CN114686455B - 一种混合限制酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种混合的限制性内切酶，所述混合限制性内切酶包括限制酶DpnI和SgeI组成，其中限制酶中DpnI和SgeI浓度分别为1～1.5U/μL，1～2.5U/μL。本发明还公开了一种混合限制性内切酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用，与单独使用DpnI相比，该混合酶消化甲基化DNA的效果显著提升，残留率降低90％以上，反应时间缩短了75％左右。在定点突变应用中，仅需酶切反应15min即可实现99％以上的阳性率。

Description

一种混合限制酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种混合限制酶及其应用。

背景技术

基因定点突变通常指改变基因上某个特定的碱基对，从而迅速、高效地改变基因所表达蛋白的性质，是生物医学领域中一种非常有用的手段。目前常用的一种体外定点突变技术是利用甲基化特异的限制性内切酶DpnI。首先将待突变的基因克隆到质粒上，将质粒转化到基因型为Dam+(腺嘌呤甲基化)的大肠杆菌感受态细胞中扩繁，然后提取质粒作为模板，用带有突变位点的引物进行PCR扩增，获得带有突变位点的质粒。因为受体菌体内存在Dam甲基化机制，所以从感受态细胞中提取的野生型质粒DNA带有甲基化修饰；而以野生型质粒为模板，在体外通过PCR扩增获得的突变体质粒，则没有被甲基化修饰。这时，加入特异性识别并切割甲基化位点的限制性内切酶DpnI，野生型质粒模板会被消化为片段，而突变体质粒不受影响。此后再将DpnI消化产物环化后转化入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，放大培养，即可提取到纯粹的突变体质粒。

目前使用上述技术的定点突变试剂盒中用于消化模板的限制酶全部为DpnI。DpnI识别序列为腺嘌呤N6位被甲基化的GATC，并切割甲基化的位点。当识别序列中两条DNA链上的两个腺嘌呤N6位都被甲基化时，DpnI呈现正常的活性；当只有一个腺嘌呤N6位被甲基化时，DpnI酶切活力会降低约60倍以上。但由于质粒在大肠杆菌中经常出现甲基化不完全的情况，即DNA双链中只有1条链上的腺嘌呤被甲基化，导致DpnI往往对野生型模板消化不完全，使消化后的转化产物含有较多假阳性克隆菌落，增加筛选的实验成本。

目前部分厂商推出的快速DpnI产品，宣称“最适反应温度下在15min内能够完全消化1μg质粒DNA”。但这里的“完全消化”一般是通过酶切产物琼脂糖电泳判断。由于琼脂糖电泳的分辨率有限，无法鉴定低于0.1ng的DNA残留。此种程度的DNA残留对限制酶的普通应用没有显著影响；但如果在定点突变中，0.1ng以下的残留模板质粒转化后仍然会产生相当数量(100以上)的阳性克隆，会显著增加假阳性率。因此，为了保证模板消化效果，市售的定点突变试剂盒推荐的模板消化时间大多在1-2小时以上。如果为了缩短反应时间而增加单酶用量，则可能产生星号活性，即非特异性切割，可能导致突变体质粒也被切割，影响点突变效率。

SgeI是另一种甲基化特异的限制性内切酶，特异性识别并切割单链或双链DNA上含有5-甲基胞嘧啶(即大肠杆菌Dcm甲基化)的DNA靶标。该酶发现较晚，单独使用需要专门的反应缓冲液，目前无快速酶产品，消化所需时间1h以上，目前应用较少，尚未被应用到定点突变中。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种反应时间更短、模板消化效率更高的混合限制酶，命名为Template Eliminator。

本发明还提供所述混合限制酶的应用。

技术方案：为了实现上述目的：本发明提供一种混合限制酶，其特征在于，所述混合限制酶包括限制酶DpnI和SgeI。

进一步地，所述混合限制酶中DpnI和SgeI浓度分别为1～1.5U/μL，1～2.5U/μL。

本发明还提供一种混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用。

进一步地，所述消化甲基化DNA的反应体系包括质粒DNA、混合限制酶、10×CutOneBuffer和无核酸酶水。

作为优选，所述消化甲基化DNA反应体系包括1μg质粒DNA、1μL混合型限制酶、2μL10×CutOne Buffer、无核酸酶水补充到20μL。

进一步地，所述混合限制性内切酶在消化甲基化DNA中的应用具体过程为：(1)将质粒转化到基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁获得甲基化修饰的质粒DNA；(2)提取被Dam和Dcm甲基化修饰的质粒DNA；(3)取1μg质粒DNA，1μL混合限制酶，再加入2μL 10×CutOne Buffer，最后加入无核酸酶水补充到20μL后反应；(4)将反应产物重新转化到大肠杆菌中，观察菌落数。

作为优选，上述使用常规的遗传转化方法，将质粒转化到基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁，所用的感受态细胞是Mach1-T1，亦可使用DH5α等其他Dam+/Dcm+基因型的感受态细胞；使用常规分子生物学方法提取质粒，获得的质粒DNA是已经被Dam和Dcm甲基化修饰的。

进一步地，所述混合限制酶在定点突变应用中的具体过程为：(1)将待突变基因克隆到质粒载体上；(2)将质粒转入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁；(3)提取质粒；(4)设计含有突变后位点的引物，以提取的质粒为模板进行PCR扩增；(5)取扩增产物40–50μL，加入1μL混合限制酶反应；(6)将产物转化入大肠杆菌中培养，筛选阳性克隆。

作为优选，上述使用常规分子克隆方法，将待突变基因克隆到质粒载体上。使用常规遗传转化方法，将质粒转入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁，所用的感受态细胞是Mach1-T1，亦可使用DH5α等其他Dam+/Dcm+基因型的感受态细胞。使用常规分子生物学方法提取质粒；使用带有所需突变位点的引物，以提取的质粒为模板进行PCR扩增。扩增可使用三步法，亦可使用两步法，循环数一般不超过30个，建议使用高保真DNA聚合酶，尽量保证扩增产物不发生其他突变。取扩增产物40-50μL，直接加入1μL TemplateEliminator，37℃反应15min。

其中，混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的反应条件为37℃下反应15-60min。

作为优选，混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的反应条件为37℃下反应15min。

本发明提供的一种混合限制酶试剂盒。

其中，所述一种混合限制酶试剂盒在快速酶反应中的应用。

进一步地，所述快速酶反应包括消化甲基化DNA和定点突变。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明所述混合限制酶与使用单酶相比，消化甲基化DNA效果显著提升，相比DpnI单酶，模板残留率降低90％以上；相比SgeI单酶，模板残留率降低98％以上；

(2)本发明大幅提高了酶反应效率，在消化甲基化DNA的应用中，混合限制酶仅需15min即可完全消化甲基化的DNA模板，相对使用单酶时间缩短了75％左右。

(3)本发明所述混合限制酶在定点突变应用中，反应仅需15min即可实现99％以上的阳性率，而DpnI单酶反应15min，阳性率仅为90％左右，反应1h才能达到与混合限制酶反应15min类似的效果。SgeI单酶反应1h后，阳性率也仅为75.9％，远不如TemplateEliminator的效果。

(4)本发明含混合限制酶的试剂盒，可以有效弥补现有定点突变试剂盒和消化甲基化DNA试剂盒假阳性率偏高，消化时间长等问题。

附图说明

图1不同限制酶消化甲基化DNA效果对比图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规分子生物学实验方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可以从常规生化试剂厂商购买得到。

本发明所提供的混合限制酶由两种甲基化特异的限制酶DpnI和SgeI组成，两者的浓度分别为DpnI：1～1.5U/μL，SgeI：1～2.5U/μL。

其中，1U DpnI定义为于50μl体系中37℃反应1小时消化1μg pUC19质粒(从Dam+基因型大肠杆菌中提取)所需的酶量，1U SgeI定义为于50μl体系中37℃反应1小时消化1μgpBR322质粒(从Dcm+基因型大肠杆菌中提取)所需的酶量。

后续为方便描述，将本发明所述的混合型限制酶在实施例中均命名为TemplateEliminator。

在本发明的一些实施例中，所用的感受态细胞是Mach1-T1。亦可使用DH5α等其他Dam+/Dcm+基因型的感受态细胞。

实施例1

消化甲基化DNA应用

选择两种质粒pUC19(ThermoFisher,货号SD0061)和pBAD(武汉淼灵生物科技有限公司，货号P0079)，分别使用普通的热激法转化到基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌Mach1-T1感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司，货号DL1015)中。37℃培养过夜后，提取被Dam和Dcm甲基化修饰的质粒DNA，各取1μg上述DNA为底物，分别用限制酶DpnI(2U/μL，江苏愚公生命科技有限公司，货号EG15585)、限制酶SgeI(5U/μL，江苏愚公生命科技有限公司，货号EG21501)和混合限制酶(Template Eliminator，包含1U/μL DpnI和2U/μLSgeI)构建反应体系进行酶切(均使用厂家推荐酶量，适当过量)，具体反应体系为表1：

表1

37℃分别反应15min、30min、60min后，80℃孵育20min将酶失活。然后用普通热激法将产物分别转化入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌Mach1-T1感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上37℃培养过夜，计算菌落数。

结果如图1所示，Template Eliminator仅需15分钟即可基本完全消化甲基化的DNA模板，而单独使用DpnI则需1个小时，单独使用SgeI反应1个小时仍有相当程度残留。

由于质粒不相容性，绝大多数情况下1个感受态细胞只能转入1个同类质粒。因此使用如下公式来近似计算质粒残留率：

本实施例所用感受态细胞实测转化效率为10⁷CFU/μg，故可计算出不同酶使用不同时间消化后，甲基化质粒DNA残留率(‰)如下表2：

表2不同酶使用不同时间消化后，甲基化质粒DNA残留率(‰)

如表2所示，反应15min后，使用Template Eliminator的甲基化DNA残留率仅为十万分之二左右，接近使用DpnI单酶的十分之一，是使用SgeI单酶的百分之二左右。反应60min后，使用Template Eliminator的甲基化DNA残留率低至千万分之九，是使用DpnI单酶的百分之三，是使用SgeI单酶的千分之六。由此可见，本发明所述混合限制酶在消化甲基化DNA方面的效果，远高于单酶各自使用，体现出极佳的协同增效作用。

实施例2

定点突变应用

以pUC19质粒所携带的LacZα基因起始密码子ATG为突变对象，设计携带突变位点的PCR上下游引物：

F：5’-CTATGACATGATTACGCCAAGCTTGCATG-3’，

R：5’-GTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG-3’。

首先用热激法将pUC19质粒转化入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌Mach1-T1感受态细胞中扩繁后，提取质粒。然后以该质粒为模板，使用上述引物和Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号P501)分五组进行PCR扩增，反应体系如下表3：

表3

PCR扩增步骤为：

扩增完成后，五组扩增产物各取40μL，其中1组加入1μL Template Eliminator(包含1U/μL DpnI和2U/μL SgeI)，2组加入1μL DpnI(2U/μL)，1组加入1μLSgeI(5U/μL)，1组不加酶。Template Eliminator组和不加酶对照组均在37℃孵育15min；两组加入DpnI的其中1组37℃反应15min，另一组37℃反应1h；加入SgeI的37℃反应1h。所有组别反应结束后都80℃孵育20min将限制酶失活。

然后各取5μL产物转化到Mach1-T1感受态细胞中，涂布到加有X-gal的含氨苄青霉素LB培养基平板上，37℃培养过夜。

结果如表4所示，突变后的pUC19质粒无法正常表达β-半乳糖苷酶基因，无法催化培养基中X-gal变为蓝色，因此含有突变体质粒的阳性菌落呈白色，而含有未突变野生型质粒的菌落呈蓝色。统计蓝白斑数量，结果如下表所示：

表4突变后的pUC19质粒与未突变野生型质粒蓝白斑数量统计结果

可见，使用Template Eliminator进行定点突变，反应仅需15min，阳性率就可达到99％以上。而DpnI单酶反应15min，阳性率仅为90％左右；反应1h才能达到与TemplateEliminator反应15min类似的效果。SgeI单酶反应1h后，阳性率也仅为75.9％，远不如Template Eliminator的效果。

Claims (6)

1.一种混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用，其特征在于，所述混合限制酶包括限制酶DpnI和SgeI，所述限制酶DpnI和SgeI浓度分别为1~1.5 U/μL，1~2.5 U/μL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述消化甲基化DNA的反应体系包括甲基化质粒DNA、混合限制酶、10×CutOne Buffer和无核酸酶水。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为：（1）将质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁获得甲基化修饰的质粒DNA；（2）提取甲基化修饰的质粒DNA；（3）将甲基化修饰的质粒DNA和混合限制酶加入反应体系中进行孵育；（4）将反应产物重新转化到大肠杆菌中，观察菌落数。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述混合限制酶在定点突变应用中的具体过程为：（1）将待突变基因克隆到质粒载体上；（2）将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁；（3）提取质粒；（4）设计引物，以提取的质粒为模板进行PCR扩增；（5）取扩增产物加入混合限制酶反应；（6）将反应后的产物转化入大肠杆菌中培养，筛选阳性克隆。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，混合限制酶反应条件为37℃下反应15-60 min。

6.一种试剂盒在消化甲基化DNA和定点突变中的应用，其特征在于，所述试剂盒为含有权利要求1中所述的混合限制酶的试剂盒。

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