甲基化检测方法，原理是采用重亚硫酸盐处理DNA，将胞嘧啶残基转化成尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶残基不受影响，因此，重亚硫酸盐处理后的DNA片段只保留有甲基化胞嘧啶。基于此原理，重亚硫酸盐能在单个核苷酸水平上揭示DNA的甲基化情况。已有多种检测方法可以实现对重亚硫酸盐处理后DNA序列的分析，分析的实际问题就是重亚硫酸盐使碱基从C到U最终到T造成的区别。

但是，重亚硫酸盐转化法也存在诸多不足：(1)重亚硫酸盐测序需要确保重亚硫酸盐转化反应完全，即每一个未被甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，如果转化反应不完全则会出现假阳性结果；(2)由于只有单链DNA的胞嘧啶才能被重亚硫酸盐攻击，在转化前需要对DNA进行变性解链，必须严格控制温度、盐浓度等因素，否则会造成转化失败或转化不完全；(3)DNA在转化反应过程中有可能被降解，如果孵育时间过长、温度和重亚硫酸盐浓度过高，可能导致高达90％的DNA被降解，降解后的DNA脱嘌呤形成随机断裂，可能导致PCR扩增失败或DNA样本数量少，准确性低，进而出现检测假阴性；(4)重亚硫酸盐处理会显著降低样本的复杂性，使得多重PCR引物设计更加困难，误差增加。

因此，发展一种高灵敏度DNA甲基化检测方法，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，成为迫切需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种SFRP2甲基化检测试剂盒及其应用，基于甲基化依赖型限制性内切酶和通用引物荧光定量PCR技术，检测与结直肠癌密切相关的SFRP2基因特殊位点上的甲基化情况，具有不需要重亚硫酸盐转化、操作简单、准确性高和特异性强的优点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种SFRP2甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸、通用引物；

所述捕获寡核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；

所述折叠序列与SFRP2甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5’末端序列至少部分相同；

所述结合捕获序列可与所检测的SFRP2甲基化位点所在的片段区域进行特异性的结合。

优选的，所述捕获寡核苷酸还包括第二通用序列。

优选地，所述第二通用序列位于结合捕获序列的5’端。

本发明中，SFRP2甲基化检测试剂盒主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量PCR检测试剂两部分：甲基化依赖型限制性内切酶通过对SFRP2甲基化模板的甲基化位点进行酶切处理，形成5’端序列明确的中间产物；捕获寡核苷酸利用结合捕获序列捕获该中间产物，并以此作为模板进行延伸反应，在捕获寡核苷酸的3’末端添加与SFRP2甲基化基因互补的核苷酸，从而形成延伸的捕获寡核苷酸，延伸的捕获寡核苷酸通过延伸序列与分子内部的折叠序列进行完全匹配或非完全匹配的配对，形成半发夹结构产物，半发夹结构产物再进行延伸反应，在3’末端添加与分子内部的第一通用序列互补的核苷酸，进而形成完整的发夹结构产物；所述发夹式结构产物利用通用引物和/或特异性引物进行PCR扩增，结合检测探针实现了SFRP2甲基化位点的荧光定量PCR检测。

优选地，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。

优选地，所述核酸延伸阻断位点位于折叠序列的3’端。

优选地，所述核酸延伸阻断修饰有Spacer、硫代基团或尿嘧啶碱基中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述折叠序列修饰有核酸类似物，能在保证折叠区域碱基互补配对的情况下，抑制引物的合成副产物延伸，从而提高检测特异性。

优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'-O,4'-C-methylenebridge RNA、2’-O-Methyl RNA或2’-Fluoro RNA中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述通用引物的核酸序列与捕获寡核苷酸的第一通用序列相同或部分相同。

优选地，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括GlaI、FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI或MseI中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述试剂盒还包括SFRP2甲基化特异性引物。

优选地，所述试剂盒还包括检测探针。

优选地，所述检测探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。

优选地，所述荧光基团标记在检测探针的5’端。

优选地，所述淬灭基团标记在检测探针的3’端。

优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LCRED460中的任意一种。

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种。

优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs或Mg²⁺中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述试剂盒还包括酶切缓冲液和/或PCR缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括内参基因PCR引物和/或检测探针。

优选地，所述内参基因包括β-actin。

优选地，所述捕获寡核苷酸包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示的核酸序列。

优选地，所述通用引物包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示的核酸序列。

优选地，所述SFRP2甲基化特异性引物包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。

优选地，所述检测探针包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。

优选地，所述内参基因PCR引物包括SEQ ID NO:7～8所示的核酸序列。

优选地，所述内参基因检测探针包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列。

第二方面，本发明提供了一种SFRP2甲基化检测体系，所述体系包括1～20nM捕获寡核苷酸、100～400nM通用引物、100～300nM检测探针、1～2U/μL Taq聚合酶、1～2U/μLUDG酶、100～300μM dNTP、1～5mM MgCl₂和PCR缓冲液。

优选地，所述体系还包括100～300nM SFRP2甲基化特异性引物。

第三方面，本发明提供了一种SFRP2甲基化检测方法，所述方法包括：

采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测SFRP2甲基化模板进行酶切处理，将酶切处理后的产物加入第二方面所述的体系中，进行荧光定量PCR。

优选地，所述酶切处理的温度为30～40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。

优选地，所述酶切处理的时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。

优选地，所述荧光定量PCR的程序为92～95℃预变性2～5min；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火80～100s，10～15个循环；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火20～30s，30～50个循环。

第四方面，本发明提供了一种SFRP2甲基化检测装置，所述装置包括：

酶切处理单元：采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测SFRP2甲基化模板进行酶切处理，获得5’端序列明确的预处理产物；

荧光定量PCR单元：利用含有捕获寡核苷酸、通用引物、SFRP2甲基化特异性引物和检测探针的荧光定量PCR体系对预处理产物进行荧光定量PCR检测。

优选地，所述酶切处理单元提供的酶切处理温度为30～40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。

优选地，所述酶切处理单元提供的酶切处理时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。

优选地，所述荧光定量PCR单元提供的荧光定量PCR程序为92～95℃预变性2～5min；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火80～100s，10～15个循环；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火20～30s，30～50个循环。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的试剂盒、第二方面所述的体系或第四方面所述的装置在制备疾病早期诊断试剂和/或设备中的应用。

优选地，所述疾病包括肿瘤。

优选地，所述肿瘤包括结直肠癌、肝癌或食管癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的SFRP2甲基化检测试剂盒主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量PCR检测试剂两部分，不需要对甲基化样本进行连接反应、化学处理等额外步骤，仅需在PCR检测之前对样本进行预处理，得到5’端序列明确的样本，结合基于通用引物的扩增技术(Universal Primer-based Amplification，UPA)，实现了核酸的高特异、高灵敏的多重检测；

(2)本发明的SFRP2甲基化检测试剂盒中，捕获寡核苷酸与通用引物经过特殊设计，相互配合，在靶标分子存在的情况下，靶标分子触发由捕获寡核苷酸介导的延伸反应，形成发夹式结构产物，并以此作为通用引物扩增反应的模板，由于扩增反应基于5’序列确定的酶切产物，有效避免了假阳性问题；

(3)本发明中，当捕获寡核苷酸的3’延伸序列与折叠序列能够形成互补配对，才能引发捕获寡核苷酸的自我折叠形成发夹式结构，有效保证了反应的特异性；

(4)本发明的捕获寡核苷酸的折叠序列修饰有核酸类似物，能在保证折叠区域碱基互补配对的情况下，抑制引物的合成副产物延伸，从而提高检测特异性，尤其适用于高浓度非甲基化背景下目标片段的检测；

(5)本发明的SFRP2甲基化检测试剂盒在针对不同靶标分子进行检测时，只需要根据靶标分子设计捕获寡核苷酸的折叠序列和结合捕获序列，而保持第一通用序列不变，极大程度降低多重靶标扩增的多种引物间干扰，提高扩增的灵敏度；

(6)本发明的SFRP2甲基化检测试剂盒通过指数扩增过程达到信号放大的目的，不仅能很好地满足DNA/RNA检测时对灵敏度的需求，而且所述指数扩增过程仅利用延长的捕获寡核苷酸和通用引物来完成，可在保持通用引物的数量和浓度不变的前提下达到对多重靶标分子的等效扩增目的，避免了序列差异导致的扩增效率的偏差；

(7)本发明的SFRP2甲基化检测方法操作简便。

附图说明

图1为不同浓度的甲基化样本中SFRP2基因的灵敏度检测结果；

图2为采用含有2’-Fluoro RNA修饰捕获寡核苷酸的体系进行SFRP2甲基化检测结果；

图3为采用含有2’-Fluoro RNA修饰捕获寡核苷酸的体系检测掺入粪便DNA的SFRP2甲基化样本结果；

图4为采用含有2’-Fluoro RNA修饰捕获寡核苷酸的体系双重检测SFRP2和β-actin的结果；

图5为基于双通用引物扩增模型的人源DNA甲基化检测结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1人源SFRP2基因的甲基化DNA检测

本实施例采用甲基化转移酶处理的Jurkat DNA作为人源SFRP2基因甲基化阳性标准品，无核酸酶水作为阴性对照，其中CG位点为5mCG，进行SFRP2基因甲基化位点检测。步骤如下：

(1)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对阳性标准品及阴性对照进行酶切处理，反应体系为10×酶切缓冲液2μL，5U GlaI，不同浓度的基因组DNA，体系共20μL；反应条件为30℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对GlaI进行热灭活；

(2)分别向上述酶切反应体系中加入SFRP2基因捕获寡核苷酸、通用引物、特异性引物和检测探针，PCR检测SFRP2基因的甲基化状态，采取的PCR扩增体系包括酶切DNA模板、10nM捕获寡核苷酸、200nM通用引物、200nM特异性引物、200nM检测探针、1U/μL Taq聚合酶、1U/μL UDG酶、300μM dNTP、1.5mM MgCl₂和2×PCR缓冲液，终体积为20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在ROCHE仪器(480)上进行实时PCR，对相应的荧光数值进行采集；

捕获寡核苷酸(SEQ ID NO:1)：

5-TGTCAGCCAACGGTATTCATCGCGACCCCG+A+GG/spacer18/GGCCCGGGACAAGCTCGAACTC(+后面的碱基代表该碱基修饰锁核酸)；

通用引物(SEQ ID NO:2)：

5-TGTCAGCCAACGGTATTCATC；

SFRP2特异性引物(SEQ ID NO:3)：

5-CGGCCGCCTCGCCCTTC；

检测探针(SEQ ID NO:4)：

5-VIC-CTCCGCTCCCTCTGC-MGB；

人源SFRP2基因如SEQ ID NO:5所示，其中，下划线为甲基化位置，//为酶切位置：

5-GCGC//GCGACCCCGAGGGGGCAGAGGGAGCGGAGCCGGGGAAGGGCGAGGCGGCCGGAGTTCGAGCTTGTCCCGGGCCCGCTCTCTTCGCTGGG。

如图1所示为不同浓度的甲基化样本中SFRP2基因的灵敏度检测，从左至右分别为1200拷贝/反应、120拷贝/反应和12拷贝/反应的DNA甲基化阳性样本，通过qPCR曲线可以看出，扩增具有明显的浓度梯度，低至12拷贝左右的DNA甲基化模板能被酶切扩增检测到，说明该体系具有较高的灵敏度。

实施例2捕获寡核苷酸折叠区域进行2’-Fluoro RNA修饰的扩增结果

由于现有的寡核苷酸合成技术的局限，使得捕获寡核苷酸在合成过程中可能会产生序列片段不完整的副产物，在高浓度的非甲基化背景下，可能会引发非特异性扩增，本实施例通过在捕获寡核苷酸的折叠区域修饰2’-Fluoro RNA，有效抑制了残次片段造成的非特异性扩增，提高了检测特异性。

本实施例采用的阳性模板、通用引物、特异性引物、检测探针和反应条件与实施例1相同，采用的捕获寡核苷酸包括：

2’-Fluoro RNA修饰捕获寡核苷酸(SEQ ID NO:6)：

5-TGTCAGCCAACGGTATTCATCTTTGCGACCCCGAGGG/spacer18/GGCCCGGGACAAGCTCGAACTC(下划线碱基修饰2’-Fluoro RNA)；

如图2所示，采用含有2’-Fluoro RNA修饰捕获寡核苷酸的体系进行甲基化检测，120拷贝和12拷贝样本能稳定扩增，在100ng非酶切处理的基因组背景下，没有非特异性扩增，说明碱基修饰能在不影响扩增效率的条件下提高扩增特异性。

实施例3粪便样本中人源SFRP2基因的甲基化检测

本实施例采用甲基化转移酶处理的Jurkat DNA作为人源SFRP2基因甲基化阳性标准品，其中CG位点为5mCG，掺入到粪便样本DNA中，进行SFRP2基因甲基化位点检测。无模板对照采用无核酸酶水。步骤如下：

(1)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对混合样本及无模板对照进行酶切处理，反应体系为1×PCR缓冲液(购自南京诺唯赞，P122-d1)、5U GlaI、不同浓度的基因组DNA，体系共10μL；反应条件为37℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对GlaI进行热灭活；

(2)分别向上述酶切反应体系中加入SFRP2基因捕获寡核苷酸(SEQ ID NO:6)、通用引物(SEQ ID NO:2)、特异性引物(SEQ ID NO:3)和检测探针(SEQ ID NO:4)，PCR检测SFRP2基因的甲基化状态，采用的PCR扩增体系包括酶切DNA模板、10nM捕获寡核苷酸、200nM通用引物、200nM特异性引物、200nM检测探针、1U/μL Taq聚合酶、1U/μL UDG酶、300μM dNTP和1×PCR缓冲液，终体积为20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在ROCHE仪器(480)上进行实时PCR，对相应的荧光数值进行采集；

人源SFRP2基因如SEQ ID NO:5所示。

如图3所示，对掺入或未掺入粪便DNA的样本进行甲基化检测，48拷贝样本在未掺入粪便DNA或掺入200ng粪便DNA甲基化阳性模板的条件下都能稳定扩增，说明该捕获寡核苷酸体系能在含大量微生物DNA背景下对甲基化目标样本进行有效扩增。

实施例4粪便样本中以β-actin为内参、人源SFRP2基因的甲基化检测

本实施例采用甲基化转移酶处理的Jurkat DNA作为人源SFRP2基因甲基化阳性标准品，其中CG位点为5mCG，掺入到粪便样本DNA中，进行SFRP2基因甲基化位点检测。无模板对照采用无核酸酶水。步骤如下：

(1)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对混合样本及无模板对照进行酶切处理，反应体系为1×PCR缓冲液(购自南京诺唯赞，P122-d1)、5U GlaI、不同浓度的基因组DNA，体系共10μL；反应条件为37℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对GlaI进行热灭活；

(2)分别向上述酶切反应体系中加入SFRP2基因捕获寡核苷酸(SEQ ID NO:6)、通用引物(SEQ ID NO:2)、SFRP2特异性引物(SEQ ID NO:3)、SFRP2检测探针(SEQ ID NO:4)、β-actin基因引物对和β-actin检测探针，PCR检测SFRP2基因的甲基化状态和β-actin表达量，采用的PCR扩增体系包括酶切DNA模板、10nM SFRP2捕获寡核苷酸、200nM通用引物、200nM SFRP2特异性引物、200nM SFRP2检测探针、100nMβ-actin特异性引物对、100nMβ-actin检测探针、1U/μL Taq聚合酶、1U/μL UDG酶、300μM dNTP和1×PCR缓冲液，终体积为20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在ROCHE仪器(480)上进行实时PCR，对相应的荧光数值进行采集；

β-actin-F(SEQ ID NO:7)：

5-TGGTGATGGAGGAGGCTC；

β-actin-R(SEQ ID NO:8)：

5-AGCCAATGGGACCTGCTC；

β-actin检测探针(SEQ ID NO:9)：

5-CY5-CTGTGGCCTCTGCAACCT-BHQ2；

人源SFRP2基因如SEQ ID NO:5所示。

如图4所示为甲基化检测结果，48拷贝样本掺入200ng粪便DNA甲基化阳性模板后，在含有β-actin内参基因和不含β-actin内参基因的体系中都能稳定扩增，说明本发明所述试剂盒及检测体系能在不影响扩增效率的前提下，用于含β-actin内参基因的双重PCR体系。

实施例5基于双通用引物扩增模型的人源DNA甲基化检测

之前实施例的扩增模型，一条引物是通用引物，一条引物来自于模板，进一步的在捕获寡核苷酸的结合捕获序列和折叠序列之间加入一条通用引物序列，利用延伸折叠引发扩增，使得扩增子带有两个通用引物序列。从而实现了利用两条通用引物对甲基化模板进行了扩增。缩短了扩增设计区域为后续多重扩增打下基础。

采用甲基化转移酶处理的Jurkat DNA作为人源SFRP2基因甲基化阳性标准品，无核酸酶水作为阴性对照，其中CG位点为5mCG，进行SFRP2基因甲基化位点检测。步骤如下：

(1)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对阳性标准品及阴性对照进行酶切处理，反应体系为10×酶切缓冲液2μL，不同浓度的基因组DNA，体系共20μL；反应条件为37℃孵育1小时；酶切反应结束后，将体系加热至85℃，孵育10分钟，对GlaI进行热灭活；

(2)分别向上述酶切反应体系中加入SFRP2基因捕获寡核苷酸、通用引物和检测探针，PCR检测SFRP2基因的甲基化状态，采取的PCR扩增体系包括酶切DNA模板、10nM捕获寡核苷酸、200nM第一通用引物、200nM第二通用引物、200nM检测探针、1U/μL Taq聚合酶、1U/μLUDG酶、300μM dNTP、1.5mM MgCl₂和2×PCR缓冲液，终体积为20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性10s，66℃退火90s，10个循环；94℃变性10s，65℃退火20s，40个循环；在ROCHE仪器(480)上进行实时PCR，对相应的荧光数值进行采集；

捕获寡核苷酸(SEQ ID NO:10)：

TGTCAGCCAACGGTATTCATCGCGACCCCGAGGGG/spacer18/AGATGTGGCACTGACAAGCTCGAACTCCGGCCGCCTC；

第一通用引物(SEQ ID NO:2)：

GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATC；

第二通用引物(SEQ ID NO:11)：

CGGCGTCAGATGTGGCACTGACAA；

检测探针(SEQ ID NO:4)：

VIC-CTCCGCTCCCTCTGC-MGB。

如图5所示，在双通用引物体系，1200拷贝、120拷贝、40拷贝和12拷贝阳性模板在酶切之后都能扩增，说明在双通用引物体系下，依然能实现SFRP2甲基化位点的扩增检测，且体系具有较高灵敏度。

综上所述，本发明采用甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的PCR扩增相结合的方式，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，实现了SFRP2甲基化DNA的精确定量检测，检测灵敏度高，特异性好，适于推广应用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 上海迈景纳米科技有限公司；上海交通大学

<120> 一种SFRP2甲基化检测试剂盒及其应用

<130> 20210105

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgtcagccaa cggtattcat cgcgaccccg aggggcccgg gacaagctcg aactc 55

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tgtcagccaa cggtattcat c 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cggccgcctc gcccttc 17

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ctccgctccc tctgc 15

<210> 5

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcgcgcgacc ccgagggggc agagggagcg gagccgggga agggcgaggc ggccggagtt 60

cgagcttgtc ccgggcccgc tctcttcgct ggg 93

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgtcagccaa cggtattcat ctttgcgacc ccgagggggc ccgggacaag ctcgaactc 59

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tggtgatgga ggaggctc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

agccaatggg acctgctc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ctgtggcctc tgcaacct 18

<210> 10

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tgtcagccaa cggtattcat cgcgaccccg aggggagatg tggcactgac aagctcgaac 60

tccggccgcc tc 72

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cggcgtcaga tgtggcactg acaa 24

Claims (10)

1.一种SFRP2甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；

所述捕获寡核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；

所述折叠序列与SFRP2甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5’末端序列至少部分相同；

所述结合捕获序列与所检测的SFRP2甲基化位点所在的片段区域特异性结合。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断位点；

优选地，所述核酸延伸阻断位点位于折叠序列的3’端；

优选地，所述核酸延伸阻断位点修饰有Spacer、硫代基团或尿嘧啶碱基中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述折叠序列修饰有核酸类似物；

优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'-O,4'-C-methylenebridge RNA、2’-O-Methyl RNA或2’-Fluoro RNA中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述通用引物的核酸序列与捕获寡核苷酸的第一通用序列相同或部分相同；

优选地，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括GlaI、FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI或MseI中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SFRP2甲基化特异性引物；

优选地，所述试剂盒还包括检测探针；

优选地，所述检测探针标记有荧光基团和/或淬灭基团；

优选地，所述荧光基团标记在检测探针的5’端；

优选地，所述淬灭基团标记在检测探针的3’端；

优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种；

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs或Mg²⁺中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述试剂盒还包括酶切缓冲液和/或PCR缓冲液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因PCR引物和/或检测探针；

优选地，所述内参基因包括β-actin。

7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获寡核苷酸包括SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示的核酸序列；

优选地，所述通用引物包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

优选地，所述SFRP2甲基化特异性引物包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；

优选地，所述检测探针包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

优选地，所述内参基因PCR引物包括SEQ ID NO:7～8所示的核酸序列；

优选地，所述内参基因检测探针包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列。

8.一种SFRP2甲基化检测体系，其特征在于，所述体系包括1～20nM捕获寡核苷酸、100～400nM通用引物、100～300nM检测探针、1～2U/μL Taq聚合酶、1～2U/μL UDG酶、100～300μM dNTP、1～5mM MgCl₂和PCR缓冲液；

优选地，所述体系还包括100～300nM SFRP2甲基化特异性引物。

9.一种SFRP2甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括：

采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测SFRP2甲基化模板进行酶切处理，将酶切处理后的产物加入权利要求8所述的体系中，进行荧光定量PCR；

优选地，所述酶切处理的温度为30～40℃；

优选地，所述酶切处理的时间为0.5～2h；

优选地，所述荧光定量PCR的程序为92～95℃预变性2～5min；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火80～100s，10～15个循环；92～95℃变性10～20s，65～70℃退火20～30s，30～50个循环。

10.权利要求1-7任一项所述的试剂盒或权利要求8所述的体系在制备疾病早期诊断试剂和/或设备中的应用；

优选地，所述疾病包括肿瘤；

优选地，所述肿瘤包括结直肠癌、肝癌或食管癌中的任意一种或至少两种的组合。

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