CN114681613A - 一种原位成胶化疗免疫药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种原位成胶化疗免疫药物组合物，包括第一组合物、第二组合物和第三组合物，所述第一组合物包括脂溶性免疫佐剂和表面活性剂，所述第二组合物包括能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，所述第三组合物包括易溶性海藻酸盐、保护填充剂和pH调节剂。本发明提供一种稳定性较好的组合物，能够较好的产生协同抗癌作用，降低副作用，同时降低癌症转移概率和复发概率，可以在有效杀灭原位肿瘤的同时通过免疫反应抑制远端转移肿瘤的生长和降低肿瘤复发的概率。本发明同时公开了该原位成胶化疗免疫组合物的制备方法，产品体系稳定性好，易于长期储存。

Description

一种原位成胶化疗免疫药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗药物领域，尤其涉及原位成胶化疗免疫组合物，以及其制备方法。
背景技术
化疗是目前临床治疗肿瘤的主要治疗方法之一，对那些有转移倾向的或者已经转移的肿瘤，化疗更是主要的治疗手段。然而临床常用的化疗模式都是全身性给药，对病变部位并没有很好地选择性，对正常器官也有毒副作用。如何能在局部治疗的同时又抑制肿瘤转移并预防其复发，一直是困扰全球的难题，此外，药物生产的可操作性，以及药物产品的灭菌和储存稳定性也都是难题。
尽管以免疫检查点阻断为代表的肿瘤免疫治疗近年来取得了令人鼓舞的成就，这一疗法还存在重要的局限性，包括临床响应率低、非特异性免疫反应带来的副作用等，意味着大部分患者对于这一代价昂贵的疗法是没有响应的。如何避免对整个身体造成损害，如何更好的放大癌细胞死亡后其肿瘤相关抗原的免疫原性以获得更强的肿瘤特异性免疫反应，如何更有效结合免疫检查点抑制剂或IDO(吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是人体色氨酸代谢的限速酶)抑制剂的作用从而进一步通过调节免疫平衡增强针对肿瘤的特异性免疫反应等一系列难题。这方面的新技术开发对癌症高发、而抗癌原研药研发较为落后的中国更是具有重要的现实意义。另外，在先申请CN110917345A报道了的实验室阶段药物已经具有很好的治疗效果，但是相关药物生产和使用中的可操作性，以及药物产品的灭菌和储存长期稳定性依然面临着一系列的难题，这些成药阶段的问题无法被解决，常常导致很多实验室药物无法真正的走向临床应用阶段。咪喹莫特现阶段的成熟剂型为乳膏制剂，常通过涂抹的方式作用于表皮病变部位，临床治疗尖锐湿疣等局部病毒感染导致的疾病，也有在临床试验中在被用于皮肤浅表肿瘤治疗的尝试。虽然其具有一定的免疫刺激功能，但是其单一的给药方式限制了咪喹莫特在身体内部各种肿瘤治疗中的应用。因此，需要开发新剂型解决其成药问题，从而将实验室药物推向临床应用。
发明内容
本发明提供一种原位成胶化疗免疫药物组合物，提供一种能够产生协同抗癌作用并降低癌症转移及复发概率的抗癌药物组合物，在有效杀灭原位肿瘤的同时还可以通过免疫反应抑制远端转移肿瘤的生长和降低肿瘤复发的概率，通过原位化疗的方式降低化疗副作用，同时提供了一种可量产的生产制备工艺，产品稳定性好。
本申请的研发团队在实验中发现，包含聚羧酸盐类辅料的组合物制剂，如果与含羧酸配体的铂类化疗药物配伍时，虽然混合配置后立刻使用并不影响其治疗效果，但是长期储存放置会出现组合物体系不稳定的情况，从而导致组合药物的存放期较短无法完全满足药品上市后长期存放的需求，通过研发团队大量的材料解析和实验验证后进一步发现，易溶性海藻酸盐的羧酸根会缓慢取代铂类化疗药物上的羧基与铂原子配位，从而导致了组合药物体系的不稳定问题，本研发团队进一步尝试通过改进剂型组合物的组合方式用以配合新的给药途径，克服了含羧酸配体的铂类化疗药物与易溶性海藻酸盐类辅料的配伍问题。
为解决相关技术问题，本发明提供了如下方案：
一种原位成胶化疗免疫药物组合物，包括第一组合物、第二组合物和第三组合物，所述第一组合物包括脂溶性免疫佐剂和表面活性剂，所述第二组合物包括能引起免疫原性死亡(immunogenic cell death，简称ICD)的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，所述第三组合物包括易溶性海藻酸盐和保护填充剂以及pH调节剂。
具体的，所述第一组合物中的脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)，或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的一种或多种。咪喹莫特(R873)，通常是作为软膏制剂用来治疗成人外生殖器和肛周尖锐湿疣的药物，还没有在临床肿瘤治疗上使用。本专利的技术采用ICD化疗药和免疫佐剂一同注射的方式，在ICD药物杀伤肿瘤产生肿瘤抗原的同时，抗原和佐剂起到了类似肿瘤疫苗的作用，不仅可以抑制转移瘤，而且还能预防肿瘤复发。
具体的，所述表面活性剂的疏水结构部分含20个以上的氧丙烯基单元；具体包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338或泊洛沙姆407。
并列可选地，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链；具体包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000或卵磷脂中的至少一种。
进一步地，所述表面活性剂优选为非离子型表面活性剂，可进一步提高材料的溶解性和稳定性。
进一步地，所述第一组合物为所述脂溶性免疫佐剂和所述表面活性剂的微米复合颗粒。所述咪喹莫特R837与泊洛沙姆188复合颗粒的粒径为0.5-5微米。
具体的，所述第二组合物中的能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物包括奈达铂、卡铂、洛铂或奥沙利铂中的一种或多种。
具体的，所述第二组合物中保护填充剂包括甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、明胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。
具体的，所述pH调节剂优选为一元有机弱酸，如乳酸或醋酸等。
具体的，所述第三组合物中所述易溶性海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾或海藻酸铵中的一种或多种。
优选的，所述海藻酸盐的粘度在80～400cP。这里海藻酸盐的粘度是其浓度为1％时的粘度，是一种规格性描述，可间接反映海藻酸盐的平均分子量，其中cP为粘度单位，1Pa.s＝1N.s/m2＝103cP。
具体的，所述第三组合物中保护填充剂包括甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、明胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。
具体的，还包括第四组合物，所述第四组合物包括免疫检查点抑制剂或IDO抑制剂。
具体的，所述免疫检查点抑制剂包括抗体类免疫检查点阻断剂、小分子类抑制剂或肽类抑制剂；优选的，所述抗体类免疫检查点阻断剂包括anti-CTLA-4、anti-PD-1或anti-PD-L1中的一种或多种；所述小分子类抑制剂包括CA-170、PM-327、BMS-8、BMS-37、BMS-202、BMS-230、BMS242、BMS-1001、BMS-1166、BMS-1001、BMS-1166或JQ1中的一种或多种；所述肽类抑制剂包括DPPA-1中的一种或多种。
具体的，所述IDO抑制剂包括BMS-986205、IDO inhibitor 1、NLG919，NLG8189、PF-06840003、Epacadostat或4-苯基咪唑中的一种或多种。
进一步可选的，所述第四组合物还包括成胶辅料，所述成胶辅料包括可溶性碱土金属离子的化合物。
本发明还提供一种原位成胶化疗免疫药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：按比例1：(0.025～5)称取脂溶性免疫佐剂和表面活性剂，粉碎形成微米混悬液,结束后取出匀浆，加水，搅拌混匀，105℃～150℃湿热灭菌10-15分钟；
S2：按比例1：(1～10)称取能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干；
S3：按比例1：(0.1～5)称取易溶性海藻酸盐与保护填充剂，加水，搅拌，加入乳酸将溶液pH调至6.8～7.5，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干；
此外，脂溶性免疫佐剂的颗粒尺寸在0.5～5微米时，可以在化药对肿瘤细胞进行杀灭后，保持稳步的释放，从而使增强免疫效果的浓度达到在释放时机上的最佳的配合关系。
采用本发明的技术方案，会具有如下的有益技术效果：
本发明技术方案解决治疗方案可实施性与成药阶段药物产品的储存长期稳定性的问题。第一组合物中咪喹莫特R837在121℃湿热灭菌后，会导致乳液不稳定产生明显的沉淀和颗粒，水分散性大打折扣，采取本发明所述表面活性剂与咪喹莫特R837形成的复合物颗粒可以大大帮助R837在灭菌后保证水分散性和稳定性。
本发明中技术方案通过新的剂型组合在保留了组合物的治疗效果的同时，克服含羧酸配体的铂类化疗药物与易溶性海藻酸盐类辅料的配伍问题。通过分别制备第二组合物能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，和所述第三组合物包括易溶性海藻酸盐、保护填充剂和pH调节剂，从在分子级别的物理空间上分散特性的隔离和化学特性的酸性抑制的组合，解决现有羧酸配体的铂类药物与易溶性海藻酸盐同时存在时导致铂类化疗药物的降解问题，以及进一步导致的杂质增加，产品的有效期缩短，以及潜在的药品安全性的技术问题。本发明中进一步公开组合物剂型以及制备方法，通过添加pH调节剂，进一步改善药品给药过程中的稳定性问题，避免了因材料的干燥及溶解过程带来的组合物pH变化的问题，解决了药物组合物从生产、保存到医师的配置使用等多个环节不同使用场景下的稳定性问题；材料混合后的保护填充剂也从分子层面降低分子碰撞相遇的几率，保护化药分子结构不被破坏，进一步克服含羧酸配体的铂类化疗药物与聚羧酸盐类辅料的配伍问题，大大增加了成药阶段的可实施性，也大大加快了冻干后复溶时间，方便临床操作。还进一步为临床中海藻酸盐的不同剂型提供不同的粘度配方，可适用不同的施药环节选择不同的粘度来调节药物在肿瘤内的滞留时间。组合物在注入瘤体后可形成多孔的网状交联结构，使得混合在海藻酸盐胶体里的其他组分能够缓慢释放，从而对含羧酸配体的铂类化疗药物进行限域锁定，在增强其效果同时大大降低其全身的毒副作用。
此外，本发明中所用的化疗药物为可以引起肿瘤免疫原性细胞死亡的化疗药物，在杀死肿瘤细胞的同时，暴露肿瘤相关抗原，提供了帮助免疫细胞识别癌细胞的靶标，激活免疫系统，使其特异性的清除癌细胞。但是该作用需要大量的抗原呈递细胞摄取、处理，并将抗原呈递给T细胞才能进一步激活这一免疫反应，而抗原呈递细胞又需要免疫佐剂的辅助才能更有效的富集到肿瘤部位并发挥作用。因此，在采用ICD类药物的同时，还需要引入免疫佐剂，协同增效抗肿瘤免疫反应。本发明将两者结合在一起，借助缓释体系，实现了原位消灭肿瘤细胞的同时在体产生了肿瘤疫苗，抑制肿瘤转移和复发。
附图说明
图1是原位成胶化疗免疫药物组合物的制备步骤示意图；
图2是使用不同粘度ALG导致的奥沙利铂的药代动力学数据图；
图3是使用不同粘度ALG导致的奥沙利铂的瘤内滞留统计图；
图4是CT26双侧肿瘤模型上的原位肿瘤生长曲线；
图5是CT26双侧肿瘤模型上的远端肿瘤生长曲线；
图6是H22双侧肿瘤模型上的原位肿瘤生长曲线；
图7是H22双侧肿瘤模型上的远端肿瘤生长曲线；
图8是Pan02双侧肿瘤模型上的原位肿瘤生长曲线；
图9是Pan02双侧肿瘤模型上的远端肿瘤生长曲线；
图10是含有不同粘度的海藻酸钠的组合物治疗的肿瘤生长情况；
图11是CT26模型上原位肿瘤内的淋巴细胞浸润情况；
图12是CT26模型上远端肿瘤内的淋巴细胞浸润情况。
具体实施方式
图1为原位成胶化疗免疫药物组合物的制备和使用步骤示意图。
实施例A1：
第一组合物的制备方法：
S1：称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级咪喹莫特R837。按比例1：(0.025～5)称取微米级脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837和表面活性剂泊洛沙姆188，优选2g R837，加入适量的泊洛沙姆188(0.05g，0.3g，0.6g，1g，2g，4g，6g，8g，10g)，加200ml注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10ml安瓿瓶中，每瓶6ml，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
第二组合物的制备方法：
S2：按比例1：(1～10)称取能引起免疫原性死亡的化疗药奥沙利铂和保护填充剂乳糖，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干。
具体的，配制奥沙利铂0.1-1％溶液，乳糖0.1-10％溶液，称取奥沙利铂适量(150mg，300mg，450mg，900mg)，乳糖适量(10mg/ml，35mg/ml)加入300ml一级水，于500ml烧杯中搅拌2-6小时(25℃-40℃，200-850rpm，以保鲜膜封住瓶口)。将获得的溶液经0.22微米滤膜过滤除菌。以60ml注射器灌装到20ml西林瓶，每瓶10ml,共30瓶。经过-80℃冰箱预冷30分钟后，冻干30小时。冻干后盖上橡胶盖，封上铝盖。
第三组合物的制备方法：
S3：按比例1：(0.1～5)称取易溶性海藻酸盐、保护填充剂和pH调节剂，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干。
具体的，配制海藻酸钠0.1-5％，乳糖0.1-10％溶液，优选的称取海藻酸钠ALG(3g或1.5g)，乳糖适量(10mg/ml，35mg/ml)，加入300ml一级水，加入乳酸将溶液pH调至6.8～7.5，于500ml烧杯中搅拌2-6小时(25℃-40℃，200-850rpm，以保鲜膜封住瓶口)。将获得的溶液经0.22微米滤膜过滤除菌。以60ml注射器灌装到20ml西林瓶，每瓶10ml,共30瓶。经过-80℃冰箱预冷30分钟后，冻干30小时。冻干后盖上橡胶盖，封上铝盖。
使用时，将第一组合物的混悬液加入到第二组合物冻干粉中，震荡混匀后，将混合溶液加入到第三组合物冻干粉中，通过震荡的方式充分混匀后注射。
第四组合物选用商业化的免疫检查点抑制剂：
免疫检查点抑制剂选自anti-CTLA-4、anti-PD-1和anti-PD-L1，或小分子抑制剂类包括CA-170、PM-327、BMS-8、BMS-37、BMS-202、BMS-230、BMS242、BMS-1001、BMS-1166、BMS-1001、BMS-1166或JQ1。
实施例A2：
第一组合物的制备方法：
S1：称取一定量的脂溶性免疫佐剂雷西莫特R848固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级雷西莫特R848。按比例1:(0.025～5)称取微米级脂溶性免疫佐剂雷西莫特R848和表面活性剂泊洛沙姆407，优选0.2g R848，加入适量的泊洛沙姆407(0.005g，0.05g，0.1g，0.2g，0.4g，0.8g，1g)，加200ml注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10ml安瓿瓶中，每瓶6ml，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
第二组合物的制备方法：
S2：按比例1：(1～10)称取能引起免疫原性死亡的化疗药洛铂和保护填充剂甘露醇，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干。
具体的，配制洛铂0.1-1％溶液，甘露醇0.1-10％溶液，称取洛铂适量(150mg，300mg，450mg，900mg)，甘露醇适量(20mg/ml，40mg/ml)加入300ml一级水，于500ml烧杯中搅拌2-6小时(25℃-40℃，200-850rpm，以保鲜膜封住瓶口)。将获得的溶液经0.22微米滤膜过滤除菌。以60ml注射器灌装到20ml西林瓶，每瓶10ml,共30瓶。经过-80℃冰箱预冷30分钟后，冻干30小时。冻干后盖上橡胶盖，封上铝盖。
第三组合物的制备方法：
S3：按比例1：(0.1～5)称取易溶性海藻酸盐、保护填充剂和pH调节剂，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干。
具体的，配制海藻酸钠0.1-5％，甘露醇0.1-10％溶液，优选的称取海藻酸钾(3g,或1.5g)，甘露醇适量(20mg/ml,40mg/ml)，加入300ml一级水，加入醋酸将溶液pH调至6.8～7.5，于500ml烧杯中搅拌2-6小时(25℃-40℃，200-850rpm，以保鲜膜封住瓶口)。将获得的溶液经0.22微米滤膜过滤除菌。以60ml注射器灌装到20ml西林瓶，每瓶10ml,共30瓶。经过-80℃冰箱预冷30分钟后，冻干30小时。冻干后盖上橡胶盖，封上铝盖。其中，所选的海藻酸钠的规格为浓度1％时粘度在80～400cP。不同粘度海藻酸钠配制过程现象如表1所示。当海藻酸钠粘度过大时，难以通过滤膜进行除菌，并很难进行转移，不能够满足后续使用要求，因此优选的海藻酸钠粘度范围为80-400cP。
表1：不同粘度海藻酸钠配制过程的现象。
粘度 现象
80cP 可通过滤膜；可使用注射器转移至西林瓶
97cP 可通过滤膜；可使用注射器转移至西林瓶
176cP 可通过滤膜；可使用注射器转移至西林瓶
200cP 可通过滤膜；可使用注射器转移至西林瓶
400cP 增加压力可通过滤膜；可使用注射器转移至西林瓶
480cP 粘度过高过滤操作困难
实施例B：
三组分的混合药液与冻干制剂的使用方案说明。
使用方案一：将上述实施例A1中的第二、三类组分的组合物冻干粉针剂加入第一组分组合物的悬液中混合均匀，通过临床介入给药和直接穿刺给药的方式，将组合物溶液直接注射到患者肿瘤部位，注射时采用多点注射的方式，保证组合物溶液均匀充满整个肿瘤。
在组合物注射入肿瘤后，首先，利用第三组合物中海藻酸盐遇到生物体组织内的钙离子或第四组合物中的成胶辅料会快速凝胶化，形成多孔的网状交联结构，使得混合在海藻酸盐里的其他三类组分能够得到缓慢释放，从而对含羧酸配体的铂类化疗药物进行限域锁定，在增强其效果同时降低其毒副作用；其次，第二组合物中的ICD化疗药不仅能有效地杀伤肿瘤细胞而且能使其产生免疫原性死亡，产生肿瘤相关抗原，激活肿瘤特异的免疫反应；再次，第一组合物中的脂溶性免疫佐剂增强了抗原提呈细胞的能力进一步放大了相应的免疫反应；此外，脂溶性免疫佐剂的颗粒尺寸在1～3微米时，可以在化药对肿瘤细胞进行杀灭后，保持稳步的释放，从而使增强免疫效果的浓度达到在释放时机上的最佳的配合关系。
四组分的混合药液与冻干制剂的使用方案说明。
使用方案二：将上述二、三、四类组分的组合物冻干粉针剂溶解于第一组分的悬液中，通过临床介入给药和直接穿刺给药的方式，将组合物溶液直接注射到患者肿瘤部位，注射时采用多点注射的方式，保证组合物溶液均匀充满整个肿瘤。
在组合物注射入肿瘤后，首先，利用第三组合物中海藻酸盐遇到生物体组织内的钙离子或第四组合物中的成胶辅料会快速凝胶化，形成多孔的网状交联结构，使得混合在海藻酸盐里的其他三类组分能够得到缓慢释放，从而对含羧酸配体的铂类化疗药物进行限域锁定，在增强其效果同时降低其毒副作用；其次，第二组合物中的ICD化疗药不仅能有效地杀伤肿瘤细胞而且能使其产生免疫原性死亡，产生肿瘤相关抗原，激活肿瘤特异的免疫反应；再次，第一组合物中的脂溶性免疫佐剂增强了抗原提呈细胞的能力进一步放大了相应的免疫反应；最后，利用第四类组分免疫检查点抑制剂或IDO抑制剂使得转移的肿瘤不能逃逸免疫反应，使得免疫治疗能更有效地杀伤肿瘤，从而抑制肿瘤的转移和复发。
使用方案三：将上述第二、三类组分的组合物冻干粉针剂溶解于第一组分的悬液中，通过临床介入给药和直接穿刺给药的方式，将组合物溶液直接注射到患者肿瘤部位，注射时采用多点注射的方式，保证组合物溶液均匀充满整个肿瘤；第四组合物通过静脉注射方式给药。
使用方案四：肿瘤患者在正常手术切除病灶部位后，考虑到手术切除不能完全清除病灶部位的肿瘤细胞的问题，可以将上述第二、三类组合物的冻干粉针剂溶解于第一组分的悬液中，然后用注射器或者喷瓶喷在手术切除后的创口部位，随后可以在该部位喷洒适量的氯化钙溶液使其凝胶化，最后再将创口缝合。第四组合物给药方案为静脉注射或喷涂创口。该方案有助于消灭残存的癌细胞，并且能抑制肿瘤转移和复发。
实施例C1：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级咪喹莫特R837粉体。
按比例1：(0.025～5)称取微米级脂溶性免疫佐剂咪喹莫特R837和表面活性剂泊洛沙姆188，优选2g R837，加入适量的泊洛沙姆188(0.05g，0.3g，0.6g，1g，2g，4g，6g，8g，10g)，加100mL注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。
将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次获得混悬液，加入注射用水定容至咪喹莫特浓度6.0mg/mL，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10mL安瓿瓶中，每瓶6mL，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
泊洛沙姆188是一种一类新型的高分子非离子表面活性剂，有多种用途包括：作乳化剂，稳定剂和增溶剂，可以进一步增强R837的水分散性和稳定性。
所用表面活性剂的疏水结构部分含20个以上的氧丙烯基单元；具体包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407。并列可选地，所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链；具体包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000，或卵磷脂中的至少一种。
泊洛沙姆是一系列多用途的药用辅料，由于无毒，无抗原性，无致敏性，无刺激性、不溶血，化学性质稳定。泊洛沙姆188是系列辅料中具有较好安全性的一种。泊洛沙姆188可以使得咪喹莫特气流粉碎后获得的微米级粉体得以利用液相微纳工艺进行加工获得尺寸均一性好的咪喹莫特微米级颗粒混悬液，泊洛沙姆188还可以帮助咪喹莫特微米级颗粒混悬液(6.0mg/mL及以下)在高压灭菌后保证水分散性和稳定性。
但是泊洛沙姆188包覆的咪喹莫特微米颗粒混悬液虽然在较低浓度(6.0mg/mL)高压灭菌后保持较好的混悬稳定性，如果灭菌时咪喹莫特浓度过高，则会导致灭菌后咪喹莫特团聚结块不能再稳定混悬。卵磷脂是一种天然表面活性剂，用卵磷脂作为稳定剂通过高压均质处理的咪喹莫特微米颗粒具有很好的稳定性，即使在高咪喹莫特浓度下高温灭菌，其混悬液依然不会团聚保持稳定混悬。
表2：咪喹莫特/表面活性剂混悬液制备工艺与数据；
Figure BDA0002874952640000111
Figure BDA0002874952640000121
气流粉碎联合高压均质或气流粉碎联合高剪切法的新型技术路线，制备了微米尺度的脂溶性免疫佐剂微米颗粒混悬液。该制备方法克服了微米颗粒的制备工艺中的技术偏见，即认为高压均质工艺或高剪切法工艺是一种液相的加工方法，而脂溶性免疫佐剂是一种半固态药剂，实验发现如果直接对脂溶性免疫佐剂进行高压均质处理，会造成均质阀的堵塞从而无法获得微米颗粒；而直接采用高剪切法虽然可以部分的得到微米颗粒，但是得到的微粒均匀性极差，大部分微粒无法达到预期的颗粒化粉碎效果和产率；而本发明中通过预先的气流粉碎工艺后获得初级粉体，加入表面活性剂的溶液条件下进行中进行高压均质或高剪切法，可以对高压均质或高剪切的微米颗粒进行快速的表面修饰和表面改性，因为有了表面活性剂的存在，使得脂溶性免疫佐剂可以离散化的分散在液相之中，从而使得脂溶性免疫佐剂的初级粉体得以利用液相微纳工艺进行加工且获得尺寸均一性好的脂溶性免疫佐剂微米级颗粒混悬液。
表3：将气流粉碎后的咪喹莫特微米颗粒粉体加入不同表面活性剂水溶液(咪喹莫特：表面活性剂质量比＝1：3)再进行高压均质处理后咪喹莫特的水分散性
Figure BDA0002874952640000122
表4：上述添加不同表面活性剂的咪喹莫特混悬液(6.0mg/mL)高压灭菌后的再分散性(咪喹莫特：表面活性剂质量比＝1:3)
Figure BDA0002874952640000131
表5：加入不同比例P188分散的咪喹莫特混悬液(灭菌时R837浓度＝6.0mg/mL)在高压灭菌后的混悬稳定性
泊洛沙姆188：R837 高压灭菌后的混悬稳定性
0.5:1 出现大量颗粒状聚集体
1:1 出现少量颗粒状聚集体
2:1 出现少量颗粒状聚集体
3:1 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
4:1 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
5:1 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
虽然理论上，分散剂越多，分散性越好，但比例一般不超过5:1，原因是：泊洛沙姆188(P188)本身有粘性，浓度过高粘度很大；且避免分散剂过多引入杂质。
表6：P188分散的不同浓度咪喹莫特混悬液在高压灭菌后的混悬稳定性(P188：咪喹莫特R837质量比＝3:1)。P188包覆的咪喹莫特混悬液在低R837浓度下高压灭菌能保持较好稳定性，但在R837浓度较高时，高压灭菌后混悬液的稳定性显著下降。
灭菌时R837浓度 高压灭菌后的混悬稳定性
3.0mg/mL 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
6.0mg/mL 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
9.0mg/mL 出现部分颗粒状聚集体
12.0mg/mL 出现大量颗粒状聚集体
15.0mg/mL 出现大量颗粒状聚集体
18.0mg/mL 出现大量颗粒状聚集体
表7：加入不同比例卵磷脂分散的咪喹莫特混悬液(灭菌时R837浓度＝6.0mg/mL或18mg/mL)在高压灭菌后的混悬稳定性。卵磷脂哪怕在较低的比例下都可以使高浓度咪喹莫特悬液高压灭菌后保持很好的混悬稳定性。
Figure BDA0002874952640000141
Figure BDA0002874952640000151
实施例C2：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂雷西莫特(R848)固体进行气流粉碎处理，粉碎气压6-10bar，得到微米级雷西莫特(R848)。
按比例1：(0.025～5)称取微米级脂溶性免疫佐剂雷西莫特(R848)和表面活性剂泊洛沙姆407，优选0.2g R848，加入适量的泊洛沙姆407(0.005g，0.01g，0.2g，0.4g，0.8g，1g)，加200mL注射用水，100-500rpm搅拌0.5-2小时，获得悬浊液。
将上述悬浊液于750-1200bar压力下高压均质2-4次获得混悬液，以蠕动泵吸取混悬液灌装到10mL安瓿瓶中，每瓶6mL，共30瓶。熔封后得到微米悬液，105℃～150℃湿热灭菌15-20分钟。
泊洛沙姆407是一种一类新型的高分子非离子表面活性剂，有多种用途包括：作乳化剂，稳定剂和增溶剂，可以进一步增强R848的水分散性和稳定性。
实施例C3：
称取一定量的脂溶性免疫佐剂吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)；选用的表面活性剂为泊洛沙姆188与卵磷脂的质量比9:1的混合表面活性剂，其他制备方法与实施例A2相同。
实施例C4：
其他制备方法与实施例A1相同，称取一定量的脂溶性免疫佐剂咪喹莫特(R837)；选用的表面活性剂为泊洛沙姆188与卵磷脂的质量比3:1的混合表面活性剂。不同表面活性剂的投料浓度对R837高压灭菌后的混悬稳定性有一定影响，结果如表8所示。在有卵磷脂存在的条件下，R837高压灭菌后的长期稳定性单独P188增溶R837的效果，获得颗粒的粒径更小且均一性更好。并且投料浓度的影响可等比例扩大，从而达到增加R837最终浓度的技术效果。
表8：加入不同浓度表面活性剂的R837高压灭菌后的混悬稳定性
R837:泊洛沙姆188:卵磷脂 高压灭菌后的长期稳定性
12mg/mL:36mg/mL:0mg/mL 出现大量颗粒状聚集体
12mg/mL:36mg/mL:12mg/mL 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
18mg/mL:54mg/mL:0mg/mL 出现大量颗粒状聚集体
18mg/mL:54mg/mL:18mg/mL 均匀分散且未出现颗粒状聚集体
可见，两种表面活性剂的混合，可进一步增加自缓释脂溶性免疫佐剂微米颗粒在高压灭菌中的混悬稳定性表现，尤其是较高的表面活性剂浓度时，表现突出。两种及以上的亲水亲油平衡值(HLB值)不同的表面活性剂组合或两种疏水结构部分不同的表面活性剂(例如，一种表面活性剂含20个以上的氧丙烯单元，或一种表面活性剂含有总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链)作为微米颗粒的包覆层。两种不同溶解性的表面活性剂并不是完全均质的相互分散，而是形成相对均匀和局部聚集的分散结构，形成的包覆层复合颗粒进入瘤体后，HLB值较大的表面活性剂首先溶解，从而在微米颗粒的包覆层表面形成一些微小开口或者微小的缺陷区域，从而使内层脂溶性免疫佐剂微米颗粒的表面积逐步变化，有效成分逐步释放，更可根据不同瘤体及人体的实际需要，通过调配两种或多种表面活性剂的配比关系，获得多种型号的药剂组合方案。
表9：加入不同比例的表面活性剂的R837高压灭菌后的粒径变化
Figure BDA0002874952640000161
Figure BDA0002874952640000171
同时，如表9所示，卵磷脂和P188同时存在得到的R837灭菌前后粒径变化最小，且粒径分布范围更小，即卵磷脂和P188同时存在更有助于样品在灭菌处理中的稳定性。其中，D50为样品中累计粒度分布达到50％时对应的粒径，D90为样品中累计粒度分布达到90％时对应的粒径，Dmax为样品中颗粒的最大粒径，三者差异越小，样品颗粒的均一度越高。在实验中还观察到，P188和卵磷脂同时存在的混悬液样品，久置后不会出现挂壁现象。值得说明的是，微米颗粒尺寸均一性是保证药物在体内具有稳定可重复的释放行为的一个重要参数。
实施例D：组合物配伍稳定性研究
其他制备方法于实施例A1相同，加入乳酸调节体系pH值，观察不同pH条件下的稳定性。
海藻酸钠是比较特殊的天然生物高分子材料，由于其在高温下会分解，因此无法采用传统的高温湿热灭菌，本专利采用过滤灭菌，保留了海藻酸钠的性质。另外，从灭菌的角度考虑，不能把海藻酸钠和咪喹莫特R837配在一起，海藻酸钠ALG需要过滤灭菌，但R837颗粒无法过滤(粉碎后颗粒直径最低为500nm，而过滤灭菌需要220nm的滤膜，因此不能通过)；另一方面，R837需要湿热灭菌，而海藻酸钠ALG高温会降解。因此，R837和ALG二者不能在一起灭菌。
另外，将咪喹莫特R837做成颗粒剂型，避免R837配成盐酸盐时与奥沙利铂(OXA)存在的配伍禁忌，OXA会与氯离子反应导致失活；其次，可以避免R837的盐酸盐会增加海藻酸钠(ALG)的粘度，造成治疗实施中使用难得增加的技术问题。
此外，该技术方案大大增加了产品存放的长期稳定性。海藻酸钠的羧酸根取代奥沙利铂的羧基，导致奥沙利铂与海藻酸钠的配伍不稳定，影响长期稳定性。本实验将海藻酸钠和奥沙利铂分开罐装冻干，使得两化合物之间不发生化学反应，并分别采用乳糖作为保护填充剂，保护分子结构不受破坏，且冻干粉有很好的复溶效果。
分别在奥沙利铂或者海藻酸钠中加入乳糖，乳糖作为低聚糖充当保护剂，既能在冻干过程中起到低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。可以有效的保护奥沙利铂和海藻酸钠在冻干过程中受到破坏，进一步增强化合物的稳定性。
所用的保护填充剂包括：甘露醇，或乳糖，或海藻糖，或蔗糖，或葡萄糖，或山梨醇，或木糖醇，或明胶，或羧甲基纤维素，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。其中乳糖，甘露醇，海藻糖，蔗糖，葡萄糖，山梨醇，木糖醇，明胶，羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或者多种对奥沙利铂或海藻酸钠都有很好的保护作用。
当加入乳酸溶液作为pH调节剂，将混合溶液调节至中性，可以很好的抑制海藻酸钠的羧酸根取代奥沙利铂的羧基，从而保持长期稳定性。所用的pH调节剂包括：乳酸和醋酸中的一种或多种。
表格10：对于不同pH条件下不同时间点的配伍稳定性:
Figure BDA0002874952640000181
Figure BDA0002874952640000191
从表格10的数据可以看出，如果海藻酸钠pH过高(如表格4中pH＝7.8)，在其与奥沙利铂配伍以后，在4小时后，奥沙利铂的杂质A草酸会快速增加，并超出产品质量标准。而控制pH在7.5以内(如表格4中pH＝7.3)，在与奥沙利铂配伍以后，4小时包括奥沙利铂杂质A草酸在内的所有杂质都增长缓慢，符合产品质量要求。
表格11：对于第一种剂型(不同保护填充剂)在2-8℃条件下不同时间点的稳定性:
Figure BDA0002874952640000192
表格11为奥沙利铂，海藻酸钠加保护剂(甘露醇/乳糖)的条件下在2-8℃的稳定性，从表格中可以看出添加乳糖或者甘露醇，该剂型的稳定性没有太大差别，5小时的杂质草酸增长至0.09％。
表格12：对于第二种剂型(不同保护填充剂)在常温条件下不同时间点的稳定性:
Figure BDA0002874952640000193
Figure BDA0002874952640000201
表格12为奥沙利铂加保护剂(甘露醇/乳糖)的条件下在常温条件下的稳定性，可以看出加乳糖或者甘露醇，稳定性没有太大差别，6小时的草酸增长至0.05％，稳定性优于第一种剂型。
表格13：对于不同保护填充剂条件下7天加速稳定性:
Figure BDA0002874952640000202
表格13为奥沙利铂加保护剂(甘露醇/乳糖)在冻干前，冻干后及25℃条件下放置7天(25℃-7天)的稳定性。从数据看出，单独奥沙利铂加保护剂(甘露醇/乳糖)7天的杂质A草酸基本没有变化，从而体现很好的稳定性。
表格14：保护填充剂不存在时，不同时间点的配伍稳定性:
Figure BDA0002874952640000203
表格14为奥沙利铂加海藻酸钠在保护剂不存在时的配伍稳定性。从数据中可以看出，没有保护剂的存在，在1小时里杂质A草酸的增长很快。
表格15：保护填充剂不存在时，不同pH条件下加速稳定性:
Figure BDA0002874952640000204
Figure BDA0002874952640000211
表格15为奥沙利铂加海藻酸钠在保护剂不存在时，在不同pH条件下的稳定性。pH越高，稳定性越不好。pH偏碱性条件下，10天的杂质含量有明显增长。
实施例E：本实施例用于治疗的具体效果如下：
实施例E1：不同粘度海藻酸盐的组合物药代动力学影响的研究；
实验方法：在小鼠背部接种小鼠结肠癌肿瘤，并将荷瘤小鼠分为四组，每组5只做药物的药代动力学实验。瘤内注射不同组分药物，并在不同时间点进行血液样品收集，检测血液中铂离子的相对含量，并在第72小时牺牲小鼠，检测瘤内铂离子含量。
第一组：游离药物组，瘤内注射奥沙利铂；
第二组：瘤内注射奥沙利铂和泊洛沙姆188分散的咪喹莫特微米颗粒；
第三组：瘤内注射奥沙利铂、泊洛沙姆188分散的咪喹莫特微米颗粒和粘度为80cP的海藻酸钠的混合物；
第四组：瘤内注射奥沙利铂、泊洛沙姆188分散的咪喹莫特微米颗粒和粘度为176cP的海藻酸钠的混合物。
本实施例的实验结果如图2和图3所示，图2使用不同粘度ALG导致的奥沙利铂的药代动力学数据图，为瘤内注射不同组分后，血液中药物的相对含量变化曲线，如图中所示，海藻酸钠的加入能够延长药物的缓释时间，延长了血液中药物峰值的出现时间，说明本发明所述组合物能够有效增强药物的缓释。此外，图3是使用不同粘度ALG导致的奥沙利铂的瘤内滞留统计图，所示的72小时小鼠瘤内药物相对含量说明高粘度的海藻酸钠显著增强了药物在肿瘤内的滞留时间。综合图2和图3，说明本发明所述药物组合物具有缓释作用，并随着海藻酸钠粘度的增加，缓释作用增强。
实施例E2：组合物在小鼠CT26肿瘤模型上的剂量爬坡实验
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠结肠癌肿瘤(左边视为原位肿瘤，右边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为6组，每组6只做联合免疫的治疗实验。
第一组：小鼠分别瘤内注射生理盐水(参照例)；
第二组：瘤内注射5微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第三组：瘤内注射10微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第四组：瘤内注射20微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第五组：瘤内注射30微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第六组：瘤内注射40微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠。
对左侧原位肿瘤进行注射，在瘤内注射后，对右侧远端肿瘤不进行注射，每隔两天用游标卡尺测量原位肿瘤和远端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。
CT26双侧肿瘤模型治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图4)和远端肿瘤生长曲线(图5)可以看出，第4组、第5组、第6组小鼠的原位肿瘤和远端肿瘤均得到了有效的抑制，几乎不再生长，并且抑瘤率都超过90％(表16)，证明该组合物极为有效。更为重要的是，这是在没有联合anti-PDL1抗体的前提下就获得了良好的治疗效果，因此具有非常好的应用前景与价值。其他对应的治疗组，部分具有一定的治疗效果，也有一些实验组的治疗效果是非常有限的。
表格16：实施例E2中各组原位肿瘤和远端肿瘤抑瘤率
分组 原位肿瘤抑瘤率(％) 远端肿瘤抑瘤率(％)
第一组 0 0
第二组 75 63
第三组 77 61
第四组 97 97
第五组 94 96
第六组 96 95
实施例E3：组合物在H22双侧肿瘤模型上的剂量爬坡实验
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠肝癌(H22)肿瘤(左边视为原位肿瘤，右边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为4组，每组6只做联合免疫的治疗实验。
第一组：小鼠分别瘤内注射生理盐水(参照例)；
第二组：瘤内注射10微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第三组：瘤内注射20微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第四组：瘤内注射40微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
对左侧原位肿瘤进行注射，在瘤内注射后，对右侧远端肿瘤不进行注射，每隔两天用游标卡尺测量原位肿瘤和远端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。
H22双侧肿瘤模型治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图6)来看，第3组和第4组小鼠的注射部位肿瘤得到了明显的抑制，在治疗期间几乎不再生长，抑瘤率均超过80％(表17)，效果显著。而从远端肿瘤生长曲线(图7)可知，第3组和第4组小鼠远端肿瘤受到明显抑制，抑瘤率超过60％，表现出明显的治疗效果。证明该组合物可以有效地抑制H22肝癌原位肿瘤和远端肿瘤的生长。
表格17：实施例E3中各组原位肿瘤和远端肿瘤抑瘤率
分组 原位肿瘤抑瘤率(％) 远端肿瘤抑瘤率(％)
第一组 0 0
第二组 35 46
第三组 86 63
第四组 91 80
实施例E4：组合物在Pan02双侧肿瘤模型上的剂量爬坡实验
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠胰腺癌(Pan02)肿瘤(左边视为原位肿瘤，右边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为3组，每组6只做联合免疫的治疗实验。
第一组：小鼠分别瘤内注射生理盐水(参照例)；
第二组：瘤内注射20微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
第三组：瘤内注射40微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
对左侧原位肿瘤进行注射，在瘤内注射后，对右侧远端肿瘤不进行注射，每隔两天用游标卡尺测量原位肿瘤和远端肿瘤的长和宽，肿瘤的体积为(长乘以(宽的平方))除以2。
Pan02双侧肿瘤模型治疗效果：从原位肿瘤生长曲线(图8)和远端肿瘤生长曲线(图9)来看，第3组小鼠的注射部位肿瘤和未注射部位远端肿瘤均得到了明显的抑制，抑瘤率均超过60％(表18)，表现出明显的治疗效果。证明该组合物可以有效地抑制Pan02胰腺癌原位肿瘤和远端肿瘤的生长。
表格18：实施例E4中各组原位肿瘤和远端肿瘤抑瘤率
Figure BDA0002874952640000241
Figure BDA0002874952640000251
实施例E5：不同粘度海藻酸盐对组合物抑制肿瘤生长效果的影响实验；
实验方法：在小鼠背部接种小鼠结肠癌肿瘤，并将小鼠随机分为4组，每组10只进行使用不同粘度的海藻酸钠的组合物对肿瘤的治疗实验。
第一组：小鼠肿瘤内注射生理盐水(参照例)；
第二组：瘤内注射30μL第一组分和第二组分混合物；
第三组：瘤内注射本发明所述组合物，其中海藻酸盐粘度为80cP；
第四组：瘤内注射本发明所述组合物，其中海藻酸钠粘度为200cP；
对肿瘤体积进行监控，每隔两天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长和宽，肿瘤的体积计算为(长乘以(宽的平方))除以2。
治疗效果：治疗结果如图10所示，与参照例相比，含有化药和脂溶性免疫佐剂的组合物能够抑制肿瘤生长，尤其是选用较高粘度的海藻酸钠时，抑制作用尤为明显，说明高粘度海藻酸钠有助于本发明所述化疗免疫组合物的疗效。但是，当海藻酸钠粘度过高时(超过400cP)，会导致溶液粘度过大不便于药液的配制和注射给药。因此，优选的海藻酸盐粘度为80-400cP。这里海藻酸盐的粘度是其浓度为1％时的粘度，是一种规格性描述，可间接反映海藻酸盐的平均分子量。
实施例E6：组合物对小鼠CT26肿瘤内T细胞调控
实验方法：在小鼠背部左右两端分别种植小鼠结肠癌肿瘤(左边视为原位肿瘤，右边视为远端肿瘤)，并将荷瘤小鼠分为2组，每组9只做免疫评价实验。
第一组：小鼠分别瘤内注射生理盐水(参照例)；
第二组：瘤内注射30微升奥沙利铂+泊洛沙姆188分散的咪喹莫特颗粒+海藻酸钠；
对左侧原位肿瘤进行注射，在瘤内注射后，对右侧远端肿瘤不进行注射，在注射药物后第72小时、120小时和168小时牺牲小鼠，取小鼠原位肿瘤和远端肿瘤进行流式检测，分析肿瘤内CD8阳性T细胞在肿瘤内的浸润情况。
免疫评价效果：从CT26模型上原位肿瘤(图11)和远端肿瘤(图12)内CD8阳性T细胞百分比可以看出，治疗组小鼠原位肿瘤和远端肿瘤在120小时后其CD8阳性T细胞的比例相比于第一组小鼠显著上升，证明该组合物能够上调具有治疗功能的CD8阳性T细胞在肿瘤内的比例，有效地激活特异性的抗肿瘤免疫反应。
癌症治疗是一个非常复杂的综合结果，因为无论是机体的免疫系统，以及癌细胞的生长机制都是非常复杂的。本实验之所以能够取得比较优异的治疗效果，除了本专利其他部分的解释外，可能还包括如下原因，采用咪喹莫特R837微米颗粒，将不溶于水的R837粉末在液相中粉碎获得1-5微米粒径，使得其兼具水相分散性和原位成胶状态下合适的释放周期，可以较好的与其他药物组分配合。
对所公开的实施例的上述说明，使得本技术领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是只需要符合与本文所公开的原理与特点一致即可。

Claims (11)

1.一种原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：第一组合物、第二组合物和第三组合物；所述第一组合物包括脂溶性免疫佐剂和表面活性剂，所述第二组合物包括能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，所述第三组合物包括易溶性海藻酸盐、保护填充剂和pH调节剂。
2.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述第一组合物中的脂溶性免疫佐剂包括咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述表面活性剂的疏水结构部分含不少于20个的氧丙烯基单元；具体包括泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338或泊洛沙姆407。
4.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述表面活性剂的疏水结构部分含总数不少于15个碳原子的一条或多条碳氢链；具体包括倍半油酸山梨坦，大豆磷脂，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40，聚山梨酯60，聚山梨酯65，聚山梨酯80，聚山梨酯85，硬脂山梨坦(司盘60)，硬脂酸盐，维生素E聚琥珀酸乙二醇酯，聚氧乙烯烷基醚，硬脂酸聚氧乙烯酯，硬脂酸聚烃氧(40)酯，蔗糖硬脂酸酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚西托醇1000或卵磷脂。
5.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述第二组合物中的能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物包括奈达铂、洛铂或奥沙利铂中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述第二组合物中保护填充剂包括甘露醇甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、明胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述第三组合物中所述易溶性海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾或海藻酸铵中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：还包括第四组合物，所述第四组合物包括免疫检查点抑制剂或IDO抑制剂。
9.根据权利要求8所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述免疫检查点抑制剂包括抗体类免疫检查点阻断剂、小分子类抑制剂或肽类抑制剂；优选的，所述抗体类免疫检查点阻断剂包括anti-CTLA-4、anti-PD-1或anti-PD-L1中的一种或多种；所述小分子类抑制剂包括CA-170、PM-327、BMS-8、BMS-37、BMS-202、BMS-230、BMS242、BMS-1001、BMS-1166、BMS-1001、BMS-1166或JQ1中的一种或多种；所述肽类抑制剂包括DPPA-1中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的原位成胶化疗免疫药物组合物，其特征在于：所述IDO抑制剂包括BMS-986205、IDO inhibitor 1、NLG919，NLG8189，PF-06840003，Epacadostat或4-苯基咪唑中的一种或多种。
11.一种原位成胶化疗免疫药物组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1：称取脂溶性免疫佐剂，通过气流粉碎工艺形成初级微米级粉体；按脂溶性免疫佐剂：表面活性剂质量比(1：0.025～5)向脂溶性免疫佐剂粉体中加入表面活性剂的水溶液，进行高压均质工艺或高剪切工艺处理，获得微米颗粒匀浆；灌注后湿热高压灭菌；
S2：按比例1：(1～10)称取能引起免疫原性死亡的含羧酸配体的铂类化疗药物和保护填充剂，加水，搅拌，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干；
S3：按比例1：(0.1～5)称取易溶性海藻酸盐与保护填充剂，加水，搅拌，加入乳酸将溶液pH调至6.8～7.5，将获得的溶液经微米滤膜过滤除菌；预冷后，进行冻干。
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