KR20220125798A - 표적화된 세포 집단의 직접 주사에 의한 치료를 위한 시스템 및 약학적 조성물 - Google Patents

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마니제 나자리 골드버그
아론 엠. 만지
에릭 골드버그
마이클 케이. 해리스
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프리보 테크놀로지스, 인코포레이티드
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Abstract

종양, 안구, 췌장 조직, 간 조직 및 폐 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 시스템은 격벽으로 둘러싸인 바이알 내에 주사 가능한 수용액을 포함한다. 용액은 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 갖는 입자를 포함하며, 코팅은 입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함한다. 용액은 중합체 겔 매트릭스 형태의 키토산 중합체를 추가로 포함하고, 수성 겔 환경으로부터 입자의 제어 방출을 추가로 제공한다. 키토산 중합체 및 키토산 코팅된 입자를 함유하는 바이알 내에 배치된 동결건조된 분말을 제조하는 방법이 또한 제공되며, 분말은 물과 혼합시 입자 및 키토산 겔의 상기 설명된 주사 가능한 수용액을 형성한다.

Description

표적화된 세포 집단의 직접 주사에 의한 치료를 위한 시스템 및 약학적 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
[0001] 본 출원은 2020년 1월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/956,795호의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
기술 분야
[0002] 본 발명은 질병 및 종양의 치료를 위한 표적화된 세포 집단으로의 주사를 위한 치료적 조성물, 보다 특히 치료제를 함유하는 키토산 겔 및 키토산 입자의 주사 가능한 수용액, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
[0003] 인간의 종양은 종종 외과적 절제를 통해 치료된다. 종양 치료, 특히 고형 악성 종양의 치료는 일반적으로 시급한 문제이다. 이러한 종양은 골수 육종, 원형-세포 육종, 흑색증 육종, 방추-세포 육종, 및 유두종을 포함한다. 다른 유형의 고형 종양은 의학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다.
[0004] 흔히, 종양은 완전히 절제될 수 없으며, 이러한 고형 종양은 수술 불가능한 것으로 간주된다. 수술 불가능한 고형 종양은 이들의 위치 또는 이들의 크기로 인해 이와 같이 분류될 수 있다. 화학요법은 종종 고형 종양의 치료에 사용되어 이들의 크기를 축소시켜 이를 수술 가능하게 만든다.
[0005] 화학요법은 3개의 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다: (1) 전신 정맥 내(IV), (2) 동맥 내, 및 (3) 종양 내. 전신 수술 전 I.V. 요법은 고형 종양을 감소 또는 축소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 문헌[Ferriere, J. P. et al. (1998) Primary chemotherapy in breast cancer: correlation between tumor response and patient outcome, American journal of clinical oncology, 21(2), 117-120]. 또한, I.V. 경로는 전이성 세포(또는 미세전이)가 신체 전체에서 치료되도록 전체 유기체에 동시 치료를 제공한다. 그러나, 주요 문제 중 하나는 표적 위치에 충분한 항종양제를 전달하는 것이다. 전신 화학요법은 환자에게 용량 제한적일 수 있고 견딜 수 없는 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 이러한 부작용은 특히 강력하고 효능이 있는 약물의 사용을 감소시킨다. 문헌에 따르면, 대부분의 약물은 최적의 효능을 제공하지 않는 용량인 허용 가능한 부작용의 한계(MTD-최대 허용 용량)로 전신 투여된다.
[0006] MTD에 대한 이러한 제한은 치료의 성공에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 보다 내성이 있는 종양을 형성시키는 역효과를 일으킬 수 있다. 특정 용량 수준에서 화학요법제에 저항하는 능력에 의해 서로 상이한 특정 고형 종양 내에 동일한 유형의 종양 세포의 여러 집단이 존재하는 것으로 추정된다. 문헌[Kinsella, A. R., Smith, D., & Pickard, M. (1997) Resistance to chemotherapeutic antimetabolites: a function of salvage pathway involvement and cellular response to DNA damage, British journal of cancer, 75(7), 935)]. MTD는 특정 종양에서 전부는 아니지만 대부분의 세포를 사멸시킬 수 있는 용량 수준일 수 있다. 결과적으로, 잔류량의 더 내성인 암 세포가 남을 뿐만 아니라 광범위한 증식으로 인해, 더 내성인 세포가 종양의 대부분을 지배할 것이고, 미래에 그 종양을 화학적으로 치료하기 위한 더 어려운 도전을 제공할 것이다. 또 다른 장애물은 많은 항신생물 약물이 단계 민감성일 수 있다는 것이다. 즉, 이들은 세포가 세포 주기의 특정 단계에 있을 때만 세포와 상호작용한다. 투여 시점에 민감한 단계에 있지 않은 다른 세포는 보존된다. 비교적 짧은 기간의 I.V. 투여는 높은 용량 강도로도 종양 세포의 민감한 단계를 놓칠 수 있다. 많은 종양의 치료는 효능 및 부작용 강도 감소 둘 모두에서 더 낮은 용량, 더 높은 빈도 또는 연속 투여 스케줄로부터 이익을 얻을 수 있다.
[0007] 종양 내 주사는 화학요법에 대한 유망한 대안 기술이며, 적어도 개념적으로는 가장 성공적인 접근법을 제시해야 한다. 이 방법에서, 항신생물 약물은 종양에 직접 투여되어, 높은 국소 농도를 달성하고 전신 부작용을 피한다. 이 방법은 또한 투여량에 있어 거의 무한한 유연성을 제공한다.
[0008] 이러한 이점에도 불구하고, 종양 내 화학요법은 특히 효과적이지 않았다. 이러한 효능 부족은 하기 요인 중 하나 이상을 반영하는 것으로 제안되었다:
[0009] 종양에서 종양 세포의 밀도는 매우 높아서, 혈관을 통하지 않을 때 세포를 통한 약물 침투를 방지한다.
[0010] 간질액 압력은 높아서 약물이 간질액으로 이동하는 것을 방지한다.
[0011] 높은 밀도의 세포 및 혈관은 혈관 자체를 수축시킨다. 문헌[Jain, R. K. (1999) Transport of molecules, particles, and cells in solid tumors, Annual review of biomedical engineering, 1(1), 241-263]을 참조한다.
[0012] 종양에서 아폽토시스를 유도함으로써 이러한 문제를 완화시키기 위한 투여 프로토콜이 제안되었다. 예를 들어, M. Flashner-Barak, 미국 특허 출원 일련 번호 2002/0041888 A1호, 일련 번호 09/829,621호를 참조한다.
[0013] 종양 내 투여의 실패에 대한 다른 가능한 이유는 종양 전체에 걸친 약물의 불균일한 확산 및 세포가 주기에서 이들의 민감한 단계에 들어갈 때 세포를 치료하기에 충분히 긴 기간 동안의 유효 용량의 부족을 포함한다. 종양 내 화학요법에서의 문제는 이후 이러한 목표를 달성하기 위해 종양 전체에 퍼진 충분히 긴 기간에 걸쳐 충분히 높은 농도의 화학요법제를 유지하는 것에 이른다. 종양 내 주사는 겔, 페이스트 및 미세입자를 사용하여 수행되었다.
[0014] 키토산은 갑각류의 외골격으로부터 유래된 무독성(LD50 > 16 g/kg)의 생분해성 천연 다당류이다. 키토산의 공급원은 갑각류 및 곤충 표피의 외골격, 진균의 세포벽, 연체동물의 껍질 등에 가장 풍부한 천연 생체중합체인 키틴이다. 키틴은 β(1→4) 연결을 통해 연결된 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코스 단량체(N-아세틸 글루코사민 단위)로 구성되며, 키토산은 전형적으로 갑각류 껍질 또는 외골격의 광물제거 및 단백질제거 후 NaOH를 이용한 키틴의 탈아세틸화에 의해 획득될 수 있는 데아세틸 α-(1,4) 글루코사민 단위의 중합체이다. 키토산은 우수한 생체적합성을 갖고, 면역원성 및 피부 자극이 없는 다기능 물질이다. 2001년에, 이는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 GRAS(일반적으로 안전한 것으로 인정됨) 물질로서 승인되었다. 키토산은 인간에서 확립된 안전성 프로파일을 갖는 널리 사용되는 생체재료이다. 이는 약학적 부형제, 체중-감소 보충물, 및 실험적 점막 애쥬번트로서, 및 FDA-승인된 지혈 드레싱에 사용된다. 고분자량 키토산(> 100 kDa)은 이의 긴 중합체 사슬로 인해 온화한 수성 용매에서 매우 점성인 용액을 형성한다. 점성 용액은 주사 후 이러한 분자의 확산 및 보급을 방해하기 때문에 생체 내에서 약물 및 거대분자의 방출을 제어하는데 널리 사용되어 왔다. 문헌[Baldrick, P. (2010) The safety of chitosan as a pharmaceutical excipient, Regulatory toxicology and pharmacology, 56(3), 290-299].
[0015] 백금-기반 약물, 예를 들어, 시스플라틴(시스-디아민디클로로백금-II)은 가장 널리 사용되는 화학요법제 중 하나이며, 고환, 난소, 유방, 결장직장, 폐, 두경부 종양을 포함하는 중추 신경계 외부의 다양한 고형 신생물에 대해 효능을 나타낸다. 전신 전달된 시스플라틴은 정맥 내 전달 후 뇌에서 검출된 혈장 농도의 5% 미만으로 혈액-뇌 장벽(BBB)으로 인해 정상 뇌 조직으로 잘 침투하지 못한다. 그러나, 종양에서 신생-혈관구조는 온전한 BBB보다 더 투과성이고, 치료적 시스플라틴 수준은 일차 및 이차 뇌 종양에서 그리고 전신 전달 후 종양에 인접한 부종성 뇌에서 더 적은 정도로 검출되었다. 문헌[
Figure pct00001
, J. et al. (2019) The effect of locally delivered cisplatin is dependent on an intact immune function in an experimental glioma model, Scientific reports, 9(1), 5632].
[0016] 면역 세포에 의해 방출되는 작은 단백질인 사이토카인은 면역 세포가 서로 통신할 수 있게 한다. 사이토카인은 잠재적인 암 치료제로서 얼마 동안 연구되어 왔다. 그러나, 다른 면역요법과 함께 사용하기 위한 이들의 공지된 효능 및 잠재력에도 불구하고, 사이토카인은 아직 효과적인 암 요법으로 성공적으로 개발되지 않았다. 이러한 실패는 건강한 조직 및 종양 모두에 대한 비슷한 사이토카인의 높은 독성을 반영하여, 이들을 전신에 투여되는 치료에 사용하기에 부적합하게 만든다.
[0017] 사이토카인을 종양에 직접 주사하는 것은 이들의 독성 효과를 종양에 국한시키고 건강한 조직을 보존하는 방법을 제공할 수 있지만, 그렇게 하기 위한 이전의 시도는 단백질이 암성 조직에서 수 분 내에 신체의 순환으로 누출되는 결과를 낳았다.
[0018] 사이토카인은 세포 신호전달에 중요한 광범위하고 느슨한 범주의 작은 단백질(약 5-20 kDa)이다. 사이토카인은 펩티드이고, 세포의 지질 이중층을 통과하여 세포질에 들어갈 수 없다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 주변분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여한다. 이들의 호르몬과의 명확한 구별은 여전히 진행중인 연구의 일부이다.
[0019] 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자를 포함한다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포 뿐만 아니라 내피 세포, 섬유모세포, 및 다양한 기질 세포를 포함하는 광범위한 세포에 의해 생성되며; 제공된 사이토카인은 하나 초과의 유형의 세포에 의해 생성될 수 있다. 문헌[Aznar, M. A. et al. (2017) Intratumoral delivery of immunotherapy―act locally, think globally, The Journal of Immunology, 198(1), 31-39].
[0020] 사이토카인은 수용체를 통해 작용하고, 면역계에서 특히 중요하며, 여기서, 이들은 체액 및 세포-기반 면역 반응 사이의 균형을 조절하고, 특정 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성을 조절한다. 일부 사이토카인은 복잡한 방식으로 다른 사이토카인의 작용을 향상시키거나 억제한다.
[0021] 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터페론, IL-2, IL-7, IL-12를 포함하는 인터루킨, 및 다양한 케모카인을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0022] 이미퀴모드, 환자 및 다른 사람들에게 사용되는 박테리아로부터의 세포 막 분획, 합성 시토신 포스페이트-구아노신(CpG), 올리고데옥시뉴클레오티드 및 글루칸을 포함하는 다른 면역조절제가 또한 연구되고 있다.
[0023] 안구 혈관 질병은 전 세계적으로 시각 장애 및 실명의 주요 원인 중 하나이다. 항-혈관 내피 성장 인자(항-VEGF) 제제의 유리체 내 주사는 신생혈관 연령-관련 황반 변성(AMD), 당뇨병성 망막병증, 및 망막 정맥 폐색(RVO)을 포함하는 일반적인 망막 질병의 치료에 혁명을 일으켰다. 또한, 신생혈관 녹내장, 미숙아 망막병증(ROP), 및 안구 내 종양과 같은 다른 안구 질병에 대한 항-VEGF 제제의 유리체 내 주사로 유망한 결과가 보고되었다.
[0024] 연령-관련 황반 변성(AMD)은 잘 특성규명되고 광범위하게 연구된 질병이다. 이는 현재 60세 이상의 환자들 사이에서 시각 장애의 주요 원인으로 간주된다. 초기 AMD의 특징은 드루젠의 형성, 황반에서의 색소 변화, 및 경증 내지 중등증의 시력 상실이다. AMD에는 두 가지 형태가 있다: "건식", 및 덜 빈번하지만 AMD로 인한 급성 실명의 90%를 차지하는 "습식" 형태. 위험 요인은 AMD 진행과 관련이 있으며, 이들은 AMD가 어떻게 발달하는지 이해하는 것과 관련이 있다: (1) 고령 및 환경 요인에 대한 노출은 황반을 손상시키는 높은 수준의 산화 스트레스를 유도하고, (2) 염증을 유발하는 이러한 손상은 악순환을 유도하여 결국 중심 시력 상실을 야기한다.
[0025] AMD를 예방하는 치료법이나 치료는 없다. 그러나, 습식 형태의 AMD에 이용 가능한 일부 치료가 있다. 습식 형태의 치료는 항혈관형성 약물의 도입으로 인해 주요 돌파구를 가졌으며; 기능적 예후는 거의 확실한 실명에서 2년의 치료 후 3선 시각 개선의 90% 초과 확률로 변경되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 진전 후에도 요법은 완벽하지 않으며 여전히 개선의 여지가 충분하다. 문헌[
Figure pct00002
, L. F. et al. (2018) Age-Related Macular Degeneration: New Paradigms for Treatment and Management of AMD, Oxidative medicine and cellular longevity, 2018, 8374647].
[0026] 정기적인 항-VEGF 유리체 내 주사와 관련된 치료 부담을 감소시키는 것이 우선순위이다. 신생혈관 AMD 및 당뇨병성 망막병증은 만성의 재발성 장애이다. 환자는 수년간의 치료에 걸쳐 수십 번의 주사를 필요로 할 수 있다. 이러한 까다로운 요법을 준수하는 것은 어려운 일이다. 현재의 유망한 접근법은 (a) 항-VEGF 약물을 전달하기 위한 새로운 하드웨어, (b) 생물학적 효과의 더 긴 내구성을 갖는 새로운 약제, (c) 지속 방출을 위한 항-VEGF 제제의 신규한 제형 및 (d) 유전자 요법을 포함한다. 문헌[Puliafito, C. A. et al. (2019) Looking ahead in retinal disease management: highlights of the 2019 angiogenesis, exudation and degeneration symposium. International journal of retina and vitreous, 5(1), 22].
[0027] 현재, 페갑타닙, 라니비주맙, 베바시주맙, 및 애플리버셉트를 포함하는 여러 항-VEGF 약물이 이용 가능하다. 잘 설계된 무작위 임상 시험은 다양한 망막 질병에서 시각적 개선에 있어서 이들 제제의 효능을 보여주었지만, 각각의 유리체 내 주사는 주사 후- 및 약물-부류-관련 부작용의 위험을 제기한다. 일반적으로 필요한 반복적이고 장기간의 주사는 안구 및 전신 합병증의 가능성을 증가시킬 수 있다. 문헌[Falavarjani, K. G. et al. (2013) Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature, Eye, 27(7), 787].
[0028] 특히, AMD에 대한 가장 흔한 치료는 유리체 내 베바시주맙 주사이다. 주사는 3 내지 4주마다 투여되며, 환자에게 절차상의 위험 및 불편함의 원인이 될 수 있다.
[0029] 췌장 조직, 폐 조직 및 간 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 조직으로의 약물의 표적화된 전달은 이러한 조직에 대한 치료를 국소화하고, 췌장염, 당뇨병, 뇌암, 폐암 및 간염을 포함하는 이러한 조직에 특이적인 질병의 치료에 잠재적인 이점을 갖는다.
[0030] 본 발명의 일 구현예에서, 대상체의 표적화된 세포 집단으로의 주사에 의한 전달을 위해 제형화된 조성물이 제공된다. 이러한 구현예에서, 조성물은 키토산 겔 및 복수의 입자를 포함하는 수용액을 포함하고, 입자는 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 코팅은 입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함한다.
[0031] 본 발명의 일 구현예는 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템을 제공한다. 이러한 구현예에서, 시스템은 치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알을 포함한다. 이러한 구현예에서, 치료적 조성물이 바이알에 배치되고, 치료적 조성물은 치료적 치료의 투여에 사용하기 위해 제공되고, 키토산 겔 및 겔에 매립된 복수의 입자를 포함하는 수용액을 포함하며, 겔은 주사에 의한 투여에 적합하게 만드는 점도를 갖는다. 이러한 구현예에서 입자는 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 코팅은 입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함한다.
[0032] 추가의 관련된 구현예에서, 수용액은 수화 촉진제, 입자 접착 억제제, 입자 응집 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함한다.
[0033] 수화 촉진제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0034] 입자 접착 억제제는 HPMC, 폴록사머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0035] 입자 응집 억제제는 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0036] 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함한다.
[0037] 일부 구현예에서, 입자는 200 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자이다. 추가 옵션으로서, 미세입자는 500 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는다.
[0038] 선택적으로, 수용액은 키토산으로 코팅되지 않은 자유량의 치료제를 추가로 포함하고, 여기서 자유량의 치료제는 수용액 중 치료제의 총량의 약 20 중량% 내지 약 80 중량%를 차지한다.
[0039] 또한 선택적으로, 입자 내의 치료제는 면역요법제이다. 추가 옵션으로서, 치료제는 항체, 사이토카인, 소분자 면역요법제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0040] 추가의 관련된 구현예에서, 치료제는 화학요법제이다.
[0041] 선택적으로, 입자는 키토산 겔과 물리적으로 직접 접촉한다.
[0042] 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 표적화된 세포 집단의 치료를 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 이 섹션의 시작 부분에 설명된 바와 같이 시스템을 획득하는 단계, 수용액을 주사기에 로딩하는 단계, 및 주사기에 의해 표적화된 세포 집단에 수용액을 주사하는 단계를 포함한다.
[0043] 방법의 관련 구현예에서, 표적화된 세포 집단은 종양을 포함한다. 또 다른 관련 구현예에서, 표적화된 세포 집단은 기관의 조직이다. 선택적으로, 기관은 눈, 폐, 췌장, 간, 신장, 뇌, 심장, 갑상선, 및 뇌하수체로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0044] 또 다른 구현예에서, 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알을 포함한다. 이러한 구현예에서, 치료적 조성물은 바이알에 배치되고, 치료적 조성물은 치료적 치료의 투여에 사용하기 위해 제공되고 물과 혼합시 용해되어 키토산 겔 및 겔에 매립된 복수의 입자를 포함하는 수용액을 제공하도록 제형화된 동결건조된 전구체를 포함하며, 겔은 주사에 의한 투여에 적합하게 만드는 점도를 갖는다. 이러한 구현예에서 입자는 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 코팅은 입자로부터 치료제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함한다.
[0045] 또 다른 구현예는 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템을 제공하기 위한 동결건조 방법을 제공한다. 이 방법은 (1) 키토산 겔 및 복수의 입자를 포함하는 수용액을 형성시키는 단계로서, 상기 입자가 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 상기 코팅이 입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함하는, 단계, (2) 알콜 수용액의 동결 온도 초과의 온도 및 최대 -80℃에서 알콜 수용액을 함유하는 배스에서 수용액을 동결시켜 동결된 층 전구체를 형성시키는 단계, (3) 동결된 층 전구체를 건조시켜 입자가 매립된 무수 분말을 형성시키는 단계, (4) 치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알에 무수 분말을 포함시키는 단계, 및 (5) 바이알에 물을 첨가하여 무수 분말을 용해시키는 단계를 포함한다.
[0046] 선택적으로, 동결건조 방법에서 수용액은 수화 촉진제, 입자 접착 억제제, 및 입자 응집 억제제를 추가로 포함한다.
[0047] 동결건조 방법의 추가의 관련된 구현예에서, 수화 촉진제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한 선택적으로, 입자 접착 억제제는 HPMC, 폴록사머, 및 이들의 조합을 포함한다. 관련 구현예에서, 입자 응집 억제제는 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 조성물은 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함한다. 또한 선택적으로, 입자는 200 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자이다. 추가 옵션으로서, 입자는 500 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자이다.
[0048] 본 발명의 일부 구현예에서, 입자-기반 조성물은 안구 질환을 치료하기 위한 유리체 내 주사에 의한 전달을 위해 제형화된다.
[0049] 선택적으로, 안구 질병은 연령-관련 황반 변성(AMD)이다.
[0050] 일부 구현예에 따르면, 유리체 내 주사용 치료제는 항체, 사이토카인, 소분자 면역요법제, 화학요법제, 압타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유리체 내 주사용 치료제는 베바시주맙이다.
[0051] 구현예의 전술한 특징은 첨부된 도면을 참조하여 취해진 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다:
[0052] 도 1a는 -80℃에서 동결되고 적절하게 보관된, 본 발명에 따른 주사 가능한 키토산 제형(PRV311)을 제공한다. 특히, 제형은 투명한 수용액을 제공한다. (좌측) 실온에서 PRV311(중간) 대비, 및 PRV111(우측). PRV111은 PRV311과 유사한 생성물이지만, 제조될 때 -80℃의 냉동고보다는 액체 질소(-196℃)에서 더 빨리 동결된다.
[0053] 도 1b는 비교를 위해 -80℃에서 동결되고 실온에서 5일 동안 보관된 본 발명에 따른 주사 가능한 키토산 제형(PRV311)을 제시한다.
[0054] 도 1c는 비교를 위해 -196℃에서 액체 질소에서 동결되고 실온에서 5일 동안 보관된 본 발명에 따른 주사 가능한 키토산 제형(PRV311)을 제시한다.
[0055] 도 2는 1400 및 1560 cm-1에서 피크를 갖는 시스플라틴 내부 표준을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말의 FTIR 스펙트럼이다.
[0056] 도 3은 액체 질소(-196℃)에서 동결되고 후속하여 동결건조될 때의 매트릭스(2x 줌)의 사진이다. 다층의 조밀한 패브릭-유사 구조를 주목한다.
[0057] 도 4는 -80℃ 체스트 냉동고(chest freezer)에서 동결되고 후속하여 동결건조될 때의 매트릭스(2x 줌)의 사진이다. 보다 다공성이고 균일한 단층 중합체 섬유를 주목한다.
[0058] 도 5는 다양한 pH 수준의 매질에서 미세입자로부터의 약물의 방출 프로파일이다. 분말을 이들 각각의 매질에서 재구성하고, 72시간 동안 교반 하에 투석 백의 내부에 넣었다. 샘플을 취하였고, 방출 퍼센트가 제시되어 있는데, pH 6의 미세입자(원)는 보다 빠른 분해로 인해 더 빨리 방출되고, pH 3의 미세입자(삼각형)는 더 높은 입자 안정성으로 인해 더 느린 속도로 방출된다. 유리 시스플라틴 용액(사각형)을 대조군으로 사용하였다.
[0059] 도 6은 상이한 처리를 수반하는 시간에 비한 마우스 종양 부피의 변화 그래프를 제공한다. 흑색 곡선은 대조군 미처리 종양에 해당하고, 회색 곡선은 약물을 함유하지 않는 위약 입자를 이용한 종양 내 주사에 해당하고, 녹색 곡선은 약물을 이용한 정맥 내 주사에 해당하고, 적색 곡선은 유리 약물의 종양 내 주사에 해당하고, 청색 곡선은 약물-캡슐화된 하이드로겔 PRV311을 이용한 주사에 해당한다.
[0060] 도 7은 형광 현미경검사로 본, 본 발명의 구현예에 따른 키토산 제형인 PRV311의 주사 후 양 조직의 단면이다. 여기서, 약물은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지되고, 현미경 하에서 녹색으로 나타난다.
[0061] 도 8은 조직 깊이의 함수로서 돼지 혀 조직 내의 FITC 표지된 약물 농도를 나타내는 그래프이다.
[0062] 도 9는 본 발명의 구현예를 이용한 종양 내 주사 및 FITC로 표지된 약물의 국소 분포를 나타내는 사진이다.
[0063] 도 10은 본 발명의 구현예에 따른 주사제의 소 뇌로의 침투를 나타내는 사진이다.
[0064] 도 11은 주사용으로 구성된 본 발명의 구현예를 크게 확대하여 예시하는 도면이다.
[0065] 도 12는 본 발명의 구현예에 따른 주사 가능한 용액 PRV311이 종양 내부 및 주위에 중합체 웹을 구축하는 방법을 크게 확대하여 예시하는 도면이다.
[0066] 도 13a 및 도 13b는 본 발명의 구현예에 따른 PRV311을 예시하는 현미경사진이다.
[0067] 도 14는 본 발명의 구현예에 따라 수 초 내에 임상 용도로 재구성하기에 적합한 제형을 개발하는 과정에서 본 발명자에 의해 평가된 80개 초과의 제형 중 일부를 제시하는 사진이다. 특히, 용액은 투명하다.
[0068] 도 15a, 도 15b 및 도 15c는 완전한 각막 적용범위 및 침투를 입증하는, 양의 눈으로의 형광 표지된 약물을 갖는 PRV311 제형의 주사를 제시한다.
[0069] 도 16은 중합체(적색) 및 약물(녹색)의 별도의 형광 표지를 사용한 주사를 제시하며, 이는 볼루스 및 제어된 전달 둘 모두가 달성될 수 있는 방법을 예시한다.
[0070] 도 17은 형광 표지된 PRV311의 폐 조직으로의 주사를 제시하며, 이는 주사 후 24시간 이상 동안 높은 국소 농도의 약물을 나타낸다.
[0071] 도 18은 양의 간으로의 PRV311의 주사를 제시하며, 이는 다시 높은 국소 농도의 약물을 나타낸다.
[0072] 도 19는 양의 간으로의 PRV311 주사의 측면도를 제시하며, 이는 조직 유형이 약물 분포 패턴에 영향을 미치는 것을 나타낸다.
[0073] 도 20은 양 췌장으로의 PRV311의 국소 주사를 제시하며, 이는 높은 국소 약물 농도 및 조직 유형이 국소화된 약물 분포 패턴에 영향을 미치는 것을 나타낸다.
[0074] 정의. 본 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같은 하기 용어는 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 지시된 의미를 가질 것이다:
[0075] "대상체"는 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 및 추가로, 예를 들어, 인간을 포함한다.
[0076] "중합체"는 적어도 100 단위의 단량체를 갖는 분자이다.
[0077] 중합체 "매트릭스"는 중합체 분자의 3차원 웹이며, 웹은 비공유적으로 얽힌 웹, 이온 가교된 웹, 공유적으로 가교된 웹, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0078] "겔"은 얽힘 및 가교를 유지하면서 용매에서 팽윤되는 중합체 매트릭스의 용액 상이다.
[0079] "미세입자"는 약 200 nm 내지 약 2000 nm의 평균 직경을 갖는 입자 세트이다. "나노입자"는 적어도 1 nm 내지 약 200 nm의 평균 직경을 갖는 입자 세트이다.
[0080] "입자 직경" 또는 "입자 크기"는 입자의 표면 상의 두 지점 사이의 가장 긴 직선 축의 길이이다.
[0081] "순수한 키토산"은 키토산의 염이 아닌 키토산이다.
[0082] "변형되지 않은 키토산"은 작용기의 첨가에 의해, 또는 담체에 대한 연결에 의해 화학적으로 변형되지 않은 키토산이다.
[0083] "변형되지 않은 치료제"는 작용기의 첨가에 의해, 또는 담체에 대한 연결에 의해 화학적으로 변형되지 않은 치료제이다.
[0084] "면역요법제"는 면역 반응을 조절하는 치료제이다. 면역요법제는 생물학적 또는 소분자 약물일 수 있다.
[0085] "화학요법제"는 소분자 약물인 치료제이다.
[0086] "압타머"는 생물학적 표적에 결합하기 위해 시험관 내 선택 방법에 의해 선택된 핵산 또는 변형된 핵산이다. "압타머"의 주목할만한 예는 VEGF에 결합하고 습성 황반 변성의 치료에 사용되는 약물 페갑타닙(pegaptanib)(상표명 Macugen®)이다.
[0087] "미세입자 접착 억제제"는 중합체 매트릭스와 그 안에 매립된 입자 사이의 인력을 낮추는 첨가제이다. 결과적으로, 입자는 접착 억제제가 없을 때보다 더 빠른 속도로 매트릭스를 통해 이동할 수 있다.
[0088] "미세입자 응집 억제제"는 매트릭스가 동결에 적용될 때 응집되는 매트릭스에 매립된 입자의 경향을 낮추는 첨가제이다. 결과적으로, 입자는 동결이 일어날 때 손상 또는 파괴를 겪을 가능성이 적다.
[0089] "점막접착제" 물질은 인체에서 점막에 부착하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
[0090] 중합체 매트릭스는 이의 부피의 일부가 빈 공간일 때 "다공성"이다. 일부 예에서, 빈 공간은 매트릭스의 외부 표면으로부터 접근 가능하여, 빈 공간에 존재하는 물품, 예를 들어, 마이크로입자가 외부 표면으로 및 외부 표면으로부터 이동할 수 있다.
[0091] 중합체 매트릭스에서 "빈" 공간은 중합체에 의해 점유되지 않고 공간을 통해 미세입자 및 소분자의 이동을 허용하는 공간이다.
[0092] "점막 조직"은 관련 점막을 갖는 조직이다. 특히, 점막 조직은 점막 및 또한 점막 아래에 있는 조직을 포함한다.
[0093] 예를 들어, 암성 종양이 존재하는 "점막 조직의 부위"는 점막 뿐만 아니라 점막 아래에 있는 조직을 포함할 수 있다.
[0094] "다분산 지수"(PDI) 또는 간단히 "분산도"는 한 세트의 입자, 예를 들어, 혼합물 중의 미세입자 크기의 불균일성의 척도이다.
[0095] "제타 전위"(ZP)는 특정 매질에서 입자가 획득하는 전체 전하의 척도이다. ZP는 Zetasizer Nano 기기에서 측정될 수 있다.
[0096] "침투"는 점막, 이의 하부 조직, 또는 둘 모두를 통과하거나 관통하는 능력이다. "생체적합성"은 요법의 수용자 또는 수혜자에서 임의의 유의한 바람직하지 않은 국소 또는 전신 효과를 유발하지 않으면서, 상기 특정 상황에서 가장 적절한 유익한 세포 또는 조직 반응을 발생시키고, 의학적 요법의 임상적으로 관련된 성능을 최적화하는, 상기 요법과 관련하여 이의 요망되는 기능을 수행하는 생체재료의 능력을 지칭한다.
[0097] "HPMC"는 하이프로멜로스로도 공지된 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 지칭한다.
[0098] "생분해성"은 생물의 작용에 의해 특히 무해한 생성물로 분해될 수 있는 물질의 특성을 지칭한다.
[0099] "초당 킬로 카운트(Kilo count per second; Kcps)"는 계수율(초당 킬로 카운트(kcps))을 의미한다. 예를 들어, 임계값은 샘플의 계수율이 100보다 낮을 때, 측정이 중단되어야 하도록 설정될 수 있으며, 이는 샘플의 농도가 측정하기에는 너무 낮다는 것을 의미한다. 적합한 Kcps를 갖는 샘플은 측정을 위한 이상적인 농도를 갖는 안정한 샘플로 간주될 수 있다.
[0100] "메쉬"는 처리된 영역에 부착되는 중합체 매트릭스를 지칭하며, 이는 처리된 영역에 적용될 때 메시로부터 방출되도록 그 안에 혼입된 요소를 함유한다.
[0101] "중합체 매트릭스 및 미세입자에 기반한 치료제의 전달을 위한 시스템"은 또한 "제제 전달 장치" 또는 "전달 패치"로 지칭될 수 있다.
[0102] 달리 명시되지 않는 한, 용어 "중량%"는 중량 백분율로 표현되는 치료제의 전달을 위한 시스템의 성분의 양을 지칭한다.
[0103] 달리 명시되지 않는 한, 중합체의 "몰 질량"은 중합체 분자의 수 평균 몰 질량을 의미하는 것으로 의도된다.
[0104] 암은 모든 연령에서 임의의 기관의 임의의 조직에서 발생할 수 있다. 암의 명백한 진단이 내려지면, 치료 결정이 최우선이 된다. 모든 암에 단일 치료 접근법을 적용할 수는 없지만, 성공적인 요법은 원발성 종양 및 이의 전이 둘 모두에 초점을 맞추어야 한다. 역사적으로, 수술 또는 방사선과 같은 국소 및 국부 요법은 전신 요법, 예를 들어, 화학요법 약물과 함께 암 치료에 사용되어 왔다. 일부 성공에도 불구하고, 통상적인 치료는 요망되는 정도로 효과적이지 않으며, 보다 효과적인 치료법에 대한 연구가 계속되었다. 보다 효율적인 암 요법에 대한 상당한 충족되지 않은 요구가 분명히 존재한다.
[0105] 본 발명의 구현예에 대한 주요 용도 중 하나는 국소 및 국부 방식으로 종양을 치료하는 가장 효과적인 방식을 보장하기 위해 종양에서 약물의 고농도를 유지하고 또한 일부 약물을 림프절로 배출시키는 가장 좋은 방식을 입증하는 데이터와 함께 화학요법 및 면역요법의 종양내 주사를 위한 것이다.
[0106] 종양 내 주사는 원발성 병변 또는 이의 전이가 직접 주사를 통해 경피적으로 또는 결장내시경, 방광경, 기관지경, 흉강경, 대장내시경, 또는 심지어 수술과 같은 특정 절차를 통해 접근 가능한 임의의 종양에 대해 고려될 수 있다.
[0107] 현재 면역 수용체 효능제(예를 들어, Toll-유사 수용체(TLR) 효능제 및 인터페론 유전자 자극제(STING) 효능제, ICT mAb, 야생형 및 유전적으로-변형된 종양용해제(예를 들어, 바이러스 및 펩티드), 사이토카인 및 다양한 잠재적 표적에 대한 면역 세포)를 포함하는 종양 내 요법에서의 역할에 대해 조사되고 있는 많은 제제가 있다. 따라서, 인간 종양 내 전략의 임상 개발을 지원하기 위해, 본 발명자는 이러한 제제의 국소 전달 및 보유를 위한 주사 가능한 시스템을 개발하였다.
[0108] 또한, 종양으로의 직접 주사는 전신 노출, 표적외 독성, 및 사용된 약물의 양을 감소시키면서 주사된 종양 병변 및 원위의 주사되지 않은 종양 병변에서 더 강한 항종양 활성을 유도한다.
[0109] 전신 면역요법 및 전신 화학요법이 종종 사용되지만, 이들은 환자의 전신을 약물의 독성 부작용에 노출시킨다. 전신 투여는 이러한 전신 노출의 안전성을 고려하여 예방조치를 취해야 하므로, 혈류 및 다른 기관 내의 노출로 인해 용량 제한적이다. 전신 전달은 종종 신체와 반응하는 독성 약물로부터 유해한 부작용을 초래한다. 이들은 신경독성, 신독성, 신부전, 탈모, 메스꺼움 및 점막염을 포함한다. 수술에 대한 대안으로서, 방사선 외에 화학요법이 또한 항문 종양을 치료하기 위한 방법으로 사용된다. 현재의 치료 표준은 작은 국소 종양이 있는 경우에도 항문관 편평 세포 암종을 갖는 환자에 대해 화학요법 및 방사선의 초기 동시 조합을 사용한다. 화학요법이 사용될 때, 임시 중심 정맥 카테터 또는 말초 삽입된 중심 카테터가 개인에게 사용될 수 있다. 치료로부터의 부작용은 전신 화학요법에 전형적인 것들을 포함한다. 여기에는 메스꺼움, 탈모, 신장 손상, 낮은 혈구 수, 구강 궤양 및 손상된 면역계가 포함된다. 화학요법은 현재 전신에 걸쳐 전신 전달되기 때문에, 용량 제한 요인이 있다.
[0110] 약물의 치료 이점은 이의 효능을 최대화하고/거나 이의 부작용을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 국부 암 약물 요법의 개발을 위한 기초는 전신 분포 및 그에 따른 독성을 최소화하면서 효과적인 표적 조직 농도의 달성이다. 임상적으로 사용되는 기존의 국부 화학요법의 예는 간 및 신장 신생물에 대한 동맥 내 주입, 흑색종 및 육종에 대한 사지 관류, CNS 신생물에 대한 척추강 내 투여, 및 복강내 신생물에 대한 복강 내 투여를 포함한다. 보다 최근에, 원발성 간세포암에 대한 순수한 에탄올의 직접 종양 내 주사가 개발되었다. 대부분의 세포독성 화학요법제와 관련된 한 가지 주요 단점은 이들이 강한 소포제이며, 따라서 전달 기술이 약물을 종양에 국소적으로 유지하고 건강한 조직으로의 누출을 허용하지 않도록 하지 않는 한 종양 내 투여를 위한 이상적인 후보가 아니라는 사실이다. 본 발명의 구현예는 종양에서의 약물 체류 및 감소된 부작용을 보장하기 위해 중합체성 약물 로딩된 키토산 입자 및 중합체의 조합물의 조합을 사용한다.
[0111] 종양 내 면역요법은 종양을 그 자체의 백신으로 사용하는 것을 목표로 하는 치료 전략이다. 종양으로의 직접 주사시, 소량의 약물을 사용하면서, 고농도의 면역자극 생성물이 동일 반응계에서 달성될 수 있다. 면역요법의 국소 전달은 다수의 조합 요법을 가능하게 하는 한편, 상당한 전신 노출 및 표적외 독성을 방지한다. 제공된 암의 우세한 에피토프가 불확실함에도 불구하고, 특성규명 필요 없이 관련 신생-항원 또는 종양-관련 항원에 대한 면역 반응을 이에 따라 촉발시킬 수 있다. 이러한 면역 자극은 적절하게 활성화된 항종양 면역 세포의 순환 덕분에, 전신(압스코팔(abscopal)) 종양 반응을 발생시키면서 국소적으로 암 면역의 강한 프라이밍을 유도할 수 있다. 암 면역요법 개발의 현재 한계 중 많은 부분을 해결하면서, 종양 내 면역요법은 또한 모든 종양 주사에서 순차적 및 다초점 생검을 허용함으로써 암 면역의 동역학을 더 잘 이해할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 문헌[Marabelle, A. et al. (2018) Starting the fight in the tumor: expert recommendations for the development of human intratumoral immunotherapy (HIT-IT), Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology, 29(11), 2163-2174].
[0112] 5가지 부류의 면역요법 모두는 전달 문제에 직면한다. 체크포인트 억제제, 사이토카인, 및 작용성 항체는 유사한 전달 문제를 갖는다. 이러한 요법의 성공은 표적화된 단백질과의 상호작용에 의존한다. 이들의 사용의 주요 제한은 이들이 상당한 자가면역을 생성하여 허용 가능한 투여 용량을 제한하는 부작용을 초래한다는 것이다. 이러한 이유로, 이러한 요법에 대한 전달 기술의 개발에서 중심 목표는 요법이 요망되는 세포 유형에서 주로 활성이 되도록 표적화 및 제어 방출을 가능하게 하여 표적-외 효과를 최소화하는 것이다.
[0113] 많은 고형 종양에서의 미세환경은 여기서 논의된 모든 면역요법 부류의 광범위한 구현에 대한 난제이다. 예를 들어, 고형 종양의 미세환경은 각각 종양 공간 내에서 높은 수준 또는 낮은 수준의 세포독성 림프구 침윤을 갖는 면역학적으로 '뜨거운'(높은 면역원성) 또는 '차가운'(낮은 면역원성) 것으로 분류될 수 있다. 미세환경 조성의 이러한 주요 차이는 높은 면역원성을 갖는 종양이 낮은 면역원성을 갖는 종양보다 체크포인트 억제제에 대해 더 강한 반응을 나타낸다는 것을 시사한다.
[0114] 전달 기술은 차가운 종양에서 면역원성을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 전달 플랫폼은 또한 특정 조직에 대한 약물 노출을 제한함으로써 면역요법의 전신 독성을 감소시킬 수 있기 때문에, 이들은 달리 환자에게 투여하기에 너무 독성이 있을 수 있는 치료제의 조합물을 전달하는데 사용될 수 있다.
[0115] 본 발명의 구현예를 이용한 면역요법의 국소 전달은 다수의 조합 요법을 가능하게 하는 한편, 상당한 전신 노출 및 표적외 독성을 방지한다. 제공된 암의 우세한 에피토프가 불확실함에도 불구하고, 특성규명 필요 없이 관련 신생-항원 또는 종양-관련 항원에 대한 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 이러한 면역 자극은 적절하게 활성화된 항종양 면역 세포의 순환 덕분에, 전신(압스코팔) 종양 반응을 발생시키면서 국소적으로 암 면역의 강한 프라이밍을 유도할 수 있다.
[0116] 본 발명의 구현예에 따르면, 종양에는 면역치료 입자 및 화학치료 입자 중 하나 이상의 조합물을 포함하는 조성물이 주사될 수 있다. 화학요법 입자는 종양 세포에서 DNA-손상 효과를 야기하는 것에 더하여 수지상 세포를 활성화시키고 종양에서 면역 활성을 유도하는 것으로 밝혀진 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하나 이에 제한되지 않는 화학요법제를 함유할 수 있다.
[0117] 화학요법을 전달할 때 본 발명의 구현예는 면역학적으로 차가운 종양이 뜨거워지도록 하여 이들을 면역요법에 민감하게 만들 수 있다. 종양-표적화된 면역요법 입자 및 화학요법은 상승적으로 작용하여 종양 성장을 억제하고, 즉, 본 발명의 구현예를 사용하지 않고 면역요법 및 화학요법 단독의 것과 비교하여 감소된 독성을 나타낸다.
[0118] 본 발명자는 미세입자가 낮은 면역원성을 갖는 종양을 면역요법에 민감하게 만드는 조합 치료 전략을 가능하게 할 수 있음을 발견하였다. 조합 치료 전략을 가능하게 하는 것 외에도, 본 발명의 구현예는 종양 미세환경에 반응하고 이러한 부위에서 침투를 증가시키도록 설계될 수 있다.
[0119] 문헌[David Zaharoff et al.]에 따르면, 사이토카인 IL-12와의 키토산 혼합물은 마우스 실험에서 종양 퇴행에 효과적이었다 (Zaharoff, D. A., et al. (2010). Intratumoral immunotherapy of established solid tumors with chitosan/IL-12. J. Immunother., 33, 697). 그러나, 본 발명자의 데이터는, 본 발명의 구현예에 따르면, IL12 입자가 로딩된 키토산 매트릭스 키토산의 조합물이 고농도로 종양에서의 제어 방출과 함께 매우 높은 체류 시간(>10일)을 갖는다는 것을 제시한다. 다양한 구현예에서, 주사 가능한 사이토카인은 자하로프(Zaharoff)의 작업에서 수행된 실험실 실험과 달리 번역을 통한 응용을 위해 병상의 클리닉에서 몇 초 이내에 혼합될 수 있다.
[0120] IL-12는 전신 투여 후 유의한 임상 독성을 나타내는 강력한 항종양 사이토카인이다. 자하로프는 생분해성 다당류 키토산과 공동제형화된 IL-12의 종양내(i.t.) 투여가 IL-12의 전신 독성을 제한하면서 IL-12의 항종양 활성을 향상시킬 수 있다고 가정하였다. 비침습적 영상 연구는 i.t. 주사 후 키토산 공동제형의 유무에 관계없이 IL-12의 국소 체류를 모니터링하였다. IL-12 단독 및 키토산과 공동제형화된 IL-12(키토산/IL-12)의 항종양 효능을 확립된 결장직장(MC32a) 및 췌장(Panc02) 종양을 갖는 마우스에서 평가하였다. 면역 세포 서브셋의 고갈, 종양 재공격, 및 CTL 활성을 포함하는 추가 연구는 퇴행 및 종양-특이적 면역의 메커니즘을 설명하기 위해 설계되었다. 키토산과의 공동제형은 국소 IL-12 체류를 1 내지 2일에서 5 내지 6일로 증가시켰다. 매주 IL-12 단독의 i.t. 주사는 확립된 MC32a 및 Panc02 종양의 ≤10%를 근절한 반면, i.t. 키토산/IL-12 면역요법은 마우스의 80% 내지 100%에서 완전한 종양 퇴행을 야기하였다. CD4+ 또는 Gr-1+ 세포의 고갈은 키토산/IL-12-매개 종양 퇴행에 영향을 미치지 않았다. 그러나, CD8+ 또는 NK 세포 고갈은 항종양 활성을 완전히 폐지하였다. I.t. 키토산/IL-12 면역요법은 전신 종양-특이적 면역을 발생시켰는데, 이는 i.t. 키토산/IL-12 면역요법으로 치료된 마우스의 >80%가 종양 재공격으로부터 적어도 부분적으로 보호되었기 때문이다. 또한, 치료된 마우스의 비장으로부터의 CTL은 MC32a 및 gp70 펩티드-로딩된 표적을 용해시켰다. 키토산/IL-12 면역요법은 종양 미세환경에서 IL-12의 국소 체류를 증가시키고, 확립된 공격적인 뮤린 종양을 근절시키고, 전신 종양-특이적 보호 면역을 발생시켰다. 키토산/IL-12는 임상 번역에 대한 상당한 잠재력을 갖는 잘 용인되고 효과적인 면역요법이다.
[0121] 일부 구현예에서, 안구 질환, 특히 연령-관련 황반 변성을 치료하기 위해 눈으로의 유리체 내 주사에 의한 약물의 제어된 전달을 위한 입자-기반 제형이 제공된다. 이러한 구현예에서, 생체적합성 중합체는 눈의 상피에 부착되는 중합체 메시를 형성하는 하이드로겔 매트릭스를 형성하며, 여기서 이는 조직에 약물 입자를 이식한다. 입자는 장기간, 예를 들어, 4개월에 걸쳐 분해되어 약물의 지속 방출을 제공할 수 있다.
[0122] 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명자는 난용성 제제 및 중합체의 경구 및 주사 가능한 전달을 위한 제형을 개발하였다. 제형은 액체 나노결정 분산액을 고체 투여 형태로 전환시키는 것을 가능하게 하였다. 고체 투여 형태는 물에 용해시 이의 원래 크기로 용이하게 재구성될 수 있는 나노결정을 포함한다. 입자-입자 응집을 감소시키기 위해 동결 속도를 최적화하기 위해서는 신중한 제형이 필요하다. 나노결정을 건조시키기 위한 임계 동결 속도가 결정되었다. 임계값 근처의 동결 속도로 동결 건조하면 재분산 후 바이모달 입자 크기 분포의 건조 분말이 생성된다. 또한, 약물 나노결정 농도는 임계 동결 속도 및 이에 따른 건조 분말의 재분산성에 유의하게 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 임계 동결 속도의 개념은 액체 나노결정 분산액의 고체 투여 형태의 개발에 중요하다.
[0123] 본 발명의 구현예는 분말 형태로 배송될 수 있고 환자의 병상에서 종양 내 주사를 위해 멸균수에 신속하고 균일하며 일관되게 용해될 수 있는 제형을 제공한다.
[0124] 본 발명의 구현예는 다양한 조직, 및 특히 암성 종양에 치료제를 전달하기 위한 시스템을 제공한다. 다양한 구현예는 키토산 및 매트릭스 내에 매립된 복수의 입자를 포함한다.
[0125] 본 발명의 구현예의 작업 제형이 개발되면, 가교제로서 소듐 트리폴리포스페이트를 이용한 이온성 겔화를 사용하여 실온에서 키토산 미세입자를 합성하였다. 입자 접착 억제제, 입자 응집 억제제, 및 수화 촉진제를 함유하는 중합체 매트릭스의 별도의 제형을 미세입자 용액에 첨가하였다. 미세입자 및 매트릭스 용액을 바이알에 분배하고, -80℃ 냉동고로 옮기고, 밤새 동결시켰다. 이후, 바이알을 72시간 동안 동결건조시켰다.
[0126] 시스플라틴을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말을 생산하기 위한 본 발명의 일부 구현예는 하기 프로토콜에 기반한다:
1. 키토산 분말을 아세트산 용액에 첨가하고(0.186 w/w%), 용해될 때까지 교반한다.
2. 별도의 용기에서, 시스플라틴(0.15 w/w%)을 소듐 트리폴리포스페이트 및 염수 용액에 첨가한다. 용액을 대략 40℃로 가열하고 교반함으로써 시스플라틴을 용해시켰다.
a. 시스플라틴이 들어 있는 모든 용기는 빛 노출로부터 차폐되었다.
3. 시스플라틴-소듐 트리폴리포스페이트 용액의 내용물을 키토산 용액으로 옮겼다.
a. 둘 모두의 용액을 이 단계 전반에 걸쳐 부드럽게 교반하였다.
b. 여기서 이 단계는 미세입자를 생산한다. 항정 상태가 달성되면, 입자 크기/전하가 수집된다.
4. 물 중 수크랄로스 용액(25 w/w%)을 제조하고 나중에 사용하기 위해 따로 두었다.
5. 별도의 스크류-탑 병에서, 키토산 분말을 희석된 아세트산 용액(1.0 w/w%)에 첨가한다. 이후, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(0.1 w/w%)를 키토산-아세트산 용액에 첨가한다. 이를 30분 동안 교반한다.
6. 수크랄로스 용액을 키토산-시스플라틴 미세입자 용액으로 옮겼다. 이후, 패치 매트릭스 용액을 옮겼다.
7. 5 mL의 용액이 분배되기 전에 최종 용액을 5분 동안 교반하였다. 바이알을 -80℃ 냉동고에서 대략 2시간에 걸쳐 동결시켰다.
8. 바이알을 6일 동안 동결건조기에 두었다.
[0127] 시스플라틴을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말에 대한 샘플 분석 증명서는 표 1에 제시되어 있다. 샘플의 FTIR 특성규명은 도 2에 제시되어 있으며, 여기서 1400 ± 30 cm-1 및 1560 ± 30 cm-1에서 특징적인 시스플라틴 피크를 볼 수 있다.
표 1: 시스플라틴을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말에 대한 샘플 분석 증명서:
Figure pct00003
Figure pct00004
[0128] 표 2에 요약된 바와 같이, pH에 대한 용해도를 특성규명하기 위해, 시스플라틴을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말을 다양한 pH 매질 내에서 재구성하고, 시스플라틴의 방출을 UV-가시광선 분광계에서 355 nm에서 모니터링하였다.
표 2: 다양한 pH의 매질에서 시스플라틴을 포함하는 주사 가능한 키토산 분말의 상대 용해도.
Figure pct00005
[0129] 본 발명의 대표적인 구현예의 제1 세트에 따르면, 조직의 부위로 치료제의 주사 가능한 국소 전달을 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 매립된 입자를 조직 내에 국한시키는 데 기여하는 용매에서 겔, 즉, 중합체 웹 유사 구조를 형성할 수 있는 중합체 매트릭스를 포함한다. 겔 매트릭스는 키토산, 수화 촉진제, 미세입자 접착 억제제, 및 미세입자 응집 억제제를 포함하는 조성물에 의해 형성된다. 복수의 미세입자는 겔 매트릭스 내에 매립된다. 겔 매트릭스는 약물 로딩된 입자가 조직 내에서 제한된 운동 범위를 가질 수 있도록 개방되도록 구성된다. 미세입자는 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 갖는다. 미세입자의 코팅은 미세입자로부터 제제의 제어 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함한다. 선택적으로, 수화 촉진제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한 선택적으로, 미세입자 접착 억제제는 비이온성 중합체이고, 추가 옵션으로서, 비이온성 중합체는 HPMC 또는 폴록사머이다. 또한, 옵션으로서, 미세입자 응집 억제제는 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한 선택적으로, 미세입자는 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함한다. 선택적으로, 시스템에는 매트릭스에 직접 매립되고 달리 키토산으로 코팅되지 않은 자유량의 치료제가 존재하며, 여기서 자유량의 치료제는 시스템에서 치료제의 총량의 20 내지 80%를 구성한다. 선택적으로, 매트릭스 중 키토산 및 미세입자 중 키토산은 순수한 키토산이다. 추가 옵션으로서, 미세입자의 평균 직경은 약 500 nm 내지 약 2000 nm이다.
[0130] 매트릭스는 조직을 통해 미세입자의 제어 방출을 제공하도록 구성된다. 이 시스템은 암성 종양과 같은 손상된 조직에 국소 방식으로 상당한 전신 독성 부작용을 갖는 강력한 약물을 주사하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 제조 방법은 혼합물을 -80℃에서 동결시켜 동결된 층 전구체를 형성시키는 것을 추가로 포함한다. 최종적으로, 본 발명의 제조 방법은 동결된 층 전구체를 건조시켜, 수화시, 매트릭스 내에 매립된 미세입자를 갖는 겔 매트릭스를 형성하는 분말을 형성하는 것을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 최종 생성물(재구성을 위한 분말)은 6개월 이상 동안 안정하지만, 이는 건조제와 함께 보관되고, 방수 마일라 호일 파우치 내에 열-밀봉되고, 2-8℃ 냉장고에서 보관되는 경우에만 가능하다. 이러한 조건이 충족되는 경우, 시스템(메쉬 내에 키토산 나노입자를 포함하는 샘플 PRV311)은 투명한 용액 또는 불균일한 미세입자 현탁액으로 재구성될 수 있다. PRV311의 용해도는 동결될 때 메쉬에서 그리고 PRV311이 환자에게 사용하기 위해 감마 조사될 때 키토산에서 발생하는 사슬 단편화 가수분해(예를 들어, 동결-해동 가수분해)로 인해 추가로 증가한다. 적절하게 보관된 PRV311은 도 1a에 제시되어 있으며, 이는 투명한 용액/미세입자 현탁액이다.
[0131] 도 1b에 제시된 바와 같이, PRV311은 재구성 전 며칠 동안 실온에서 보관되는 경우 적절하게 재구성되지 않는다. 도 1b의 바이알은 재구성 전에 실온에서 5일 동안 보관되었고, 이는 주사에 부적합한 불균질한 거친 현탁액을 형성한다. 도 1c의 바이알은 액체 질소에 의해 PRV311보다 더 빠르게 동결되고 또한 5일 동안 실온에서 보관된 또 다른 제형인 PRV111을 제시한다. 이에 따라 처리된 PRV111 제형은 또한 주사에 부적합한 불균질한 거친 현탁액을 형성한다.
[0132] 이론에 국한됨이 없이, 다음과 같이 가정된다:
a) 응집 억제제가 첨가된 경우에도, 동결건조 후 분말 제형에서 입자-입자 입체형태적 응집이 천천히(반 데르 발스 힘에 의해 구동) 발생하지만, 분말 제형이 2-8℃ 조건에서 보관될 때, 저온은 시스템에서 더 큰 동역학적 안정성을 제공한다;
b) 일부 온도-관련 요인은 메쉬의 일부를 불용성으로 만든다.
[0133] PRV311은 생성물의 액체 형태를 바이알에 분배하고, 바이알을 -80℃ 주위 환경에서 적어도 8시간에 걸쳐 동결시킴으로써 제조된다. 적어도 1 mL의 매질에서 재구성한 후, 적절한 부피의 PRV311을 루어 락(Luer Lock) 주사기로 회수한다. PRV311은 18 내지 30의 바늘 게이지를 사용하여 종양에 직접 주사된다. PRV311의 각 바이알은 0.1 내지 100 mg의 약물을 함유할 수 있다. 투여량의 한계는 캡슐화된 면역요법제 또는 소분자의 물에서의 용해도에 의존적이다. 투여 빈도는 치료 부위, 적응증 및 관리자의 재량에 의존한다.
[0134] 본 발명의 일부 구현예에서, 키토산, 수화 촉진제, 미세입자 접착 억제제, 및 미세입자 응집 억제제를 포함하는 조성물에 의해 형성된 수용성 중합체 매트릭스가 존재한다. 본 발명의 또 다른 세트의 대표적인 구현예에 따르면, 치료제 전달 시스템을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 복수의 미세입자를 갖는 제1 혼합물을 형성시키는 단계를 포함한다. 미세입자는 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 코팅은 키토산을 포함한다. 상기 방법은 또한 제1 혼합물, 키토산, 수화 촉진제, 미세입자 접착 억제제, 및 미세입자 응집 억제제를 포함하는 성분으로부터 제2 혼합물을 형성시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 알콜 수용액의 동결 온도 초과의 온도 및 최대 -80℃에서 알콜 수용액을 함유하는 배쓰에서 제2 혼합물을 동결시켜 동결된 층 전구체를 형성시키는 단계를 추가로 포함한다. 최종적으로, 상기 방법은 동결된 층 전구체를 건조시켜 매트릭스 내에 매립된 미세입자를 갖는 다공성 중합체 매트릭스를 형성시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 배스는 드라이아이스를 추가로 함유한다. 또한, 선택적으로, 알콜 수용액의 알콜은 에탄올이다. 추가 옵션으로서, 알콜 수용액은 약 90 중량% 에탄올 내지 약 99 중량% 에탄올이다. 선택적으로, 상기 방법은 제2 층 전구체를 동결된 층 전구체에 적용하여 제1 층 및 제2 층을 포함하는 고체를 형성시키는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 제2 층은 치료제를 포함한다. 또한, 선택적으로, 건조는 진공 하에서의 건조이다.
[0135] 본 발명의 일부 구현예에서, 수용액은 -80℃ 초저온 냉동고를 사용하여 동결된다. 다른 구현예에서, 액체 질소를 사용하여 용액을 동결시켰다. -80℃ 초저온 냉동고를 사용한 동결 방법을 액체 질소 동결 방법과 비교하였고, 결과는 놀라웠다. 도 3에 제시된 바와 같이, 액체 질소(-196℃)에서 동결되고 동결건조될 때, 다층의 조밀한 직물-유사 구조가 획득된다. 대조적으로, 도 4에 제시된 바와 같이, -80℃에서 동결될 때, 더 다공성이고 균일한 단일 층 중합체 섬유가 획득된다. 두 가지 방법으로 인한 용액 사이의 구조적 차이는 캡슐화된 치료제의 방출의 제어 및 타이밍에 주요한 영향을 미쳤다. 시스플라틴을 포함하는 특정 구현예에서, 본 발명자는 제품 개발 과정을 통해 시스플라틴 메시가 적절하게 기능하기 위해 중합체 및 부형제의 특정 조합이 필요하다는 것을 발견하였다. 개발 동안, 메시 내의 나노입자의 덩어리 및 응집으로 인해 메시로부터 조직으로의 시스플라틴-함유 나노입자의 침투가 방해되었다. 부형제 및 중합체의 조합물을 첨가하면 메쉬로부터 나노입자가 완전히 방출되는 것으로 밝혀졌다. 조합물의 포함이 이상적인 방출 및 투과를 초래하는 이유는 즉시 알려지지 않았으나; 현미경 분석시, 이의 포함물이 메쉬 구조의 포어 내에 미세입자 "콜로니"를 형성하는 방식으로 나노입자 및 메쉬 구조와 반응하는 것이 명백하였다(도 3 참조). 전형적으로 하나의 큰 덩어리이고 불균일한 응집 또는 덩어리와 달리, "콜로니"는 크기가 거의 균일하고 메쉬로부터 방출되어 조직으로 침투하기에 충분히 작게 유지된다. 메쉬의 구조는 또한 중합체 부형제 조합물이 포함될 때 변경되었다. 상기 포함은 미세입자를 보유하고 보다 쉽게 방출할 수 있는 포어를 갖는 보다 결정질인 구조를 생성하였다. 중합체 부형제 조합에 기인한 상기 언급된 기능은 조직 내에서 세포 접합을 개방하는 중합체의 능력의 결과인 것으로 보고되었으며; 이들은 이러한 목적을 위해 시험 동안 메쉬의 조성에 처음에 포함되었다. 그러나, 메쉬의 구조에 대한 이의 효과 뿐만 아니라 이의 미세입자의 "콜로니화" 및 응집 예방의 효과 둘 모두를 포함하여 세포를 변경하는 것 이상의 이의 효과는 이전에 보고되거나 관찰되지 않았다. 조합하여 사용되는 중합체 및 부형제의 효과는 상승작용적이며, 이는 방출 및 침투에 대한 이들의 조합된 영향이 이들의 개별 효과의 합보다 훨씬 크기 때문이다.
[0136] 다양한 pH에서 입자의 방출 프로파일은 도 5에 제시되어 있다. 분말을 이들 각각의 매질에서 재구성하고, 72시간 동안 교반 하에 투석 백의 내부에 넣었다. 샘플을 취하였고, 방출 퍼센트가 제시되어 있는데, pH 6의 미세입자(원)는 보다 빠른 분해로 인해 더 빨리 방출되고, pH 3의 미세입자(삼각형)는 더 높은 입자 안정성으로 인해 더 느린 속도로 방출된다. 유리 시스플라틴 용액(사각형)을 대조군으로 사용하였다. 이 도면에서, 더 낮은 pH는 미세입자로부터 약물의 방출을 늦추는 것이 명백하다.
[0137] 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 중합체 부형제 조합물은 키토산, 하이프로멜로스, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 수화 촉진제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0138] 본 발명의 일부 구현예에서, 미세입자 접착 억제제는 비이온성 중합체이다.
[0139] 본 발명의 일부 구현예에서, 비이온성 중합체는 HPMC 또는 폴록사머이다.
[0140] 본 발명의 일부 구현예에서, 미세입자 응집 억제제는 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0141] 본 발명의 일부 구현예에서, 미세입자는 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함한다.
[0142] 본 발명의 일부 구현예에서, 시스템은 매트릭스에 직접 매립되고 달리 키토산으로 코팅되지 않은 자유량의 치료제를 추가로 포함하고, 여기서 자유량의 치료제는 시스템에서 치료제의 총량의 20 내지 80 중량%를 구성한다.
[0143] 본 발명의 일부 구현예에서, 매트릭스 중의 키토산 및 미세입자 중의 키토산은 변형되지 않은 키토산이다.
[0144] 본 발명의 일부 구현예에서, 미세입자의 평균 직경은 약 0.5 μm 내지 약 2 μm이다.
[0145] 본 발명의 일부 구현예에서, 치료제는 면역요법제와 같은 항체 또는 화학요법제와 같은 소분자이다.
[0146] 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명은 치료제의 표적화된 전달을 위한 미세입자를 포함하고, 미세입자는 변형되지 않은 치료제 및 변형되지 않은 키토산을 함유한다.
[0147] 본 발명의 일부 구현예에서, 미세입자는 매트릭스에 의해 직접 둘러싸이고 매트릭스와 접촉하도록 매트릭스 내에 매립된다.
[0148] 본 발명의 일부 구현예에서, 매트릭스로의 수화 촉진제의 첨가에 의해 개선된 중합체 매트릭스 및 미세입자에 기반한 치료제의 전달을 위한 시스템이 제공된다. 예시적인 수화 촉진제는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 및 글리세롤과 같은 흡습성 화합물을 포함한다. 수화 촉진제의 양에 대한 예시적인 농도 범위는 약 0.001 내지 약 10 중량%, 약 0.01 내지 약 5 중량%, 및 약 0.1 내지 약 1 중량%를 포함한다.
[0149] 임의의 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 수화 촉진제는 전달 시스템에 의한 수분 흡수를 증가시키는 것으로 여겨진다. 이러한 수화의 증가는 매트릭스로부터 미세입자의 빠른 방출 및 투과를 가능하게 한다. 또한, 수화 촉진제는 전달 시스템의 제조 공정 동안 동결보호제로서 작용함으로써 균일성 및 내구성을 개선시키는 것으로 여겨진다. 다시, 임의의 특정 이론에 국한됨이 없이, 수화 촉진제는 얼음 결정과 매트릭스 중합체 분자 사이에 "스페이서"로서 작용하여 균일한 동결 패턴을 보장하는 것으로 여겨진다. 생성된 구조는 수화 촉진제의 부재하에서 보다 더 유연하고, 균일하고, 내구성이 있다.
[0150] 또 다른 세트의 대표적인 구현예에서, 접착 억제제의 첨가에 의해 개선된 전달 장치가 제공된다. 임의의 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 매트릭스 및 입자가 키토산과 같은 극성 또는 이온 하전된 모이어티를 갖는 물질로 제조될 때, 입자의 이동성이 저하되는 것으로 여겨진다. 키토산의 경우, 중합체의 아세틸 및 아민 모이어티 사이의 상호작용은 입자를 매트릭스에 부착시키고 이들의 방출을 억제하게 하는 것으로 여겨진다.
[0151] 접착 억제제의 포함은 입자와 매트릭스의 접착을 완화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 임의의 특정 이론에 국한됨이 없이, 접착 억제제는 입자의 키토산과 매트릭스의 몸체의 키토산 사이에 "스페이서"로서 작용하여, 입자를 방출하고 개선된 약물 방출 프로파일을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 대표적인 예시적인 접착 억제제는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC)와 같은 비이온성 중합체를 포함한다. 적용에 따라, 비이온성 중합체의 몰 질량은 약 1 kDa 내지 약 200,000 kDa일 수 있는 한편, 이의 점도는 약 10 cps 내지 100,000 cps로 다양할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 비이온성 중합체의 몰 질량은 약 10 kDa 내지 30 kDa이고, 이의 점도는 약 10 cps 내지 약 100 cps이다. 적용에 따라, 접착 억제제의 양은 약 0.1 중량% 내지 약 99 중량%일 수 있다. 일부 구현예에서, 접착 억제제의 양은 약 0.1 중량% 내지 약 25 중량%이다.
[0152] 대표적인 구현예의 추가 세트에서, 응집 억제제의 첨가에 의해 개선된 전달 장치가 개시된다. 전달 장치를 제조하기 위한 공정은 얼음 결정이 매트릭스 내에 형성될 수 있는 동결 단계를 포함한다. 이러한 결정은 미세입자를 서로 강제할 수 있어, 입자가 손상되거나 파괴되는 입자 응집체를 생성할 수 있다. 다시 임의의 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 응집 억제제는 입자의 응집을 방지하는 결정 미세구조를 형성함으로써 동결보호제 작용을 발휘하는 것으로 여겨진다. 탄수화물 및 탄수화물 유도체는 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 및 염소화 이당류, 예를 들어, 수크랄로스를 포함하는 예시적인 유형의 응집 억제제를 제공한다. 적용에 따라, 패치 중 응집 억제제의 양은 약 0.1 내지 약 50 중량% 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 응집 억제제의 양은 약 1 내지 약 10 중량%이다.
[0153] 또 다른 세트의 대표적인 구현예에서, 개선된 순수한 키토산 미세입자가 제공된다. 전통적인 키토산 입자는 높은 정도의 탈아세틸화를 특징으로 하고 전기적으로 하전된 모이어티, 예를 들어, 키토산 클로라이드 및 키토산 글루타메이트를 보유하는 키토산의 염으로 제조된다. 입자가 염이 아닌, 즉, 양성자화되지 않은 이의 아민 기를 특징으로 하고, 적어도 70%의 탈아세틸화도를 갖는 것을 특징으로 하는 물질인 순수한 키토산으로부터 제조되는 경우 더 나은 결과가 제공되는 것으로 밝혀졌다. 특히, 입자는 전통적인 입자보다 큰 직경을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 순수한 키토산 입자의 평균 직경은 약 200 내지 약 2000 나노미터의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 평균 직경은 약 500 내지 약 2000 나노미터, 및 추가 구현예에서 500 내지 1000 nm의 범위이다. [0043] 추가 개선에서, 소듐 트리폴리포스페이트(STPP)의 첨가에 의해 개선된 키토산 미세입자가 제공된다. 임의의 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, STPP는 키토산 상의 양으로 하전된 아민 기에 대해 음성 반대-이온으로서 작용함으로써 입자를 형성하는 가교제로서 기능하는 것으로 여겨진다. 이러한 정전기적 상호작용은 입자의 구조를 지지하는 이온 결합을 형성한다. 또한, 임의의 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 양성 반대이온으로서 소듐의 존재는 STPP를 다른 TPP 염보다 더 효과적인 가교결합제로 만드는 것으로 여겨진다.
[0154] 또한, 겔 매트릭스가 매트릭스에 직접 매립되고 입자에서 키토산으로 달리 코팅되지 않은 자유량의 치료제를 포함하는 경우, 장치는 단지 자유량의 치료제 또는 단지 키토산으로 코팅된 치료제를 포함하는 비교 가능한 매트릭스보다 치료적으로 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 대표적인 구현예에서, 치료제의 자유량은 전달 시스템에서 치료제의 총량의 20 내지 80%를 구성한다.
실시예:
[0155] 주사용수 USP, 0.12% 염수 USP, 및 0.9% 염수 USP와 같은 통상적인 매질로 재구성될 수 있는 주사제를 하기에서 시험하였다:
실시예 1: 생체 내, 마우스 연구
[0156] 도 6에 제시된 바와 같이, 암 세포가 이식된 마우스의 PRV311을 이용한 종양 내 주사는 실질적인 종양 성장을 제거하였다(청색 곡선). 여기서, PRV311 조성물은 항-종양 사이토카인 IL-12가 로딩된 미세입자를 포함하였다. 비교 실험에서, 대조군 염수 용액(흑색 곡선), 위약 입자(회색 곡선)의 종양에 이루어진 주사는 종양 성장에 대한 최소 효과를 나타내었다. 유사하게, IL-12 단독의 정맥 내 주사(녹색 곡선)는 대조군과 비교할 때 종양 성장률에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. 특히, IL-12가 로딩된 PRV311(청색 곡선)에 의한 종양 성장의 거의 제거와 대조적으로, IL-12 단독의 종양 내 주사(적색 곡선)는 단지 종양 성장을 지연시켰다. 주사된 PRV311의 중합체 메시는 PRV311을 함유하는 미세입자가 국소적으로 유지되게 하여 효능을 증가시키는 것으로 가정된다.
실시예 2: 생체 외 혀 연구
[0157] 23G 피하 루어-록 바늘을 사용하여 500 μL의 PRV311을 돼지 혀에 주사하였다. 약물은 중합체 메시로 인해 국소적으로 남아 있었다. 도 8에 제시된 바와 같이, 약물 농도는 조직의 단면 당 대략 균일하게 유지되었고, 종 곡선 유사 모양을 형성하였다(주사 구체와 유사함).
실시예 3: 소의 뇌
[0158] PRV311(200 μL)을 26 게이지 바늘로 소 뇌에 주사하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 현미경검사를 통한 영상화를 위해 조직을 절단하였다.
[0159] 확산의 대략적인 치수는 주사된 부피에 대해 9 mm 높이 x 5 mm 길이였다. 도 10에서 관찰되는 적색은 키토산 중합체에 부착된 Cy5 형광단 염료이며, 이는 미세입자 및 메쉬의 움직임을 나타낸다. 녹색은 캡슐화된 약물의 확산을 모델링하는 캡슐화된 형광단이다. 주사제 내의 메쉬는 형광단을 국소적이고 집중적으로 유지한다.
실시예 4: 양 각막으로의 약물 전달
[0160] 양에서 수행된 연구는 PRV311이 각막을 통해 유리체내액으로 약물을 전달할 수 있음을 보여주었다(도 15a, 도 15b, 및 도 15c). PRV311을 홍채 아래 약 5 mm의 눈의 유리체에 주사하였다. 도 16의 우측 상단의 적색 이미지는 Cy5 표지된 키토산이 어떻게 망막, 맥락막, 및 공막을 완전히 투과하는지 제시한다. 도 16의 우측 하단의 녹색 이미지는 동일한 주사 동안 FITC 표지된 유리 약물의 유사한 분포를 제시한다.
[0161] 이는 AMD에 대한 기존 요법에 대한 대안을 제공함에 있어 PRV311을 뒷받침한다. 현재까지 수집된 데이터는 하기를 제시한다:
● 각막, 및 유리체내액으로의 표지된 입자의 전달
● 4개월에 걸친 베바시주맙의 지속 방출
● 캡슐화는 베바시주맙의 안정성 및 흡수를 향상시킨다
실시예 5: 양 폐로의 약물 전달
[0162] 양에서 수행된 연구는 PRV311이 약물을 폐 조직으로 전달할 수 있는 것으로 나타났으며, 여기서 이는 국소화된 상태로 유지된다(도 17). 약물은 절편화를 위해 준비하기 위해 동결되기 전에 주사 후 24시간에 걸쳐 고농도로 유지되었다.
실시예 6: 양 간으로의 약물 전달
[0163] 도 17 및 18에 제시된 바와 같이, PRV311은 약물을 간 조직으로 전달할 수 있고, 여기서 이는 국소화된 상태로 유지된다. 약물은 절편화를 위해 준비하기 위해 동결되기 전에 주사 후 24시간에 걸쳐 고농도로 유지되었다. 도 19의 측면도에서 볼 수 있는 바와 같이, 조직 유형은 약물 분포 패턴에 영향을 미친다.
실시예 7: 양 췌장으로의 약물 전달
도 20에 제시된 바와 같이, PRV311은 췌장 조직으로 약물을 전달할 수 있고, 여기서 이는 국소화된 상태로 유지된다. 약물은 절편화를 위해 준비하기 위해 동결되기 전에 주사 후 24시간에 걸쳐 고농도로 유지되었다.
상기 설명된 본 발명의 구현예는 단지 예시적인 것으로 의도되며; 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 모든 변화 및 변형은 임의의 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (24)

  1. 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이,
    치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알;
    바이알에 배치된 치료적 조성물로서, 상기 치료적 조성물이 치료적 치료의 투여에 사용하기 위해 제공되고, 키토산 겔 및 겔에 매립된 복수의 입자를 포함하는 수용액을 포함하며, 상기 겔이 주사에 의한 투여에 적합하게 만드는 점도를 갖는, 치료적 조성물;
    치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 갖는 입자; 및
    입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함하는 코팅을 포함하는,
    시스템.
  2. 제1항에 있어서, 수용액이 수화 촉진제, 입자 접착 억제제, 입자 응집 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하고, 여기서,
    (a) 수화 촉진제가 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    (b) 입자 접착 억제제가 HPMC, 폴록사머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    (c) 입자 응집 억제제가 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용액이 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함하는 시스템.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 입자가 200 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자인 시스템.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 입자가 500 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자인 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액이 키토산으로 코팅되지 않은 자유량의 치료제를 추가로 포함하고, 상기 자유량의 치료제가 수용액 중 치료제의 총량의 약 20 중량% 내지 약 80 중량%를 차지하는 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 면역요법제인 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 면역요법제가 항체, 사이토카인, 소분자 면역요법제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 시스템.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 화학요법제인 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 입자가 키토산 겔과 물리적으로 직접 접촉하는 시스템.
  11. 대상체의 표적화된 세포 집단을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
    제1항에 따른 시스템을 획득하는 단계;
    수용액을 주사기에 로딩하는 단계;
    주사기에 의해 표적화된 세포 집단에 수용액을 주사하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 표적화된 세포 집단이 종양을 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 표적화된 세포 집단이 기관의 조직인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 기관이 눈, 폐, 췌장, 간, 신장, 뇌, 심장, 갑상선 및 뇌하수체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이,
    치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알;
    바이알에 배치된 치료적 조성물로서, 상기 치료적 조성물이 치료적 치료의 투여에 사용하기 위해 제공되고 물과 혼합시 용해되어 키토산 겔 및 겔에 매립된 복수의 입자를 포함하는 수용액을 제공하도록 제형화된 동결건조된 전구체를 포함하며, 상기 겔이 주사에 의한 투여에 적합하게 만드는 점도를 갖는, 치료적 조성물;
    치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 갖는 입자; 및
    입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함하는 코팅을 포함하는,
    시스템.
  16. 대상체의 표적화된 세포 집단에 치료적 치료를 전달하기 위한 시스템을 제공하기 위한 동결건조 방법으로서, 상기 방법이,
    키토산 겔 및 복수의 입자를 포함하는 수용액을 형성시키는 단계로서, 상기 입자가 치료제를 함유하고 치료제 주위에 코팅을 가지며, 상기 코팅이 입자로부터 제제의 제어된 방출을 제공하기 위한 키토산을 포함하는, 단계;
    알콜 수용액의 동결 온도 초과의 온도 및 최대 -80℃에서 알콜 수용액을 함유하는 배쓰에서 제1 수용액을 동결시켜 동결된 층 전구체를 형성시키는 단계;
    동결된 층 전구체를 건조시켜 입자가 매립된 무수 분말을 형성시키는 단계;
    치료적 치료의 투여에 사용되는 주사기의 바늘에 의해 관통될 수 있는 격벽으로 둘러싸인 바이알에 무수 분말을 포함시키는 단계; 및
    용기에 물을 첨가하여 무수 분말을 용해시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  17. 제16항에 있어서, 무수 분말이 수화 촉진제, 입자 접착 억제제, 입자 응집 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하고,
    여기서, 수화 촉진제가 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 베타-프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    입자 접착 억제제가 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴록사머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    입자 응집 억제제가 단당류, 이당류, 당 알콜, 염소화 단당류, 염소화 이당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    동결건조 방법.
  18. 제16항에 있어서, 무수 분말이 소듐 트리폴리포스페이트를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 입자가 200 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 입자가 500 nm 내지 2000 nm의 평균 직경을 갖는 미세입자인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 유리체 내 주사에 의해 안구 질환에 대한 치료적 치료를 전달하도록 구성된 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 치료제가 항체, 사이토카인, 소분자 면역요법제, 화학요법제, 압타머, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 시스템.
  23. 제21항에 있어서, 안구 질환이 연령-관련 황반 변성인 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 치료제가 베바시주맙인 시스템.
KR1020227026296A 2020-01-03 2021-01-03 표적화된 세포 집단의 직접 주사에 의한 치료를 위한 시스템 및 약학적 조성물 KR20220125798A (ko)

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