CN1880957A - 酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统 - Google Patents

Abstract

酶促化学发光底物其合成方法及酶促化学发光底物系统，属于免疫诊断技术领域。酶促化学发光底物系统由A、B两组成分组成，A组主要由酶促化学发光底物、增强剂、氨基酸组成，B组主要由氨基酸氧化酶和稳定剂组成，酶促化学发光底物通式为右式，其中，R₁为卤素，R₂为含有3－8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。本发明酶促化学发光底物系统发光信号强、持续时间长、常温保存期长。

Description

酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统

技术领域

本发明属于免疫诊断技术领域，特别涉及一种适用于过氧化物酶(辣根过氧化物酶HRP)或HRP标记的抗原抗体配合物痕量检测的酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统。

背景技术

20世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行分析检测，即利用发光的化学反应(chemiluminescence，CL)和生物反应(bioluminescence，BL)分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)因灵敏度高(attomole即10^-18mol)、快速、简便、测试中不使用有害、试剂，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

化学发光指化学反应引起的发光现象，发光原理是在一个反应体系中的A、B两种物质，通过化学反应生成一种激发态的产物(C^*)，在其回到基态的过程中，释放出的能量转变成光子(能量hγ)，从而产生发光现象。其反应式为： ， (h是普朗克常数，γ为发射光子的频率)。

化学发光反应的首要条件是反应体系必须提供足够的激发能，其活化焓(ΔH)应介于170～300kJ/mol之间，才能在可见光区域观察到化学发光现象；化学发光反应的第二个条件是吸收了化学能后处于激发态的分子必须以光子的形式将能量释放出来，或者将能量转移至另一个分子，使该分子被激发，当被激发的分子回到基态时，将以光子的形式释放能量。

目前，酶促化学发光检测主要有两大体系。一是碱性磷酸酶(alkalinephospharase，AP)催化的AMPPD(金刚烷衍生物)发光；一是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化的鲁米诺(Luminol)及其衍生物发光。由于AP较难获得高纯度制品，价格比HRP高约20倍；部分正常组织含有AP，某些病理情况下血中AP增加，也会对测定产生影响。并且AP催化AMPPD的发光反应是水解反应，发光强度较低，起光较慢，但是具有较长的平台期。目前AP所催化的底物技术仍处于专利的保护期。而HRP价廉易得，比活性可高达4500U/mg，HRP常用于生物分子、激素、肿瘤标志物的标记，约有60％的ELISA检测采用。并且HRP催化Luminol的发光反应是氧化-还原反应，该反应发光强度比AP系统有所提高，起光也较迅速，但缺点是该反应为闪光型化学发光，发光信号易衰减，一般发光在5分钟后迅速下降，30分钟后信号全部消失，直接影响其在检测中的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种发光信号强、持续时间长、常温保存期长的酶促化学发光底物、其合成方法及酶促化学发光底物系统。

为大上述目的，本发明采用如下技术方案：酶促化学发光底物，其特征在于，其通式如下：

其中，R₁为卤素，R₂为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。

R₁为F、Cl、Br、I，R₂为-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)N⁺(CH₃)Br^-、-(CH₂)₄SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)₃CO₂H、-CH₂CH(CH₃)CH₂SO₃ ^-Na⁺、-CH₂CH(CH₃)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Cl^-。

酶促化学发光底物合成方法，以邻二甲苯为原料，依次经过硝基化、卤化，然后在酸性条件下加入高锰酸钾氧化，生成含有卤素和硝基的邻苯二甲酸，再在苯环上引入烷基磺酸盐，生成物与肼及次硫酸盐反应制得高效发光剂。

酶促化学发光底物系统，由A、B两组成分组成，A组主要由酶促化学发光底物、增强剂、氨基酸组成，B组主要由氨基酸氧化酶和稳定剂组成，酶促化学发光底物通式为：

其中，R₁为卤素，R₂为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。

R₁为F、Cl、Br、I，R₂为-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)N⁺(CH₃)Br^-、-(CH₂)₄SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)₃CO₂H、-CH₂CH(CH₃)CH₂SO₃ ^-Na⁺、-CH₂CH(CH₃)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Cl^-。

增强剂为羟基香豆素、没食子酸或其衍生物，氨基酸为酪氨酸或色氨酸，稳定剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C。

酶促化学发光底物中R₁＝-Cl，R₂＝-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺，浓度为0.2-8.0mM；增强剂为羟基香豆素或/和没食子酸，浓度分别为0.1-10mM、0.05-4.5mM；氧化剂为氨基酸和氨基酸氧化酶，浓度分别为2-40mM、5-100mM。

A组还含有PH9.4的缓冲剂，B组还含有表面活性剂和PH6.5的缓冲剂。

本发明酶促化学发光底物在苯环上引入长链烷基磺酸盐类，大大降低了氧化还原反应的活化能，起光迅速，在2分钟内达到发光平台，同时发光剂的稳定性大大增强，且易溶于水，易于配制。与化学修饰前，发光的量子效率提高了数倍。氧化剂由氨基酸及氨基酸氧化酶提供，并分别配制于A，B液中。当A，B二者混合后，产生均速的H₂O₂。适当调整二者的浓度，在一定的时间范围内，H₂O₂的产生速率可保持不变，这就使化学发光反应速率也保持稳定，故平台期大大延长(约120分钟)，这在临床应用中具有独特的优势。在HRP的催化下，底物系统发生氧化还原反应，产生光子。在B组成分中还加入了稳定剂如抗氧剂亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C，可有效延长发光液的保存期(长达12个月)。

对本发明进行的相对发光光子数测定试验如下：化学发光仪选自AUTHOS公司的LUCY3系列化学发光仪；HRP购自SIGMA公司，RZ＞3.0；所用酶促化学发光检测试剂盒均为自产。

由于该复合增强剂的加入，使发光信号大大增强。与市售某国产发光底物相比结果如下：(同时用500pg SA-HRP加入100UL底物液做实验)

                            相对发光光子数(RLU)

本发明配制工作液：          1246.53

市售国产化学发光液：        120.25

本发明的发光值为1246.53，某国产化学发光液的相对发光值为120.25，相对发光值增加了10.36倍。

同时在发光系统中还加入了非离子表面活性剂如吐温-20及金属螯合物如DTPA、EDTA或EDTP等，可降低发光液的本底噪音。以空白酶标板孔做两种发光剂的背景信号：

                          相对发光光子数(RLU)

本发明配制工作液：        8.63

市售国产化学发光液：      23.56

两种发光液的背景噪音相比，下降了3倍。

利用本高效稳定化学发光底物系统测定(TSH)试验如下：

应用双抗体夹心法检测血清中TSH含量。TSH由α亚基和β亚基组成。

试验步骤：

1、包被：将纯化的抗-α亚基的单克隆抗体包被于微孔板上，制成固相抗体。用0.1mol/L碳酸盐缓冲液将抗体稀释到5ug/ml，取100UL加入不透光板式微孔中，4度过夜。次日用0.01mol/LPH7.4PBS洗涤三次，加入150UL的封闭液(0.01mol/LPH7.4PBS+3％BSA+5％蔗糖)，4度过夜。次日甩干，干燥备用。

2、用辣根过氧化物酶标记抗-β亚基的单克隆抗体。

3、测定：往包被板的微孔中加入TSH(标准品或待测样品)及酶标抗体，在37℃条件下，温育60分钟；特异性地形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”复合物，洗去未结合的酶标抗体。

4、每孔加混合后的底物100μl，室温反应5分钟。

5、化学发光检测仪检测发光强度。

本次实验测量结果(TSH)标准品的浓度及相应的发光值如下表：

标准品浓度C(uIU/ml)	相对发光值(RLU)
		0.1	62.35
0.25	133.977
		1	654.32
5	3318.015
		15	9775.417
30	19924.23
		100	62312.4

对标准浓度及发光值分别取对数后作线性回归图，得标准品浓度与相应发光值间的相关系数R2＝0.9993，由于使用本发明底物系统，检测线性范围大大提升。利用本发明化学发光底物系统最低检测限可达0.15μlU/ml，线性范围可达0.10～100μlU/ml。

利用本高效稳定化学发光底物系统测定定量检测孕酮(Progesterone)试验如下：

应用竞争性固相酶免疫测定技术检测血清中的孕酮含量。病人标本中的孕酮与酶标孕酮竞争结合包被板上固定和有限的抗体位点。

测定过程中，在微孔板各孔中分别加入标准品或血清样品后，再加入孕酮抗体和酶标孕酮混匀温育，则标准品或血清样品中所含的孕酮与酶标孕酮竞争结合固相抗体，形成固相抗体—抗原或固相抗体—酶标抗原复合物，洗涤除去未结合的抗原和酶标抗原后，加入化学发光底物，其发光强度与血清中的孕酮含量成反比。测定每孔发光值，以系列标准品的发光值为纵坐标(Y轴)，以标准品的浓度值为横坐标(X轴)作图，即得到标准曲线。血清样品中孕酮含量可相应从该标准曲线上查得。

操作步骤(用同一批试剂对比某市售底物与本发明中的底物作对比)：

1、取出两条包被条重复做实验。每孔分别加入10μl标准品或血清样品。(标准品为6个，浓度分别为0，0.5，1，2.5，10，20ng/ml)

2、每孔分别加入抗体溶液50μl。

3、每孔分别加入酶结合物50μl。

4、在微量振荡器上振荡30秒使其混合均匀。

5、贴封膜后，在室温条件(18～25℃)温育60分钟。

6、甩去孔内混合物，用工作浓度洗液洗涤微孔5次。每次冲洗后将水分甩尽，最后在吸水纸上拍干。切勿擦拭反应孔内壁。

7、每孔加入混合后的底物50μl，室温(18-25℃)反应5分钟。

8、使用化学发光仪检测各孔发光值。

从实验结果不难看出，本发明发光底物系统对低值的分辨力大大增强，灵敏度也进一步提高。

本次实验数据(孕酮P)标准品浓度及检测发光值如下表

标准品浓度C(ng/ml)	某市售发光底物发光值(RLU)	本发明化学发光底物发光值(RLU)
			0	883.954	3146.63
0.5	739.137	2560.16
			1	608.636	1895.94
2.5	405.19	771.978
			10	83.824	117.551
20	28.874	62.33

从实验结果看，本发明所用的底物的发光值超过市售发光值3倍，对低值的分辨力明显大增强，故灵敏度有了很大提高。

附图说明

图1为试验1所得样品标准浓度与发光值线性回归图；

图2为试验1所得样品标准浓度与发光值线性回归图；

具体实施方式

实施例、酶促化学发光底物系统由A、B两组成分组成，其中A液中：酶促化学发光底物为

其中，R₁＝-Cl，R₂＝-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺，浓度为0.15mM；羟基香豆素浓度为0.59mM；没食子酸浓度为0.35m；色氨酸浓度为1.5mM；Tris-Hcl缓冲液浓度为0.2M；PH＝9.4。B液中：氨基酸氧化酶浓度为0.85mM；吐温-20浓度为0.8％(V/V)；DTPA浓度为0.5mM；维生素C浓度为0.12mM；乙酸-乙酸盐缓冲液浓度为0.2M；；PH＝6.5。

Claims (8)

1、酶促化学发光底物，其特征在于，其通式如下：

其中，R₁为卤素，R₂为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。

2、如权利要求1所述的发光底物，其特征在于，R₁为F、Cl、Br、I，R₂为-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)N⁺(CH₃)Br^-、-(CH₂)₄SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)₃CO₂H、-CH₂CH(CH₃)CH₂SO₃ ^-Na⁺、-CH₂CH(CH₃)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Cl^-。

3、酶促化学发光底物合成方法，其特征在于，以邻二甲苯为原料，依次经过硝基化、卤化，然后在酸性条件下加入高锰酸钾氧化，生成含有卤素和硝基的邻苯二甲酸，再在苯环上引入烷基磺酸盐，生成物与肼及次硫酸盐反应制得高效发光剂。

4、酶促化学发光底物系统，其特征在于，由A、B两组成分组成，A组主要由酶促化学发光底物、增强剂、氨基酸组成，B组主要由氨基酸氧化酶和稳定剂组成，酶促化学发光底物通式为：

其中，R₁为卤素，R₂为含有3-8个C原子的烷基羧酸盐、烷基磺酸盐或者烷基铵盐。

5、如权利要求4所述的系统，其特征在于，R₁为F、Cl、Br、I，R₂为-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)N⁺(CH₃)Br^-、-(CH₂)₄SO₃ ^-Na⁺、-(CH₂)₃CO₂H、-CH₂CH(CH₃)CH₂SO₃ ^-Na⁺、-CH₂CH(CH₃)CH₂N(CH₃)₃ ⁺Cl^-。

6、如权利要求4或5所述的系统，其特征在于，增强剂为羟基香豆素、没食子酸或其衍生物，氨基酸为酪氨酸或色氨酸，稳定剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或维生素C。

7、如权利要求6所述的系统，其特征在于，酶促化学发光底物中R₁＝-Cl，R₂＝-(CH₂)₃SO₃ ^-Na⁺；增强剂为羟基香豆素或/和没食子酸，浓度分别为0.1-10mM、0.05-4.5mM；氧化剂为氨基酸和氨基酸氧化酶，浓度分别为2-40mM、5-100mM。

8、如权利要求7所述的系统，其特征在于，A组还含有PH9.4的缓冲剂，B组还含有表面活性剂和PH6.5的缓冲剂。

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