CN114686474A - 多菌种固化菌丝球的制备方法、多菌种固化菌丝球及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及菌种发酵液的固体化处理领域，具体公开了一种多菌种固化菌丝球的制备方法、多菌种固化菌丝球及应用。制备方法包括：1）将菌种接种培养得种子液Ⅰ；2）种子液Ⅰ发酵培养得复合发酵液；3）向复合发酵液中加入硅藻土和氧化钙搅拌，过滤，取沉淀备用；4）将放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种接种培养得种子液Ⅱ；5）种子液Ⅱ发酵培养得含菌丝球的发酵液Ⅰ；6）将沉淀加入含菌丝球的发酵液Ⅰ中，加入硅藻土和氧化钙培养得到含菌丝球的发酵液Ⅱ；7）将含菌丝球的发酵液Ⅱ过筛，烘干，即得。本申请的方法使复合菌种固化工艺不受设备和空间限制，适合大规模或小规模生产，且成本低，易推广，工艺简单，容易控制。
Description
技术领域
本申请涉及菌种发酵液的固体化处理领域，更具体地说，它涉及一种多菌种固化菌丝球的制备方法、多菌种固化菌丝球及应用。
背景技术
固体菌种作为一种常见的菌种形式，相比于液体菌种，虽然其生产周期较长，且上下菌龄不一致，但相对的，固体菌种具有保存周期长、污染率低、便于运输等优点，因此得以广泛的推广和使用。
目前，相关技术中常见的工业化生产的固体化的菌种即菌种粉剂产品，通常是通过喷雾干燥工艺制得，喷雾干燥工艺需要预先对待处理的发酵液进行预处理，比如加入麦芽糊精等保护剂，以保护菌种的活性，再通过大型的喷雾干燥塔进行高温雾化干燥成粉剂，这种生产方式占地面积大，工序复杂，造价高，且产品的质量高度依赖喷雾干燥塔，不适合小批量粉剂的制作，一般是中大型企业才能够投资使用。而小规模粉剂的生产，通常采用的工艺为真空冷冻干燥工艺，这种工艺方式生产成本更高，常使用的单位多为科研机构，绝大部分小微等研发型企业无充足的资金和空间条件使用。除此之外，上述两种粉剂的制作多适用于单个菌种粉剂的制备，复合菌种目前多以原始液体发酵液的形式进行保存和运输，无成熟的粉剂生产工艺，比如类似日本的em菌，其产品主要以液体形式存在，在运输和贮存过程极易受到外界环境影响。
因此，研究出一种工艺简单易行，生产成本较低，并可适用于两种及两种以上的复合菌种固化工艺具有十分重要的意义。
发明内容
为了优化复合菌种固化工艺，使复合菌种的固化工艺不受设备和空间限制，并且可进行大批量规模化生产或小规模生产，有效降低生产成本，本申请提供一种多菌种固化菌丝球的制备方法、多菌种固化菌丝球及应用。
第一方面，本申请提供一种多菌种固化菌丝球的制备方法，采用如下的技术方案：
一种多菌种固化菌丝球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将多种菌种分别接种到各自的液体培养基中培养，制备种子液Ⅰ；
（2）将步骤（1）所得的种子液Ⅰ混合后加入发酵母液Ⅰ中，发酵培养，得到复合菌发酵液；
（3）向步骤（2）所得的复合菌发酵液中加入硅藻土和氧化钙，搅拌后静置，过滤，取沉淀备用；
（4）将放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种接种到液体培养基中培养，制备种子液Ⅱ；
（5）将步骤（4）所得的种子液Ⅱ加入发酵母液Ⅱ中，发酵培养，得到含有菌丝球的发酵液Ⅰ；
（6）将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅰ中，再次加入硅藻土和氧化钙，继续发酵培养，得到含有菌丝球的发酵液Ⅱ；
（7）将步骤（6）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅱ过筛，得到菌丝球，将菌丝球烘干，即得多菌种固化菌丝球。
通过采用上述技术方案，该制备方法只需在原有的生产条件下，增加过滤和干燥工艺，不依赖其他特殊设备即可实现由液体发酵液到固体菌剂的转变，工艺步骤简单易行，工艺条件参数易于控制，且生产成本低，易于推广，不仅可采用大规模批量化生产的模式进行生产，还可小规模精细化生产，适用于各类企业、高校及科研院所。由本申请制备方法中，可以根据使用环境调整产品菌种结构，适合水环境修复、土壤修复、有机废气物处理等复合微生物制剂的生产，有很广阔的应用前景。
优选的，步骤（1）的具体步骤为：将多种菌种分别接种到各自的液体培养基中，在32～37℃、150～160r/min的条件下培养24～72h至各自菌数至少达到10.0×108CFU/mL数量级，制得种子液Ⅰ。
通过采用上述技术方案，在上述条件下有助于菌种快速繁殖，从而缩短生产周期。其中，各自的液体培养基指的是每种菌种对应的常规培养基，如芽孢杆菌培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，酵母菌培养基为察氏液体培养基等。
优选的，步骤（1）中，所述菌种包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、嗜热乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌中的至少两种。
通过采用上述技术方案，在实际生产时，可根据实际处理需要选择固化合适的菌种组合，便于使用。
优选的，步骤（2）的具体步骤为：将步骤（1）所得的种子液Ⅰ混合后加入发酵母液Ⅰ中，在32～37℃、好氧或厌氧的条件下发酵培养24～72h至总菌数不少于20.0×108CFU/mL，得到复合菌发酵液。
通过采用上述技术方案，在上述条件下有助于菌种快速繁殖，从而缩短生产周期。其中，发酵条件中好氧或厌氧的选择依据种子液Ⅰ中菌种的类型进行选择，如好氧菌种选择好氧条件发酵，厌氧菌种选择厌氧条件发酵。
优选的，步骤（2）中，所述发酵母液Ⅰ，按重量份数计算，包括如下组分；
磷酸氢二钾 1～3份；
硫酸镁 0.1～0.3份；
七水合硫酸亚铁 0.1～0.3份；
酵母膏 0.7～1.3份；
糖蜜 70～130份；
蒸馏水 700～1300份。
通过采用上述技术方案，上述组分配比的发酵母液可有效促进菌种生长繁殖。
优选的，步骤（2）中，所述种子液Ⅰ的总量为发酵母液Ⅰ的1～5wt%。
通过采用上述技术方案，通过控制发酵母液Ⅰ与种子液Ⅰ的比值，进一步促进了菌种的快速繁殖。
优选的，步骤（3）的具体步骤为：向步骤（2）所得的复合菌发酵液中加入0.05～0.15wt%的硅藻土和0.05～0.15wt%的氧化钙，搅拌20～40min后避光密闭静置2～4h，过滤，取沉淀备用。
通过采用上述技术方案，采用天然硅藻土和氧化钙粉剂对复合菌发酵液进行吸附和沉淀处理，对发酵液中菌种进行初步富集，菌种与硅藻土、氧化钙产生吸附沉降作用，使得发酵液自然分层，从而分离出大量的底部沉淀物。
优选的，步骤（4）的具体步骤为：将放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种接种到液体培养基中，在32～34℃、160～170r/min的条件下培养24～72h至菌数至少达到10.0×108CFU/mL数量级，制得种子液Ⅱ。
通过采用上述技术方案，在上述条件下有助于菌种快速繁殖，从而缩短生产周期。
优选的，步骤（5）的具体步骤为：将步骤（4）所得的种子液Ⅱ加入发酵母液Ⅱ中，在32～34℃、好氧的条件下发酵培养18～24h至发酵母液Ⅱ中大量出现直径2mm以上的菌丝球时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅰ；
所述大量出现指的是发酵液静止30min以上时，菌丝球体积占发酵液体积的40%以上。
通过采用上述技术方案，当菌丝球生长到2mm时，已初具雏形，便于后期对菌种沉淀物的吸附和富集，从而提高菌种的固化效果。
优选的，步骤（5）中，所述发酵母液Ⅱ，按重量份数计算，包括如下组分；
20%马铃薯汁 1000份；
蔗糖 18～22份。
优选的，20%马铃薯汁的配制方法为：取去皮马铃薯200.0g，切成1cm*1cm*1cm的小块，加水1000mL煮沸后，保持沸腾30min，用三层纱布过滤，将滤液补足至1000mL。
通过采用上述技术方案，上述组分配比的发酵母液可有效促进菌种生长繁殖。
优选的，步骤（5）中，所述种子液Ⅱ的总量为发酵母液Ⅱ的1～5wt%。
通过采用上述技术方案，通过控制发酵母液Ⅱ与种子液Ⅱ的比值，进一步促进了菌种的快速繁殖。
优选的，步骤（6）的具体步骤为：将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅰ中，再次加入0.05～0.15wt%的硅藻土和0.05～0.15wt%的氧化钙，继续在32～34℃、好氧的条件下发酵培养8～12h至发酵液中菌丝球的直径生长到10mm以上时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅱ。
通过采用上述技术方案，在上述条件下菌丝球继续生长，菌丝球的直径可生长到10mm左右，在生长过程中，菌丝球将上一步加入的沉淀物逐步吸附和富集在球体内，形成以放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种为骨架的菌丝球，悬浮在培养液中生长，提高菌种的固化效果。
优选的，所述硅藻土的粒径为200目；所述氧化钙的粒径为100目。
优选的，步骤（7）的具体步骤为：将步骤（6）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅱ经孔径为5～10mm的筛网过筛，得到菌丝球，将菌丝球烘干至水分低于30%，即得以放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种为载体的多菌种固化菌丝球。
通过采用上述技术方案，通过5～10mm的筛网将菌丝球成品筛出，有效减少了未成形物和杂质的含量。
优选的，烘干方式可以是将菌丝球置于干燥室烘干，也可以是热风干燥，还可以是自然晾干。
优选的，菌丝球烘干时的温度不高于45℃。
通过采用上述技术方案，温度高于45℃会破坏菌种活性，使菌种功能性失效。
第二方面，本申请提供一种由上述制备方法制备获得的多菌种固化菌丝球。
第三方面，本申请提供一种上述多菌种固化菌丝球在水环境修复、土壤修复、有机废弃物处理中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1. 本申请的制备方法不依赖特殊设备即可以实现由液体发酵液到固体菌剂的转变，对工艺条件要求低，便于生产；
2. 本申请的制备方法不仅可采取大规模批量化生产的模式进行生产，还可小规模精细化生产，适用于各类企业、高校及科研院所，适用范围广；
3. 本申请的制备方法，可以根据使用环境调整产品菌种结构，适合水环境修复、土壤修复、有机废气物处理等复合微生物制剂的生产，有很广阔的应用前景；
4. 本申请的制备方法，实现了对两种及以上复合菌种的固化，便于复合菌种的贮存和运输。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的各实施例中所用的原料，除下述特殊说明之外，其他均为市售：
20%马铃薯汁的配制方法为：取去皮马铃薯200.0g，切成1cm*1cm*1cm的小块，加水1000mL煮沸后，保持沸腾30min，用三层纱布过滤，将滤液补足至1000mL。
实施例
一种多菌种固化菌丝球，其制备步骤包括：
（1）将多种菌种分别接种到各自的液体培养基中培养，制备种子液Ⅰ
将枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，水1000mL，pH=7.4～7.6，121℃蒸汽灭菌20分钟）中，在37℃、155r/min的条件下培养48h至菌数达到10.0×108CFU/mL数量级，得到芽孢杆菌种子液Ⅰ；将酿酒酵母接枝到察氏液体培养基（硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH=7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20分钟）中，在37℃、155r/min的条件下培养48h至菌数达到10.0×108CFU/mL数量级，得到酵母菌种子液Ⅰ；
（2）将步骤（1）所得的芽孢杆菌种子液Ⅰ和酵母菌种子液Ⅰ混合后加入发酵母液Ⅰ（磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、七水合硫酸亚铁0.2g、酵母膏1g、蔗糖30g、糖蜜100g、蒸馏水1000mL，pH=7.2～7.5，121℃蒸汽灭菌20分钟）中，在37℃、好氧条件下发酵培养48h至菌数达到20.0×108CFU/mL数量级，得到复合菌发酵液；
其中种子液Ⅰ的总量为发酵母液Ⅰ的2wt%；
（3）向步骤（2）所得的复合菌发酵液中加入0.1wt%的200目硅藻土和0.1wt%的100目氧化钙，搅拌30min后避光密闭静置3h，过滤，取沉淀备用；
（4）将放线菌（本实施例为细黄链霉菌）菌种接种到液体培养基（20%马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，121℃蒸汽灭菌20分钟）中，在32℃、165r/min的条件下培养48h至菌数至少达到10.0×108CFU/mL数量级，制得放线菌（本实施例为细黄链霉菌）种子液Ⅱ；
（5）将步骤（4）所得的放线菌（本实施例为细黄链霉菌）种子液Ⅱ加入发酵母液Ⅱ（20%马铃薯汁1000ml，蔗糖20g，121℃蒸汽灭菌20分钟）中，在32℃、好氧的条件下发酵培养24h至发酵母液Ⅱ中大量出现直径2mm以上的菌丝球时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅰ；
其中大量出现指的是发酵液静止30min以上时，菌丝球体积占发酵液体积的40%以上；
其中种子液Ⅱ的总量为发酵母液Ⅱ的2wt%；
（6）将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅰ中，再次加入0.1wt%的200目硅藻土和0.1wt%的100目氧化钙，继续在32℃、好氧的条件下发酵培养12h至发酵液中菌丝球的直径生长到10mm以上时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅱ；
（7）将步骤（6）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅱ经孔径为5～10mm的筛网过筛，得到菌丝球，将菌丝球在40℃烘干至水分低于30%，即得以放线菌（本实施例为细黄链霉菌）为载体的多菌种固化菌丝球。
值得说明的是，上述实施例仅是本申请技术方案众多实施方式中的具体一种，并不应认为是对本申请保护范围的限制。
比如，在其他的实施方式中，步骤（1）所述的菌种还可以是所述菌种包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、嗜热乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌中的其他组合，相应的，步骤（1）中所使用的液体培养基是每种菌种对应的常规培养基。
在其他的实施方式中，步骤（2）所述的发酵母液Ⅰ中各组分配比还可以在本申请技术方案所提及的范围内进行调整，并不会对复合菌种的固化产生影响。
在其他的实施方式中，步骤（2）中种子液Ⅰ的总量可以为发酵母液Ⅰ的1～5wt%，在1～5wt%的范围内进行调整，并不会对复合菌种的固化产生影响。
在其他的实施方式中，步骤（4）中的菌种还可以是毛霉菌、根霉菌、曲霉菌、木霉菌中的任意一种；相应的，步骤（4）中所使用的液体培养基是每种菌种对应的常规培养基。
在其他的实施方式中，步骤（5）所述的发酵母液Ⅱ中各组分配比还可以在本申请技术方案所提及的范围内进行调整，并不会对复合菌种的固化产生影响。
在其他的实施方式中，步骤（5）中种子液Ⅱ的总量可以为发酵母液Ⅱ的1～5wt%，在1～5wt%的范围内进行调整，并不会对复合菌种的固化产生影响。
在其他的实施方式中，步骤（3）和步骤（6）中硅藻土和氧化钙的目数也可在一定范围内上下波动，比如硅藻土的目数为80目～400目；氧化钙的目数为80目～200目。
在其他的实施方式中，步骤（7）中菌丝球烘干时的温度只要不高于45℃均可，且烘干方式可以为干燥室烘干，也可以是热风干燥，还可以是自然晾干。
在其他的实施方式中，各步骤中的工艺参数也可以在本申请技术方案记载的范围内上下浮动，并不会对复合菌种的固化产生影响。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (17)
1.一种多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将多种菌种分别接种到各自的液体培养基中培养，制备种子液Ⅰ；
（2）将步骤（1）所得的种子液Ⅰ混合后加入发酵母液Ⅰ中，发酵培养，得到复合菌发酵液；
（3）向步骤（2）所得的复合菌发酵液中加入硅藻土和氧化钙，搅拌后静置，过滤，取沉淀备用；
（4）将放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种接种到液体培养基中培养，制备种子液Ⅱ；
（5）将步骤（4）所得的种子液Ⅱ加入发酵母液Ⅱ中，发酵培养，得到含有菌丝球的发酵液Ⅰ；
（6）将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅰ中，再次加入硅藻土和氧化钙，继续发酵培养，得到含有菌丝球的发酵液Ⅱ；
（7）将步骤（6）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅱ过筛，得到菌丝球，将菌丝球烘干，即得多菌种固化菌丝球。
2.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：将多种菌种分别接种到各自的液体培养基中，在32～37℃、150～160r/min的条件下培养24～72h至各自菌数至少达到10.0×108CFU/mL数量级，制得种子液Ⅰ。
3.根据权利要求1或2所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述菌种包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、嗜热乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌中的至少两种。
4.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：将步骤（1）所得的种子液Ⅰ混合后加入发酵母液Ⅰ中，在32～37℃、好氧或厌氧的条件下发酵培养24～72h至总菌数不少于20.0×108CFU/mL，得到复合菌发酵液。
5.根据权利要求1或4所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵母液Ⅰ，按重量份数计算，包括如下组分；
磷酸氢二钾 1～3份；
硫酸镁 0.1～0.3份；
七水合硫酸亚铁 0.1～0.3份；
酵母膏 0.7～1.3份；
糖蜜 70～130份；
蒸馏水 700～1300份。
6.根据权利要求1或4所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液Ⅰ的总量为发酵母液Ⅰ的1～5wt%。
7.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：向步骤（2）所得的复合菌发酵液中加入0.05～0.15wt%的硅藻土和0.05～0.15wt%的氧化钙，搅拌20～40min后避光密闭静置2～4h，过滤，取沉淀备用。
8.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（4）的具体步骤为：将放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种接种到液体培养基中，在32～34℃、160～170r/min的条件下培养24～72h至菌数至少达到10.0×108CFU/mL数量级，制得种子液Ⅱ。
9.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（5）的具体步骤为：将步骤（4）所得的种子液Ⅱ加入发酵母液Ⅱ中，在32～34℃、好氧的条件下发酵培养18～24h至发酵母液Ⅱ中大量出现直径2mm以上的菌丝球时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅰ；
所述大量出现指的是发酵液静止30min以上时，菌丝球体积占发酵液体积的40%以上。
10.根据权利要求1或9所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述发酵母液Ⅱ，按重量份数计算，包括如下组分；
20%马铃薯汁 1000份；
蔗糖 18～22份。
11.根据权利要求1或9所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述种子液Ⅱ的总量为发酵母液Ⅱ的1～5wt%。
12.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（6）的具体步骤为：将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅰ中，再次加入0.05～0.15wt%的硅藻土和0.05～0.15wt%的氧化钙，继续在32～34℃、好氧的条件下发酵培养8～12h至发酵液中菌丝球的直径生长到10mm以上时，停止发酵，得到含有菌丝球的发酵液Ⅱ。
13.根据权利要求7或12所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，所述硅藻土的粒径为200目；所述氧化钙的粒径为100目。
14.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，步骤（7）的具体步骤为：将步骤（6）所得的含有菌丝球的发酵液Ⅱ经孔径为5～10mm的筛网过筛，得到菌丝球，将菌丝球烘干至水分低于30%，即得以放线菌、毛霉菌、根霉菌、曲霉菌和木霉菌中的任一菌种为载体的多菌种固化菌丝球。
15.根据权利要求1所述的多菌种固化菌丝球的制备方法，其特征在于，菌丝球烘干时的温度不高于45℃。
16.一种如权利要求1-15任一项所述的制备方法制备获得的多菌种固化菌丝球。
17.一种如权利要求16所述的多菌种固化菌丝球在水环境修复、土壤修复、有机废弃物处理中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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