CN114712547B - 一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用，其中，方法包括步骤：提供细菌纤维素；配置不同浓度的光敏剂BITT分子溶液，BITT分子的化学结构式为：
Figure DDA0003505456910000011
对所述细菌纤维素进行干燥处理后浸泡到所述光敏剂BITT分子溶液中，得到细菌纤维素基光敏抗菌敷料。本发明提供的细菌纤维素基光敏抗菌敷料具有很好的杀菌效果(杀菌率>99％)，且光动力和光热协同杀菌的方式不仅不会引起细菌的耐药性，而且温和的光热效果可以促进细胞的增殖，血管的再生，加快伤口的愈合；本发明制备的复合敷料具有较好的透明度，有利于实时观察伤口的愈合程度；敷料柔软性好具有可穿戴性能可与不同部位的伤口紧密贴合；敷料生物可降解，绿色环保。

Description

一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，特别涉及一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用。
背景技术
纤维素作为植物细胞壁的主要成分，是自然界中最为丰富的天然聚合物。除植物外，一些特定的细菌如木醋杆菌、根瘤菌、农杆菌、假单胞菌和沙门氏菌等也能产生纤维素，这类纤维素称之为细菌纤维素。与植物纤维素相比，细菌纤维素具有高纯度，高孔隙度，超精细的纳米网络结构，高吸水能力和高机械强度等优点。此外，研究发现细菌纤维素在体内、外具有良好的生物相容性，且是生物可降解性材料，被广泛用于食品、生物医用等领域。
细菌纤维素作为伤口敷料，可以为伤口提供一个湿润且温和的环境，有利于伤口的愈合，同时不易与伤口发生粘连，更换方便，是一种理想的基质材料。但细菌纤维素本身没有抗菌效果，这无疑会增加伤口感染的风险，因此具有抗菌效果又能促进伤口愈合的细菌纤维素敷料受到人们的广泛关注。近年来，通过添加抗生素或具有抗菌效果的重金属离子改性细菌纤维素的例子常有报道，这类复合敷料虽然可以赋予细菌纤维素优良的抗菌效果，但也存在着一些问题。传统抗生素广谱抗菌性差，长期使用还会引起细菌的耐药性，引发新的感染；重金属离子对人体有较大的毒害作用，不适合长期与皮肤接触。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用，旨在解决现有抗菌敷料广谱抗菌性较差以及副作用较大的问题。
本发明的技术方案如下：
一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，包括步骤：
提供细菌纤维素；
配置不同浓度的光敏剂BITT分子溶液，BITT分子的化学结构式为：
Figure BDA0003505456890000021
对所述细菌纤维素进行干燥处理后浸泡到所述光敏剂BITT分子溶液中，得到细菌纤维素基光敏抗菌敷料。
所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，所述细菌纤维素的制备包括步骤：
从培养细菌的液体培养基中收集初始细菌纤维素；
用超纯水对初始细菌纤维素进行冲洗、浸泡处理后，再用碱液进行煮沸处理，得到预处理细菌纤维素；
用超纯水对所述预处理细菌纤维素进行冲洗后，再进行灭菌处理，得到细菌纤维素。
所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，所述碱液为质量分数0.5％-1.5％的氢氧化钠溶液。
所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，所述灭菌处理的温度为100-150℃，时间为10-30min。
所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，所述光敏剂BITT分子溶液的浓度为50-700μM。
所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，对所述细菌纤维素进行干燥处理的步骤中，干燥温度为70-90℃，时间为5-15min。
一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料，其中，采用本发明所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法制得。
一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的应用，其中，将本发明所述的细菌纤维素基光敏抗菌敷料用作皮肤创伤抗菌贴。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的种细菌纤维素基光敏抗菌敷料对革兰氏阳性菌(S.aureus)和耐药性革兰氏阳性菌(MRSA,VRE)具有很好的杀菌效果(杀菌率>99％)，且光动力和光热协同杀菌的方式不仅不会引起细菌的耐药性，而且温和的光热效果可以促进细胞的增殖，血管的再生，加快伤口的愈合；本发明使用的细菌纤维素形状、大小可控，可以根据伤口大小和部位设计；本发明使用的有机小分子BITT细胞毒性小，与细菌纤维素结合具有良好的生物相容性，与皮肤长时间接触不会对人体造成危害；本发明制备的复合敷料具有较好的透明度，有利于实时观察伤口的愈合程度；敷料柔软性好具有可穿戴性能可与不同部位的伤口紧密贴合；敷料生物可降解，绿色环保。
附图说明
图1为实施例1中细菌纤维素膜的SEM图和宏观形貌图；
图2为实施例1中BITT/细菌纤维素膜的SEM图和宏观形貌图；
图3为实施例1中BITT/细菌纤维素膜上BITT分子负载量折线图；
图4为实施例1中BITT/细菌纤维素膜ROS释放量测试图；
图5为实施例1中BITT/细菌纤维素膜光热测试图；
图6为实施例1中BITT/细菌纤维素膜对金黄色葡萄球的抗菌实验图；
图7为实施例1中BITT/细菌纤维素膜对耐甲氧西林金黄色葡萄球的抗菌实验图；
图8为实施例1中BITT/细菌纤维素膜对耐万古霉素肠球菌的抗菌实验图；
图9为实施例1中复合膜用于小鼠伤口治疗后的伤口面积统计图；
图10为实施例1中复合膜用于小鼠伤口治疗不同时间点的伤口图片；
图11为实施例1中复合膜用于小鼠伤口治疗后的伤口愈合痕迹的叠加图。
具体实施方式
本发明提供一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
光敏剂作为一种有机小分子，生物相容性好，对人体危害小，而且在光的照射下可以产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)杀死细菌，具有广谱抗菌性，同时避免了细菌产生耐药性的问题，是一种理想的抗菌候选药物。在已报道的有机小分子光敏剂中，具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)特性的光敏剂受到越来越多的关注。与传统的有机小分子光敏剂相比，具有AIE特性的光敏剂表现出聚集诱导增强ROS的效应，同时分子中转子的存在可以让激发态的能量通过非辐射的方式耗散，促进光热转换效果，实现光动力和光热的协同杀菌。目前报道的抗菌性能的AIE光敏剂在伤口感染治疗方面主要采取喷、涂的方法，这些方法所用光源为白光，组织穿透力差；另外，AIE光敏剂只有光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)效果，更好抗菌性能的AIE光敏剂和治疗方法有待开发。
基于此，本发明提供了一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其包括步骤：
S10、提供细菌纤维素；
S20、配置不同浓度的光敏剂BITT分子溶液，BITT分子的化学结构式为：
Figure BDA0003505456890000051
S30、对所述细菌纤维素进行干燥处理后浸泡到所述光敏剂BITT分子溶液中，得到细菌纤维素基光敏抗菌敷料。
在本实施例中，所述BITT分子是一种具有光动力和光热性能且水溶性较好的AIE分子，本实施例将BITT分子结合到细菌纤维素中形成细菌纤维素基光敏抗菌敷料，其对革兰氏阳性菌(S.aureus)和耐药性革兰氏阳性菌(MRSA,VRE)具有很好的杀菌效果(对金黄色葡萄球菌(S.aureus)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，抗万古霉素肠球菌具有极好的抗菌效果，杀菌率都在99％以上)，且光动力和光热协同杀菌的方式不仅不会引起细菌的耐药性，而且温和的光热效果可以促进细胞的增殖，血管的再生，加快伤口的愈合。因此，可将所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料用作皮肤创伤抗菌贴，其中，皮肤创伤包括细菌感染伤口，烧伤，烫伤等皮肤伤口。
本实施例使用的细菌纤维素形状、大小可控，可以根据伤口大小和部位设计；本实施例使用的有机小分子BITT细胞毒性小，与细菌纤维素结合具有良好的生物相容性，与皮肤长时间接触不会对人体造成危害；本实施例制备的复合敷料具有较好的透明度，有利于实时观察伤口的愈合程度；敷料柔软性好具有可穿戴性能可与不同部位的伤口紧密贴合；敷料生物可降解，绿色环保
在一些实施方式中，所述细菌纤维素的制备包括步骤：从培养细菌的液体培养基中收集初始细菌纤维素；用超纯水对初始细菌纤维素进行冲洗、浸泡处理后，再用碱液进行煮沸处理，得到预处理细菌纤维素；用超纯水对所述预处理细菌纤维素进行冲洗后，再进行灭菌处理，得到细菌纤维素。
在本实施例中，所述细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。本实施例以所述细菌为葡糖醋杆菌菌株(G.xylinus，ATCC 53582)为例，所述碱液为质量分数0.5％-1.5％的氢氧化钠溶液；所述灭菌处理的温度为100-150℃，时间为10-30min。
在一些实施方式中，所述光敏剂BITT分子溶液的浓度为50-700μM。作为举例，所述光敏剂BITT分子溶液的浓度为50μM，100μM，200μM，300μM，500μM或700μM，溶剂为乙醇，综合杀菌效果和细胞毒性，优选浓度为200μM，经计算其负载率为27.8μg/cm2。
在一些实施方式中，将细菌纤维素膜在鼓风干燥箱中烘烤去除部分水分后浸泡到浸泡到所述光敏剂BITT分子溶液中，得到细菌纤维素基光敏抗菌敷料。在本实施例中，干燥温度为70-90℃，时间为5-15min；浸泡时间为20-30h。
在一些实施方式中，还提供一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料，其中，采用本发明所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法制得。
在一些实施方式中，还提供一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的应用，其中，将本发明所述的细菌纤维素基光敏抗菌敷料用作皮肤创伤抗菌贴。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将不同孔径大小的细菌纤维素膜用超纯水多次冲洗，除去表面残留的细菌培养基和木醋杆菌，再用超纯水浸泡3天，期间每隔12h换一次水。
(2)配制质量分数1％的氢氧化钠水溶液，将步骤(1)中的细菌纤维素膜加入到配好的碱溶液中，放入锅中煮沸30min，用超纯水多次冲洗，除去水中的氢氧化钠，最后高温、高压灭菌浸泡在超纯水中得到细菌纤维素备用，如图1所示。
(3)配制浓度为50μM，100μM，200μM的BITT分子溶液各1mL，溶剂为100％的乙醇，将步骤(2)中处理完的细菌纤维素膜浸泡到不同浓度的BITT溶液中，避光浸泡24h，得到BITT复合的细菌纤维素膜，如图2所示。
BITT分子负载量测定方法：
(1)通过紫外可见分光光度计测定BITT/EtOH体系下的标准曲线，具体步骤为配制浓度2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM浓度的BITT标准液，测定它们在595nm处的吸收强度，以吸收强度为纵坐标，BITT浓度为横坐标作标准曲线。
(2)分被测定细菌纤维素膜浸泡前和浸泡后溶液在595nm处的吸收强度，根据标准曲线换算成对应的浓度，根据溶液体积和分子量转换成对应的质量，通过测量膜的面积就可以求出每平方厘米负载的BITT分子质量，结果如图3所示。
光动力效果测试：
取实施例1中制备的不同浓度的复合膜将其裁剪成0.3*0.3cm2的方块，放在24孔板中。加入525μL的PBS和75μL的DCFH溶液(ROS荧光指示剂)，用660nm激光照射复合膜，每隔30s测试溶液在490nm激发下529nm处的荧光强度，以时间为横坐标，照射后的荧光强度与照射前的初始荧光强度的比值为纵坐标作图，如图4所示。
光热效果测试:
取实施例1中制备的不同浓度的复合膜，将其顶部朝上放在在载物台上，用660nm激光照射复合膜，高度20cm，功率0.3W/cm2，同时用热成像记录复合膜温度随时间的变化，结果如图5所示，由图可知，复合膜随着照射时间的延长温度逐渐升高，200μM浓度下的复合膜温度最高可达43℃，具有温和的光热效果。
抗菌实验测试方法
实验全程在生物安全柜中操作，实验菌种为金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌。首先取实施例1中不同浓度的复合膜放在紫外灯下光照杀菌30min，排除环境中的细菌对实验的干扰。然后在48孔板中加入10μL浓度为108CFU mL-1的菌液，将不同浓度的复合膜覆盖在菌液上方，模拟伤口环境，孵育30min之后用660nm激光光照10min,加入990μL的PBS，混匀后取100μL的PBS稀释到104CFU mL-1，之后取100μL涂板计数。实验结果表明，200μM浓度浸泡得到的复合膜对三种细菌的杀菌率均达到99％以上，具有很好的杀菌效果，结果如图6、7、8所示。
体内伤口愈合实验：
BC-BITT抗菌敷料的伤口愈合效果通过小鼠全层皮肤伤口感染模型进行评估，实验所用小鼠为平均体重20g的雌性小鼠，所有小鼠随机分为4组(每组12只)：S.aureus感染的治疗组和空白组，MRSA感染的治疗组和空白组。首先给小鼠进行麻醉(注射0.1mL，1％的戊巴比妥生理盐水)，然后在呼吸麻醉机(异氟烷)下剪直径为1cm的全层皮肤伤口，滴上菌液(50μL，109CFU mL-1)后感染30min，将空白膜和复合膜贴在伤口，使其与伤口完全接触，孵育30min，再用激光(660nm,0.3W/cm-2)光照10min，空白组不光照。最后在第三天，第五天和第七天对小鼠伤口进行拍照，用ImageJ软件统计伤口面积并作图，如图9,10,11所示。由图可知，与空白组相比治疗组伤口面积明显减小，第七天时P值小于0.01，具有显著统计学差异。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其中，包括步骤：
提供细菌纤维素；
配置不同浓度的光敏剂BITT分子溶液，BITT分子的化学结构式为：
Figure FDA0003897330760000011
所述BITT分子是一种具有光动力、光热性能以及水溶性的AIE分子；
对所述细菌纤维素进行干燥处理后浸泡到所述光敏剂BITT分子溶液中，得到细菌纤维素基光敏抗菌敷料；
所述细菌纤维素的制备包括步骤：
从培养细菌的液体培养基中收集初始细菌纤维素；
用超纯水对初始细菌纤维素进行冲洗、浸泡处理后，再用碱液进行煮沸处理，得到预处理细菌纤维素；
用超纯水对所述预处理细菌纤维素进行冲洗后，再进行灭菌处理，得到细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述碱液为质量分数0.5％-1.5％的氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度为100-150℃，时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述光敏剂BITT分子溶液的浓度为50-700μM。
5.根据权利要求1所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法，其特征在于，对所述细菌纤维素进行干燥处理的步骤中，干燥温度为70-90℃，时间为5-15min。
6.一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述细菌纤维素基光敏抗菌敷料的制备方法制得。
7.一种细菌纤维素基光敏抗菌敷料的应用，其特征在于，将权利要求6所述的细菌纤维素基光敏抗菌敷料用作皮肤创伤抗菌贴。
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