JP2023509463A - 細胞の標的集団の直接注射による治療のためのシステム及び医薬組成物 - Google Patents

Abstract

対象の細胞の標的集団に治療的処置を提供するためのシステム及び方法が提供される。 このシステムには、隔壁で囲まれたバイアルに注射可能な水溶液が含まれている。注射可能な水溶液は、標的となる細胞集団に注射するために処方されている。 この溶液は、治療薬を含み、治療薬の周りにコーティングを有する粒子を含み、コーティングは、粒子からの薬剤の制御された放出を提供するためにキトサンを含む。 この溶液は、ポリマーゲルマトリックスの形態のキトサンポリマーをさらに含み、水性ゲル環境からの粒子の制御された放出をさらに提供する。キトサンポリマー及びキトサン被覆粒子を含むバイアル内に配置された凍結乾燥粉末を製造する方法も提供され、粉末は、水と混合すると、粒子及びキトサンゲルの上記の注射可能な水溶液を形成する。 治療薬の局所送達を提供するために、腫瘍、眼球、膵臓組織、肝臓組織、及び肺組織を含むがこれらに限定されない標的細胞集団に上記の注射可能な水溶液を注射する方法がさらに提供される。【選択図】図１２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月３日に出願された米国仮出願番号６２／９５６，７９５号の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組込まれる。

本発明は、疾患及び腫瘍の治療のための標的細胞集団への注射のための治療用組成物、及びより具体的には、治療薬を含むキトサンゲル及びキトサン粒子の注射可能な水溶液、並びにそのような組成物を調製及び使用する方法に関する。

ヒトの腫瘍は、しばしば外科的切除によって治療される。 腫瘍治療は通常緊急の問題であり、特に固形悪性腫瘍の治療である。 これらの腫瘍には、骨髄性肉腫、円形細胞肉腫、メラニン性肉腫、紡錘細胞肉腫、及び乳頭腫が含まれる。 他のタイプの固形腫瘍は、医学技術の当業者によく知られている。

しばしば、腫瘍は完全に切除可能ではなく、これらの固形腫瘍は手術不能であると見なされる。 手術不能な固形腫瘍は、その位置又はサイズによってそのように分類することができる。 化学療法は、固形腫瘍の治療によく使用され、そのサイズを縮小して、手術可能にする。

化学療法は、以下の３つの異なる経路によって投与され得る：（１）全身静脈内（ＩＶ）、（２）動脈内、及び（３）腫瘍内。全身術前Ｉ．Ｖ． 治療は固形腫瘍の縮小又は収縮に効果的であることがわかっている。Ferriere, J. P. et al. (1998) Primary chemotherapy in breast cancer: correlation between tumor response and patient outcome, American journal of clinical oncology, 21(2), 117-120. さらに、Ｉ．Ｖ．経路は、転移性細胞（又は微小転移巣）が全身で治療されるように、生物全体に同時治療を提供する。 ただし、主要な問題の1つは、十分な量の抗腫瘍剤を標的の場所に送達することである。 全身化学療法は、用量を制限し、患者にとって耐えられない可能性のある重篤な副作用を引き起こす可能性がある。これらの副作用は、特に強力で有能な薬の使用を減ずる。 文献によると、ほとんどの薬は、最適な効果をもたらさない用量で、許容可能な副作用の限界（ＭＴＤ－最大許容用量）で全身投与される。

ＭＴＤに対するこの制限は、治療の成功に影響を与えるだけでなく、より耐性のある腫瘍を形成するという逆効果の結果をもたらす可能性がある。 特定の固形腫瘍内には、特定の用量レベルで化学療法剤に抵抗する能力が互いに異なる、同じタイプの腫瘍細胞のいくつかの集団が存在すると想定されている。Kinsella, A. R., Smith, D., & Pickard, M. (1997) Resistance to chemotherapeutic antimetabolites: a function of salvage pathway involvement and cellular response to DNA damage, British journal of cancer, 75(7), 935). ＭＴＤは、特定の腫瘍内の全てではないがほとんどの細胞を殺すことができる用量レベルである可能性がある。 結果として、より耐性のある癌細胞の残留量が残るだけでなく、広範な増殖のために、それらのより耐性のある細胞が腫瘍の大部分を支配し、将来その腫瘍を化学的に治療するためのより困難な課題を提供する。 もう1つの障害は、多くの抗腫瘍薬が相感受性である可能性があることである。 つまり、細胞が細胞周期の特定の段階にある場合にのみ、細胞と相互作用する。投与時に敏感な段階にない他の細胞は免れる。Ｉ．Ｖ．投与は比較的短時間であるため、高用量強度であっても腫瘍細胞の感受性相を見落とす可能性がある。 多くの腫瘍の治療は、有効性と有害事象の強度の低下の両方において、低用量、高頻度、又は継続的な投与スケジュールの恩恵を受ける可能性がある。

腫瘍内注射は、化学療法のための有望な代替技術であり、少なくとも概念的には、最も成功したアプローチを提示するはずである。 この方法では、抗腫瘍薬が腫瘍に直接投与されるため、高い局所濃度が達成され、全身性の副作用が回避される。 この方法はまた、投与量にほぼ無限の柔軟性を提供する。

これらの利点にもかかわらず、腫瘍内化学療法は特に効果的ではなかった。 この有効性の欠如は、以下の要因の1つ以上を反映していると想定されている：

腫瘍内の腫瘍細胞の密度は非常に高く、従って、血管を経由しないときに細胞を介した薬物の浸透を妨げる。

間質液圧は高く、薬剤が間質液に移動するのを防ぐ。

高密度の細胞及び血管は、血管自体を収縮させる。Jain, R. K. (1999) Transport of molecules, particles, and cells in solid tumors, Annual review of biomedical engineering, 1(1), 241-263を参照のこと。

腫瘍にアポトーシスを誘発することによってこれらの問題を軽減するための投与プロトコルが提案されている。例えば、M. Flashner-Barak,米国特許出願番号第２００２／００４１８８８Ａ１号、出願番号第０９／８２９，６２１号を参照のこと。

腫瘍内投与の失敗のその他の考えられる理由には、腫瘍全体への薬物の不均一な広がり、及び細胞が周期の感受性期に入るときに細胞を治療するのに十分長い期間の有効用量の欠如が含まれる。 次に、腫瘍内化学療法の問題は、これらの目標を達成するために、腫瘍全体に広がる十分に長い期間にわたって化学療法剤の十分に高い濃度を維持することに減少する。 腫瘍内注射は、ゲル、ペースト、微粒子を使用して実施されてきた。

キトサンは、甲殻類の外骨格に由来する無毒（ＬＤ５０＞ １６ｇ ／ ｋｇ）の生分解性の天然多糖類である。 キトサンの供給源は、甲殻類や昆虫のキューティクルの外骨格、真菌の細胞壁、軟体動物の殻などに最も豊富に含まれる天然のバイオポリマーであるキチンである。キチンは、β（１→４）結合を介して結合された２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコースモノマー（Ｎ－アセチルグルコサミンユニット）で構成され、そして キトサンはデアセチルα－（１，４）グルコサミンユニットのポリマーであり、甲殻類の殻又は外骨格の脱灰及び除タンパク後に、ＮａＯＨでキチンを脱アセチル化することによって通常得られる。キトサンは、生体適合性に優れ、免疫原性や皮膚刺激性のない多機能素材である。 ２００１年に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められている）物質として承認されている。キトサンは広く使用されているバイオマテリアルであり、人間の安全性プロファイルが確立されている。 これは、医薬品の賦形剤、減量サプリメント、実験的な粘膜補助剤として、またＦＤＡが承認した止血ドレッシングに使用される。 高分子量キトサン（＞ １００ｋＤａ）は、その長いポリマー鎖により、穏やかな水性溶媒中で高粘度の溶液を形成する。粘性溶液は、注射後のそれらの分子の拡散と分散を妨げるため、インビボでの薬物及び高分子の放出を制御するために広く使用されてきた。Baldrick, P. (2010) The safety of chitosan as a pharmaceutical excipient, Regulatory toxicology and pharmacology, 56(3), 290-299.

シスプラチン（シス－ジアンミンジクロロ白金－ＩＩ）などのプラチナベースの薬物は、最も広く使用されている化学療法剤の１つであり、 そして精巣、卵巣、乳房、結腸直腸、肺、頭頸部の腫瘍を含む、中枢神経系の外側のさまざまな固形新生物に対して有効性を示している。全身送達されたシスプラチンは、静脈送達後に脳で検出された血漿濃度の５％未満で、血液脳バリア（ＢＢＢ）のために、正常な脳組織への浸透が不十分である。ただし、腫瘍の新血管系は無傷のＢＢＢよりも透過性が高く、治療用シスプラチンレベルは原発性及び続発性脳腫瘍で検出されており、全身送達後の腫瘍に隣接する浮腫性脳ではそれほどではない。Perez, J. et al. (2019) The effect of locally delivered cisplatin is dependent on an intact immune function in an experimental glioma model, Scientific reports, 9(1), 5632.

免疫細胞によって放出される小さなタンパク質であるサイトカインは、免疫細胞が互いに通信することを可能にする。 サイトカインは、潜在的な癌治療としてしばらくの間調査されてきた。 しかし、他の免疫療法と併用するための既知の効力と可能性にもかかわらず、サイトカインはまだ効果的な癌療法にうまく開発されていない。 この失敗は、健康な組織と腫瘍の両方に対するサイトカインの高い毒性を反映している可能性があり、全身に投与される治療での使用には不適切である。

サイトカインを腫瘍に直接注射することは、それらの毒性効果を腫瘍に限定し、健康な組織を温存する方法を提供し得るが、そうする以前の試みは、タンパク質が癌性組織から体の循環に数分以内に漏れる結果となっている。

サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要である、広くて緩いカテゴリーの小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）である。 サイトカインはペプチドであり、細胞の脂質二重層を通過して細胞質に入ることができない。 サイトカインは、免疫調節剤としてオートクリンシグナル伝達、パラクリンシグナル伝達及び内分泌シグナル伝達に関与している。 ホルモンとの明確な区別は、現在も進行中の研究の一部である。

サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が含まれる。 サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞などの免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、さまざまな間質細胞など、さまざまな細胞によって産生され； 特定のサイトカインは、複数のタイプの細胞によって産生される可能性がある。Aznar, M. A. et al. (2017) Intratumoral delivery of immunotherapy-act locally, think globally, The Journal of Immunology, 198(1), 31-39.

サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要であり、体液性免疫応答と細胞ベースの免疫応答との間のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、成長、及び応答性を調節する。 一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強又は阻害する。

サイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２を含むインターロイキン、及び様々なケモカインが含まれるが、これらに限定されない。

イミキモド、患者および他の人に使用されている細菌からの細胞膜画分、合成シトシンホスフェート－グアノシン（ＣｐＧ）、オリゴデオキシヌクレオチド及びグルカンを含む、他の免疫調節剤も研究されている。

眼血管疾患は、世界中の視覚障害及び失明の主要な原因の１つである。 抗血管内皮成長因子（抗ＶＥＧＦ）剤の硝子体内注射は、新生血管加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）などの一般的な網膜疾患の治療に革命をもたらした。 さらに、血管新生緑内障、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、眼内腫瘍などの他の眼疾患に対する抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射で有望な結果が報告されている。

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、十分に特徴付けられ、広く研究されている疾患である。 現在、６０歳以上の患者の視覚障害の主な原因と考えられている。 初期のＡＭＤの特徴は、ドルーセンの形成、斑点での色素変化、及び軽度から中等度の視力喪失である。 ＡＭＤには、「ドライ」と「ウェット」の２つの形式がある。頻度は低くなるが、ＡＭＤによる急性失明の９０％の原因となる。リスク要因はＡＭＤの進行に関連しており、そしてそれらはＡＭＤがいかにして発展するかを理解するために関連している：（１）高齢化と環境要因への暴露は、黄斑に損傷を与える高レベルの酸化ストレスを誘発し、（２）炎症を引き起こすこの損傷は悪循環を誘発し、最終的に中枢視力喪失を引き起こす。

ＡＭＤを予防するための治療法も治療法もない。 ただし、ＡＭＤのウェットフォームに利用できるいくつかの治療法がある。 湿った形態の治療は、抗血管新生薬の導入により大きな進歩を遂げ； 機能的予後は、ほぼ確実な失明から、２年間の治療後に３ラインの視覚的改善の９０％以上の可能性に変化した。 それにもかかわらず、この進歩の後でも、治療は完璧にはほど遠いものであり、まだ十分な改善の余地がある。Hernandez-Zimbron, L. F. et al. (2018) Age-Related Macular Degeneration: New Paradigms for Treatment and Management of AMD, Oxidative medicine and cellular longevity, 2018, 8374647.

定期的な抗ＶＥＧＦ硝子体内注射に関連する治療負担を軽減することが優先事項である。 血管新生ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症は慢性の再発性障害である。 患者は、長年の治療で数十回の注射を必要とする場合がある。 このような厳しいレジメンの遵守は困難である。現在の有望なアプローチには、（a）抗ＶＥＧＦ薬を提供するための新しいハードウェア（b）生物学的効果のより長い耐久性を備えた新しい医薬品（c）徐放用の抗ＶＥＧＦ剤の新しい製剤及び（d）遺伝子療法が含まれる。Puliafito, C. A. et al. (2019) Looking ahead in retinal disease management: highlights of the 2019 angiogenesis, exudation and degeneration symposium. International journal of retina and vitreous, 5(1), 22.

現在、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びアフリベルセプトを含むいくつかの抗ＶＥＧＦ薬が利用可能である。 適切に設計されたランダム化臨床試験では、さまざまな網膜疾患の視覚的改善におけるこれらの薬剤の有効性が示されているが、硝子体内注射はそれぞれ、注射後及び薬物クラスに関連する有害事象のリスクをもたらす。 一般的に必要とされる反復的且つ長期の注射は、眼及び全身の合併症の可能性を高める可能性がある。Falavarjani, K. G. et al. (2013) Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature, Eye, 27(7), 787.

特に、ＡＭＤの最も一般的な治療は、硝子体内ベバシズマブ注射である。 注射は３～４週間ごとに投与され、患者にとって手続き上のリスクと不便の原因となる可能性がある。

膵臓組織、肺組織及び肝臓組織を含むがこれらに限定されない他の組織への薬物の標的化された送達は、これらの組織への治療を局所化し、そして 膵炎、糖尿病、脳癌、肺癌、肝炎などを含むこれらの組織に特有の疾患の治療に潜在的な利点がある。

本発明の１つの実施形態によれば、対象の細胞の標的集団への注射による送達のために処方された組成物が提供される。 この実施形態によれば、組成物は、キトサンゲル及び複数の粒子を含む水溶液を含み、前記粒子は、治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有し、前記コーティングは、粒子からの薬剤の制御放出を提供するためのキトサンを含む。

本発明の１つの実施形態によれば、対象の細胞の標的集団に治療的処置を送達するためのシステムを提供する。 この実施形態によれば、システムは、治療的処置の投与に使用される注射器の針によって貫通可能である隔壁で囲まれたバイアルを含む。この実施形態によれば、治療用組成物がバイアルに配置され、前記治療用組成物は、治療的処置の投与に使用するために提供され、そして キトサンゲルとゲルに埋め込まれた複数の粒子を含む水溶液を含み、前記ゲルは注射による投与に適した粘度を有する。この実施形態による粒子は、治療薬を含み、治療薬の周りにコーティングを有し、コーティングは、粒子からの薬剤の制御された放出を提供するようにキトサンを含む。

さらに関連する実施形態によれば、水溶液は、水和促進剤、粒子付着阻害剤、粒子凝集阻害剤、及びそれらの組み合わせから成る群から選択された化合物をさらに含む。

水和促進剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータ－プロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

粒子付着阻害剤は、ＨＰＭＣ、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

粒子凝集阻害剤は、単糖類、二糖類、糖アルコール、塩素化単糖類、塩素化二糖類、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

あるいは、又はさらに、組成物は、トリポリリン酸ナトリウムをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、粒子は、２００ｎｍ～２０００ｎｍの間の平均直径を有する微粒子である。 さらなるオプションとして、微粒子の平均直径は５００ｎｍ～２０００ｎｍである。

任意には、溶液はさらにキトサンでコーティングされていない遊離量の治療薬をさらに含み、ここで前記治療薬の遊離量は、水溶液中の治療薬の総量の約２０重量％～約８０重量％の間を構成する。

また、任意には、粒子中の治療薬は免疫治療薬である。 さらなる選択肢として、治療薬は、抗体、サイトカイン、小分子免疫療法薬、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

さらに関連する実施形態によれば、治療薬は化学療法剤である。

任意には、粒子はキトサンゲルと直接物理的に接触している。

別の実施形態によれば、本発明は、対象の細胞の標的集団を治療するための方法を提供する。この方法は、このセクションの冒頭で説明したシステムを入手し、水溶液を注射器に充填し、そして注射器を使用して、細胞の標的集団に前記水溶液を注入することを含む。

この方法の関連する実施形態によれば、細胞の標的集団は、腫瘍を含む。 別の関連する実施形態によれば、細胞の標的集団は、器官内の組織である。任意には、器官は、目、肺、膵臓、肝臓、腎臓、脳、心臓、甲状腺、及び下垂体から成る群から選択される。

別の実施形態によれば、対象の細胞の標的集団に治療的処置を送達するためのシステムが提供され、前記システムは治療的処置の投与に使用される注射器の針が貫通可能な隔壁で囲まれたバイアルを含む。この実施形態によれば、治療用組成物はバイアルに配置され、前記組成物は治療的処置の投与に使用するために提供され、そして 水と混合すると溶解してキトサンゲル及びゲルに埋め込まれた複数の粒子を含む水溶液を提供するように処方された凍結乾燥前駆体を含み、前記ゲルは注射による投与に適した粘度を有する。この実施形態によれば、前記粒子は、治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有する粒子を有し、前記コーティングは粒子からの治療薬の制御放出を提供するためのキトサンを含む。

別の実施形態によれば、標的化された細胞集団に治療的処置を送達するためのシステムを提供するための凍結乾燥法を提供する。この方法は、以下を含む：（１）キトサンゲル及び複数の粒子を含む水溶液を形成し、前記粒子は治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有し、前記コーティングは、粒子からの薬剤の制御放出を提供するためにキトサンを含み、（２）アルコール水溶液の凍結温度より高い温度で、せいぜい－８０℃で、アルコール水溶液を含む浴中で最初の水溶液を凍結して、凍結層前駆体を形成し、（３）凍結層前駆体を乾燥させて、粒子が埋め込まれた無水粉末を形成し、（４）治療的処置の投与に使用される注射器の針によって貫通可能な隔壁で囲まれたバイアル内に無水粉末を含み、そして（５）容器に水を加えて無水粉末を溶解する。

任意には、凍結乾燥法における水溶液は、水和促進剤、粒子付着阻害剤、および粒子凝集阻害剤をさらに含む。

凍結乾燥法のさらに関連する実施形態によれば、水和促進剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータ－プロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。 また、任意には、粒子付着阻害剤は、ＨＰＭＣ、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせを含む。 関連する実施形態によれば、粒子凝集阻害剤は、単糖類、二糖類、糖アルコール、塩素化単糖類、塩素化二糖類、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。任意には、組成物はトリポリリン酸ナトリウムをさらに含む。 また、任意には、粒子は、２００ｎｍ～２０００ｎｍの間の平均直径を有する微粒子である。 さらなるオプションとして、粒子は、５００ｎｍ～２０００ｎｍの間の平均直径を有する微粒子である。

本発明のいくつかの実施形態よれば、粒子ベースの組成物は、眼の状態を治療するための硝子体内注射による送達のために処方される。

任意には、眼疾患は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）である。

いくつかの実施形態によれば、硝子体内注射のための治療薬は、抗体、サイトカイン、小分子免疫療法薬、化学療法薬、アプタマー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。 いくつかの実施形態によれば、硝子体内注射のための治療薬はベバシズマブである。

実施形態の前述の特徴は、添付の図面を参照して取られた以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解されるであろう。

図１Ａは、－８０℃で凍結され、適切に保存された、本発明（ＰＲＶ３１１）による注射可能なキトサン製剤を示す。 特に、製剤は透明な水溶液を提供する。 （左）対室温（中央）でのＰＲＶ３１１、及びＰＲＶ１１１（右）。 ＰＲＶ１１１はＰＲＶ３１１と同様の製品であるが、製造時に－８０℃の冷凍庫ではなく、液体窒素（－１９６℃）でより迅速に凍結されている。

図１Ｂは、比較のために、本発明（ＰＲＶ３１１）による、－８０℃で凍結され、室温で５日間保存された注射可能なキトサン製剤を示す。

図１Ｃは、比較のために、本発明（ＰＲＶ３１１）による、－１９６℃で液体窒素中で凍結され、室温で５日間保存された注射可能なキトサン製剤を示す。

図２は、シスプラチン内部標準を含む注射可能なキトサン粉末のＦＴＩＲスペクトルを示し、１４００及び１５６０ｃｍ ^－１にピークを有する。

図３は、液体窒素（－１９６℃）で凍結され、続いて凍結乾燥された場合のマトリックス（２倍ズーム）の写真を示す。 多層で高密度の生地のような構造に注意してください。

図４は、－８０℃のチェストフリーザーで凍結し、続いて凍結乾燥した場合のマトリックス（２倍ズーム）の写真を示す。 より多孔質で均一な単層ポリマー繊維に注意してください。

図５は、様々なｐＨレベルの媒体中の微粒子からの薬物の放出プロファイルを示す。 粉末をそれぞれの媒体で再構成し、７２時間撹拌しながら透析バッグの中に入れた。 サンプルを採取し、放出率を示す。ｐＨ６（円）の微粒子は分解が速いためより速く放出され、ｐＨ ３（三角形）の微粒子は粒子の安定性が高いためより遅い速度で放出される。 遊離シスプラチン溶液（四角）を対照として使用した。

図６は、異なる治療を含む、マウス腫瘍体積対時間の変化のグラフを示す。 黒の曲線は対照の未治療腫瘍に対応し、灰色の曲線は薬物を含まないプラセボ粒子の腫瘍内注射に対応し、緑の曲線は薬物の静脈内注射に対応し、赤の曲線は遊離薬物の腫瘍内注射に対応し、そして青い曲線は、薬物でカプセル化されたヒドロゲルＰＲＶ３１１の注射に対応する。

図７は、蛍光顕微鏡で見た、本発明の実施形態によるキトサン製剤であるＰＲＶ３１１の注射後の子羊組織の断面図を示す。 ここでは、薬剤はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されており、顕微鏡下では緑色に見える。

図８は、組織の深さの関数としてのブタ舌組織内のＦＩＴＣ標識薬物濃度を示すグラフである。

図９は、本発明の実施形態を使用した腫瘍内注射及びＦＩＴＣで標識された薬物の局所分布を示す写真である。

図１０は、本発明の実施形態による注射剤の牛の脳への浸透を示す写真である。

図１１は、注射用に構成された本発明の実施形態を大幅に拡大して示す図である。

図１２は、本発明の実施形態による、注射可能な溶液ＰＲＶ３１１が、腫瘍内及び腫瘍の周囲に高分子ウェブをどのように構築するかを大きく拡大して示す図である。

図１３Ａ及び図１３Ｂは、本発明の実施形態による、ＰＲＶ３１１を示す顕微鏡写真である。

図１４は、本発明の実施形態に従って、数秒以内に臨床使用のための再構成に適した製剤を開発する過程で、本発明者らによって評価された８０を超える製剤のいくつかを示す写真である。 特に、解決策は明確である。

図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５Ｃは、蛍光標識された薬剤を含むＰＲＶ３１１製剤を羊の目に注射したもので、角膜が完全に覆われ、浸透していることを示している。

図１６は、ポリマー（赤）及び薬物（緑）の別々の蛍光標識を用いた注射を示し、ボーラス及び制御された送達の両方がどのようにもたらされ得るかを示している。

図１７は、蛍光標識されたＰＲＶ３１１の肺組織への注射を示しており、注射後２４時間以上にわたって高い局所濃度の薬物を示している。

図１８は、羊の肝臓へのＰＲＶ３１１の注射を示しており、これもまた、薬物の局所濃度が高いことを示している。

図１９は、羊の肝臓へのＰＲＶ３１１の注射の側面図を示しており、組織のタイプが薬物分布パターンに影響を与えることを示している。

図２０は、羊膵臓へのＰＲＶ３１１の局所注射を示し、高い局所薬物濃度を示し、その組織タイプは、局所薬物分布パターンに影響を与える。

定義。 この説明及び付随する特許請求の範囲で使用される場合、特に断らない限り、以下の用語は示された意味を有するものとする。

「対象」には、哺乳動物などの脊椎動物、及びさらにはヒトなどが含まれる。

「ポリマー」は、少なくとも１００単位のモノマーを有する分子である。

ポリマー「マトリックス」は、ポリマー分子の三次元ウェブであり、ウェブは、非共有的に絡み合っている、イオン的に架橋されている、共有的に架橋されている、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

「ゲル」は、絡み合い及び架橋を保持しながら、溶媒中で膨潤するポリマーマトリックスの溶液相である。

「微粒子」は、約２００ｎｍ～約２０００ｎｍの平均直径を有する粒子のセットである。 「ナノ粒子」は、少なくとも１ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する粒子の集合である。

「粒子径」又は「粒子サイズ」は、粒子の表面上の２点間の最長の直線軸の長さである。

「純粋なキトサン」は、キトサンの塩ではないキトサンである。

「未修飾キトサン」は、官能基の添加によって、又は担体への結合によって化学的に修飾されていないキトサンである。

「未修飾の治療薬」は、官能基の添加によって、又は担体への結合によって化学的に修飾されていない治療薬である。

「免疫療法剤」は、免疫応答を調節する治療薬である。 免疫療法薬は、生物学的又は小分子薬であり得る。

「化学療法剤」は、小分子薬である治療薬である。

「アプタマー」は、生物学的標的に結合するためのインビトロ選択法によって選択された核酸又は修飾核酸である。 「アプタマー」の注目すべき例は、ＶＥＧＦに結合し、湿性黄斑変性症の治療に使用される薬剤ペガプタニブ（商品名Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））である。

「微粒子付着阻害剤」は、ポリマーマトリックスとその中に埋め込まれた粒子との間の引力を低下させる添加剤である。 結果として、粒子は、付着阻害剤がない場合よりも速い速度でマトリックスを移動することができる。

「微粒子凝集阻害剤」は、マトリックスが凍結にさらされたときに、マトリックスに埋め込まれた粒子が凝集する傾向を低下させる添加剤である。 その結果、凍結が発生したときに粒子が損傷や破壊を受ける可能性が低くなる。

「粘膜付着性」材料は、人体の粘膜に付着する能力を有することを特徴とする。

ポリマーマトリックスは、その体積の一部が空隙である場合、「多孔性」である。 場合によっては、マトリックスの外面からボイド空間にアクセスできるため、微粒子などのボイド空間に存在するアイテムが外面に移動したり、外面から移動したりすることがある。

ポリマーマトリックス中の「ボイド」空間は、ポリマーによって占められていない空間であり、空間を通る微粒子及び小分子の移動を可能にする。

「粘膜組織」は、関連する粘膜を有する組織である。 特に、粘膜組織には、粘膜及び粘膜の下にある組織が含まれる。

例えば、癌性腫瘍が存在する「粘膜組織内の部位」は、粘膜だけでなく、粘膜の下にある組織も含み得る。

「多分散性指数」（ＰＤＩ）または単に「分散性」は、粒子のセット、例えば混合物中の微粒子のサイズの不均一性の尺度である。

「ゼータ電位」（ＺＰ）は、粒子が特定の媒体において獲得する全体的な電荷の尺度である。 ＺＰは、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ機器で測定できる。

「浸透」は、粘膜、その下にある組織、又はその両方を通過または浸透する能力である。「生体適合性」とは、その治療の受要者又は受益者に重大な望ましくない局所的又は全身的影響を誘発することなく、 しかし、その特定の状況で最も適切な有益な細胞または組織の反応を生成し、その治療の臨床的に関連するパフォーマンスを最適化して、医学的治療に関してその所望の機能を実行する生体材料の能力を指す。

「ＨＰＭＣ」は、ヒプロメロースとしても知られるヒドロキシプロピルメチルセルロースを指す。

「生分解性」とは、生物の作用によって特に無害な生成物に分解することができる材料の特性を指す。

「キロカウント／秒」（Ｋｃｐｓ）」、平均カウント率（キロカウント／秒（ｋｃｐｓ））。例えば、サンプルのカウント率が１００未満の場合、測定を中止する必要があるように閾値を設定でき、これは、サンプルの濃度が測定するには低すぎることを意味する。適切なＫｃｐｓを備えたサンプルは、測定のための理想濃度を備えた安定したサンプルと見なすことができる。

「メッシュ」とは、処理された領域に付着したポリマーマトリックスを指し、処理された領域に適用された場合にメッシュから放出されるようにその中に組み込まれた要素を含む。

「高分子マトリックスおよび微粒子に基づく治療薬の送達のためのシステム」はまた、「薬剤送達装置」又は「送達パッチ」と呼ばれ得る。

特に断らない限り、「重量％」という用語は、重量パーセントで表される、治療薬の送達のためのシステムの成分の量を指す。

特に断らない限り、ポリマーの「モル質量」は、ポリマー分子の数平均モル質量を意味することを意図している。

癌は、任意の年齢の任意の器官の任意の組織で発生する可能性がある。 癌の明確な診断が下されると、治療の決定が最も重要になる。 全ての癌に単一の治療アプローチを適用できるわけではないが、成功する治療法は原発腫瘍とその転移の両方に焦点を当てる必要がある。 歴史的に、外科手術や放射線療法などの局所的及び局所的療法は、化学療法薬などの全身療法と共に、癌治療に使用されてきた。 ある程度の成功にもかかわらず、従来の治療法は望ましい程度に効果的ではなく、より効果的な治療法の探求が続けられている。 より効率的な癌治療に対する重要で満たされていない必要性が明らかにある。

本発明の実施形態の主な用途の１つは、腫瘍内の薬物の高濃度を維持し、局所的及び局所的な方法で腫瘍を治療するための最も効果的な方法を確保するためにリンパ節に薬物の一部を排出するための最良の方法を示すデータを使用しての、化学療法及び免疫療法の腫瘍内注射のためである。

腫瘍内注射は、原発巣又はその転移が、直接注射によって、又は結腸鏡検査、膀胱鏡検査、気管支鏡検査、胸腔鏡検査、共腸鏡検査、さらには手術などの特定の手順によって経皮的にアクセス可能である任意の腫瘍に対して考慮され得る。

現在、腫瘍内療法におけるそれらの役割について調査されている多数の薬剤があり、それらは免疫受容体アゴニスト（トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、インターフェロン遺伝子刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、ＩＣＴ ｍＡｂ、野生型及び遺伝子改変腫瘍溶解剤（ウイルスやペプチドなど）、 さまざまな潜在的な標的に向けられたサイトカイン及び免疫細胞）を含む。従って、ヒトの腫瘍内戦略の臨床的発達を支援するために、本発明者らは、これらの薬剤の局所送達及び保持のための注射可能なシステムを開発した。

さらに、腫瘍への直接注射は、全身曝露、標的外毒性、及び使用される薬物の量を低減する一方で、注射された腫瘍病変及び遠隔の非注射腫瘍病変においてより強い抗腫瘍活性を誘導する。

全身免疫療法及び全身化学療法がしばしば使用されるが、それらは患者の全身を薬物の毒性副作用にさらす。 全身投与は、血流及び他の器官内の曝露のために用量制限であり、この全身曝露の安全性を考慮して予防措置を講じる必要があるためである。 全身送達は、しばしば、体と反応する有毒な薬物からの有害な副作用をもたらす。 これらには、神経毒性、腎毒性、腎不全、脱毛、悪心及び粘膜炎が含まれる。 手術の代わりに、放射線に加えて化学療法も肛門腫瘍を治療する方法として使用される。現在の標準的なケアでは、小さな局所腫瘍がある場合でも、肛門管扁平上皮癌の患者に対して、化学療法と放射線の最初の同時併用を使用している。 化学療法を使用する場合、一時的な中央静脈カテーテル又は末梢に挿入された中央カテーテルを個人に使用することができる。 治療による副作用には、全身化学療法に典型的なものが含まれる。 これらには、吐き気、脱毛、腎臓の損傷、血球数の減少、口の痛み、免疫システムの低下などがある。 現在、化学療法は全身に投与されているため、用量制限要因がある。

薬物の治療上の利点は、その有効性を最大化すること、及び／又はその副作用を低減することによって増加させることができる。 地域の抗癌剤療法の開発の基礎は、全身分布、従って毒性を最小限に抑えながら、効果的な標的組織濃度を達成することである。 既存の臨床的に使用される局所化学療法の例には、肝臓及び腎臓の新生物に対する動脈内注入、黒色腫及び肉腫に対する肢の灌流、ＣＮＳ新生物に対する髄腔内投与、及び腹腔内新生物に対する腹腔内投与が含まれる。 最近では、原発性肝細胞腫に対する純粋なエタノールの腫瘍内直接注射が開発されている。ほとんどの細胞毒性化学療法剤に関連する1つの大きな欠点は、それらが強力な膀胱薬であり、従って、送達技術が薬物を腫瘍に局所的に維持し、健康な組織への漏出を可能にしない限り、腫瘍内投与の理想的な候補ではないという事実である。 本発明の実施形態は、ポリマー薬物負荷キトサン粒子の組み合わせ及びポリマーの組み合わせを使用して、腫瘍における薬物保持及び低減された副作用を確実にする。

腫瘍内免疫療法は、腫瘍をそれ自体のワクチンとして使用することを目的とする治療戦略である。 腫瘍に直接注射すると、少量の薬剤を使用しながら、高濃度の免疫刺激産物をその場で達成することができる。 免疫療法の局所送達は、重大な全身曝露及び標的外毒性を防ぎながら、複数の併用療法を可能にする。 従って、所定の癌の優勢なエピトープが不確かであるにもかかわらず、それらの特徴づけを必要とせずに、関連する新抗原又は腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発することができる。このような免疫刺激は、適切に活性化された抗腫瘍免疫細胞の循環のおかげで、全身性（アブスコパル）腫瘍反応を生成しながら、局所的に癌免疫の強力なプライミングを誘発することができる。 癌免疫療法開発の現在の制限の多くに対処する一方で、腫瘍内免疫療法は、すべての腫瘍注射で連続的かつ多焦点の生検を可能にすることにより、癌免疫のダイナミクスをよりよく理解するユニークな機会も提供する。Marabelle, A. et al. (2018) Starting the fight in the tumor: expert recommendations for the development of human intratumoral immunotherapy (HIT-IT), Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology, 29(11), 2163-2174.

免疫療法の５つのクラスすべてが、送達の課題に直面している。 チェックポイント阻害剤、サイトカイン、及びアゴニスト抗体には、同様の送達の課題がある。 これらの治療法の成功は、標的タンパク質との相互作用に依存している。 それらの使用の主な制限は、それらが実質的な自己免疫を生み出し、許容される投与量を制限する悪影響をもたらすことである。 このため、これらの治療法の送達技術の開発における中心的な目標は、標的化された制御放出を可能にして、治療法が主に目的の細胞タイプで活性化し、それによってオフターゲット効果を最小限に抑えることである。

多くの固形腫瘍における微小環境は、ここで論じられる全ての免疫療法クラスの広範な実施への挑戦である。 例えば、固形腫瘍の微小環境は、免疫学的に「高温」（高い免疫原性）又は「低温」（低免疫原性）のいずれかに分類でき、それぞれ腫瘍空間内に高レベル又は低レベルの細胞毒性リンパ球浸潤がある。 微小環境の組成におけるこの重要な違いは、免疫原性の高い腫瘍は、免疫原性の低い腫瘍よりもチェックポイント阻害剤に対して強い反応を示すことを示唆している。

送達技術を利用して、冷腫瘍における免疫原性を調節することができる。 さらに、送達プラットフォームは、特定の組織への薬物曝露を制限することにより、免疫療法の全身毒性を低減することもできるため、毒性が高すぎて患者に投与できない治療法の組み合わせを送達するために使用できる。

本発明の実施形態を使用する免疫療法の局所送達は、有意な全身曝露及び標的外毒性を防止しながら、複数の併用療法を可能にする。 所定の癌の優勢なエピトープが不確かであるにもかかわらず、それらの特徴づけを必要とせずに、関連する新抗原又は腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発することができる。 このような免疫刺激は、適切に活性化された抗腫瘍免疫細胞の循環のおかげで、全身性（アブスコパル）腫瘍反応を生成しながら、局所的に癌免疫の強力なプライミングを誘発することができる。

本発明の実施形態によれば、腫瘍は、１つ以上の免疫療法粒子及び化学療法粒子の組み合わせを含む組成物を注射することができる。 化学療法剤粒子は、シスプラチン及びオキサリプラチンを含むがこれらに限定されない化学療法剤を含み得、これらは、腫瘍細胞にＤＮＡ損傷効果を引き起こすことに加えて、樹状細胞を活性化し、腫瘍において免疫活性を誘導することが示されている。

化学薬品を送達するときの本発明の実施形態は、免疫学的に冷たい腫瘍を熱くさせ、従ってそれらを免疫療法に感受性にすることができる。 腫瘍標的免疫療法粒子及び化学療法は、相乗的に作用して、腫瘍増殖を阻害し、免疫療法及び化学療法単独の場合と比較して、すなわち本発明の実施形態を使用せずに、毒性の低下を示す。

微粒子は、免疫原性の低い腫瘍を免疫療法に感受性にするための併用治療戦略を可能にすることができることを見出された。 併用治療戦略を可能にすることに加えて、本発明の実施形態は、腫瘍微小環境に応答し、それらの部位での浸透を増加させるように設計することができる。

David Zaharoffなどによれば、サイトカインＩＬ－１２とのキトサン混合物は、彼らのマウス実験における腫瘍退縮に有効であった(Zaharoff, D. A., et al. (2010). Intratumoral immunotherapy of established solid tumors with chitosan/IL-12. J. Immunother., 33, 697)。しかしながら、本発明者らのデータは、本発明の実施形態によれば、ＩＬ１２粒子を充填したキトサンマトリックスキトサンの組み合わせは、高濃度での腫瘍における制御放出と共に、非常に高い保持時間（＞ １０日）を有することを示す。 さまざまな実施形態によれば、注射可能なサイトカインは、Zaharoffの研究で行われた実験室実験とは異なり、翻訳適用のために数秒以内にベッドサイドの診療所で混合することができる。

ＩＬ－１２は、全身投与後に有意な臨床毒性を示す強力な抗腫瘍サイトカインである。 Zaharoffは、生分解性多糖類キトサンと共製剤化されたＩＬ－１２の腫瘍内（i.t.）投与は、全身毒性を制限しながらＩＬ－１２の抗腫瘍活性を増強できると仮定した。非侵襲的イメージング研究では、i.t.注入後、キトサン共製剤の有無にかかわらず、ＩＬ－１２の局所的な保持を監視した。確立された結腸直腸（ＭＣ３２ａ）及び膵臓（Ｐａｎｃ０２）腫瘍を有するマウスにおいて、ＩＬ－１２単独及びキトサンと共製剤化されたＩＬ－１２（キトサン/ ＩＬ－１２）の抗腫瘍効果を評価した。免疫細胞サブセットの枯渇、腫瘍の再チャレンジ、及びＣＴＬ活性を含む追加の研究は、退行及び腫瘍特異的免疫のメカニズムを解明するために設計された。 キトサンとの共製剤化により、局所的なＩＬ－１２の保持が１日～２日から５日～６日に増加した。毎週ＩＬ－１２のみのi.t.注射は、確立されたＭＣ３２ａ及びＰａｎｃ０２腫瘍の１０％以下を根絶し、ところが キトサン/ＩＬ－１２免疫療法は、８０％～１００％のマウスで完全な腫瘍退縮を引き起こした。ＣＤ４＋又はＧｒ－１＋細胞の枯渇は、キトサン/ＩＬ－１２を介した腫瘍の退縮に影響を与えなかった。 ただし、ＣＤ８ ＋又はＮＫ細胞の枯渇は、抗腫瘍活性を完全に無効にした。i.t. キトサン/ＩＬ－１２免疫療法により治癒された８０％を超えるマウスが、腫瘍の再チャレンジから少なくとも部分的に保護されていたので、i.t.キトサン/ＩＬ－１２免疫療法は全身性腫瘍特異的免疫を生成した。さらに、治癒したマウスの脾臓からのＣＴＬは、ＭＣ３２ａ及びｇｐ７０ペプチドを負荷された標的を溶解した。 キトサン/ＩＬ－１２免疫療法は、腫瘍微小環境におけるＩＬ－１２の局所的保持を増加させ、確立された攻撃的なマウス腫瘍を根絶し、全身性腫瘍特異的防御免疫を生成した。キトサン/ ＩＬ－１２は、忍容性が高く、効果的な免疫療法であり、臨床翻訳の可能性がかなりある。

いくつかの実施形態によれば、粒子ベースの製剤は、眼の状態、特に加齢に伴う黄斑変性を治療するために、眼への硝子体内注射による薬物の制御された送達のために提供される。 そのような実施形態によれば、生体適合性ポリマーは、眼の上皮に付着するポリマーメッシュを形成するヒドロゲルマトリックスを形成し、そこで薬物粒子を組織に移植する。 粒子は、薬の持続放出を提供するために、長期間、例えば４ヶ月にわたって分解する可能性がある。

本発明の一実施形態によれば、本発明者らは、難水溶性薬剤及びポリマーの経口及び注射可能な送達のための製剤を開発した。 この製剤により、液体ナノ結晶分散液を固体投与形態に変換することが可能になった。 固体投与形態には、水に溶解すると元のサイズに容易に再構成できるナノ結晶が含まれている。 凍結速度を最適化して粒子間凝集を減らすには、注意深い配合が必要である。 ナノ結晶を乾燥させるための臨界凍結速度が決定されている。臨界値に近い凍結速度で凍結乾燥すると、再分散後に二峰性の粒子サイズ分布の乾燥粉末が生成される。 さらに、薬物ナノ結晶濃度は、臨界凍結速度に大きく影響し、従って乾燥粉末の再分散性に大きく影響することがわかった。 臨界凍結速度の概念は、液体ナノ結晶分散液の固体投与形態の開発にとって重要である。

本発明の実施形態は、粉末形態で出荷することができ、患者のベッドサイドでの腫瘍内注射のために滅菌水に迅速に、均一にそして一貫して溶解することができる製剤を提供する。

本発明の実施形態は、様々な組織、特に癌性腫瘍への治療薬の送達のためのシステムを提供する。 様々な実施形態は、キトサン及びマトリックス内に埋め込まれた複数の粒子を含む。

本発明の実施形態の実用的な製剤が開発されると、キトサン微粒子は、架橋剤としてトリポリリン酸ナトリウムを用いたイオンゲル化を使用して、室温で合成された。 粒子付着阻害剤、粒子凝集阻害剤、及び水和促進剤を含むポリマーマトリックスの別個の製剤を微粒子溶液に加えた。 微粒子とマトリックス溶液をバイアルに分注し、－８０℃の冷凍庫に移し、一晩凍結させた。 次に、バイアルを７２時間凍結乾燥した。

シスプラチンを含む注射可能なキトサン粉末を製造するための本発明のいくつかの実施形態は、以下のプロトコルに基づく：
１．キトサン粉末を酢酸溶液（０．１８６ ｗ / ｗ％）に加え、攪拌して溶解させる。
２．別の容器で、シスプラチン（０．１５ ｗ / ｗ％）をトリポリリン酸ナトリウムと生理食塩水に加える。 溶液を約４０℃に加熱して撹拌することにより、シスプラチンを溶解させた。
３．シスプラチンが入っているすべての容器は露光から保護され、そしてシスプラチン－トリポリリン酸ナトリウム溶液の内容物はキトサン溶液に移された。
a. この工程全体を通して、両方の溶液を穏やかに攪拌した。
b. ここでのこの工程では、微粒子が生成される。 定常状態に達すると、粒子サイズ/電荷が収集される。
４．スクラロース水溶液（２５ ｗ / ｗ％）を調製し、後で使用するために取っておいた。
５.別のスクリュートップボトルで、キトサン粉末を希酢酸溶液（１．０ ｗ / ｗ％）に添加する。 次に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（０．１ ｗ / ｗ％）をキトサン-酢酸溶液に添加する。 ３０分間攪拌する。
６.スクラロース溶液をキトサン-シスプラチン微粒子溶液に移した。 次に、パッチマトリックス溶液が移された。
７.最終溶液を５分間撹拌した後、５ｍＬの溶液を分注した。 バイアルは－８０℃の冷凍庫で約２時間凍結された。
８.バイアルを凍結乾燥機に６日間入れた。

シスプラチンを含む注射可能なキトサン粉末の分析証明書のサンプルを表１に示す。サンプルのＦＴＩＲ特性を図２に示し、ここで１４００＋３０ｃｍ^－１と１５６０＋３０ｃｍ^－１に特徴的なシスプラチンのピークが見られる。

表２に要約されるように、ｐＨに関する溶解性を特徴づけるために、シスプラチンを含む注射可能なキトサン粉末を様々なｐＨ媒体内で再構成し、シスプラチンの放出をＵＶ－可視分光計において３５５ｎｍでモニターした。

本発明の代表的な実施形態の第１組によれば、組織内の部位への治療薬の注射可能な局所送達のためのシステムが提供される。 このシステムは、埋め込まれた粒子を組織内に局在化させるのに寄与する溶媒中で、ゲル、すなわち、ポリマーウェブのような構造を形成することができるポリマーマトリックスを含む。 ゲルマトリックスは、キトサン、水和促進剤、微粒子付着阻害剤、及び微粒子凝集阻害剤を含む組成物によって形成される。複数の微粒子がゲルマトリックス内に埋め込まれている。 ゲルマトリックスは、薬物を負荷した粒子が組織内で限られた範囲の動きをすることができるように開くように構成されている。 微粒子は治療薬を含み、治療薬の周りにコーティングが施されている。 微粒子のコーティングは、微粒子からの薬剤の制御された放出を提供するためにキトサンを含む。 任意には、水和促進剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータプロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。 また、任意には、微粒子付着阻害剤は非イオン性ポリマーであり、さらなるオプションとして、非イオン性ポリマーはＨＰＭＣ又はポロキサマーである。さらに、オプションとして、微粒子凝集阻害剤は、単糖、二糖、糖アルコール、塩素化単糖、塩素化二糖、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。 また、任意には、微粒子はさらにトリポリリン酸ナトリウムを含む。任意には、システムには、マトリックスに直接埋め込まれ、キトサンでコーティングされていない、遊離量の治療薬があり、ここで、治療薬の遊離量は、システム内の治療薬の総量の２０～８０％を構成する。任意には、マトリックス中のキトサン及び微粒子中のキトサンは純粋なキトサンである。 さらなるオプションとして、微粒子の平均直径は約５００ｎｍ～約２０００ｎｍである。

マトリックスは、組織を介した微粒子の制御された放出を提供するように構成される。 このシステムは、癌性腫瘍などの損傷した組織に局所的に、重大な全身毒性副作用を伴う強力な薬物を注射するために使用することができる。 本発明を製造するための方法は、混合物を－８０℃で凍結して、凍結層前駆体を形成することをさらに含む。 最後に、本発明を製造するための方法は、凍結層前駆体を乾燥させて、水和すると、マトリックス内に埋め込まれた微粒子を有するゲルマトリックスを形成する粉末を形成することを含む。 本発明のいくつかの実施形態によれば、最終生成物（再構成用の粉末）は、６ヶ月以上安定であるが、それが乾燥剤と共に貯蔵され、水密マイラーホイルポーチ内にヒートシールされ、２～８℃冷蔵庫に貯蔵される場合に限る。これらの条件が満たされた場合、システム（メッシュ内にキトサンナノ粒子を含むサンプルＰＲＶ３１１）は、透明な溶液又は不均一な微粒子懸濁液のいずれかに再構成できる。 ＰＲＶ３１１の溶解度は、凍結時にメッシュで、ＰＲＶ３１１を患者に使用するためにガンマ線照射するとキトサンで発生する鎖断片化加水分解（例えば、凍結融解加水分解）によりさらに増加する。 適切に保管されたＰＲＶ３１１を図１Ａに示し、これは、透明な溶液/微粒子懸濁液である。

図１Ｂに示されるように、ＰＲＶ３１１は、再構成前に数日間室温で保存された場合、適切に再構成されない。 図１Ｂのバイアルは、再構成する前に室温で５日間保管され、注入に適さない不均一な粗い懸濁液を形成する。 図１Ｃのバイアルは、液体窒素によってＰＲＶ311よりも急速に凍結され、室温で５日間保存された別の製剤ＰＲＶ１１１を示している。 このように処理されたＰＲＶ１１１製剤は、注射に適さない不均一な粗い懸濁液も形成する。

理論に拘束されることなく、以下のように仮定される：
ａ）凝集阻害剤を添加しても、凍結乾燥後の粉末製剤では、粒子－粒子の立体配座凝集がゆっくりと起こる（ファンデルワールス力によって駆動される）が、粉末製剤を２～８℃の条件で保管すると、 低温により、システムの動的安定性が向上し；
ｂ）温度に関連する要因により、メッシュの一部が不溶性になる。

ＰＲＶ３１１は、液体形態の製品をバイアルに分配し、バイアルを－８０℃の周囲環境で少なくとも８時間にわたって凍結させることによって作製される。 少なくとも１ｍＬの媒体で再構成した後、適切な量のＰＲＶ３１１をLuerLockSyringeで引き出す。 ＰＲＶ３１１は、１８～３０のニードルゲージを使用して腫瘍に直接注入される。ＰＲＶ３１１の各バイアルには、０．１～１００ｍｇの薬剤を入れることができる。 投与量の制限は、カプセル化された免疫療法又は小分子の水への溶解度に依存する。 投与の頻度は、治療部位、適応症、及び管理者の裁量によって異なる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、キトサン、水和促進剤、微粒子付着阻害剤、及び微粒子凝集阻害剤を含む組成物によって形成される水溶性高分子マトリックスが存在する。 本発明のさらに別の組の代表的な実施形態によれば、治療薬送達システムを製造するための方法が提供される。 この方法は、複数の微粒子との第１の混合物を形成することを含む。 微粒子は治療薬を含み、治療薬の周りにキトサンを含むコーティングを有する。 この方法はまた、第１の混合物、キトサン、水和促進剤、微粒子付着阻害剤、及び微粒子凝集阻害剤を含む成分から第２の混合物を形成することを含む。この方法はさらに、アルコール水溶液の凍結温度より高く、最大で－８０℃の温度で、アルコール水溶液を含む浴中で第２の混合物を凍結して、凍結層前駆体を形成することを含む。 最後に、この方法は、凍結層前駆体を乾燥させて、マトリックス内に埋め込まれた微粒子を有する多孔質ポリマーマトリックスを形成することを含む。 任意には、浴にはさらにドライアイスが含まれる。 また、任意には、アルコール水溶液のアルコールはエタノールである。 さらなるオプションとして、アルコール水溶液は、約９０重量％のエタノール～約９９重量％のエタノールである。 任意には、この方法は、第２の層の前駆体を凍結層の前駆体に適用して、第１の層及び第２の層を含む固体を形成することをさらに含む。 任意には、第２の層は治療薬を含む。 また、任意には、乾燥は真空下で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、水溶液は、－８０℃の超冷凍庫を使用して凍結される。 他の実施形態では、液体窒素を使用して溶液を凍結させた。－８０℃の超冷凍庫を使用した凍結法を液体窒素凍結法と比較したところ、驚くべき結果が得られた。 図３に示すように、液体窒素（－１９６℃）で凍結して凍結乾燥すると、多層で緻密な布のような構造が得られる。 対照的に、図４に示すように、－８０℃で凍結すると、より多孔質で均一な単層ポリマー繊維が得られる。 ２つの方法から生じる溶液間の構造の違いは、カプセル化された治療薬の放出の制御とタイミングに大きな影響を及ぼした。シスプラチンを含む特定の実施形態によれば、本発明者らは、製品開発の過程を通じて、シスプラチンメッシュが適切に機能するために、ポリマー及び賦形剤の特定の組み合わせが必要であることを発見した。 開発中、メッシュ内のナノ粒子の凝集と凝集により、メッシュから組織へのシスプラチン含有ナノ粒子の浸透が妨げられた。 賦形剤とポリマーの組み合わせを加えると、メッシュからナノ粒子が完全に放出されることが発見された。 組み合わせを含めると理想的な放出と浸透が得られる理由はすぐにはわからず； しかし、顕微鏡分析では、その含有物がナノ粒子及びメッシュ構造と反応して、メッシュ構造の細孔内に微粒子の「コロニー」を形成することが明らかでした（図３を参照のこと）。通常は1つの大きな塊で不均一な凝集又は凝集とは異なり、「コロニー」はサイズがほぼ均一であり、メッシュから解放されて組織に浸透するのに十分小さいままである。 ポリマー賦形剤の組み合わせが含まれる場合、メッシュの構造も変更された。 含有物は、微粒子を保持し、より容易に放出することができる細孔を備えた、より結晶性の構造をもたらした。 ポリマー賦形剤の組み合わせに起因する前述の機能は、組織内の細胞接合部を開くポリマーの能力の結果であると報告されており； これらは当初、この目的の試験中にメッシュの構成に含まれていた。しかしながら、細胞の変化を超えたその効果は、メッシュの構造への効果と、微粒子の「コロニー形成」及び凝集の防止の効果の両方を含め、これまで報告又は観察されていなかった。 組み合わせて使用されるポリマーと賦形剤の効果は相乗的であり、放出と浸透に対するそれらの組み合わせた影響は、それらの個々の効果の合計よりもはるかに大きい。

様々なｐＨでの粒子の放出プロファイルを図５に示す。粉末をそれぞれの媒体で再構成し、７２時間撹拌しながら透析バッグの中に入れた。 サンプルを採取し、放出率を示す。ｐＨ６（円）の微粒子は分解が速いためより速く放出され、ｐＨ３（三角形）の微粒子は粒子の安定性が高いためより遅い速度で放出される。 遊離シスプラチン溶液（四角）を対照として使用した。 この図では、ｐＨが低いと微粒子からの薬物の放出が遅くなることが明らかである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリマー賦形剤の組み合わせは、キトサン、ヒプロメロース、及びプロピレングリコールを含む。 本発明のいくつかの実施形態によれば、水和促進剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータ－プロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、微粒子付着阻害剤は、非イオン性ポリマーである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、非イオン性ポリマーは、ＨＰＭＣ又はポロキサマーである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、微粒子凝集阻害剤は、単糖、二糖、糖アルコール、塩素化単糖、塩素化二糖、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、微粒子は、トリポリリン酸ナトリウムをさらに含む。

本発明のいくつかの実施形態において、システムは、マトリックスに直接埋め込まれ、他の方法ではキトサンでコーティングされていない、遊離量の治療薬をさらに含み、ここで、治療薬の遊離量は、システム内の治療薬の総重量の２０～８０％を構成する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、マトリックス中のキトサン及び微粒子中のキトサンは、未修飾のキトサンである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、微粒子の平均直径は、約０．５μｍ～約２μｍである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、治療薬は、免疫療法薬などの抗体又は化学療法薬などの小分子である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明は、治療薬の標的送達のための微粒子、未修飾の治療薬及び未修飾のキトサンを含む微粒子を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、微粒子は、マトリックスによって直接囲まれ、そしてマトリックスと接触するように、マトリックス内に埋め込まれる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、マトリックスへの水和促進剤の添加によって改善される、ポリマーマトリックス及び微粒子に基づく治療薬の送達のためのシステムが提供される。 水和促進剤の例には、グリコールなどの吸湿性化合物、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータプロピレングリコール、及びグリセロールが含まれる。 水和促進剤の量の例示的な濃度範囲には、約０．００１～約１０重量％、約０．０１～約５重量％、及び約０．１～約１重量％が含まれる。

特定の理論に拘束されることを望まないが、水和促進剤は、送達システムによる水分吸収を増加させると考えられている。 この水和の増加により、マトリックスからの微粒子の迅速な放出と浸透が可能になる。 水和促進剤は、送達システムの製造プロセス中に凍結防止剤として作用することにより、均一性及び耐久性を改善するとも考えられている。 この場合も、特定の理論に拘束されることなく、水和促進剤が氷結晶とマトリックスポリマー分子の間の「スペーサー」として機能し、均一な凍結パターンを確保すると考えられている。 結果として得られる構造は、水和促進剤がない場合よりも柔軟で、均一で、耐久性がある。

代表的な実施形態の別の組では、付着阻害剤の添加によって改善された送達装置が提供される。 特定の理論に拘束されることを望まないが、マトリックス及び粒子が、キトサンなどの極性又はイオン的に帯電した部分を有する材料でできている場合、粒子の移動度が低下すると考えられる。 キトサンの場合、ポリマーのアセチル部分とアミン部分の間の相互作用により、粒子がマトリックスに付着し、それらの放出が阻害されると考えられている。

付着阻害剤を含めることにより、マトリックスと粒子との付着を軽減できることが見出された。 特定の理論に拘束されることなく、付着阻害剤は、粒子のキトサンとマトリックス本体のキトサンとの間の「スペーサー」として作用し、粒子を放出し、薬物放出プロファイルの改善を可能にすると考えられている。 付着阻害剤の代表的な例には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などの非イオン性ポリマーが含まれる。 用途に応じて、非イオン性ポリマーのモル質量は約１ｋＤａ～約２００，０００ｋＤａであり、その粘度は約１０ｃｐｓ～１００，０００ｃｐｓで変化する。代表的な実施形態によれば、非イオン性ポリマーのモル質量は約１０ｋＤａ～３０ｋＤａであり、その粘度は約１０ｃｐｓ～約１００ｃｐｓである。 用途に応じて、付着阻害剤の量は、約０．１重量％～約９９重量％であり得る。 いくつかの実施形態によれば、付着阻害剤の量は、約０．１重量％～約２５重量％である。

代表的な実施形態のさらなる組によれば、凝集阻害剤の添加によって改善された送達装置が開示される。送達装置を製造するための方法には、マトリックス内に氷の結晶が形成される可能性のある凍結工程が含まれる。このような結晶は、微粒子を互いに押し込み、粒子が損傷又は破壊される場所に粒子凝集体を作成する可能性がある。 この場合も、特定の理論に拘束されることを望まないが、凝集阻害剤は、粒子の凝集を防ぐ結晶微細構造を形成することによって凍結防止作用を発揮すると考えられている。炭水化物及び炭水化物誘導体は、単糖、二糖、糖アルコール、塩素化単糖、及びスクラロースなどの塩素化二糖を含む、例示的なタイプの凝集阻害剤を提供する。用途に応じて、パッチ中の凝集阻害剤の量は、約０．１～約５０重量％の範囲であり得る。いくつかの実施形態によれば、凝集阻害剤の量は、約１～約１０重量％である。

代表的な実施形態の別の組によれば、改良された純粋なキトサン微粒子が提供される。 従来のキトサン粒子は、高度の脱アセチル化を特徴とし、帯電した部分を有するキトサンの塩、例えば、塩化キトサン及びグルタミン酸キトサンで製造されている。 粒子が純粋なキトサンから作られる場合、より良い結果が得られることが見出された。これは、塩ではない、すなわち、そのアミン基がプロトン化されておらず、少なくとも７０％の脱アセチル化度を有することを特徴とする材料である。特に、粒子は従来の粒子よりも大きな直径を特徴としている。 いくつかの実施形態によれば、純粋なキトサン粒子の平均直径は、約２００～約２０００ナノメートルの範囲であり得る。 他の実施形態によれば、平均直径は、約５００～約２０００ナノメートルの範囲であり、追加の実施形態よれば、５００～１０００ｎｍの範囲である。さらなる改善において、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の添加によって改善されたキトサン微粒子が提供される。 特定の理論に拘束されることを望まないが、ＳＴＰＰは、キトサン上の正に帯電したアミン基に対する負の対イオンとして作用することにより、粒子を形成するための架橋剤として機能すると考えられている。 この静電相互作用は、粒子の構造をサポートするイオン結合を形成する。 また、特定の理論に拘束されることを望まないが、正の対比としてのナトリウムの存在は、ＳＴＰＰを他のＴＰＰ塩よりも効果的な架橋剤にするものと考えられている。

ゲルマトリックスが遊離量の治療薬を含み、マトリックスに直接埋め込まれ、粒子中のキトサンでコーティングされていない場合、装置は、遊離量の治療薬のみ、またはキトサンでコーティングされた治療薬のみを含む同等のマトリックスよりも治療的に効果的であることが見出された。代表的な実施形態において、治療薬の遊離量は、送達システムにおける治療薬の総量の２０～８０％の間を構成する。

注射用水ＵＳＰ、０．１２％食塩水ＵＳＰ、及び０．９％食塩水ＵＳＰなどの一般的な媒体で再構成することができる注射剤を、以下で試験した：
実施例１：インビボ、マウス研究

図６に示されるように、癌細胞を移植されたマウスのＰＲＶ３１１の腫瘍内注射は、実質的な腫瘍成長を排除した（青い曲線）。 ここで、ＰＲＶ３１１組成物には、抗腫瘍サイトカインＩＬ－１２が負荷された微粒子が含まれていた。比較実験では、対照食塩水（黒い曲線）、プラセボ粒子（灰色の曲線）の腫瘍への注射は、腫瘍の成長に最小限の影響しか示さなかった。 同様に、ＩＬ－１２のみの静脈内注射（緑色の曲線）は、対照と比較した場合、腫瘍増殖速度に有意な変化を示さなかった。 特に、ＩＬ－１２のみの腫瘍内注射（赤い曲線）は、ＩＬ－１２を負荷したＰＲＶ３１１（青い曲線）による腫瘍成長のほぼ排除とは対照的に、腫瘍成長を単に遅らせただけである。 注入されたＰＲＶ３１１のポリマーメッシュにより、ＰＲＶ３１１を含む微粒子が局所的に保持され、効果が高まると仮定されている。
実施例２：生体外の舌の研究

２３Ｇ皮下ルアーロック針を使用して、豚の舌に５００μＬのＰＲＶ３１１を注射した。 ポリマーメッシュのため、薬物は局所的なままであった。 図８に示すように、薬物濃度は組織の断面ごとにほぼ均一に保たれ、ベルカーブのような形状（注射球に似ている）を形成した。
実施例３：牛の脳

ＰＲＶ３１１（２００μＬ）を、２６ゲージの針で牛の脳に注射した。 図１０に示すように、顕微鏡によるイメージングのために組織を切断した。

広がりのおおよその寸法は、注入された体積について、高さ９ｍｍ×長さ５ｍｍであった。 図１０に見られる赤は、キトサンポリマーに付着したＣｙ５フルオロフォア染料であり、微粒子とメッシュの動きを示している。 緑は、カプセル化された薬物の広がりをモデル化したカプセル化されたフルオロフォアである。 注射剤のメッシュは、フルオロフォアを局所的かつ集中的に保つ。
実施例４：羊角膜への薬物送達

羊で実施された研究は、ＰＲＶ３１１が、角膜を介して硝子体内液に薬物を送達できることを示した（図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５Ｃ）。 ＰＲＶ３１１は、虹彩の約５ｍｍ下の硝子体に注入された。 図１６の右上の赤い画像は、Ｃｙ５で標識されたキトサンが網膜、脈絡膜、及び強膜に完全に浸透する様子を示している。 図１６の右下の緑色の画像は、同じ注射中のＦＩＴＣ標識遊離薬物の同様の分布を示している。

これは、ＡＭＤのための既存の治療法に代わるものを提供する際にＰＲＶ３１１をサポートする。 これまでに収集されたデータは次のことを示している：
・標識された粒子の角膜及び硝子体内液への送達
・４か月にわたるベバシズマブの持続放出
・カプセル化により、ベバシズマブの安定性と吸収が向上する
実施例５：羊の肺への薬物送達

羊で実施された研究は、ＰＲＶ３１１が薬物を肺組織に送達することができ、そこで局所化されたままであることを示した（図１７）。 薬剤は、切片化の準備のために凍結する前に、注射後２４時間以上高濃度で保持された。
実施例６：羊の肝臓への薬物送達

図１７及び１８に示されるように、ＰＲＶ３１１は、薬物を肝臓組織に送達することができ、そこで、それは局在化されたままである。 薬剤は、切片化の準備のために凍結する前に、注射後２４時間以上高濃度で保持された。 図１９の側面図からわかるように、組織の種類は薬物の分布パターンに影響を与える。
実施例７：羊の膵臓への薬物送達

図２０に示すように、ＰＲＶ３１１は、局所化されたままの膵臓組織に薬物を送達できる。 薬剤は、切片化の準備のために凍結する前に、注射後２４時間以上高濃度で保持された。

上記の本発明の実施形態は、単に例示的であることを意図しており；多くの変形及び修正は、当業者には明らかであろう。 そのようなすべての変形及び改変は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内にあることが意図されている。

Claims (24)

1. 対象の細胞の標的集団に治療的処置を提供するためのシステムであって、以下：
   治療的処置の投与に使用される注射器の針が貫通可能な隔壁で囲まれたバイアル；
   バイアルに配置された治療用組成物、 前記組成物は治療的処置の投与に使用するために提供され、そして キトサンゲル及び前記ゲルに埋め込まれた複数の粒子を含む水溶液を含み、前記ゲルは注射による投与に適した粘度を有し；
   治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有する粒子；及び
   粒子からの薬剤の制御放出を提供するためのキトサンを含むコーティング、
   を含むシステム。
2. 前記水溶液はさらに、水和促進剤、粒子付着阻害剤、粒子凝集阻害剤、及びそれらの組み合わせから成る群から選択された化合物を含み、ここで
   （a）前記水和促進剤が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータ－プロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、
   （b）前記粒子付着阻害剤が、ＨＰＭＣ、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、そして
   （c）前記粒子凝集阻害剤が、単糖類、二糖類、糖アルコール、塩素化単糖類、塩素化二糖類、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載のシステム。
3. 前記水溶液がさらにトリポリリン酸ナトリウムを含む、請求項１又は２に記載のシステム。
4. 前記粒子が、平均直径が２００ｎｍ～２０００ｎｍの微粒子である、請求項１又は２に記載のシステム。
5. 前記粒子が、平均直径が５００ｎｍ～２０００ｎｍの微粒子である、請求項１又は２に記載のシステム。
6. 前記溶液がさらにキトサンでコーティングされていない遊離量の治療薬をさらに含み、ここで前記治療薬の遊離量は、水溶液中の治療薬の総量の約２０重量％～約８０重量％の間を構成する、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
7. 前記治療薬が免疫療法薬である、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
8. 前記免疫療法薬が、抗体、サイトカイン、小分子免疫療法薬、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項７に記載のシステム。
9. 前記治療薬が化学療法剤である、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
10. 前記粒子がキトサンゲルと直接物理的に接触している、請求項１に記載のシステム。
11. 対象の細胞の標的集団を治療するための方法であって、
    請求項１に記載のシステムを入手し；
    水溶液を注射器に充填し；
    注射器を使用して、細胞の標的集団に前記水溶液を注入することを含む方法。
12. 前記細胞の標的集団が腫瘍を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞の標的集団が器官内の組織である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記器官が目、肺、膵臓、肝臓、腎臓、脳、心臓、甲状腺、及び下垂体から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 対象の細胞の標的集団に治療的処置を提供するためのシステムであって、以下：
    治療的処置の投与に使用される注射器の針が貫通可能な隔壁で囲まれたバイアル；
    バイアルに配置された治療用組成物、 前記組成物は治療的処置の投与に使用するために提供され、そして 水と混合すると溶解してキトサンゲル及びゲルに埋め込まれた複数の粒子を含む水溶液を提供するように処方された凍結乾燥前駆体を含み、前記ゲルは注射による投与に適した粘度を有し；
    治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有する粒子；及び
    粒子からの薬剤の制御放出を提供するためのキトサンを含むコーティング、
    を含むシステム。
16. 対象の細胞の標的集団に治療的処置を提供するためのシステムを提供するための凍結乾燥法であって、
    キトサンゲル及び複数の粒子を含む水溶液を形成し、前記粒子は治療薬を含み、そして治療薬の周りにコーティングを有し、前記コーティングは、粒子からの薬剤の制御放出を提供するためにキトサンを含み；
    アルコール水溶液の凍結温度より高い温度で、せいぜい－８０℃で、アルコール水溶液を含む浴中で最初の水溶液を凍結して、凍結層前駆体を形成し；
    凍結層前駆体を乾燥させて、粒子が埋め込まれた無水粉末を形成し；
    治療的処置の投与に使用される注射器の針によって貫通可能な隔壁で囲まれたバイアル内に無水粉末を含み；そして
    容器に水を加えて無水粉末を溶解することを含む凍結乾燥法。
17. 前記無水粉末がさらに、水和促進剤、粒子付着阻害剤、及び粒子凝集阻害剤、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択された化合物を含み、
    前記水和促進剤が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベータ－プロピレングリコール、グリセロール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
    前記粒子付着阻害剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、そして
    前記粒子凝集阻害剤が、単糖類、二糖類、糖アルコール、塩素化単糖類、塩素化二糖類、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６に記載の凍結乾燥法。
18. 前記無水粉末がさらにトリポリリン酸ナトリウムを含む、請求項１６に記載の凍結乾燥法。
19. 前記粒子が、平均直径が２００ｎｍ～２０００ｎｍの微粒子である、請求項１６に記載の凍結乾燥法。
20. 前記粒子が、平均直径が５００ｎｍ～２０００ｎｍの微粒子である、請求項１６に記載の凍結乾燥法。
21. 硝子体内注射により眼の状態の治療的処置を提供するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
22. 前記治療薬が、抗体、サイトカイン、小分子免疫療法薬、化学療法薬、アプタマー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記眼の状態が加齢に伴う黄斑変性症である、請求項２１に記載のシステム。
24. 前記治療薬がベバシズマブである、請求項２３に記載のシステム。

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