CN114698750A - 一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品及其应用方法 - Google Patents
一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品及其应用方法，属于水产营养领域，所述抗菌产品的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯，18‑22%；三辛酸甘油酯，23‑27%；癸酸乙酯，28‑32%；棕榈酸钠盐载体，25‑27%；所述抗菌产品在不同水温下的使用方法为当养殖环境水温为15℃‑18℃时，将复合短链脂肪酸和鹅去氧胆酸结合使用；当养殖环境水温超过20℃时，将复合短链脂肪酸和胆酸结合使用；本发明的抗菌产品能够结合胆汁酸辅助递送，可靶向作用于肠道细胞，激活Toll‑like receptor等防御途径，增强肠道粘膜屏障，降低肠炎发生率，实现了水产饲料中抗肠炎功能性物质的精准递送和靶向作用。
Description
技术领域
本发明属于水产营养领域，具体涉及一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品及其应用方法。
背景技术
随着水产养殖的高速发展，水产养殖规模日益扩增，然而，我国可用于水产养殖的土地和水资源非常有限，因此，高密度集约化养殖成为水产养殖的必然选择。在高密度集约化养殖条件下，水产养殖面临一系列新的问题，而病害频发是首当其冲的问题。在高密度养殖条件下，养殖鱼类极易处于应激状态。而且，在高密度养殖条件下，水质条件往往易发生快速恶化，从而加剧病害爆发。水产病害爆发又导致了一系列次生危害，比如抗生素滥用、抗生素残留及食品安全等问题。
在集约化养殖的大背景下，通过营养学途径来增强养殖动物体质、提高抗病力和抗胁迫能力是目前能采取的有限措施之一，也是目前最为高效和环保的措施。除了保持水产饲料的均衡营养，目前大量的功能性物质正被用来增强动物免疫力和抗病力，而且很多物质已经被证明具有良好的效果，在生产中也得到了较为广泛的应用，这些物质包括但不限于：β-葡聚糖、肽聚糖、酵母提取物、合成乳铁蛋白、核苷酸、植物提取物和部分中草药等。另一方面，虽然这些物质已经被证明了其增强水产动物体质的功能，但是其作用大多是广谱的免疫刺激作用，而非靶向的功能调节过程。针对一些特定的容易受应激或损伤的机体代谢过程（如脂肪肝及肠炎），市场上仍然缺少靶向的起预防或者缓解作用的营养学措施，这常常导致在水产动物发生脂肪肝或者肠道炎症后，仍然必须依赖抗生素等药物的使用，这对可持续水产养殖的发展非常不列。因此，在水产饲料功能化产品的开发中，急需研究和开发能够靶向调节特定代谢过程的营养学方法。
发明内容
本发明提供一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品及其应用方法，该复合短链脂肪酸靶向抗菌产品能够结合胆汁酸辅助递送，可靶向作用于肠道细胞，激活Toll-likereceptor等防御途径，增强肠道粘膜屏障，降低肠炎发生率，实现了水产饲料中抗肠炎功能性物质的精准递送和靶向作用，并细化了其在不同水温场景下的使用方法，在大规模应用后能够进一步减少水产养殖中抗生素的使用。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯（C6:0），18-22%；三辛酸甘油酯（C8:0），23-27%；癸酸乙酯（C10:0），28-32%；棕榈酸钠盐载体，25-27%。
一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品的应用方法，当养殖环境水温为15℃-18℃时，将复合短链脂肪酸和鹅去氧胆酸共同加入饲料中，所述复合短链脂肪酸占饲料干物质的质量百分数为1.5%-1.6%，所述鹅去氧胆酸占饲料干物质的质量百分数为0.03%-0.04%；当养殖环境水温超过20℃时，将复合短链脂肪酸和胆酸共同加入饲料中，所述复合短链脂肪酸占饲料干物质的质量百分数为0.5%-0.6%，所述胆酸占饲料干物质的质量百分数为0.03%-0.04%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品，在15℃时的养殖成活率提高31%，在18℃时的养殖成活率提高23-25%，在21℃时的养殖成活率提高15%，在23℃时的养殖成活率提高26%；能够提高小肠绒毛的厚度；在15℃时能够将肠道Toll样受体（Toll-like receptor）基因表达量提高330%，在18℃时能够将肠道Toll样受体（Toll-likereceptor）基因表达量提高20%，在21℃时能够将肠道Toll样受体（Toll-like receptor）基因表达量提高410%；在15℃时能够将抗炎因子TGF-β基因表达量提高80%，在18℃时能够将抗炎因子TGF-β基因表达量提高90-220%，在21℃时能够将抗炎因子TGF-β基因表达量提高260%，在23℃时能够将抗炎因子TGF-β基因表达量提高260%；在15℃时攻毒感染死亡率降低8%，在18℃时攻毒死亡率降低43-55%，在21℃时攻毒死亡率降低37.5%，在23℃时攻毒死亡率降低52%；还能够有效减少肠炎发生率；
（2）本发明制备的水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品，基于对饲料中功能性营养物质的管理，有非常强的可操作性；并且，避免了抗生素使用和药物残留等问题，绿色环保；
（3）本发明制备的水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品，成本在可控范围内，经济性高。
（4）本发明的水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品的应用方法，依据实验室多年研发结果，创新性筛选和应用短链脂肪酸组合，并基于胆汁酸的辅助作用，可靶向作用于肠道细胞，激活Toll-like receptor等防御途径，建立防御屏障，降低肠炎的发生率，并基于短链脂肪酸的特殊理化特性，本技术的应用需要对应严格的水温场景，以最大限度发挥其功能作用。
附图说明
图1为实施例一中养殖实验结束后成活率。
图2为实施例一中大菱鲆肠道组织切片例图（4×）。
图3为实施例一中肠道促炎因子TNF-α的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图4为实施例一中肠道促炎因子IL-β的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图5为实施例一中肠道抗炎因子TGF-β的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图6为实施例一中肠道粘膜屏障蛋白Claudin-3的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图7为实施例一中肠道粘膜屏障蛋白Claudin-4的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图8为实施例一中Toll样受体（Toll-like receptor）的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图9为实施例一中攻毒死亡率统计。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图10为实施例二养殖实验结束后最终成活率。
图11为实施例二中凡纳滨对虾肠道组织切片例图（图中比例尺为50μm）。
图12为实施例二中肠道促炎因子TNF-α的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图13为实施例二中肠道促炎因子IL-β的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图14为实施例二中肠道抗炎因子TGF-β的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图15为实施例二中肠道粘膜屏障蛋白Claudin-4的mRNA表达量。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
图16为实施例二中攻毒死亡率统计。数据以平均值±标准误表示；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异（P<0.05）。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1 在大菱鲆不用养殖温度下应用本方法的效果比较实验
1、实验设计和实验饲料配方（基础饲料配方为模拟常用的商业饲料配方，并非对本发明保护范围的限制，在能够满足大菱鲆正常生长的情况下，实施本发明的添加方案，均能达到本发明效果）
以鱼粉、酵母、磷虾粉以及小麦粉、谷朊粉和豆粕等原料为主要蛋白源，以鱼油作为主要脂肪源配制成三组饲料，分别为Ctrl，SCFA+CDCA，SCFA+CA，具体饲料成分见表1。配方中所用复合短链脂肪酸的成分及质量百分数为：复合短链脂肪酸的配伍包括：三己酸甘油酯（C6:0），20%；三辛酸甘油酯（C8:0），25%；癸酸乙酯（C10:0），30%；棕榈酸钠盐载体，25%。
表1 实验饲料的饲料配方和粗成分（%干物质）
2、实验用鱼和养殖管理
本实验采用初始体重为23.3g的大菱鲆幼鱼，实验在室内流水海水养殖系统中进行。实验采用人工控温的情况下，分成三个温度处理组，温度分别控制在15℃、18℃和21℃。三个温度下三种饲料组的实验编号分别为Ctrl/15、SCFA+CDCA/15、SCFA+CA/15、Ctrl/18、SCFA+CDCA/18、SCFA+CA/18、Ctrl/21、SCFA+CDCA/21和SCFA+CA/21。正式试验前，实验鱼在水泥池（25㎡）中暂养7天以适应养殖环境条件。实验开时，每组饲料投喂3个玻璃钢桶（直径：230cm，高：100cm）中，每桶60尾鱼，采用室内流水养殖，水流量50L/min，每天饱食投喂两次（8:00和18:00点投喂）。
养殖实验在中国水产科学研究院黄海水产研究所鲆鲽鱼类繁育基地进行，总养殖周期120天。在中国山东省海阳市的自然光周期（N36°41'，E121°07'）下进行，在实验过程中，盐度在30〜32间波动；pH为7.6〜8.3；溶解氧为6〜8mg L-1。每天摄食结束后半小时进行残余饲料和粪便清理。
3、攻毒实验
待120天的养殖周期结束后，每桶取20尾鱼进行哈维氏菌攻毒实验。首先通过预实验确定腹腔注射哈维氏菌液的浓度（筛选条件为10天内死亡一半实验鱼，即10天半致死浓度），最终预实验确定的哈维氏菌10天半致死浓度为3.2×106CFU/g鱼体重。以该浓度对每桶20尾实验鱼进行攻毒，计算10天内的死亡率。
4、样品采集及指标分析
120天的养殖周期结束后，对所有桶中的实验鱼进行称重、计数。每桶取样6尾，取肠道（中肠）样品分别用于肠道切片、分子生物学指标分析，并依据表观指标鉴定肠炎的发生情况。
肠道切片分析方法：采用苦味酸固定，石蜡切片，HE 染色的常规方法，具体方法如下：①波恩氏液的配制：在100 ml 的蒸馏水中加入苦味酸结晶，边加边搅动，直至苦味酸溶解并达到饱和为止，再经静止沉淀，取上清饱和溶液75 ml，注入烧杯中，加40%甲醛25 ml，冰醋酸5 ml；②切片制作。具体步骤如下：
1、组织取样：取肠道统一部位(中肠)少许放入固定液中。2、固定24 小时后，用70%乙醇洗到无色，然后保存在70%乙醇中。3、脱水：分别在以下溶液中进行浸泡：80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精(两次)，每次浸泡35 min。4、透明：在100%乙醇＋二甲苯(体积比为1:1)中浸泡30min，然后在二甲苯中浸泡15 min。5、透蜡；在二甲苯＋石蜡(i)(体积比为1:1)中浸泡30 min→在石蜡(i)中浸泡40min→在石蜡(ii)中浸泡30min。所述石蜡(i)的熔点为52℃；所述石蜡(ii)的熔点为62℃。6、包埋。7、切片；将凝固的蜡块修整成合适的方块，上下边要平行，并固定，切片厚度7 um。8、贴片；洁净的纯净水贴片，放在45℃烘片台展平。9、染色；常规HE 染色。10、封固；中性树胶。11、观察和照相。
分子生物学分析方法：使用RNAiso Plus(TaKaRa(大连)，中国大连)提取肠道样品中的总RNA，并根据用户手册使用带有gDNA Eraser(TaKaRa)的PrimeScript™ RT试剂盒进行反转录。根据GenBank中内参基因(β-actin)和靶基因的序列，由青岛擎科生物科技有限公司制备特异性引物(表2)。经6步4倍稀释后的标准曲线，其线性回归系数R2> 0.99，范围为95-105%。使用SYBR® Premix Ex TaqTM (TaKaRa)及罗氏定量PCR仪(Roche LightCycler96) 进行荧光定量PCR实验。反应体系包括2μL cDNA模板，10μL SYBR® Premix Ex TaqTM(2×), 0.8μL上游引物(10μM), 0.8 μL下游引物(10μM)及6.4μL纯水。PCR程序设定：95℃,5 min; 40 循环 “95℃, 5s; 55℃, 20s, 72℃, 10s”。后接溶解曲线绘制(从58℃到95℃每分钟升高1.85℃)以确定PCR产物的特异性。每样品3重复。mRNA的相对表达量采用2−ΔΔ对表法计算。
表2 所用引物序列表
5、实验统计方法
实验数据的统计采用单因素方差（One way-ANOVA）分析方法，使用SPSS16.0进行。数据采用平均值±标准误表示。以P<0.5表示为差异显著。
6、实验结果
实验各组的最终成活率如图1所示，在水温15℃和18℃的情况下，均是在SCFA+CDCA组成活率最高，比对照组提高20-30%。而SCFA+CA组成活率略有提高，和对照组间没有显著性差异，在水温21℃的情况下，SCFA+CA组成活率比对照提高15%，但各组间没有显著性差异。
实验各组的肠道切片如图2所示，图中A为Ctrl/15组；B为SCFA+CDCA/15组；C为SCFA+CA/15组；D为Ctrl/18组；E为SCFA+CDCA/18组；F为SCFA+CA/18组；G为Ctrl/21组；H为SCFA+CDCA/21组；I为SCFA+CA/21组。
由图2可以看出，在水温15℃的情况下，SCFA+CDCA组表现最好，几乎未观察到肠炎发生，绒毛长度合适、杯状细胞数量丰富；粘膜和粘膜下层厚度较厚，而SCFA+CA组表现虽优于对照组，但仍观察到2例肠炎发生，表现为绒毛长度变短、杯状细胞数量减少等症状。在水温18℃的情况下，同样是SCFA+CDCA组表现最好，几乎未观察到肠炎发生，而SCFA+CA组观察到1例肠炎。在水温21℃的情况下，SCFA+CA组表现最好，未观察到肠炎发生，而SCFA+CDCA组观察到2例肠炎。
基因表达方面：在水温15℃和18℃的情况下，SCFA+CDCA组促炎因子TNF-α基因表达量显著（P＜0.05）降低，SCFA+CA组有所降低，但与对照组相比差异不显著（图3）。在水温21℃的情况下，SCFA+CA组促炎因子TNF-α基因表达量显著（P＜0.05）降低，SCFA+CDCA组有所降低，但与对照组相比差异不显著（图3）。促炎因子IL-β的基因表达与TNF-α极为类似（图4）。
在水温15℃和18℃的情况下，SCFA+CDCA组抗炎因子TGF-β基因表达量显著（P＜0.05）升高，SCFA+CA组与对照组之间没有显著性差异（图5）。在水温21℃的情况下，SCFA+CA组促炎因子TNF-α基因表达量显著（P＜0.05）升高，SCFA+CDCA组与对照组之间没有显著性差异。
肠道粘膜屏障蛋白Claudin-3的基因表达趋势跟抗炎因子TGF-β极为类似（图6）。肠道粘膜屏障蛋白Claudin-4的基因表达趋势跟Claudin-3大体类似，但是在水温18℃的情况下，各饲料处理组间没有显著性差异（图7）。
肠道Toll样受体基因表达方面跟肠道粘膜屏障蛋白Claudin-3的基因表达趋势比较类似（图8）。同样地，在水温18℃的情况下，各饲料处理组间没有显著性差异。
攻毒死亡率方面：在水温15℃的情况下，各处理组间攻毒死亡率没有显著性差异（图9）。在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA组显著降低了攻毒死亡率；在水温21℃的情况下，SCFA+CA组显著降低了攻毒死亡率。
实施例2在凡纳滨对虾不用养殖温度下应用本方法的效果比较实验
1、实验设计和实验饲料配方（基础饲料配方为模拟常用的商业饲料配方，并非对本发明保护范围的限制，在能够满足凡纳滨对虾正常生长的情况下，实施本发明的添加方案，均能达到本发明效果）
以鱼粉、磷虾粉以及小麦粉、谷朊粉等原料为主要蛋白源，以鱼油和大豆卵磷脂作为主要脂肪源配制成三组饲料，分别为Ctrl，SCFA+CDCA，SCFA+CA，具体饲料成分见表3。配方中所用复合短链脂肪酸的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯（C6:0），21%；三辛酸甘油酯（C8:0），26%；癸酸乙酯（C10:0），28%；棕榈酸钠盐载体，25%。
表3凡纳滨对虾实验饲料的饲料配方和粗成分（%干物质）
2、实验用鱼和养殖管理
本实验采用初始体重为3.3g的凡纳滨对虾幼虾，实验在室内流水海水养殖系统中进行。实验采用人工控温的情况下，分成两个温度处理组，温度分别控制在18℃和23℃。两个温度下三种饲料组的实验编号分别为Ctrl/18、SCFA+CDCA/18、SCFA+CA/18、Ctrl/23、SCFA+CDCA/23和SCFA+CA/23。正式试验前，实验虾在水泥池（25㎡）中暂养7天以适应养殖环境条件。实验开时，每组饲料投喂3个玻璃钢桶（直径：230cm，高：100cm）中，每桶100尾鱼，采用室内流水养殖，水流量50L/min，每天饱食投喂3次（8:00，13:00和18:00点投喂）。养殖实验在中国水产科学研究院黄海水产研究所鲆鲽鱼类繁育基地进行，总养殖周期60天。在中国山东省海阳市的自然光周期（N36°41'，E121°07'）下进行，在实验过程中，盐度在30〜32间波动；pH为7.6〜8.3；溶解氧为6〜8mg L-1。每天摄食结束后半小时进行残余饲料和粪便清理。
3、攻毒实验
投喂实验结束后，每桶取30尾虾进行急性肝胰腺坏死病（AHPND）攻毒实验。首先通过预实验确定AHPND的浸泡浓度和时间（筛选条件为10天内死亡一半实验虾，即10天半致死浓度），最终预实验确定的哈维氏菌10天半致死浓度为106CFU/L浸泡2天然后转移至清水养殖。以该浓度对每桶30尾实验虾进行攻毒，计算10天内的死亡率。
4、样品采集及指标分析
60天的养殖周期结束后，对所有桶中的实验鱼进行称重、计数。每桶取样6尾，取肠道（中肠）样品分别用于肠道切片、分子生物学指标分析，并依据表观指标鉴定肠炎的发生情况。
肠道切片分析方法：采用苦味酸固定，石蜡切片，HE 染色的常规方法，具体方法如下：①波恩氏液的配制：在100 ml 的蒸馏水中加入苦味酸结晶，边加边搅动，直至苦味酸溶解并达到饱和为止，再经静止沉淀，取上清饱和溶液75 ml，注入烧杯中，加40%甲醛25 ml，冰醋酸5 ml；②切片制作。具体步骤如下：1、组织取样：取肠道统一部位(中肠)少许放入固定液中。2、固定24 h后，用70%乙醇洗到无色，然后保存在70%乙醇中。3、脱水：80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精(两次)，每级45min。4、透明：100%乙醇＋二甲苯(体积比为1:1)40 min，二甲苯15 min。5、透蜡：二甲苯＋石蜡(i)(体积比为1:1) 30 min→石蜡(i) 40min→石蜡(ii) 30 min。所述石蜡(i)的熔点为52℃;所述石蜡(ii)的熔点为62℃。6、包埋；7、切片：将凝固的蜡块修整成合适的方块，上下边要平行，并固定，切片厚度8um。8、贴片：洁净的纯净水贴片，放在50℃烘片台展平。9、染色：常规HE 染色。10、封固；中性树胶。11、观察和照相。
分子生物学分析方法：使用RNAiso Plus(TaKaRa(大连)，中国大连)提取肠道样品中的总RNA，并根据用户手册使用带有gDNA Eraser(TaKaRa)的PrimeScript™ RT试剂盒进行反转录。根据GenBank中内参基因(β-actin)和靶基因的序列，由青岛擎科生物科技有限公司制备特异性引物(表4)。经6步4倍稀释后的标准曲线，其线性回归系数R2> 0.99，范围为95-105%。使用SYBR® Premix Ex TaqTM (TaKaRa)及罗氏定量PCR仪(Roche LightCycler96) 进行荧光定量PCR实验。反应体系包括2μL cDNA模板，10μL SYBR® Premix Ex TaqTM(2×), 0.8μL上游引物(10μM), 0.8 μL下游引物(10μM)及6.4μL纯水。PCR程序设定：95℃,5 min; 40 循环 “95℃, 5s; 55℃, 20s, 72℃, 10s”。后接溶解曲线绘制(从58℃到95℃每分钟升高1.85℃)以确定PCR产物的特异性。每样品3重复。mRNA的相对表达量采用2−ΔΔ对表法计算。
表4凡纳滨对虾实验所用引物序列表
5、实验统计方法
实验数据的统计采用单因素方差（One way-ANOVA）分析方法，使用SPSS16.0进行。数据采用平均值±标准误表示。以P<0.5表示为差异显著。
6、实验结果
实验各组的最终成活率如图10所示，在水温18℃的情况下，SCFA+CA组成活率最高，比对照组提高25%。在水温23℃的情况下，SCFA+CA组成立最高，比对照组提高26%。
实验各组的肠道切片如图11所示，图中，A为Ctrl/18组；B为SCFA+CDCA/18组；C为SCFA+CA/18组；D为Ctrl/23组；E为SCFA+CDCA/23组；F为SCFA+CA/23组。
在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA组表现最好，几乎未观察到肠炎发生，绒毛长度合适、杯状细胞数量丰富；粘膜和粘膜下层厚度较厚，而SCFA+CA组表现虽优于对照组，但仍观察到3例肠炎发生，表现为绒毛长度变短、杯状细胞数量减少等症状。在水温23℃的情况下，SCFA+CA组表现最好，未观察到肠炎发生，而SCFA+CDCA组观察到2例肠炎。
基因表达方面：在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA组促炎因子TNF-α基因表达量显著（P＜0.05）降低，SCFA+CA组与对照组相比差异不显著（图12）。在水温23℃的情况下，SCFA+CDCA组和SCFA+CA组促炎因子TNF-α基因表达量均显著（P＜0.05）降低。
在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA组和SCFA+CA组促炎因子IL-β的基因表达均显著（P＜0.05）降低（图13）。在水温23℃的情况下，SCFA+CA组促炎因子IL-β的基因表达显著（P＜0.05）降低，但SCFA+CDCA组与对照组无显著差异。
在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA抗炎因子TGF-β基因表达量显著（P＜0.05）升高，SCFA+CA组与对照组之间没有显著性差异（图14）。在水温23℃的情况下，SCFA+CDCA组和SCFA+CA组促炎因子TNF-α基因表达量均显著（P＜0.05）升高。
在水温18℃的情况下，肠道粘膜屏障蛋白Claudin-4的基因表达在SCFA+CDCA组和SCFA+CA组均显著（P＜0.05）高于对照组（图15）。在水温23℃的情况下，只有SCFA+CA组肠道粘膜屏障蛋白Claudin-4的基因表达显著（P＜0.05）高于对照组。
攻毒死亡率方面：在水温18℃的情况下，SCFA+CDCA组攻毒死亡率显著（P＜0.05）低于对照组（图16）。在水温23℃的情况下，SCFA+CDCA组和SCFA+CA组均显著（P＜0.05）降低了攻毒死亡率。
实施例3大菱鲆养殖中试规模下应用本方法的效果评价
1、实施过程
在大菱鲆的实际养殖生产过程中，同位于山东省烟台市开发区的养殖户合作，使用室内水泥池2个，每个规格2m×3m，每个池子放200尾大菱鲆，初始均重551g。一个水泥池投喂蛋白含量52%脂肪含量9%的商品饲料作为对照组，另一个水泥池在投喂时，将商品饲料粉碎后添加复合短链脂肪酸后重新制粒，作为实验组。配方中所用复合短链脂肪酸的成分组成及所占质量百分数为：三己酸甘油酯（C6:0），18%；三辛酸甘油酯（C8:0），27%；癸酸乙酯（C10:0），30%；棕榈酸钠盐载体，25%。
每天投喂2次。养殖实验从6月份持续到8月份。在养殖过程中，每天记录死亡鱼数。养殖水温17℃。
表5实验饲料的饲料配方和粗成分（%干物质）
2、效果评价
经过3个月的养殖实验后，养殖过程中成活率提高30%（对照组72%，实验组94%）。每只个水泥池随机打样30尾，按前述方法进行攻毒实验（因鱼体较大，预实验结果表明，菌液浓度略微增加），计算死亡率。发现死亡率降低28.6%（对照组70%，实验组50%），经过分别对10尾取样鱼进行肠道切片分析鉴定发现，对照组出现3例肠炎，实验组未发现肠炎。
实施例4凡纳滨对虾养殖中试规模下应用本方法的效果评价
1、实施过程
在凡纳滨对虾的实际养殖生产过程中，同位于山东省日照市的养殖户合作，租用小型室内水泥池2个。每个规格1.5m×3m，每个池子放6000尾幼虾，初始均重2.1g。一个水泥池投喂蛋白含量42%脂肪含量7%的商品饲料作为对照组，另一个水泥池在投喂时，将商品饲料粉碎后按本发明所述方法添加功能性成分后重新制粒作为实验组（表6）。配方中所用复合短链脂肪酸的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯（C6:0），18%；三辛酸甘油酯（C8:0），25%；癸酸乙酯（C10:0），32%；棕榈酸钠盐载体，25%。
每天投喂2次。养殖实验从7月份持续到10月份。在养殖过程中，每天记录死亡鱼数。养殖水温22℃。
表6实验饲料的饲料配方和粗成分（%干物质）
2、效果评价
养殖实验后结束后，全池出虾售卖。成活率对照组51%，实验组58%。每池取100尾虾进行攻毒实验，计算死亡率。发现死亡率降低30.6%（对照组62%，实验组43%），经过分别对10尾取样虾进行肠道切片分析鉴定发现，对照组出现4例肠炎，实验组发现1例肠炎。
实施例5红鳍东方鲀养殖中试规模下应用本方法的效果评价
1、实施过程
在红鳍东方鲀的实际养殖生产过程中，同位于河北省唐山市的养殖户合作，租用外海网箱2个。每个规格3m×3m，每个网箱放400尾红鳍东方鲀幼鱼，初始均重150.6g。一个网箱投喂蛋白含量54%脂肪含量9%的商品饲料作为对照组，另一只网箱在投喂时，将商品饲料粉碎后按本发明所述方法添加功能性成分后重新制粒作为实验组（表7）。配方中所用复合短链脂肪酸的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯（C6:0），22%；三辛酸甘油酯（C8:0），23%；癸酸乙酯（C10:0），28%；棕榈酸钠盐载体，27%。
每天投喂2次。养殖实验从5月份持续到11月份。在养殖过程中，每天记录死亡鱼数。养殖水温变动范围为15-28℃（整个养殖周期中超过20℃的时间占多数）。
表7实验饲料的饲料配方和粗成分（%干物质）
2、效果评价
养殖实验结束后，清点每个网箱存活率。成活率对照组95%，实验组96%，无显著性差异，可能与外海低密度网箱中养殖环境较为适宜有关。每个网箱取30尾鱼进行攻毒实验，计算死亡率。发现死亡率降低28.5%（对照组46.6%，实验组33.3%），经过分别对10尾取样鱼进行肠道切片分析鉴定发现，均未发现肠炎，推测可能与外海低密度网箱中养殖环境较为适宜有关。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品，其特征在于，所述复合短链脂肪酸靶向抗菌产品的成分及质量百分数为：三己酸甘油酯，18-22%；三辛酸甘油酯，23-27%；癸酸乙酯，28-32%；棕榈酸钠盐载体，25-27%。
2.一种权利要求1所述的水产饲料复合短链脂肪酸靶向抗菌产品的应用方法，其特征在于，当养殖环境水温为15℃-18℃时，将复合短链脂肪酸和鹅去氧胆酸共同加入饲料中，所述复合短链脂肪酸占饲料干物质的质量百分数为1.5%-1.6%，所述鹅去氧胆酸占饲料干物质的质量百分数为0.03%-0.04%；当养殖环境水温超过20℃时，将复合短链脂肪酸和胆酸共同加入饲料中，所述复合短链脂肪酸占饲料干物质的质量百分数为0.5%-0.6%，所述胆酸占饲料干物质的质量百分数为0.03%-0.04%。
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