CN113080111A - 胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用 - Google Patents
胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于水产养殖的技术领域，涉及胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用。本发明通过在半滑舌鳎饲料中添加一定量的胆汁酸，肠道的免疫指标、抗氧化指标和肠黏膜屏障相关基因的表达量均显著提高，因此肠道的健康水平显著提高，进而半滑舌鳎的生长速度和养殖成活率显著提高。该发明涉及的方法操作简单，且效果显著，有利于促进半滑舌鳎养殖产业的健康可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖饲料的技术领域，具体涉及胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用。
背景技术
肠道是机体重要的器官之一，不仅是食物消化吸收的场所，也是机体重要的免疫场所，肠道的健康状况直接影响动物的健康状况，因此，肠道健康是保障水产养殖动物生产性能的重要前提之一。在水产上，以往抗生素被常用于改善肠道健康，治疗肠道疾病等，抗生素的使用不仅会造成耐药菌株在肠道大量增殖，使肠道菌群失衡，而且有药物残留的风险，进而影响人类健康。随着水产养殖业禁抗的到来，探索一种改善肠道健康的方法尤为重要。
半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国沿海地区重要的海水养殖鱼类之一，由于其肉质细嫩、营养丰富等特点，深受消费者青睐，再加上价格较高，养殖前景广阔。目前半滑舌鳎的养殖主要是室内工厂化养殖，工厂化养殖密度很大，导致以肠炎等为主的细菌病频繁爆发，严重限制了半滑舌鳎养殖产业的健康可持续发展。
在水产养殖上，有研究发现胆汁酸能够促进水产动物脂肪和糖类代谢和预防脂肪肝作用。例如，胆汁酸能够军曹鱼的生长，并能降低脂肪在军曹鱼体内中的沉积(饲料中添加胆汁酸对军曹鱼生长及体组成的影响[J]，南方水产，2010，6(4):20-25)。但是，这些研究集中于鱼类体内脂肪代谢和相关组织器官作用上，目前尚未见关于用于替代抗生素的作用，用于改善半滑舌鳎肠道健康的报道。
发明内容
根据现有技术上存在的缺陷，结合目前的研究前沿，本发明提供了胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用，用于克服现有半滑舌鳎养殖上存在肠炎病较严重的情况，该方法具有操作简便、容易实现并且安全高效的特点，能够从根本上改善半滑舌鳎肠道健康，进而促进生长和降低养殖死亡率，大大提高养殖效益。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
本发明提供了胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用。
具体地，所述胆汁酸的添加量为每公斤饲料中添加300～900mg；饲料日投喂量为所有半滑舌鳎总重的1％～2％。
其中，所述胆汁酸总质量中含有≥70％的猪去氧胆酸、≥20％的鹅去氧胆酸和≥8％的猪胆酸。
进一步地，作为本发明的一个优选方案，所述饲料总质量中粗蛋白含量≥53％，粗脂肪含量≥8％，粗纤维含量≤3％，粗灰分含量≤16％，钙含量≤4％，赖氨酸含量≥2.5％，总磷含量1.5～3％。
本发明的应用具体包括以下养殖方法：每天定时投喂半滑舌鳎2～3次，每次投喂完0.5～1.5小时后，清扫养殖池中残饵和其他污物，连续投喂28天以上。
进一步地，作为本发明的一个优选方案，所述半滑舌鳎养殖条件为海水温度21～23℃，盐度25～30‰，溶氧6～8mg/L，pH7.5～8.2，日换水率300～400％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
胆汁酸提高了四个肠粘膜屏障相关基因(Claudin-4-like、Claudin-7-like、ZO-1-like、MLCK)的转录水平，肠道的免疫指标、抗氧化指标均显著提高。胆汁酸的应用可有效改善半滑舌鳎肠道的健康状况，进而替代抗生素在其养殖过程中的使用，进一步提高人工养殖的半滑舌鳎生长速度和养殖成活率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为实施例1、实施例2和对比例1中四个肠粘膜屏障基因相对表达量对比图，其中，数据以重复样本平均值±SD表示，不同小写字母上标表示组间差异显著，P<0.05。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
1、下列实施例采用的材料如下：
本发明所述半滑舌鳎优选平均体重10～12g，在本发明实施例中以11g体重为例进行相应实验。
半滑舌鳎饲料，购自三通生物工程有限公司，品名旺食养成用EP料；饲料中粗蛋白含量≥53％，粗脂肪含量≥8％，粗纤维含量≤3％，粗灰分含量≤16％，钙含量≤4％，赖氨酸含量≥2.5％，总磷含量1.5～3％。
胆汁酸购自龙昌动保有限公司，品名乳能；胆汁酸中含有≥70％的猪去氧胆酸、≥20％的鹅去氧胆酸和≥8％的猪胆酸。
免疫指标检测试剂盒，购自南京建成生物有限公司，对应产品为：溶菌酶(LZM)测试盒，货号A050-1-1；碱性磷酸酶(AKP)活性检测试剂盒，货号A059-2-2；免疫球蛋白M(IgM)测试盒，货号H109；补体C3测定试剂盒，货号E032-1-1。
抗氧化指标检测试剂盒，购自南京建成生物有限公司，对应产品为：超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，货号A001-3-2；过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒，货号A007-1-1；总抗氧化能力(TAOC)检测试剂盒，货号A015-1-2；谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒，货号H545-1；丙二醛(MDA)测定试剂盒，货号A003-1-2。
总RNA提取试剂盒，购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号9767。
gDNA Eraser逆转录试剂盒，购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G3330-100。
2、肠粘膜屏障相关基因转录的mRNA水平检测
四个肠粘膜屏障相关基因：Claudin-4-like，Claudin-7-like，ZO-1-like，MLCK。
表1.四个肠粘膜屏障相关基因和内参基因(β-actin)的特异性引物碱基序列
| 基因名称 | 上游引物5′-3′ | 下游引物5′-3′ |
| β-actin | CCAACAGGGAAAAGATGACC | TTCTCCTTGATGTCACGCAC |
| Claudin-4-like | CAGTTGTGCTTTGCCAATGTG | CAGAGAGATGAGGAGAGCCACC |
| Claudin-7-like | GACGGAAAGGACAAGGTCAAAT | GCTCGGCTGGTAGTGCTTGAT |
| ZO-1-like | GCAGATTTACCCTTGAAGAGCG | GGGGTTTGTTTGGTCCAGTTT |
| MLCK | GGGGAATAAGCCGAAGACCTAC | CGGTTCCTTGAAGTGGGGTG |
以上特异性引物由上海生物工程有限公司合成。
一、胆汁酸喂养半滑舌鳎
实施例1
每公斤饲料中胆汁酸的添加量为300mg。所用半滑舌鳎平均体重约11g，分为3个平行组，每组120尾，分别饲养在0.8m3的玻璃钢桶中，每天8:00和16:00各投喂1次，日投喂量为所有半滑舌鳎总重的1.5％，连续投喂8周。
实施例2
每公斤饲料中胆汁酸的添加量为900mg。所用半滑舌鳎平均体重约11g，分为3个平行组，每组120尾，分别饲养在0.8m3的玻璃钢桶中，每天8:00和16:00各投喂1次，日投喂量为所有半滑舌鳎总重的1.5％，连续投喂8周。
对比例1
与实施例1不同的是，饲料中没有添加胆汁酸。半滑舌鳎条件和喂养条件与实施例1相同。
二、胆汁酸对半滑舌鳎生长性能和养殖成活率的影响
投喂8周后，停食24小时，将实施例1、2和对比例1的半滑舌鳎随机捞取30尾测量终末平均体重，计算增重率。清点存活个体数量，计算养殖成活率，结果如表2所示。
增重率＝(终末平均体重-初始平均体重)/初始平均体重×100％。
成活率＝终末数量/初始数量×100％。
表2.实施例1、2和对比例1中半滑舌鳎的生长性状和成活率对比表
注：表2中数据为平均值±标准误差。不同小写字母上标组间差异显著，P<0.05。
由表2可知，每公斤饲料中添加300mg和900mg胆汁酸能够明显提高半滑舌鳎的生长速度和养殖成活率，实施例1和实施例2中半滑舌鳎的终末平均体重、增重率和成活率均显著高于对比例1。
三、胆汁酸对半滑舌鳎肠道健康的影响
1、半滑舌鳎肠道免疫指标和抗氧化指标的检测
将投喂8周后，停食24小时，随机捞取实施例1、2和对比例1中的9尾半滑舌鳎，用30ppm的MS-222麻醉后，取约1cm的中段肠道组织，用商业化的试剂盒检测肠道中四个免疫指标和五个抗氧化指标。检测方法按照试剂盒说明书进行。
四个免疫指标分别为溶菌酶(LZM)活性、碱性磷酸酶(AKP)活性、免疫球蛋白M(IgM)含量和补体3(C3)含量，结果如表3所示。
表3.实施例1、2和对比例1中半滑舌鳎的肠道免疫指标对比表
注：表3中数据为平均值±标准误差。不同小写字母上表组间差异显著，P<0.05。
五个抗氧化指标分别为超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性、丙二醛(MDA)含量，结果如表4所示。
表4.实施例1、2和对比例1中半滑舌鳎的肠道抗氧化指标对比表
注：表4中数据为平均值±标准误差。不同小写字母上表组间差异显著，P<0.05。
由表3可知，每公斤饲料中添加300mg和600mg胆汁酸能够明显提高半滑舌鳎的肠道免疫指标，实施例1和实施例2中半滑舌鳎肠道中LZM活力、IgM含量和C3的含量显著高于对比例1，而AKP活力显著降低；由表4可知，每公斤饲料中添加300mg和600mg胆汁酸能够明显提高半滑舌鳎的肠道的抗氧化指标，实施例1和实施例2中半滑舌鳎肠道中SOD活力、CAT活力、TAOC活力和GPX活力显著升高，而MDA含量显著降低。上述实验结果表明，该发明的方法能够显著提高半滑舌鳎肠道的健康水平。
2、肠粘膜屏障相关基因转录水平的检测
将投喂8周后，停食24小时，随机捞取实施例1、2和对比例1中的9尾半滑舌鳎，用30ppm的MS-222麻醉后，取约1cm的中段肠道组织，放入2mL的RNase-free管中，液氮速冻后在-80℃超低温冰箱中保存备用。
用总RNA提取试剂盒，按照说明书提取中段肠道的总RNA。
采用琼脂糖凝胶电泳和分光光度分析评估RNA的质量和数量。
采用gDNA Eraser逆转录试剂盒合成cDNA。qRT-PCR扩增体系总体积为15μL，其中上下游引物各1.5μL，2×SYBR Green qRT-PCR Master Mix 7.5μL，RNase-Free Water 4.0μL，cDNA Mix 2.0μL。qRT-PCR反应程序如下：95℃ 30s循环1次，95℃ 15s循环40次，60℃60s循环60次，然后进行熔解曲线分析(每15s上升0.3℃至95℃)，冷却至4℃。qRT-PCR实验设置3个生物学重复。所有基因表达量的标准化采用2-ΔΔCT法，将对比例1中各基因的表达量作为参照。
四个肠粘膜屏障相关基因：Claudin-4-like，Claudin-7-like，ZO-1-like，MLCK。特定引物如表1所示，内参基因为β-actin，qRT-PCR检测结果如图1所示。
根据图1显示，实施例1和实施例2中半滑舌鳎四个肠黏膜屏障基因的表达量与对比例1相比均显著上调，证实胆汁酸可改善半滑舌鳎的肠道健康状况。
上述结果表明，本发明涉及的方法显著提高了半滑舌鳎肠道健康水平，同时半滑舌鳎的生长和养殖成活率明显提高，因此该发明能够有效的减少半滑舌鳎养殖过程中抗生素的使用，促进半滑舌鳎肠道健康，进而促进生长，提高经济效益。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.胆汁酸在提高半滑舌鳎肠道健康和养殖成活率中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸的添加量为每公斤饲料中添加300～900mg；饲料日投喂量为所有半滑舌鳎总重的1％～2％。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸总质量中含有≥70％的猪去氧胆酸、≥20％的鹅去氧胆酸和≥8％的猪胆酸。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述饲料总质量中粗蛋白含量≥53％，粗脂肪含量≥8％，粗纤维含量≤3％，粗灰分含量≤16％，钙含量≤4％，赖氨酸含量≥2.5％，总磷含量1.5～3％。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体包括以下养殖方法：每天定时投喂半滑舌鳎2～3次，每次投喂完0.5～1.5小时后，清扫养殖池中残饵和其他污物，连续投喂28天以上。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述半滑舌鳎养殖条件为海水温度21～23℃，盐度25～30‰，溶氧6～8mg/L，pH7.5～8.2，日换水率300～400％。
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