CN114685417A - 用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和增强发光剂 - Google Patents

用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和增强发光剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学合成技术领域，具体而言，涉及用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和增强发光剂。该有机物的结构式包括荧光素发光基团骨架、至少含有2个氨基的氨基酸残基侨联结构以及与氨基酸残基侨联结构连接的烷烃侧链。其可以有效提升碱性磷酸酶底物，特别是1，2‑二氧环已烷衍生物AMPPD的发光强度，继而提升化学发光检测的灵敏度。

Description

用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和 增强发光剂
技术领域
本发明涉及化学合成技术领域，具体而言，涉及用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和增强发光剂。
背景技术
AMPPD为1，2-二氧环已烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其被广泛应用于化学发光检测中，在检测过程中其反应速度快，在很短时间内可提供正确可靠的结果，但是，现有技术中发光检测的物质成分复杂，会导致1，2-二氧环已烷衍生物的发光效率被降低，继而容易导致检测效果不准确，因此，需要增强1，2-二氧环已烷衍生物的发光强度。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物及其制备方法和增强发光剂。本发明实施例提供一种有机物，其可以有效提升碱性磷酸酶底物，特别是1，2-二氧环已烷衍生物AMPPD的发光强度，继而提升化学发光检测的灵敏度。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，有机物的结构式中包括荧光素发光基团骨架结构、至少含有2个氨基的氨基酸残基侨联结构以及与氨基酸残基侨联结构的羧基连接的烷烃基侧链，所述烷烃基为取代烷烃基或未取代烷烃基。
第二方面，本发明提供前述实施方式所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物的制备方法，包括：
将至少含有2个氨基且氨基被氨基保护基保护的氨基酸与含有烷烃基的原料进行酰胺反应形成化合物1，而后脱除所述化合物1中氨基的氨基保护基形成化合物2，而后再将化合物2与荧光素进行酰胺反应；
其中，化合物1为至少2个氨基被氨基保护且羧基与烷烃基通过酰胺键键合的中间体，化合物2为所有氨基脱去氨基保护基的且能与荧光素发光基团骨架通过酰胺键键合的中间体。
第三方面，本发明提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的增强发光剂，其包括前述实施方式任一项所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，且所述有机物在所述增强发光剂中的物质量的浓度为0.0005mM～1mM，优选0.001mM～0.005mM。
本发明中所述“未取代烷烃基”指的是结构式：—(CH2)m—CH3。本发明中所述“取代烷烃基”指的是“未取代烷烃基”中的甲基被其他基团所取代。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供通过将氨基酸的至少2个氨基分别与荧光素发光基团骨架通过酰胺键键合，继而引入2个甚至多个荧光素发光基团骨架，且将荧光素发光基团骨架以及烷烃基进行配合，继而使得该有机物可以显著提升碱性磷酸酶底物，特别是1，2-二氧环已烷衍生物AMPPD的发光强度，继而提升化学发光检测的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为20ul、30ng/ml碱性磷酸酶溶液+100ul底物液的检测结果图；
图2为20ul、0.03l碱性磷酸酶溶液+100ul底物液的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，有机物的结构式中包括荧光素发光基团骨架结构、至少含有2个氨基的氨基酸残基侨联结构以及与氨基酸残基侨联结构连接的烷烃基侧链。具体地，氨基酸残基侨联结构的两个氨基分别与荧光素发光基团骨架结构通过酰胺键键合，氨基酸残基侨联结构的羧基与烷烃基通过酰胺键键合。氨基酸残基侨联结构是以氨基酸残基作为侨联结构，两端分别接枝荧光素发光基团和烷烃基侧链。而氨基酸残基侨联结构至少含有2个氨基意思是形成氨基酸残基的原料中至少含有2个氨基，而通过该氨基与荧光素发光基团骨架连接，同时，氨基酸残基侨联结构的羧基与烷烃基连接；即形成氨基酸残基的原料中的羧基与烷烃基侧链连接。而荧光素发光基团骨架指的是以荧光素发光基团为骨架，荧光素发光基团骨架即为发光基团。
本发明实施例提供的有机物的结构式中至少2个氨基分别与发光基团(即荧光素发光基团骨架)通过酰胺键键合，继而引入多个发光基团，同时，采用烷烃基与发光基团进行配合，使得该类型的荧光衍生物可作为碱性磷酸酶底物液的添加剂，从而增强酶促反应的速率，增强酶促化学发光的强度，特别是1，2-二氧环已烷衍生物AMPPD的发光强度，继而提升化学发光检测的灵敏性。
具体地，本发明实施例应用氨基酸作为荧光分子与疏水烷烃基的桥联臂，一方面可以通过单个氨酸或多个氨酸组合类氨基酸作为连接桥，连接更多荧光分子，从而增加底物液中底物分子周边的荧光增强剂的分子浓度，以此可以提高发光效率与量子产率。另一方面借用不同氨基酸的氨基、羧基与侧链基与中心碳的距离不同能够设计出错位不同的荧光分子，这样能大大增加底物分子外围荧光分子的致密度，从而有望增加底物液的稳定性。第三点，可以通过不同氨基酸的组合与烷烃基的n值的大小调整，设计出合适的非水微环境，从而进一步提高化学发光的反应效率与量子产率；第四点，由于是氨基酸残基，故其与蛋白酶(碱性磷酸酶)有一定同源性，只要氨基酸的选择及排序适当，就能够促进底物分子与酶活位点的结合，从而更快地发生酶促反应，继而使得有机物能提升碱性磷酸酶底物发光强度。
具体地，形成所述氨基酸残基侨联结构的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的任意一种。采用上述至少含有2个氨基的氨基酸，能够保证氨基酸的氨基与发光基团稳定地结合，羧基与烷烃基稳定地结合，继而保证形成的有机的性能。
进一步地，荧光素发光基团骨架选自
Figure BDA0002880242390000041
Figure BDA0002880242390000042
中的任意一种，该荧光素发光基团骨架仅仅为本发明实施例的举例，其他能够与氨基酸的氨基形成酰胺键，并能提升1，2-二氧环已烷衍生物的发光强度的其他荧光基团也在本发明实施例的保护范围内。
进一步地，烷烃基选自未取代的直链烷烃基、含胺基取代的支链烷烃基和含胺基取代的支链烷烃基中的任意一种；具体地，烷烃基为------(CH2)m-CH3、------(CH2)m-NH-(CH2)m-CH3、
Figure BDA0002880242390000051
Figure BDA0002880242390000052
以及
Figure BDA0002880242390000053
中的任意一种，其中，m为整数；m为1-20，更优选为1-2或者10-20。例如，m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19以及20等整数。
需要说明的是，本发明实施例提供的结构式中的虚线表示与其他基团连接的位点。且若至少含有2个氨基的氨基酸有多个羧基，可以有1个羧基与烷烃基键合，也可以有所有羧基与烷烃基键合，也可以部分羧基与烷烃基键合。
具体地，有机物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure BDA0002880242390000061
Figure BDA0002880242390000062
m为整数，优选为1-20，更优选为10-20。
更具体地，所述有机物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure BDA0002880242390000063
本发明实施例还提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物的制备方法，包括：将至少含有2个氨基且氨基被氨基保护基保护的氨基酸与含有烷烃基的原料进行酰胺反应形成化合物1，即至少含有2个氨基且氨基被氨基保护基保护的氨基酸的羧基与含有烷烃基的原料进行酰胺反应，而后与羧基形成酰胺键，并引入烷烃基，即化合物1为至少2个氨基被氨基保护且羧基与烷烃基通过酰胺键键合的中间体。
具体地，至少2个氨基含有氨基保护基的氨基酸与含有烷烃基的原料的摩尔比为1:1-1.2，温度为20～35℃，时间为0.5～3h，采用上述条件能够有利于化合物1的形成，继而有利于有机物的形成。
而后脱除化合物1中的至少2个氨基的氨基保护基，使得氨基形成NH2，形成化合物2，而化合物2为脱去氨基保护基的氨基，且能与荧光素发光基团骨架通过酰胺键键合的中间体。
需要说明的是，此步骤脱除的氨基保护基为后续能与荧光素进行反应的氨基的氨基保护基，且本发明实施例脱除氨基保护的操作参照现有技术，本发明实施例不再进行详述。
而后将化合物2与荧光素进行酰胺反应，形成所需的有机物，所述化合物2与所述荧光素反应的条件为：所述化合物2与所述荧光素的摩尔比为1:2～2.5，反应温度为20～35℃，反应时间为0.5～3h。
采用上述条件能够进一步保证有机物的形成，且保证有利于提升有机物的性能。
例如，参照下述合成路径合成所需有机物：
Figure BDA0002880242390000081
本发明实施例还提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的增强发光剂，其包括上述用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，且所述有机物在所述增强发光剂中的物质量的浓度为0.0005mM～1mM，优选0.001mM～0.005mM。采用上述特定的含量能够有利于提升增强发光剂的性能。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其结构式如下所示：
Figure BDA0002880242390000082
本实施例提供一种上述用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物的制备方法，参照下述合成路径：
Figure BDA0002880242390000091
具体地：
S1：将10mmol Boc-Lys(Boc)-OH(上海吉尔生化)与11mmol的直链烷烃伯胺(n＝13)(sigma)加至50ml圆底烧瓶，放入搅拌磁子，倒入30ml DMF(sigma)后，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上搅拌溶解，待完全溶解后加入11mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(sigma)、11mmol N，N-二异丙基乙胺，常温(25℃)反应3h，然后将反应液倒入分液漏斗中，于分液漏斗中加入100ml乙酸乙酯，100ml纯化水，盖上分液漏斗盖子，充分摇晃震荡，静置3min后，分液，上层洗涤2次。
S2：将上述粉末转移至50ml圆底烧瓶中，缓慢加入10ml 4M HCl/dioxane溶液，反应1h后除去有机溶剂，在即将完全旋干时，加入石油醚，将产物析出后过滤得到白色粉末。
S3：取上述白色粉末1mmol加至50ml圆底烧瓶中，加入10ml DMF(sigma)，加入磁子搅拌溶解，然后加入2mmol Fluorescein(Thermo Fisher Scientific)，置于磁力搅拌器中避光搅拌反应1h，之后将反应液倒入分液漏斗中，于分液漏斗中加入50ml乙酸乙酯，50ml纯化水，盖上分液漏斗盖子，充分摇晃震荡，静置3min后，分液，上层再用50ml纯化水洗两次，之后加入50ml饱和NaCl洗1次，最后分液后将上层有机层分装到烧杯中，加入无水硫酸钠过夜干燥，次日将有机层加入至单口茄型瓶中通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到红色固体粉末。
其表征数据为：1H NMR(400MHz，氘代DMSO)，11.02(s，2H，COOH)8.35～8.05(s，4H，Ph-H)，8.00～8.10(s，3H，CONH)，7.75～7.80(s，2H，Ph-H)，7.00～7.08(s，2H，Ph-H)，6.05～6.50(s，10H，Ph-H)，5.35(s，2H，OH)，4.52(s，1H，CH)，3.20～3.30(t，4H，CH2)，1.25～1.85(m，30H，CH2)0.88(t，3H，CH2CH3)。
实验例
实验方法：用超纯水配置含有以下组分的基础发光液A(盐酸调整PH至9.8)：
200mM，2-氨基-2-甲基-1-丙醇
0.5mM，AMPPD
3mM，MgCl2
1mM，CTAB
0.5g/L，Proclin300；
取相同1L基础发光液A，分别加入贝克曼专利提及的增强剂与实例1中的增强剂，其对应实验组及相关加入量如下表1，其中，对照组为1号至4号，且1号为空白对照，2号、3号、4号为贝克曼专利提及的增强剂，测试样为实施例1的增强剂的为实验组，且为5号、6号以及7号。其中贝克曼专利提及的增强剂为Fluorescein-C14，其结构式为：
Figure BDA0002880242390000101
表1
Figure BDA0002880242390000102
Figure BDA0002880242390000111
以20ul 30ng/ml碱性磷酸酶溶液为样品，加入100ul表1中各种底物液，在Thermofisher化学发光检测器上37℃温育5min后检测发光强度，并记为发光值1，以20ul0.03ng/ml碱性磷酸酶溶液为样品，加入100ul表1中各种底物液，在Thermofisher化学发光检测器上37℃温育5min后检测发光强度，并记为发光值2。上述两种碱性磷酸酶溶液与不同底物液在第一次5min点测试后，继续长时间检测发光值，最后绘制成曲线；
表2
Figure BDA0002880242390000112
结果参见图1、图2和表2，表2显示，加入实施例1的底物液的发光值增强倍数高于贝克曼专利提及的增强剂，且在三种添加浓度上都有相同规律，说明该含有双氨基赖氨酸残基的荧光素衍生物具体提高酶促化学发光的作用；根据图1和图2可知，从长时间持续发光跟踪来看，本发明实施例提供的有机物添加AMPPD底物液中能加速酶促反应，使其化学发光值更快达到峰值，提高试剂检测的灵敏度。在实施例1的基础上在侧链烷烃基上进行胺基取代也能相对于Fluorescein-C14提高2倍以上的发光强度。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，有机物的结构式中包括荧光素发光基团骨架结构、至少含有2个氨基的氨基酸残基侨联结构以及与氨基酸残基侨联结构连接的烷烃基侧链，所述烷烃基为取代烷烃基或未取代烷烃基。
2.根据权利要求1所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，氨基酸残基侨联结构的至少两个氨基分别与荧光素发光基团骨架结构通过酰胺键键合，氨基酸残基侨联结构的羧基与烷烃基通过酰胺键键合；
优选地，形成所述氨基酸残基侨联结构的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，所述烷烃基选自未取代的直链烷烃基、含胺基取代的支链烷烃基和含胺基取代的支链烷烃基中的任意一种；
优选地，所述烷烃基为------(CH2)m-CH3、------(CH2)m-NH-(CH2)m-CH3、
Figure FDA0002880242380000011
Figure FDA0002880242380000012
以及
Figure FDA0002880242380000021
中的任意一种，其中，m为整数；
优选地，m为1-20，更优选为1-2或者10-20。
4.根据权利要求1所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，所述荧光素发光基团骨架选自
Figure FDA0002880242380000022
Figure FDA0002880242380000023
中的任意一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，所述有机物选自以下结构式中的任意一种：
Figure FDA0002880242380000031
Figure FDA0002880242380000032
m为整数，优选为1-20，更优选为10-20。
6.根据权利要求1所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，其特征在于，所述有机物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure FDA0002880242380000033
7.权利要求1所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物的制备方法，其特征在于，包括：
将至少含有2个氨基且氨基被氨基保护基保护的氨基酸与含有烷烃基的原料进行酰胺反应形成化合物1，而后脱除所述化合物1中氨基的氨基保护基形成化合物2，而后再将化合物2与荧光素进行酰胺反应，其中，化合物1为至少2个氨基被氨基保护且羧基与烷烃基通过酰胺键键合的中间体，化合物2为所有氨基脱去氨基保护基的且能与荧光素发光基团骨架通过酰胺键键合的中间体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，形成化合物1的条件为：至少含有2个氨基且氨基被氨基保护基保护的氨基酸与含有烷烃基的原料的摩尔比为1:1-1.2，温度为20～35℃，时间为0.5～3h；
优选地，所述化合物2与所述荧光素反应的条件为：所述化合物2与所述荧光素的摩尔比为1:2～2.5，反应温度为20～35℃，时间为0.5～3h。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，按照下述合成路径合成得到所需化合物：
Figure FDA0002880242380000041
10.一种用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的增强发光剂，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的用于提升碱性磷酸酶底物发光强度的有机物，且所述有机物在所述增强发光剂中的物质量的浓度为0.0005mM～1mM，优选0.001mM～0.005mM。
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