CN114667345A - 用于检测转基因事件的多核苷酸、引物和方法，遗传构建体，用于检测来自植物样品的材料的试剂盒，事件ctc91087-6，抗虫甘蔗植物，以及用于产生抗虫甘蔗植物、植物细胞、植物部分或种子的方法 - Google Patents

用于检测转基因事件的多核苷酸、引物和方法，遗传构建体，用于检测来自植物样品的材料的试剂盒，事件ctc91087-6，抗虫甘蔗植物，以及用于产生抗虫甘蔗植物、植物细胞、植物部分或种子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域。更确切地说，一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，其抵抗害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis)的侵染，后者作为害虫被广泛知晓，描述为普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫。本发明描述了该事件、事件鉴定的方法，以及插入检测方法，以在插入部分和宿主基因组之间交叉的独特区域和特征性的侧翼区域为基础。

Description

用于检测转基因事件的多核苷酸、引物和方法，遗传构建体， 用于检测来自植物样品的材料的试剂盒，事件CTC91087-6，抗 虫甘蔗植物，以及用于产生抗虫甘蔗植物、植物细胞、植物部 分或种子的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，描述了一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，该事件表达了赋予对害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫)侵染抗性的Cry1Ac毒素。本发明描述了一种检测抗甘蔗螟虫侵染的事件和来自该事件的材料，以及识别这种事件的多核苷酸、引物、探针和侧翼区的方法。本发明具体地涉及用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC91087-6，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法。
背景技术
甘蔗(Saccharum spp.)是一种属于植物禾本科的草本植物，原产于东南亚，更精确地说，是产于新几内亚和印度尼西亚的广大中部地区。它是热带和亚热带地区生长的最重要的植物品种之一，其面积超过2,300万公顷，分布在121个国家(粮农组织2012年统计年鉴第233页)。
甘蔗是生产糖、酒、糖蜜、朗姆酒、卡莎萨(巴西的国家蒸馏酒)和燃料乙醇的原材料来源。甘蔗碾磨后产生的甘蔗渣可用于打捆、提供热能、在工厂加工、生产电力(通常卖给用户电网)，或作为生产甘蔗第二代乙醇的原料(BR 11 2014 02385-1)。因此，甘蔗农业产业通过由糖和乙醇的商业化以及植物生物质的可持续优化利用为该地区创造了数百万个工作岗位，并促进了外汇的增长，具有巨大的经济和社会意义。
最近，随着全球变暖的出现，以及随之而来的对化石燃料(生物燃料)替代品的渴望，全世界对甘蔗的兴趣大大增加。以甘蔗为基础的乙醇作为一种可再生能源，被认为对减少温室气体和对化石燃料的依赖极为重要，从而使其成为控制全球气候变化的一个关键因素(Savage，2011年)。
由于甘蔗的经济和社会意义，越来越多的研究被用于确定甘蔗种植的最佳农业实践和提高种植品种的质量。改善甘蔗农艺特性的努力集中在提高糖的产量和积累、提高对生物和非生物胁迫的耐受性、对病虫害和病原体的抗性和耐受性，以及开发利用木质纤维素生物质生产甘蔗乙醇的替代技术(PI 0802153-8；PI 0904538-4；PI 1101295-1)。
现代甘蔗品种的多倍体和非整倍体基因组的复杂性，连同其相对有限的遗传基础和低生育率，给利用常规育种选择具有合乎需求的农艺特性的植株带来了很大的困难和许多限制(Souza等人，2011年；D′Hont和Glaszmann，2005年，Basel，第109卷，第1-3期，第27-33页；Cheavegatti-Gianotto等人，2011年)。因此，生产成本高、必须使用手工劳动、产品上市时间线长，可能会阻碍甘蔗产业满足全球市场日益增长的需求。
由于传统育种方法的局限性，以及对快速有效纳入合乎需求的性状的日渐增长的需求，基因工程(生物技术)在甘蔗育种计划中的应用已经变得越来越突出，特别是由于通过基因工程整合合乎需求的农艺性状在其他植物品种(例如大豆、玉米、油菜籽、甜菜和棉花)获得了商业成功。
植物基因工程涉及将目的基因转移到植物细胞中(基因转化)，以这样的方式：使可育性和农艺上优越的后代保持并稳定地表达负责所需性状的基因。
尽管甘蔗具有通过基因工程进行遗传改变(整合入合乎需求特性)的潜力[病毒抗性(Guo等，2015；Zhu等，2011)、昆虫(Kalunke，Kolge，Babu，&Prasad，2009；Weng等,2011)、除草剂(Enríquez-Obregon，Vazquez-Padron，Prieto-Samsonov，De la Riva，&Selman-Housein，1998；van der Vyver，Conradie，Kossmann，&Lloyd，2013)、耐旱性(Molinari等人,2007；Reis等，2014)、盐度(Kumar，Uzma，Khan，Abbas，&Ali，2014)和铝毒性(Ribeiro，2016)、糖分的产量和积累提升(Bewg，Poovaiah，Lan，Ralph，&Coleman，2016；Mudge等，2013)]，这种方法受到甘蔗内在特性的限制。与玉米、水稻、小麦和其他商业谷物不同，甘蔗在组织培养繁殖方面表现出困难，胚性愈伤组织的诱导和再生率低，并且不可能将合子胚作为基因转化的靶组织[(Anderson&Birch，2012；Basnayake，Moyle，&Birch，2011；Molinari等，2007)]。经常观察到甘蔗基因型之间转化效率低和变异性高，为了成功地利用基因工程将合乎需求的农艺性状引入甘蔗中，仍有许多挑战需要克服。
甘蔗被认为是对遗传转化顽抗的物种，尽管已经对该物种的几种遗传工程方法进行了评估，但仍然没有标准的方案以确保转基因事件的产生(Smith等人，1992；Rathius&Birch.1992；Rathius&Birch 1992.；Chen等人，1987；Arencibia 1998；Manickavasagam等人。2004；Elliott等人，1998).
除了该物种的固有限制阻止了现有基因工程技术的应用外，甘蔗基因组的复杂性(高倍性水平和非整倍性)阻止了通过回交(特定基因型的重组)将性状的基因掺入到特定栽培品种中，如同通常在其他商业利益作物中进行的那样。
该物种的基因型复杂性也极大地影响了对所产生事件的表征(为确保其商业化所必需的特征的存在)。转基因事件的明确识别是确保其可追溯性和监测的根本，这是其商业化的监管要求。甘蔗基因组的高度多倍性和大量的重复区域，连同关于其组织和结构的信息的缺乏，使得对所产生的转基因事件的表征更加困难。
在甘蔗育种领域，即使应用广为人知的常规和/或分子/遗传技术，要提高结果的可预测性，还有一些技术挑战需要克服。尽管在获得更高产的甘蔗品种方面存在着各种技术挑战，但毫无疑问，获得具有显著影响作物产量从而影响其市场的特性的改良品种是非常迫切的。
历史上，农业害虫是造成农业损失的主要因素之一。在巴西，主要的甘蔗害虫是物种小蔗螟Diatraea saccharalis(1794年由Fabricius首次描述)，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫或仅称为螟虫。它是草螟科和鳞翅目的成员。该螟虫几乎在所有该作物的地方都有发现，这个面积在2019/20作物季约为1000万公顷(CONAB，2019)。
雌性甘蔗螟虫交配后，产卵200～400粒，分布在叶片两侧以及叶鞘上。孵化后，新生幼虫以叶实质为食，迁移到叶鞘区躲避。它们在此区域停留7至10天，通过刮取叶鞘或年轻节间的树皮取食。蜕皮后，毛虫刺穿茎干(stem)，钻入内部。该虫在茎内制造隧道，通常在取食时向上钻。在秆内，毛虫在成为有翅成虫之前，大约要经历六次蜕皮(DINARDO-MIRANDA，2014)。这是该虫的发育阶段，其对作物造成经济损失(图1)。
甘蔗螟虫的攻击还对用于制糖、制酒的原料的质量造成严重的二次损害，因为螟虫对甘蔗茎的钻蛀，为真菌进入和条件致病菌，特别是造成赤腐病(图2)的镰形刺盘孢菌(Colletotrichum falcatum)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliform)，创造了有利条件。与赤腐病原材料相关的细菌会产生不良的发酵作用，带来工业酒精发酵的异物产物。此外，这些细菌还从麦芽汁中含有的糖类中产生有机酸和胶质(葡聚糖)，对酵母细胞的活力产生负面影响，需要在发酵反应器中替换它们(Prececti和Terán，1983；Prececti等，1988；BOTELHO和MACEDO，2002)。细菌在发酵反应器中存在的另一个问题是发生酵母絮凝的可能性。在这种情况下，污染的细菌形成粘液，聚集酵母细胞，导致它们絮凝。最后，被螟虫/赤腐复合病攻击的植物也有高水平的酚类化合物(METCALF和LUCKMANN，1994；PRICE，1997)。
假设有4％的螟虫感染指数(巴西甘蔗田的典型情况)、平均农业损失和害虫控制成本，估计螟虫每年给糖和乙醇生产行业造成的经济损失超过50亿雷亚尔。
甘蔗螟虫由于幼虫在茎干中的取食行为阻止了杀虫剂有效接触该虫，因此化学杀虫剂难以控制。作为化学杀虫剂的替代品，主要从苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)中鉴定的杀虫蛋白已被用于防治包括Diatraea sp在内的农业害虫，在从Bt菌株中提取的杀虫蛋白中，Cry结晶蛋白因其对常见的鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的特定毒性而脱颖而出。这些蛋白质以原毒素(65-149KDa)形式产生，在易感昆虫的肠道中通过蛋白水解而溶解和活化，并与肠细胞膜结合，诱导上皮细胞渗透性溶解，这导致昆虫死亡。
Cry蛋白根据序列同源性分为若干组，其中，被归为Cry1的蛋白组对鳞翅目昆虫表现出高特异性，使其成为引入甘蔗种质中培育甘蔗螟虫抗性品种的优良候选者。在甘蔗品种中异源表达Cry1蛋白，虽然具有一定的挑战性，但对甘蔗螟虫的防治，减少甘蔗产业的经济损失，以及在环境中免除化学杀虫剂，具有很大的潜力。
因此，仍然需要制定策略来减轻害虫侵染特别是甘蔗螟虫的侵染对甘蔗作物造成的损害。通过向甘蔗种植者提供具有高产潜能和抗螟虫性状的品种，农业生物技术为甘蔗产业和巴西的甘蔗种植者作出重要贡献。
实施方案
在第一实施方案中，本发明提供了能够明确识别事件CTC91087-6的多核苷酸。
本发明还确定了能够识别表征事件CTC91087-6的多核苷酸的引物对和探针。
在第三个实施方案中，本发明提供了检测源自CTC91087-6事件的植物材料的方法。
本发明的其它实施方案定义了一种用于检测植物材料样品中存在事件CTC91087-6的试剂盒。
本发明的第五个实施方案是一种能够赋予甘蔗(Saccharum spp.)植物对昆虫侵染，特别是被Diatraea saccharalis害虫侵染的抗性的基因构建体。
另外，本发明还提供了一种转基因甘蔗、植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其包含定位于转化的甘蔗植物基因组中定义的位点的目的基因构建体，其特征在于特定的侧翼序列。
本发明的第七个实施方案是提供一种商品产品。
本发明的第八个实施方案是生产一种抗虫植物的方法。
最后，本发明的第九和第十个实施方案是提供一种制作和培育抗虫甘蔗植物和/或植物细胞、植物部分或种子的方法。
发明简述
第一实施方案是通过提供包含选自由以下组成的组的序列的至少14至26个连续的核苷酸的多核苷酸来实现的：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。
本发明的第二实施方案通过提供引物对来实现，其中正向引物由SEQ ID NO:6组成且反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物由SEQ ID NO:8组成且反向引物由SEQ IDNO:9组成。
第三实施方案是通过检测源自事件CTC91087-6的植物材料的方法实现的，包括以下步骤：
a)获得用于分析的样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且检测扩增产物的存在。
同样为了实现第三实施方案，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
仍然为了实现第三种实施方案，本发明描述了一种检测源自事件CTC91087-6的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得分析用的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸的互补物结合，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少14个连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；以及
e)检测探针的实际杂交情况。
本发明的第四个实施方案由检测植物样品中事件CTC91087-6的存在的试剂盒证明，该试剂盒包含用于检测多核苷酸的存在的工具，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸，和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
第五个实施方案是通过提供包含SEQ ID NO:1的基因构建体实现的。
第六个实施方案是通过包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物、植物部分、植物细胞、植物组织或种子来实现的。
第七个实施方案是通过提供由本发明的转基因甘蔗生产的商品产品来实现的。
第八个实施方案是通过产生包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的抗虫植物的方法实现的。
本发明的第九个实施方案提供了一种制作抗虫甘蔗植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以生产事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。
最后，本发明的第十个实施方案描述了一种培育事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括在包括昆虫侵染的条件下种植包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:22的CTC91087-6的转基因甘蔗植物。
附图简要说明
图1体现了由D.saccharalis(甘蔗螟虫)引起的对甘蔗茎秆的损害。
图2说明了由于D.saccharalis(甘蔗螟虫)的攻击而造成的赤腐-螟害复合病。
图3表示本发明事件中引入的T-DNA的图谱。
图4表示作为构建本发明中使用的质粒的基础使用的质粒。
图5表示所得到的质粒，用于获得目的事件。
图6是经由
Figure BDA0003495290200000061
(相对荧光强度x循环)对目的事件进行qPCR扩增的曲线图。
图7是经由SYBR GREENTM(相对荧光强度x温度)对于目的事件的qPCR熔解曲线。箭头指示了在83.5℃的温度下的目的事件的特异性扩增峰和一些样本呈现的非特异性峰，而且基线指示了其他阴性事件和对照的无扩增。
图8是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片中Cry1Ac蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba和Valparaiso(SP)、Camamu-BA和Quirinópolis(GO)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过Tukey’s检验没有差异。
图9是比较本发明的事件在甘蔗中在60和120DAP然后240和300DAP时Cry1Ac在叶片中的表达量平均值(mean)的结果。Barrinha-SP、Piracicaba-SP、Quirinópolis-GO和Valparaíso-SP的综合分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图经Tukey’s检验没有差异。
图10是比较本发明的事件在甘蔗中在330DAP时Cry1Ac在茎干中的表达量平均数(average)的结果。
图11是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片中Pat蛋白表达量平均值的结果。对于Barrinha、Piracicaba和Valparaiso(SP)、Camamu(BA)和Quirinópolis(GO)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图经Tukey’s检验没有差异。
图12是比较本发明的事件在甘蔗中在60和120DAP然后240和300DAP时Pat蛋白在叶片中的表达量平均值(mean)的结果。Barrinha-SP、Piracicaba-SP、Quirinópolis-GO和Valparaíso-SP的综合分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图经Tukey’s检验没有差异。
图13是在PACE测定中，比较本发明的事件在甘蔗中在330DAP时Pat蛋白在茎干中的表达量平均数(average)的结果
图14是Western blot方法鉴定Cry1Ac蛋白的结果。M：分子量标记(kDa)。R1和R2：本发明的事件。CN：亲本栽培品种。CP1:50ng纯化的Cry1Ac蛋白，稀释在亲本栽培品种的总蛋白中。CP2:5ng商购的Cry1Ac蛋白，稀释在PBST缓冲液中。CP3:Bt11玉米。CP4:表达Cry1Ac蛋白的转基因甘蔗事件。
图15是Western blot方法鉴定Pat的结果。蛋白M：分子量标记(kDa)。R1、R2和R3：本发明的事件的生物重复。CP1(阳性对照1):1ng Bar蛋白，稀释在从亲本栽培品种提取的总蛋白中。CP2(阳性对照2):1ng蛋白Bar，稀释在PBST缓冲液中。
图16表示Diatraea saccharalis在不同地点(Piracicaba(SP)、Barrinha(SP)、Valparaiso(SP)、和Quirinópolis(GO))的田间试验中的自然侵染强度(II％)。CTC91087-6：本发明的事件；9001TC：经过组织培养处理的亲本栽培品种；9001WT：普通亲本栽培品种。X轴代表侵染强度的百分比(II％；综合分析-4个地点)。
图17显示在叶盘测定中在喂食七天后幼虫大小和发育的示范性结果。左边(A)是用抗虫CTC91087-6事件的植物材料喂养的示范性幼虫，右边(B)是用来自常规(亲本-非转基因)品种CTC9001的植物材料喂养的示范性幼虫。
图18显示了CTC91087-6和其对应的常规的CTC9001(亲本品种-非转基因)之间的温网室(screenhouse)生物测定结果。在左边，I)显示了由D.saccharalis对A：CTC91087-6的茎秆(stalk)部和B：CTC9001a的茎秆部造成的可见损害的示例性图像。I)中的图表显示了筛查室中的茎秆损害(％损害)结果。右边的II)显示了温网室中的侵染强度(％)的结果。
图19展示了通过基因编辑方式生成事件CTC91087-6的盒(cassette)的例子。盒A包含由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的甘蔗密码子优化的Cas9；盒B包含由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA，盒C包含HR模板，HR模板包含9001BT-T-DNA区域，具有1kb同源臂，用于位点定向整合。
图20表示包含Cas 9和crRNA盒的基因编辑结构的一个例子。
图21表示了一个基因编辑构建的实例，其包含HR模板，HR模板包含9001BT-T-DNA区域，具有1kb同源臂，用于位点定向整合。
图22表示基因编辑构建，包含用于产生事件CTC91087-6的所有盒：由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的密码子优化的Cas9；由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA和包含9001BT-T-DNA区域具有1kb同源臂用于位点定向整合的HR模板。
发明详述
首先，术语"事件"是指通过遗传转化产生的转基因植物(即经基因修饰植物，经遗传修饰植物)，该转基因植物稳定地表达由引入的转基因赋予的所需性状。更具体地，在本例中，术语"事件"被认为是转基因植物，优选是甘蔗转基因植物(Saccharum spp.)，该植物在经过遗传改造后，表达了抗害虫的特性，特别是对害虫Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。在一个优选的实施方案中，通过遗传转化产生的转基因甘蔗被指定为'CTC91087-6'，并且可以交替地称为"CTC91087-6事件"。
另外，为参考目的，除非另有明确提及，"LB区域"是指转移的T-DNA(5')的左边界(边缘)，而"RB区域"是指转移的T-DNA(3')的右边界(边缘)。
此外，除另有明确说明外，本文描述的所有生物序列都涵盖与所描述序列具有至少80％、优选85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的序列。
最后，"植物材料"是指任何和所有植物组织或其衍生物，诸如但不限于种子、茎、茎秆、叶、秸秆、树皮、根、细胞、植物来源的分子，等等。此外，"植物材料"可以包括植物的任何产品或其衍生物，例如但不限于汁液、糖、乙醇，等等。
重组DNA技术已使基因的分离及其稳定插入宿主基因组成为可能。这种技术也称为基因转化，可以定义为将核酸("DNA"或DNA)受控制地引入到受体基因组中，不包括通过受精引入。这是一个受控的过程，在这个过程中，确定的DNA片段被引入宿主(或受体)基因组，并且必须整合到其中。将这些分子稳定地插入到宿主基因组中，就会产生一个基因组与重组分子的受体(宿主)相等或实质上相等，但具有新的特殊特征的个体。"实质上相等"是指基因组相对于受体具有80％以上，最好是85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
有几种植物基因转化技术可归纳为两大类：间接和直接基因转移。间接转移是指通过生物载体的作用将外源DNA插入基因组，而直接转移则是基于物理生化过程。
根据基因转化技术和根据要转化的物种或基因型，可以使用不同的组织和/或细胞。一般来说，这些组织或细胞包括但不限于胚胎愈伤组织、愈伤组织、原生质体、胚胎、体细胞胚胎、分生组织、具有再生能力的植物的任何其它部分、组织或细胞。
间接转化是以农杆菌(Agrobacterium)属的细菌介导系统为基础，一直是获得转基因植物最广泛使用的方法。这种方法的优点包括能够转移相对较长的DNA片段而不发生重排，同时保持转基因的低拷贝数整合，从而保证生成事件的基因型更加稳定。一些农杆菌的种和株、质粒和程序方案已经被开发并适应于几种植物物种的基因转化。这些方法的优点包括对于单拷贝事件更高的概率，稳定的整合，和引入的遗传性状的遗传继承，以及，世世代代的一致的基因表达和更低的基因沉默率。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是属于根瘤菌科的革兰氏阴性土壤植物病原菌，分别引起双子叶植物的病害，即所谓的冠瘤和毛状根球。在这种植物与病原体的相互作用中，农杆菌与植物细胞之间有一个自然基因转移的过程，其中细菌DNA的片段被转移到植物细胞中(T-DNA)，与核基因组整合。在其自然形式下，细菌转移T-DNA("转移的DNA")，它是称为Ti("诱导肿瘤的")的细菌质粒的一部分，并整合到感染的植物细胞的基因组中。转移到植物细胞中的T-DNA片段由参与植物激素(茁长素和细胞分裂素)组成性生物合成的基因组成，这些基因改变了感染组织的正常发育程序，并导致肿瘤的形成。此外，它还包含用于合成糖和可作为细菌的碳和氮源的称为冠瘿碱的氨基酸的癌基因(Oger等人,1997)。左右边界25个碱基对(bp)的重复末端划定了T-DNA的界限，对其转移至关重要。受伤植物组织释放的酚类化合物激活特定区域(vir区域)，启动T-DNA向植物细胞转移的过程。农杆菌还具有染色体(chv)基因，促进细菌与宿主细胞之间的结合，使含T-DNA复合物的孔道形成(Sheng&Citovsky.1996).
由于要转移的片段是由其边界确定的，任何由该边界侧翼的序列都可以通过农杆菌转移到植物上，使得操纵这些序列以转移目的编码序列成为可能。替换或删除野生型T-DNA的编码区(致癌基因)，就可以产生非致癌(缴械)的农杆菌菌株，这些菌株可以携带目的序列。修饰后的T-DNA能够将目的序列转移到植物上，因为毒力基因(vir区域)保持完整。
此外，只要构建体包含这种T-DNA边界，农杆菌间接转化系统就允许将人工质粒构建体转移到植物上，这实现了使用为其它细菌菌株开发的分子工具和材料的灵活性。
这些人工质粒构建体除了具有赋予抗生素抗性、除草剂抗性或耐受性或酶活性(磷酸甘露糖异构酶(PMI)/甘露糖(Man))的基因外，还具有来自不同来源的启动子，例如植物启动子、病毒启动子、细菌启动子和或嵌合启动子，因此这些标记可用于转化细胞或植物的选择。
这些构建还可以包含辅助基因，其干扰相关的形态发生信号通路，提高遗传转化过程的效率和植物组织的再生。包括但不限于LEAFY COTYLEDON1(Lotan等，1998)、Lec1(Lowe等，2002)、LEAFY COTYLEDON2(Stone等，2001)、WUSCHEL(WUS；Zuo等，2002)、e BABYBOOM(BBM；Boutilier等，2002)，等等。
在本发明的第一方面，要引入植物的外来或外源DNA被克隆到二元质粒中，左、右边界共有序列(T-DNA)之间。将二元质粒转移到农杆菌细胞中，随后用于感染植物组织。将包含外源DNA的载体的T-DNA区域插入到植物基因组中。标记基因表达盒和特征基因表达盒可以存在于T-DNA的同一区域，也可以存在于同一质粒上T-DNA的不同区域，或者存在于不同质粒上T-DNA的不同区域。在本发明的一个实施方案中，盒体存在于与T-DNA相同的区域。本领域的技术人员熟悉通过农杆菌间接转化的方法。
另外，可以使用直接DNA转移来直接将DNA引入植物细胞中。直接DNA转移的一种方法是用粒子枪将包含DNA的载体轰击植物细胞进行插入(粒子介导的基因枪转化)。转化植物细胞的其它方法包括原生质体转化(可选地在聚乙二醇的存在下)；在包含多核苷酸或载体的培养基中对植物组织、细胞或原生质体进行超声处理；将多核苷酸或载体显微注射到植物材料中；显微注射、真空渗透、超声处理、使用碳化硅、用PEG进行化学转化、植物细胞电穿孔等。介于直接转化的缺点之间的是与植物组织的再生和转基因表达量低有关的挑战。
此外，还可以通过核酸酶介导的同源重组进行位点直接插入进行基因转化(基因组编辑)。近年来，基于使用工程核酸酶或嵌合核酸酶的基因组编辑技术使转基因生物的生成更加精确和特异。外源基因或外来基因的引入由同源重组实现，通过引入具有与与受体生物基因组同源的DNA片段连接的外源DNA的同源重组模板(HR)。现有的工具之间有嵌合酶系统CRISPR-(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats成簇的规律间隔的短回文重复序列)-Cas，锌指(ZFN)核酸酶和TAL效应核酸酶(TALENs)。Crispr-Cas系统是由两个主要成分组成的酶系统：内切酶(Cas)和引导RNA(单引导RNA-sgRNA；朝向Cas内切酶的特定切割位点的向导)。引导RNA也可以包含两个成分：Crispr RNA(crRNA)--与特定DNA基因组序列互补的17-20mer的序列，以及任选的tracr RNA。由sgRNA引导和内切酶所进行的特异性切割将被同源重组进行修复，特别是将侧翼是同源序列的外源DNA插入到切割位点。将该酶系统引入细胞可以通过几种方式进行，使用质粒，通过直接或间接转化，或使用载体如蛋白质和其他化学试剂。该系统组分的表达将以瞬时或稳定的方式发生，使用受体生物体的细胞机制或以外源方式实现，在体外，将所有准备好使用的组分(内切酶+sgRNA，在细胞递送前体外转录和组合)递送到靶细胞或组织。本文所列出的描述并非详尽无遗，不应限制使用本发明范围内已知的、甚至尚未发现的基因组编辑的不同变体、系统和方法。
转化之后，从转化的植物组织中再生转基因植物，并且可以使用适当的标记如卡那霉素或草铵膦(ammonium glufosinate)抗性来选择具有外源DNA的后代。本领域的技术人员熟悉合适的再生培养基的组成。
另外，可以应用其它选择方法，而不需要如前所述在宿主基因组(受体生物体)中插入任何基因标记。
在一个优选的实施方案中，遗传转化是通过农杆菌属的细菌来介导的。
在一个更优选的实施方案中，遗传转化是通过根癌农杆菌介导的。
CTC91087-6事件表现出包含两个表达盒的新基因型。第一表达盒包含适合植物表达的启动子，该启动子与编码在控制鳞翅目昆虫害虫中有用的Cry1Ac杀虫毒素的基因和合适的多腺苷酸化信号可操作地连接。第二表达盒包含适合植物表达的启动子，该启动子可操作地连接到编码用于获得本发明事件的选择性标记的蛋白质的基因。
适合植物表达的启动子可以从植物或其他生物体中分离出来。已经分离或开发了几种启动子，包括组成型启动子、"开和关"启动子和对组织特异性非生物胁迫有反应的启动子等。这些启动子中的许多具有被描述为与适当基因表达相关的内含子序列。在本发明的一个优选方面，启动子是组成型启动子，可以选自CaMV 35S、CoYMV(鸭跖草黄斑驳病毒，Commelina yellow mottle virus)、FMV 35S、泛素(Ubiquitin)、Actin Rice Promoter(Act-1)、Act-2、胭脂碱合成酶启动子(NOS)、章鱼碱合成酶启动子(OCS)、玉米乙醇脱氢酶启动子(Adh-1)、PvUbi1等等组成的非限制性组。
在本发明的一个实施方案中，启动子是玉米泛素基因(pUBI)启动子。在一个甚至更优选的实施方案中，玉米泛素启动子在前导RNA的5'序列中包含一个内含子。
本发明的启动子区域(UBI-1)有1992个碱基对，这些碱基对被细分为：启动子片段(899个碱基)、多泛素-1(polyubiquitin-1)基因的第一外显子(83个碱基)和第一内含子(1,010个碱基)。
为了增强基因表达水平，还可以将额外的元件如增强子序列和转运子(转运蛋白)加入到表达盒中，例如转录或翻译增强子，如CaMV 35s增强子、FMV 35s、Nos、supP等等。
在表达盒上还考虑了终止子序列。合适的和功能性的植物多聚腺苷酸化信号的实例包括那些来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nopaline synthase,nos)基因、蛋白酶抑制剂II基因rbcS(豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基,pea ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase small subunit)、Lhcb1(烟草叶绿素a/b结合蛋白)、CaMV 35s、章鱼碱(octopine)合成酶、α-微管蛋白基因，等等的。
在本发明的一个实施方案中，多腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的信号。
优选地，cry1Ac和bar基因的表达受玉米泛素基因启动子–UBI-1(其有一个内源性内含子)的调节。两种表达盒都使用根癌农杆菌的胭脂碱合成酶合成酶终止子-NOS。
cry1Ac基因编码一种615个氨基酸的毒素，估计分子量为68KDa，来源于苏云金芽孢杆菌serovar kustaki(菌株HD73)，它赋予了对Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。本发明考虑了对仅表达原生Cry1Ac蛋白的活性胰蛋白酶核心(active trypticnucleus)进行基因修饰。因此，在本发明的一个优选实施方案中，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸是截断的，编码52KDa的胰蛋白酶杀虫核(tryptic insecticide nucleus)。在一个更优选的实施方案中，Cry1Ac蛋白是SEQ ID NO 34。本发明还考虑了与SEQ ID NO:34的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100％的同一性的序列。胰核负责蛋白质的杀虫活性，与昆虫肠道的特定蛋白质结合，导致该器官的功能和解剖学完整性的破坏。目标昆虫摄取Cry1Ac蛋白后，会引起营养吸收的改变，从而导致昆虫迅速中毒并随后死亡。
根据本发明，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸可以具有优化(或以其他方式改变)的密码子，以改善在植物材料中的表达。这种密码子优化可用于改变在任何转化细胞中产生的RNA转录产物的预测的二级结构，或破坏存在于未改变的转录产物中的隐性RNA不稳定元件，从而提高转录产物在转化细胞中的稳定性和/或可用性。
优选地，在本发明事件中存在的cry1Ac基因对应于经优选甘蔗密码子优化的截断合成DNA序列。在本发明的更优选方面，cry1Ac基因具有序列SEQ ID NO:20。本发明还考虑了与SEQ ID NO:20的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100％的同一性的序列。
已经表征了几种用于植物事件选择的标记基因，包括一些赋予抗生素耐受性的基因和其他赋予除草剂抗性的基因。在本发明中可以选择使用的标记基因的例子包括赋予对潮霉素(hygromycin)、卡那霉素、庆大霉素、草甘膦、草铵膦的抗性或耐受性或对毒素如eutypine的抗性的那些基因。还可以采用其它形式的选择，如基于激素的选择系统、通过表达荧光蛋白的视觉选择、甘露糖异构酶、木糖异构酶等等。在本发明的一个实施方案中，事件选择标记基因是赋予草铵膦耐受性的基因。
在本发明的一个优选实施方案中，第二表达盒中使用的标记基因是双丙氨膦抗性(bar)基因，该基因编码183个氨基酸的膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶，其具有22kDa的预估分子量。在本发明的更优选方面，bar基因具有SEQ ID NO:21的序列。膦丝菌素乙酰转移酶赋予对草铵膦除草剂的抗性，这用于转化体的初始选择过程。在获得本发明的事件中用作选择标记的bar基因来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。PAT蛋白也可以表达自绿色产绿链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因。
使用选择标记基因，如bar基因，对于选择在转化过程中转化的细胞是必要的(HORSCH等，1985)。因此，在本发明的事件中插入bar基因的目的是选择用cry1Ac基因转化的细胞。尤其是，选择该基因是因为草铵膦除草剂不用于甘蔗种植中的杂草控制，在田间条件下不能用于处理本发明的事件。
除所述表达盒外，还可在事件CTC91087-6中使用另外的表达盒。
事件CTC91087-6中包含的第一和第二表达盒可以在相同或不同质粒上引入植物。如果第一和第二表达盒位于同一质粒上并通过农杆菌介导的转化方法引入植物，它们可以存在于T-DNA的相同或不同区域内。在本发明的一个实施方案中，第一和第二表达盒存在于T-DNA的同一区域内。
更具体地，本发明的事件是通过根癌农杆菌介导的转化，用包含含有cry1Ac和bar基因表达盒的DNA片段(T-DNA)的遗传构建体获得的。优选地，本发明的遗传构建体包含序列SEQ ID NO:1的核苷酸。
本发明的事件是通过含有上述定义的T-DNA片段(SEQ ID NO:1)的根癌农杆菌介导的转化获得的。
该T-DNA片段插入到二元质粒中，该质粒的宿主谱中含有大肠杆菌和根癌农杆菌。本发明原始二元质粒的具体遗传元件和成分来源如图4所示。图5中描述了包含本发明构建体的二元质粒。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因构建体包含SEQ ID NO:14的序列。
所述构建体是通过本领域普通技术人员已知的技术，如电穿孔或热休克(thermalshock)等，转移到根癌农杆菌(载体)菌株上。
在一个更优选的实施方案中，载体是根癌农杆菌肿菌株EHA105。
进一步描述了一种产生目的事件的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤。
a)将基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有草铵膦的培养基中选择含有功能片段的转化细胞；以及
e)再生转化的甘蔗植物。
在一个实施方案中，生产事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法的步骤a)包括将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中。此外，所述方法的步骤e)包括再生转化甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。本发明还考虑了，由本文所述方法产生的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
本领域的技术人员熟悉用于生成胚胎愈伤组织(b阶段)的合适的培养基的组成，以及共培养阶段(c阶段：共培养+静息)、选择(d阶段)和再生(e阶段；再生+延伸)的手段。优选地，所使用的培养基是基于包含诸如MS盐(Murashige和Skoog，1962)、蔗糖和维生素B5等成分的组合物。可选地，还可以加入以下：选自脯氨酸和天冬酰胺的氨基酸；酪蛋白水解物；柠檬酸；甘露醇；硫酸铜；甘氨酸；胶凝剂；茁长素；抗生素；乙酰丁香酮；和选择剂。茁长素的使用，在胚胎愈伤组织的生成、共培养和选择中尤为重要，在选择培养基中使用草铵膦也很重要。
"共培养"步骤是指对已经感染或接触过农杆菌(使农杆菌T-DNA转移到植物细胞中)的植物组织进行孵化。该阶段对应于从接种(农杆菌与植物组织接触)后立即一直到菌体被去除或失活的时刻。
接种的组织可以共培养约1至30天，优选1至20天，更优选1至10天。
在共培养步骤中，温度可以是本技术中已知的任何适合目标植物的温度。示例性地，对于甘蔗，温度可以在约15℃至约30℃和约16℃至约29℃范围之间。在一些实施方案中，共栽培步骤在没有光照的情况下进行。
在与农杆菌共培养之后，除去培养基并将细胞转移到没有农杆菌的培养基中。然后将细胞在约20℃和约26℃之间的温度下在黑暗中培养1至20天。
本文提供的方法还包括选择包含至少一个拷贝的目的遗传序列的细胞。本文使用的"选择"是指其中对转化体使用选择剂的情况，其中所述选择剂将允许含有至少一个定位在T-DNA内的标记基因拷贝的植物细胞优先生长。而那些未转化的细胞将不含有允许在选择剂中生存的标记基因。如上所述，可以使用任何合适的选择标记物。优选地，使用的选择标记基因是bar基因，该基因编码一种赋予对草铵膦的抗性的酶。
在一些实施方案中，还加入抑制农杆菌生长的药剂。
选择可以在光照或黑暗条件下进行，例如，这取决于被转化的植物种类和基因型等。在某些情况下，进行转化的胚胎愈伤组织或其它组织可在同一培养基中定期或不定期地进行传代培养。在愈伤组织转化的情况下，可以将各个愈伤组织分开，以确保每个愈伤组织只再生一株植物(从而确保所有再生的植物来自独立的转化事件)。在一个优选的实施方案中，使用草铵膦作为选择剂，选择步骤在黑暗中进行约1至10周。更优选地，选择步骤进行约2至5周。
在选择期结束后，可将在选择剂存在下继续生长并因此是已被遗传修饰的植物组织，通过置于合适的培养基和生长条件中进行操作和再生。这样得到的转基因植物可以检测是否存在目的DNA。出于本发明的目的，术语"再生"是指形成包含地上部分和根的植物。再生的植物可以种植在合适的基质(如土壤)上并转移到温室中。如本文所使用的，"遗传修饰(genetically modified)"或"转基因(transgenic)"或"稳定转化(stablytransformed)"是指包含通过转化引入其基因组的目的DNA序列的植物细胞、植物部分、植物组织或植物。
在一个实施方案中，该细菌是农杆菌属的。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌菌株EHA105。
本发明还涉及选定事件(CTC91087-6)的表征和检测由其衍生的植物材料的方法。用于检测和表征转基因植物的分析方法包括间接方法(基于蛋白质的检测方法)或直接方法(基于DNA的检测方法)。
宿主细胞基因组中T-DNA稳定整合位点的定义及其侧翼序列的表征对于开发和验证明确识别和表征的方法是必要的。
为了鉴定事件CTC91087-6中T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多项DNA扩增和测序实验。在T-DNA的两端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。随后，利用Sanger法对得到和分离的片段进行测序，以验证iPCR得到的结果。由这些实验产生的数据所得到的存在于事件CTC91087-6中的基因插入图如图3和SEQ ID NO:2所示，事件CTC91087-6的侧翼序列显示在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的至少17个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18。在本发明的另一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:13.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:12的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:5的序列的多核苷酸。在本发明的另一个方面，提供了一种包含序列SEQ ID NO:22的多核苷酸。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ IDNO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:13的植物。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ IDNO:13的植物。
在本发明的一个实施方案中，所述植物是转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。此外，所述植物是抗昆虫的，并且包含SEQ ID NO:5。还是在另一个方面，本发明的抗虫植物包含SEQ ID NO:22。在另一个方面，所述植物是事件CTC91087-6的抗虫甘蔗植物或由其衍生的植物。
在本发明的一个方面，事件CTC91087-6是甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQID NO:5。在另一个方面，事件CTC91087-6包含SEQ ID NO:22。
在其他方面，提供了一种检测和鉴定CTC91087-6事件的具体方法。
根据本发明，提供了一种检测来自事件CTC91087-6的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向引物和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；以及
e)检测扩增产物的存在。
在一个实施方案中，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的连续的核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述(步骤c)引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续核苷酸。
此外，根据描述的检测方法的引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31的序列的连续的核苷酸以及第二引物包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计成结合到包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ IDNO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在另一个实施方案中，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQID NO:39的序列的连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
众所周知，特别是对于本技术领域的技术人员来说，DNA分子(或DNA)是由两股(核苷酸的)组成，它们通过核苷酸碱基之间的氢桥固定在一起。根据碱基的互补性进行配对，遵循的一般规则是：腺嘌呤与胸腺嘧啶和胞嘧啶与鸟嘌呤。因此，虽然核苷酸序列的表示只针对其中一条链进行，但它们的互补链或互补序列被包括在本发明的范围内，并被考虑用于本文所述引物和探针的定义。
获得用于DNA提取的样品的方法对于本领域普通技术人员来说是广为人知的，包括收集来自CTC91087-6转基因事件的任何植物材料，如茎干、根和叶。优选地，样品从完整的叶子中获得。植物DNA提取方法包括但不限于基于使用CTAB洗涤剂的方法(Alianabi等，1999)，(任选地)随后用氯化铯或乙酸铵进一步净化样品，以及其它市售方法。
既然SEQ ID No:2、3、4、5、22、23、24、29、30、31、36、37、38和39已经可用，适用于本检测方法的引物对可以使用分子生物学技术领域的技术人员熟知的参数进行设计。例如，该对引物中的一个或两个引物可以被设计成构建体特异性、性状基因特异性、启动子特异性、插入DNA和基因组DNA之间连接处的序列特异性和/或侧翼序列特异性。
与本发明的这一方面相应地，有许多扩增方法可以使用。本领域技术人员已知的最常见的扩增技术之一，是聚合酶链反应(PCR)。PCR反应的扩增产物可以通过用荧光标记如溴化乙锭染色核苷酸链，然后用紫外光激发它(通常是在使用琼脂糖凝胶电泳进行大小分离后)来可视化。
本发明的一个实施例采用了PCR原理的变化，如定量实时PCR、巢式PCR、反向PCR(iPCR)、数字PCR、长(Long)PCR、降落(Touchdown)PCR、热起动(Hot Start)PCR、多重PCR等。扩增产物也可以通过不同的方法进行检测，这些方法是本发明所考虑的，例如SYBR GreenTM系统，当该试剂与双链DNA结合时就会发出荧光，以及
Figure BDA0003495290200000211
系统，其检测是基于荧光探针的相互作用。
Figure BDA0003495290200000212
方法使用与位于反应引物之间的目标PCR产物段互补的探针。在PCR循环的杂交阶段，探针与目标DNA结合，在Taq聚合酶延伸过程中，通过其5'-外切酶的活性，去除探针，释放出荧光色素并发出荧光。本发明这方面的其他实施例包括但不限于：环介导等温扩增(LAMP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、微阵列技术Luminex、"DNA行走(DNAwalking)"和下一代测序(NGS)、Sanger法、Illumina等。
本发明描述了一种基于定量实时PCR(qPCR)技术的具体检测方法，称为"Plus-Minus"或"Presence-Absence"，呈现出了该方法的两种变化：SYBR GREENTM和
Figure BDA0003495290200000221
技术。
在本发明的一个实施方案中，提供了引物对，其中正向引物由SEQ ID NO:6和反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物为SEQ ID.NO:8和反向引物为SEQ ID NO:9.
在另一个实施方案中，事件CTC91087-6的转基因甘蔗植物材料检测方法的步骤c)中使用的引物对包含由SEQ ID NO:6组成的正向引物和由SEQ ID NO:7组成反向引物的和/或正向引物是SEQ ID NO:8和反向引物是SEQ ID NO:9。此外，由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物产生的扩增子(扩增后的产物)通过SEQ ID NO:10的标记探针观察。另外，通过SEQID NO:8和SEQ ID NO:9引物产生的扩增子，通过SEQ ID NO:11的标记探针观察。因此，本发明的一个方面是，检测通过使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8和SEQID NO:9获得的扩增产物，是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
在本发明的一个实施方案中，通过所述方法扩增的区域(扩增的扩增子或产物)长度在80至1000个碱基对之间。在另外一个实施方案中，扩增子的长度在100到300个碱基对之间。在一个优选的实施方案中，使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7获得的扩增子的长度为117个碱基对，如SEQ ID NO:12所定义的。在另一个优选的实施方案中，通过使用引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9获得的扩增子长度为149个碱基对，如SEQ ID NO:13所定义的。
图6(本发明经由
Figure BDA0003495290200000222
的事件特异性检测反应)和7(SYBR GREENTM测定)代表两种方法的验证。
本发明中所述的引物和探针可组合使用以检测CTC91087-6事件。因此，本发明的另一个实施方案涉及使用多路PCR来鉴定CTC91087-6事件的植物材料。
本发明中包含用于检测和表征CTC91087-6事件的替代引物和探针。这些和其它变体可与但不限于上述任何一种直接检测方法一起使用。
此外，通过将DNA样品与探针杂交，可以从植物材料中检测CTC91087-6事件。具体而言，本发明描述了一种检测转基因甘蔗事件CTC91087-6的材料的方法，其包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品。
b)从样品中提取DNA或RNA。
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ IDNO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的14个或更多个连续的核苷酸，同时该多核苷酸为单链。
d)将所述探针与样品杂交，并且
e)检测探针的实际杂交。
根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少15个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少16个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少17个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33的序列的至少18个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少20个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少21个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少22个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少23个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少24个连续的核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少25个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少26个连续的核苷酸的多核苷酸。
该探针可以是例如PCR产物或限制性消化片段。在另一个实施方案中，本文所述的探针可以用适合于使杂交得以检测的荧光、放射性、酶或其它标签标记。鉴于本公开的优点，本领域的技术人员现在将知道如何设计合适的探针。
在另一个实施例中，提供了一种在严格条件下(高特异性)对样品进行探针杂交的方法。严格的杂交条件对于本领域的技术人员来说是众所周知的。严格条件的例子包括：在大约65℃的温度下，在含有6x SSC、0.01
％SDS和0.25％脱脂奶粉的溶液中进行杂交，然后在相同的温度下，在含有0.2倍SSC和0.1％SDS的溶液中进行洗涤。
基于杂交原理检测来自事件CTC91087-6的植物材料的合适技术包括但不限于Southern Blots和原位杂交。本领域的技术人员熟悉此类技术。
典型地，这些技术涉及将探针与样品孵育，洗涤以去除未结合的探针，并检测探针是否已杂交。所述检测方法取决于附着在探针上的标签类型。例如，放射性标记的探针可以通过暴露在X射线胶片上和显影来检测。另外，酶标记的探针可以通过转换底物以产生颜色变化来检测。
此外，本发明的另一个方面设想了一种检测源自事件CTC91087-6的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供一种抗体，该抗体设计为与植物内包含的Cry或Pat蛋白结合，该蛋白包含在SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸之内；将所述抗体与样品孵育；以及检测抗体是否结合。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，所述Pat蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包含SEQ ID NO:34，所述Pat蛋白包含SEQ ID NO:35。
基于所述抗体结合检测来源于CTC91087-6事件的植物材料的合适方法包括(但不限于)：western blot、ELISA(酶联免疫吸附测定)和质谱法(例如表面增强激光解吸/电离(SELDI))。本领域的技术人员熟悉这些免疫学技术。典型的步骤包括用与Cry或Pat蛋白结合的抗体孵育样品，洗涤以去除未结合的抗体，并检测抗体是否已结合。许多这样的检测方法是基于酶反应的：例如，抗体可以与酶如过氧化物酶连接，在应用合适的底物后，检测颜色变化。这种抗体可以是单克隆或多克隆的。
本发明的另一个方面考虑了一种检测源自事件CTC91087-6的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供来自样品的蛋白质提取物；提供设计用于检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸的植物中Cry或Pat蛋白存在的试纸条；将试纸条与样品一起孵育；并检测。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，Pat蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包含SEQ ID NO:34，所述Pat蛋白包含SEQ ID NO:35。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种检测来源于CTC91087-6事件的植物材料的方法，所述方法包括：获得用于分析的来源于CTC91087-6事件的样品和来源于非转基因甘蔗品种的样品(对照)；将一种或多种Diatraea saccharallis种的昆虫(对Cry1Ac易感)置于样品中；检测对昆虫的杀虫作用。在本发明的这一方面，"杀虫剂"指的是对昆虫的任何抑制作用(包括但不限于)：减少进食、生长迟缓、降低繁殖力、麻痹和死亡。
检测来自事件CTC91087-6的植物材料的方法包括但不限于生物叶饲检测，其中事件CTC91087-6的植物的叶子或其他合适的部分，或来自事件CTC91087-6的任何植物材料被一种或多种昆虫害虫侵染。所述检测的测量可以包括在调整的时间段后评估叶子或植物损害，评估死亡率或评估其他杀虫效果。这种生物测定可以在田间或温室中进行，并且可以需要自然或人工昆虫侵染。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于检测植物样品中是否存在事件CTC91087-6的试剂盒，所述试剂盒包含：检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19和/或杀虫晶体蛋白(Cry)的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸存在的工具。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒可包含DNA扩增检测技术，如PCR、qPCR或
Figure BDA0003495290200000251
在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可以包含探针杂交检测技术，如Southern Blots或原位(in situ)杂交。在一个方面，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC91087-6)的转基因甘蔗的材料的工具包含设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸的引物对，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。此外，该工具包含引物对，其中正向引物包含SEQ ID NO:6和反向引物包含SEQ ID NO:7，或者正向引物包含SEQ ID NO:8和反向引物包含SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC91087-6)的转基因甘蔗的材料的工具包含含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可包含抗体结合检测技术，如western blots、ELISA、质谱(SELDI)或试纸条。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包含生物昆虫检测技术，如叶片取食生物测定或生物死亡检测。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包含上述检测技术的任意组合。
本发明所述的转基因事件会影响包含鳞翅目昆虫的群体中的一个或多个物种的昆虫。因此，与相同品种的非转基因甘蔗植株相比，在所述植株的栽培过程中需要减少杀虫喷雾的次数。
本发明本身并不拘泥于事件CTC91087-6；相反，它被进一步扩展到包括由其衍生的任何植物材料，包括种子，只要它们含有至少一种本发明的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明包括来自转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19.在其它实施方案中，本发明考虑了包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。此外，本发明还包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。本发明还包括但不限于通过常规或其它杂交方法从具有CTC91087-6事件或其衍生物的杂交系中衍生的植物；因此，本发明的一个实施方案涉及使用来自本文所述转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子，该植物、植物细胞、植物部分或种子用于再生植物、种植、栽培植物田或生产植物产品。本发明还考虑了包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在其它实施方案中，本发明包括包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在本发明中还考虑了一种包含SEQ ID NO.5或SEQ IDNO:22的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。此外，本发明还包括从上述组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:19。植物细胞和植物部分的实例包括但不限于：悬浮细胞、愈伤组织、体胚、分生组织、顶茎、茎、叶、叶盘、分蘖、芽。另一个方面考虑了一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是包含事件CTC91087-6的植物，并由此生产子代甘蔗植物。含有事件CTC91087-6的植物是包含SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。本发明还考虑了由上述生产抗虫甘蔗的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种商品产品，由包含事件CTC91087-6的甘蔗植物生产。因此，本发明包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。在一个实施方案中，本发明考虑了一种商品产品，其由包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。此外，本发明还包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的转基因甘蔗(Saccharumspp.)植物生产。商品产品的例子包括但不限于：甘蔗渣、甘蔗汁、糖浆、第一代乙醇(由甘蔗汁生产)、第二代乙醇(纤维素乙醇；由生物质生产)、生物质、糖、原糖、精制糖、糖蜜、酒糟和纤维。
本发明还提供了一种来自CTC91087-6事件的植物材料，其包含额外的多核苷酸序列，经过修饰或比CTC91087-6更小，或表现出其它表型特征。例如，植物材料CTC91087-6事件可以被转化以产生包含额外特征的新事件，例如，第二抗虫基因。这个过程被称为基因叠加。这样的第二昆虫抗性基因编码，例如，来自苏云金杆菌的杀虫凝集素(insecticidallectin)、杀虫蛋白酶抑制剂和其它杀虫蛋白。
本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供来源于CTC91087-6事件的植物材料。本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供CTC91087-6衍生的植物材料，并对所述植物材料施用其它农业化学试剂(例如除草剂、杀真菌剂等)。
在其它实施方案中，本发明描述了，一种制造事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以产生事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有更好的抗虫性。在另外一个实施方案中，本发明提供了一种培育CTC91087-6事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，在包含昆虫侵染的条件下，其中，与在相同条件下种植的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。本发明还提供了，一种事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
转基因甘蔗'CTC91087-6'的描述
转基因杂交甘蔗'CTC91087-6'植株在遗传学上和表型上实质等同于重组分子的接受者(宿主)即亲本植株品种'CTC9001'，一种商业化的巴西甘蔗品种(植物品种保护登记号(SNPC)：20130226)，但具有新的和特定的特征(Cry1Ac的表达)，这保证了对甘蔗螟虫D.saccharalis(鳞翅目)的抗虫性。如同其亲本品种'CTC9001'，'CTC91087-6'是一个现代甘蔗杂交种，它具有几个合乎需求的农艺特性，诸如对巴西大多数甘蔗种植者采用的机械收割系统的适应性，高截根蔗萌发活力的遗传潜力，高甘蔗产量，优良的截根苗生长性，低纤维和高蔗糖含量。'CTC91087-6'显示出早熟，并且，除了昆虫抗性之外，该事件也抵抗白条病(leaf scald)，黑穗病(smut)，棕锈病和橙锈病。
简而言之，'CTC91087-6'植株的特点是在阳光下有紫色的茎秆，带有绿色的色调，在叶丛(straws)下有黄绿色的茎秆(stalk)。'CTC91087-6'植株表现出中等大小的弯曲状节间和窄宽度的绿黄色生长环。节间是光滑的，很少有(如果有的话)木栓状的斑点或裂缝，没有沟纹，并有高蜡质层。'CTC91087-6'植株表现出圆形的芽形，有一个顶端的孔。叶子结构是直立的，叶子很宽。平均叶耳(auricle)形状为披针形，分布不对称，呈现新月形的叶舌。
在5个不同的地点，与亲本品种‘CTC9001’相比，评估了平均成熟的茎秆高度(330收获日(Harvest Day after Planting)-DAP；从冠部到叶子插入点测量+1)，茎秆直径(5°茎秆；来自10根甘蔗的平均数)、分蘖数(在120DAP和330DAP)、重量(330DAP；10个分蘖)、糖分含量(BRIX％；330DAP；来自榨汁)、开花情况(330DAP)和物候状态(phenologicalstatus)(以每次截根苗分蘖数衡量)。
对于每个数据集，将所有地点的数据合并进行统计分析。合并的地点分析采用以下统计模型：
yijk＝μ+Si+B(S)ij+Gk+(SG)ik+εijk，
其中，yijk为在地点i上经处理k的第j重复的测量值；μ为总体平均值；Si为地点i(i＝1～5)的效应；Bj为第j重复(j＝1～4)的效应；B(S)ij为在地点i的第j重复(j＝1～4)的效应；Gk为处理k(k＝1～7或8)的效应；(SG)ik为地点i和处理k之间的交互作用；εijk为实验残留误差。
主效应分析和模型交互作用按Kuznetsova等人(2017)的描述进行。所有数据均采用通过lme4包装的混合线性模型(Bates等，2015)进行分析。
农艺和表型特征分析的结果如下方表格所示，并证实了'CTC91087-6'与其亲本非转基因品种('CTC9001')实质上等同的结论。
表01.'CTC91087-6'和'CTC9001'亲本(非转基因)品种的农艺和表型特征的平均数(average)。对5个位置的合并分析：Barrinha-SP、Camamu-BA、Piracicaba-SP、Quirinópolis-GO、Valparaíso-SP。
Figure BDA0003495290200000291
＊基于在相同实验条件下栽培的4个不同商业参考品种的最小和最大观察值估算。＊＊统计学差异(T检验；P≤0,05)。＊＊＊物候状态：每次截根苗平均分蘖数，每30天测量一次(整个周期有11次评估)。与CTC9001相比，CTC91087-6事件的分蘖数/截根苗的平均数数字较高(13.30vs.11.0un.)，但仍在商业参考的范围内。
进行了其他成分研究也表明，'CTC91087-6'与其常规的(非转基因)相对应的'CTC9001'基本等同[如经合组织指导文件(OECD，2011)规定的与营养和甘蔗在饮食中的使用相关的成分参数]。基于合并的数据分析的结果(巴西甘蔗种植区的五个代表性地点)，在'CTC91087-6'和常规对应者'CTC9001'之间，任何营养成分相比较都不存在统计学上的显著性差异(P≤0.05)(表02)。结果还表明，'CTC91087-6'在叶片中优先表达Cry1Ac，以在整个甘蔗栽培周期中控制螟虫所需的水平，并且没有出现影响植物代谢的基因修饰的非预期作用。
表02.在转基因事件"CTC91087-6"和常规对应者"CTC9001"中测量的成分参数的平均值。
Figure BDA0003495290200000292
Figure BDA0003495290200000301
1结果以干重为基础表示；2数值以甘蔗茎秆为基础表示；3四个商业参考栽培品种的最小和最大平均值；SEM：平均值的标准误差。根据在p≤0.05的t检验，'CTC91087-6'与常规对应品种'CTC9001'之间没有显著差异。
实施例
实施例1.CTC91087-6事件的产生--农杆菌转化。
事件CTC91087-6是通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)介导的CTC9001栽培品种的基因转化获得的。
CTC9001是一个由CTC开发的商业杂交品种，是CTC91087-6事件遗传背景的供体基因型；也就是说，它代表了CTC91087-6事件的未转化对应物。该品种为早熟品种，被推荐在巴西的圣保罗州、马托格罗索州、南马托格罗索州、米纳斯吉拉斯州、戈亚斯和巴西东北部种植(BRASIL,2012)。与其他商业化甘蔗杂交种一样，它是高倍性材料，具有来自其两个亲本品种(S.officinarum和甘蔗细茎野生种S.spontaneum)的大量染色体(DANIELS和ROACH，1987；SREENIVASAN等人，1987)。
CTC91087-6事件具有cry1Ac基因，其表达一种毒素以控制D.saccharalis，以及bar基因，在基因修饰过程中用作选择标记。cry1Ac和bar基因的表达由玉米泛素基因启动子UBI-1调控，其具有一个内源性内含子。两种表达盒都使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
1.1使用cry1Ac和bar基因开发构建体(图5；SEQ ID NO14)。
使用商业细菌质粒、限制性酶消化和片段连接(用连接酶)的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(图5)。
通过连接UBI-cry1Ac-NOS和UBI-bar-NOS盒来开发本发明的构建体。使用限制性酶将含有这两种盒的T-DNA从克隆质粒转移到基础质粒(图4:二元质粒载体，其宿主谱中含有大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌)，生成本发明的构建体(图5；SEQ ID NO:14).
在最后的克隆步骤之后，将构建体(SEQ ID NO:14)利用电穿孔插入到大肠杆菌菌株DH5α中。将含有构建体的分离菌落接种到补充有150μg/ml大观霉素的液体LB培养基中，并在37℃下且以250rpm摇动孵育16小时。然后制备含有细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的贮存品，将其储存在-80℃的超低温冰箱中。
然后，通过分离和纯化质粒DNA，并通过电穿孔转化农杆菌，将本发明的构建体从大肠杆菌转移到根癌农杆菌菌株EHA105。与大肠杆菌菌株一样，将含有农杆菌的细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的存货存放在-80℃的超低温冰箱中。
1.2农杆菌介导的植物转化方法
为了获得胚性愈伤组织，收集在田间或温室中生长长达12个月的幼CTC9001甘蔗叶子(palm leaf)，进行初始外植体的分离。
表面消毒后，在无菌条件下从分生组织上方切取约0.05-5mm厚的横切面。将切片置于愈伤组织诱导培养基[Sais MS–Murashige和Skoog，1962；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、甘露醇、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D]的表面。培养物保持在26±2℃的黑暗中，每隔15天传代培养一次，共3～5个周期，每次7～28天。转化前一周，再次选择愈伤组织的胚胎发生特征(结节、紧凑、不透明、略带黄色)。
由用本发明构建体转化的EHA105菌株组成的农杆菌培养物，从甘油贮藏液开始，在28℃黑暗中保持2～3天。通过在MS液体培养基加乙酰丁香酮中重新悬浮培养制备农杆菌悬浮液用于感染植物材料，调整至最终OD600为0.1-1.0(MS盐、蔗糖和维生素B5)。
目测选出具有胚胎特征的愈伤组织，直接转移到农杆菌悬浮液中，在黑暗中以50转/分的恒定速度持续搅拌，保持30分钟。
在此之后，将愈伤组织从农杆菌悬浮液中分离出来，并去除多余的悬浮液。下一步，愈伤组织在半固体培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、柠檬酸、胶凝剂、2,4D和乙酰丁香酮)中，以22℃避光培养1-5天。
共培养后，将愈伤组织转移到DT静息培养基(MS盐；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D、特美汀)中，以26℃避光保持14天。
通过在含有植物调节素和选择剂草铵膦的选择培养基中进行连续传代培养，选择转化的细胞。(含有草铵膦的选择培养基：MS盐，蔗糖，维生素B5，选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸，酪蛋白水解物，硫酸铜，甘氨酸，胶凝剂，2,4D，特美汀)。在这种条件下，愈伤组织在26℃避光保持21天，然后将愈伤组织转移到再生培养基(相当于不含2,4D的选择培养基)，然后转移到延伸培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、酪蛋白水解物、胶凝剂、特美汀)。在用作选择剂的除草剂存在的情况下，将愈伤组织暴露在4,000勒克斯的16小时光周期下，然后在将它们转移到温室之前进行繁殖、生根和适应。这个过程被用来生成最终创造事件CTC91087-6的克隆。
实施例2.事件CTC91087-6的分子特征
2.1DNA提取。
使用来自事件CTC91087-6的约10mg叶片组织。根据制造商的说明，在BioSprint96Nucleic Acid Extractor(Quiagen，GER)上用BioSprint 96DNA DNA Plant KitExtraction Kit(Quiagen，GER)进行基因组DNA提取。在Multiskan GO光谱仪(ThermoScientific，USA)中，将DNA归一化为10ng/μL的浓度。
2.2插入宿主植物种质的转基因拷贝数的测定。
通过定量
Figure BDA0003495290200000321
PCR(qPCR/
Figure BDA0003495290200000322
)对插入CTC91087-6事件中的cry1Ac和bar基因的拷贝数进行初步评估，并经由Southern blot和/或测序确认结果。
Figure BDA0003495290200000323
实时PCR反应是通过7500实时PCR系统(Applied Biosystems，美国)在Fast模式下实现的。所用引物对和探针见表03。作为cry1Ac和bar反应的内对照，以确认所用DNA的存在和质量，以及，反应的有效性，在多重模式中使用甘蔗多泛素基因(正向引物：5'ACCATTACCCTGGAGGTTGAGA 3'；反义引发物(antisense initiator)：5'GTCCTGGATCTTCGCCTTCA 3'；探针：VIC-5'CTCTGACACCATCGAC 3'-MGB。
表03:用于经由qPCR确定拷贝数的引物和探针
Figure BDA0003495290200000324
Figure BDA0003495290200000325
Figure BDA0003495290200000331
qPCR反应使用1X
Figure BDA0003495290200000332
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每种引物300nM，相应探针200nM。使用的循环是：50℃循环2分钟用于尿嘧啶N-糖基酶活化，95℃循环20秒用于DNA聚合酶活化，95℃3秒(变性)和60℃30秒(退火和延伸)循环40轮。
通过手动输入扩增曲线指数阶段的阈值进行数据分析。对于cry1Ac和bar基因，拷贝数由DeltaCt(dCt)分析推断，其中内源基因的Ct(扩增产物发出的荧光信号达到阈值的周期)从靶基因的Ct中减去。在这类分析中，在每一个Ct值，拷贝数都被认为加倍，并且数值已知的同一物种的对照拷贝的参考数量作为参照。
因此，这两种检测都指出CTC91087-6事件基因组中cry1Ac基因存在1个拷贝。bar基因也检测到相同的拷贝数(即1个拷贝)，该基因的检测是基于基因启动子的检测。
2.3侧翼序列的定义。
为了分离事件CTC91087-6中存在的T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多次DNA测序实验。由这些实验数据生成的事件CTC91087-6的基因插入图如图3所示。
对T-DNA的两个末端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。iPCR方法是基于基因组DNA消化，使用酶切割T-DNA序列和随机事件基因组序列。切割产物被环化，并使用已知T-DNA区域的引物进行多重巢式PCR循环(表04)。然后将分离出的片段进行分离、克隆并通过Sanger方法进行测序。最后，组装了侧翼区域的共有(consensus)序列(SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24).
表04.用于实施iPCR反应的限制性酶和引物序列，以及扩增反应条件。
Figure BDA0003495290200000341
Figure BDA0003495290200000351
同时，由于目前没有完全测序的基因组可以用作CTC9001种质的参考，因此采用了捕获测序方法，作为分离插入到事件CTC91087-6的T-DNA及其侧翼区域的额外努力。在该策略中，开发了小的重叠多核苷酸片段(探针)以覆盖整个T-DNA序列。将这些探针与CTC9001和CTC91087-6两个栽培品种的部分分级的基因组DNA杂交，并分离出杂交序列。然后根据标准程序使用
Figure BDA0003495290200000352
技术对分离的片段进行测序。将得到的数据与存在于转化载体中的T-DNA序列进行比对，并与上述iPCR数据一起，得到CTC91087-6事件及其侧翼序列(SEQID NO:22、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24)的完整T-DNA共有序列(SEQ ID No:2)。
2.4CTC91087-6事件的检测和表征方法(事件特异性测定)
为了验证该方法，我们使用了来自四个不同地点(Piracicaba、Barrinha、和Valparaiso(
Figure BDA0003495290200000353
Paulo)；和Quirinópolis(Goiás))的事件叶片样品。将未处理对照(WT)植物和具有相同构建体的其他转基因事件作为实验对照。如上所述进行DNA提取。
基于T-DNA插入基因组侧翼序列的分子特征，设计并验证了用于识别CTC91087-6事件的实时PCR检测。为了开发特定的检测方法，选择了被称为"加-减(Plus-Minus)"或"存在-不存在(Presence–Absence)"的实时PCR(qPCR)技术，验证了该方法的两种变化：通过SYBR GREENTM和通过
Figure BDA0003495290200000354
技术。特定的引物对已被设计成在两种方法中产生有关T-DNA插入的信息，这样的一个引物结合到构建体中，第二个引物结合到宿主基因组中。对于
Figure BDA0003495290200000355
技术的使用，在引物之间设计了特定的探针。
在一个优选的实施方案中，
Figure BDA0003495290200000356
PCR技术中采用的探针由在RB区域中的SEQ ID NO:10和/或在左边界中LB区域的SEQ ID NO:11组成。
Figure BDA0003495290200000357
实时PCR反应使用7500Real-Time PCR系统(Applied Biosystems，USA)在其Fast模式下进行。
甘蔗多泛素基因(内源基因)被用作内部反应对照，以确认所使用DNA的存在和质量。以下试剂可与用于事件的测定方法多重地进行：正向引物(SEQ ID NO:15)；反向引物(SEQ ID NO:16)；探针(SEQ ID NO:17)。
qPCR反应使用1X
Figure BDA0003495290200000361
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每个事件特异性引物为150nM和相应探针为100nM，内源性多泛素基因的引物为200nM，其探针为200nM，DNA100-200ng，以及足够的水加至20μL的体积。使用以下PCR程序：50℃循环2分钟以活化尿嘧啶N-糖基化酶，95℃循环20秒以活化DNA聚合酶，95℃3秒(变性)和87℃30秒(退火和延伸)40个循环。
使用SYBR GREENTM的qPCR反应也使用7500Real-Time PCR System(AppliedBiosystems，USA)在其标准模式下进行这种类型的检测。反应使用1X QuantiFast SYBRGreenTM PCR试剂盒(QIAGENTM)、40nM RB正向引物和28nM RB反向引物、100-200ng DNA和足够的水加至最终体积为25μL。使用本发明事件、与本发明事件相同构建体转化的其它事件(阴性对照)、野生甘蔗(WT)样品和实验对照(提取和反应空白对照)进行反应。
使用以下PCR程序：95℃下5分钟的一个DNA变性循环，35个引物退火循环和95℃下15秒及60℃下1分钟的扩增，以及生成熔解峰的一个解离循环(95℃下15秒，60℃下1分钟，95℃下15秒和60℃下15秒)。使用SYBR safe的反应不允许使用多重扩增，因此，有必要准备一个单独的内源基因扩增反应，使用相同的DNA以消除假阴性。
对应于本发明事件的样品显示出特异性扩增：具有定义良好的扩增曲线形成和特征性的S形形状；而其他事件、WT以及提取和反应空白的样品没有显示出事件特异性扩增。正如预期的那样，除了提取和反应空白对照外，内源性对照对所有样品都呈现了扩增，这既表明了反应中使用的DNA的质量，也表明了反应和循环的质量。
结果是，有可能通过高精度的
Figure BDA0003495290200000362
验证本发明的事件特异性检测反应，如图6所示
SYBR GREENTM检测结果显示了事件样品在预期的熔解温度(83.5℃)下的特异性扩增。尽管一些目的事件的样品在特异性峰值之前显示了较低的强度曲线，其他事件的样品以及WT和空白的样品在这个温度下没有达到峰值(图7)。此种曲线是PCR反应过程中引物二聚体形成的特征，这是预期到的，因为该技术是基于嵌入剂与任意双链DNA分子的结合——无论是来自特异性扩增还是引物之间的结合。相比之下，
Figure BDA0003495290200000363
技术的探针与DNA特异性结合，并在DNA扩增过程中释放出来，从而产生在此过程中为设备所捕获的荧光信号。
实施例3.事件CTC91087-6的产生--基因组编辑(GE)
本发明的事件CTC91087-6是使用基因组编辑(GE)方式产生的，从而重现了使用本文所述的优选的农杆菌介导的转化方法产生的事件。
以这种方式，通过将cry1Ac基因插入到与CTC91087-6事件相同的基因组位置来重现CTC91087-6事件，cry1Ac基因的表达由能够以足以控制目标害虫侵染的水平驱动Cry1Ac蛋白表达的启动子或启动子区域和终止子调节。此外，还插入(瞬时或稳定地)标记基因或选择系统以实现事件选择。优选地，将所要求的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)被插入到与CTC91087-6事件相同的基因组位置。因此，通过插入表达控制D.saccharalis的毒素的cry1Ac基因和bar基因，重现CTC91087-6事件。cry1Ac和bar基因的表达受玉米泛素基因启动子UBI-1调控，UBI-1有一个内源性内含子。两种表达盒都使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
如果上述生成事件CTC91087-6的基因组编辑方法导致T-DNA在靶位点的整合效率低下，可以将发育基因或其他调控元件与GE试剂一起传递，以提高整合效率。
3.1构建体的开发。
使用商业化质粒、限制性酶消化、片段连接(用连接酶)和其它已知方法的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(质粒)。
GE试剂可以在多个质粒上递送，每个质粒包含酶复合体的一个元件(内切酶、crRNA或引导RNA，以及同源重组(HR)模板；图21)。
在一个实施方案中，HR模板构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC91087-6的侧翼序列同源的大约1kb的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，HR模板构建体包含SEQ ID NO:26(图21)。本发明还包括包含内切酶表达盒的第二构建体。在一个优选的实施方案中，内切酶表达盒包含Cas9内切酶序列。在更优选的实施方案中，Cas9序列是针对甘蔗表达优化的密码子。在一个实施方案中，Cas 9构建体另外包含引导/crRNA序列。优选地，Cas 9构建体包含crRNA序列SEQ ID NO:28.在一个更具体的实施方案中，Cas 9构建体包含SEQ ID NO:27(图20)。本发明中还计划了单独包含引导RNA表达盒的第三构建体，其包含SEQ ID NO:28.
在另外一个实施方案中，基因组编辑构建体包含HR模板、核酸酶和引导RNA表达盒，在单个构建体中递送所有GE试剂。在一个实施方案中，单一构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC91087-6的侧翼序列同源的大约1kb的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，该构建体包含SEQ IDNO:25(图22)。
可选地，构建体还包含荧光/选择标记和/或其他基因工程系统，以去除标记基因和/或核酸酶盒，例如来自噬菌体P1的Cre/loxP重组系统。在这种情况下，应被删除的标记基因/核酸酶基因盒侧翼是loxP区域，而Cre重组酶在瞬时表达过程中删除该片段。
3.2直接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用直接递送蛋白质、RNA或质粒的方法产生的。直接递送的方法选自由粒子轰击、电穿孔、脂质体转染和原生质体转染组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它递送方法也可以利用。
3.2.1直接递送-RNP方法
在一个实施方案中，本发明的事件是使用核糖核蛋白(RNP)递送产生的。RNP递送的优选方法选自甘蔗愈伤组织的粒子轰击和原生质体转染组成的组。此外，其他甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于):叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
使用RNP方式进行基因组编辑，内切酶和crRNA或引导RNA以RNP形式递送，与HR模板分开，后者通过质粒递送。
导向RNA可以通过体外转录初步产生，或如同核糖寡核苷酸以化学方式合成，而相应的核酸酶可以通过进一步纯化(细菌表达)在体内产生，或从任何此类产品的制造商购买。在一个优选的实施方案中，该引导RNA包含SEQ ID NO:28.在另一个实施方案中，核酸酶是Cas9核酸酶。
由相应的核酸酶和引导RNA以及HR模板质粒组成的即用核糖核蛋白(RNP)复合物被吸附在金色颗粒上，并直接递送到细胞或组织中。
3.2.2直接递送--质粒法
在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC91087-6的位点定向整合，而无需整合与GE方式相关的额外转基因。
质粒递送的方法选自由甘蔗愈伤组织的粒子轰击(基因枪)或原生质体的聚乙二醇转化组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它方法也可以利用。此外，其它甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
仍然在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂是稳定表达的，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方式，LoxP位点将保留在事件CTC91087-6植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC91087-6植物的基因组中去除GE试剂DNA。
3.3间接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用间接递送质粒的方法产生的，如农杆菌转化。可以使用根癌农杆菌和发根农杆菌。植物病毒也可用于将质粒间接递送至植物细胞和组织。例如，转基因植物双生病毒使得实现更高的转化效率成为可能，特别是在没有稳定插入基因组的情况下。此外，不同的组织和细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：愈伤组织、原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
在一个优选的实施例中，农杆菌转化如实施例1所述进行。
在另一个优选的实施方案中，本发明的事件是通过农杆菌转化使用质粒递送产生的，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC91087-6的位点定向整合，而无需整合与GE方法相关的额外转基因。
GE试剂可以在多个质粒上递送，但优选在单个质粒上递送。在一个优选的实施方案中，构建体是SEQ ID NO:25，包含一个可选择的标记、一个核酸酶、crRNA或引导RNA和同源重组(HR)模板(图22)。HR模板包含含有所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是大约1kb的与所述CTC91087-6的侧翼序列同源的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于表达盒的两侧。
在一个优选的实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂稳定表达，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方法，LoxP位点将保留在事件CTC91087-6植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC91087-6植物的基因组中去除GE试剂DNA。
通过上述所有转化过程，所得转化细胞将再生形成含有本发明事件的植物。
3.4分子表征。
使用基因组编辑生成的事件CTC91087-6，对于其T-DNA在基因组的目标位点准确插入情况，使用本发明的引物(SEQ ID NO:6-9)进行评估，如本文说明书中所述。
此外，验证设计用于扩增紧贴事件CTC91087-6侧翼序列1kb区域的序列的引物对，以评价重组位点的完整性(表05)。
表05.为CTC91087-6侧翼序列(1Kb区域)设计的引物对。
Figure BDA0003495290200000401
Figure BDA0003495290200000402
实施例4.对本发明事件中插入的基因表达产物的评价。
使用ELISA对本发明事件中的基因表达产物进行了详细的表征，以确定Cry1Ac和NptII蛋白的浓度，并使用Western印迹法确认这些异源蛋白的身份。
(ELISA)酶联免疫吸附测定。
为了经由ELISA评价cry1Ac和bar基因的表达，在作物发育的不同阶段研究不同的甘蔗组织。为了生产本发明事件和亲本对照的组织样品，进行了三种类型实验测试：PACE、EB和AGROPHENO。
PACE和AGROPHENO试验一起在亲本对照种植区的5个代表性地点进行，其中3个在圣保罗州(Barrinha、Piracicaba和Valparaíso)，1个在戈亚斯州(Quirinópolis)，1个在巴伊亚州(Camamu)。实验采用随机完全分块设计，4组重复。实验地块由4个12米长的行组成(Barrinha、Piracicaba、Valparaíso和Quirinópolis)或由4个7米长的行组成(Camamu)。在全部试验中行间距都是1.5米。
EB试验在四个地点进行，3个在圣保罗州(Barrinha、Piracicaba和Valparaíso)，1个在戈亚斯州(Quirinópolis)。实验采用随机分块设计，4组重复。实验地块由4行组成，每行4米。在全部试验中行间距都是1.5米。表06列出了在各个地方进行的试验的细节
表06.用于分析本发明事件产生的cry1Ac和bar基因表达的样品采集的测定信息。(种植后天(DAP)数表示用于分析的样品采集的时间。)
Figure BDA0003495290200000411
在甘蔗植物发育的不同时期，研究了本发明的事件产生的Cry1Ac和Pat蛋白的表达分析。评价的条件是：
·叶片中异源蛋白在本发明的事件的一个栽培周期内的表达(100、200和300DAP)；
·叶片中异源蛋白的表达，沿着甘蔗周期在60和120DAP、然后在240和300DAP；
·在甘蔗周期的330DAP时的茎和根中异源蛋白的表达。
在PACE/AGROPHENO测定中在100、200和300DAP时，在实验处理地块(发明和亲本对照)上收集叶子样品。在EB测定中，在60、120、240和300DAP收集样品。在PACE/AGROPHENO测定中，腐殖(thatched)和根样品仅在330DAP时收集。采集后，样品被送往ELISA分析，以确定Cry1Ac和Pat蛋白的表达水平。
叶子样品：从5到10片"诊断"叶的顶端收集30厘米的组织，在曲折线2和3上，避免病叶。去除中央肋后，将叶子切成碎片，均质化并包装在先前确定的封口袋中。
茎秆样品。收集了10根整根甘蔗。去掉干叶和尖后，将甘蔗切成小尾状，均质化，装入贴有标签的包装中。
根部样品。从实验地块的第2行和第3行采集有代表性的一丛。将土壤粉碎，用清水洗净根部，去除多余的土壤。然后将干净的根切成碎块，均质化，装入有标签的塑料袋中。
所有样品(来自叶、茎干和根组织)在收集15分钟内转移到泡沫塑料箱中的干冰中。如上所述，通过事件特异性检测确认所有团块样品的遗传学身份。
使用TissueLyser设备浸渍30mg叶、60mg茎干和200mg根组织(在干冰或液氮中冷冻)。向浸渍的叶组织中加入750μL补充有Tween 20的生理盐水磷酸盐提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20，pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM，美国)稀释。对于茎秆和根，使用375μL相同的缓冲液。加入缓冲液之后，进行漩涡均质化，然后以最高速度离心20分钟。收集所得上清并使用Bradford测定对总蛋白定量。
对Cry1Ac和Pat蛋白的定量是根据ThermoScientificTM Coomassie Plus(Bradford)Protein Assay Kit(23236)-Microplate Procedure的推荐进行的。因此，用于获得校准曲线的标准是与上述试剂盒一起提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用2000、1000、500、250、125和0μg/mL的校准物(在PBST缓冲液中配置)。每种标准校准物10μL，一式三份加入板孔中。独立稀释生成总共6条曲线。对于样品，3个单独的蛋白质提取液在每个孔中使用10μL。然后将200μL的Coomassie Plus Reagent Solution加入到每个含有校准剂和样品的孔中。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(Molecular Device)在595纳米(nm)处读取吸光度。
对每个研究的样品获得一式三份的总蛋白。对每个重复的总蛋白定量后，选择中位定量值变异最小的样品进行ELISA分析。这些样品按照标准的Qiagility自动移液器(QIAGEN)操作程序进行标准化(normalized)。标准化至最终浓度为150μg/mL总蛋白完成。随后，对样品进行稀释，以确保待鉴定的蛋白质浓度在可信的定量范围内。为了分析Cry1Ac蛋白的存在，稀释到1.000ng/mL。为了分析Pat蛋白的存在，稀释到30,000ng/mL。标准样品按之前的描述用于ELISA分析。
通过96孔板光谱仪在两种不同波长下读取结果：在SpectraMax Plate reader(Molecular Devices)上对于Cry1Ac以450nm和630nm的波长以及对于Bar以450nm的波长读取。对于Cry1Ac，使用Envirologix AP003 CRBS试剂盒进行蛋白质检测和定量。对于Pat(bar)使用Envirologix AP013 BAR试剂盒。在所有情况下，都遵循制造商的建议。
分析是基于测试样品的吸光度值与通过测量标准曲线的吸光度估计的方程中的预测值的关联。将合成蛋白在PBST缓冲液中稀释至所需浓度。对每个样品进行一式两份的实验分析。Cry1Ac和Pat蛋白的浓度是根据总蛋白(μg/mg)、新鲜组织(μg/g)和干燥组织(μg/g)计算的。
下方表7显示了所评估的来自在5个地点中的每一个的经过一年培养(110、200和300DAP)的本发明的事件的叶片的Cry1Ac蛋白表达数据。
表07：在经过一年甘蔗栽培的本发明的事件的叶片中的平均Cry1Ac表达。对5个试验地点在100、200和300DAP时的单独和合并的统计分析(SE：标准误差)。
Figure BDA0003495290200000441
图8显示了来自经过一年甘蔗栽培的本发明的事件的5个地点的合并分析的Cry1Ac表达数据(叶片)(表07)(以μg蛋白质/g干组织计)。
表08列出了经过甘蔗60和120DAP以及甘蔗240和300DAP的一个周期的本发明的事件的叶片中Cry1Ac蛋白的表达数据。
表08:在经过甘蔗60和120DAP以及甘蔗240和300DAP的一个周期的本发明的事件的叶片中Cry1Ac蛋白的表达平均值的比较。
Figure BDA0003495290200000442
Figure BDA0003495290200000451
图9显示了来自在甘蔗60和120DAP以及甘蔗240和300DAP的一个作物周期内本发明的事件的4个地点的合并分析的Cry1Ac表达数据(叶片)(以μg蛋白/g干组织计)。
表09显示了在来自330DAP时收获的本发明的事件的成熟茎干中的Cry1Ac表达数据。
表09:在330DAP时收获的本发明的事件的成熟茎干中平均Cry1Ac蛋白表达量的比较。
Figure BDA0003495290200000452
图10中显示了在来自330DAP时收获的本发明的事件的成熟茎干中的Cry1Ac表达数据(表09)(以μg蛋白/g干组织计).
表10中列出了对于5个评估的地点的，来自经过一年栽培(110、200和300DAP)的本发明的事件的叶片中的Pat蛋白表达数据。
表10:在来自经过一个甘蔗作物周期(100、200和300DAP)的本发明的事件的叶片中的平均Pat表达量的比较。
Figure BDA0003495290200000453
Figure BDA0003495290200000461
图11显示了来自本发明的事件的来自5个地点的经过一年甘蔗种植栽培的合并分析的Pat表达数据(叶片)(表10)(以μg蛋白/g干组织计)。
表11列出来在4个评估的地点，来自经过一个甘蔗60和120DAP以及甘蔗240和300DAP的周期的本发明的事件的叶片的Pat蛋白表达数据。
表11:来自经过一个甘蔗周期(60和120DAP以及240和300DAP)的本发明的事件的平均叶片Pat表达量的比较。
Figure BDA0003495290200000462
Figure BDA0003495290200000471
图12显示了来自经过一个甘蔗60和120DAP以及甘蔗240和300DAP的作物周期的本发明的事件的4个评估的叶片表达地点的合并分析的数据(表11)(以μg蛋白/g干组织计)。
表12显示了来自在330DAP收集的本发明的事件的成熟茎干的Pat蛋白表达数据。
表12:来自在330DAP收获的本发明的事件的成熟茎干的平均Pat表达量的比较。
Figure BDA0003495290200000472
图13显示了在330DAP时的本发明的事件的成熟茎干上的Bar表达(表12)(以μg蛋白/g干组织计)。
来自所有地块和地点的所有根部样品的Cry1Ac蛋白表达值都低于先前验证的分析方案的定量限(<LOQ)，除了Quirinópolis地点，那里的一个实验重复中每克新鲜组织含有0.053μg Cry1Ac。对于Pat蛋白，结果显示，所有地块和地点的所有样品，无一例外，都低于先前验证的方法的检测限(<LOD)(表13)。
表13:在本发明的事件的根部组织中的Cry1Ac和Pat蛋白表达值(μg/g新鲜组织)。
Figure BDA0003495290200000481
1一个LOQ之上的例外.
叶、茎和根所得到的结果表明，本发明事件的Cry1Ac蛋白表达水平远高于Pat的表达。例如，在叶片中，跨取样时间/地点的平均Cry1Ac表达量范围为26.9至33.3μg/g新鲜组织，而均值Pat表达量范围为0.11至0.18μg/g新鲜组织。在整个甘蔗周期中，来自本发明事件叶片的Cry1Ac的平均浓度跨100、200和300DAP的采集时间中保持不变(或略微下降)，其浓度分别为26.9、29.8和33.3μg/g新鲜组织。Pat表达水平在100DAP时更高(0.17μg/g新鲜组织)，在200和300DAP时出现统计学意义的下降，平均值分别为0.12和0.11μg/g新鲜组织。
叶子的表达分析显示，关于种植地点，没有相关的蛋白质差异。例如，本发明的事件的叶片中Cry1Ac在五个地点的平均表达量范围为24.2至31.1μg/g新鲜组织(100DAP)，22.1至35.8μg/g新鲜组织(200DAP)，以及27.5至44.1μg/g新鲜组织(300DAP)。Pat表达量的相应的值为0.11至0.25μg/g新鲜组织(100DAP)，0.10至0.16μg/g新鲜组织(200DAP)，0.06至0.16μg/g新鲜组织(300DAP)。
在330DAP收集的茎干部表达数据显示，Cry1Ac和Pat的表达水平分别为3.65μg/g新鲜组织和0.01μg/g新鲜组织。在330DAP的在五个地点的Cry1Ac平均表达量为2.53至4.27μg/g新鲜组织。
本发明事件的根中Cry1Ac和Pat蛋白的表达数据表明，这些蛋白在这一组织中的表达非常匮乏，无法准确识别/量化。只有在Quirinópolis的一个重复的Cry1Ac的浓度得到了估算(每克新鲜根0.053μg Cry1Ac)。根据所采用的ELISA方法，所有其他样品都低于LOD和/或LOQ。
还评估了剪切对表达水平的影响。在60和120DAP时收集叶子样本，在180DAP时剪切茎部以模拟作物，并在剪切后60和120天(或240和300DAP)重新取样。在这些收集期间，跨不同地点Cry1Ac的平均组合浓度为36.2和51.1微克/克(60和120DAP)，以及23.1和29.2微克/克新鲜组织(240和300DAP)。Pat表达水平为0.11和0.18(60和120DAP)以及0.16和0.19(240和300DAP)。综上所述，Cry1Ac和Pat(bar)蛋白的表达水平范围与来自之前讨论的实验(100、200和300DAP)的表达数据一致，表明剪切后的表达水平与剪切前的表达水平相似。
与剪切前的Cry1Ac浓度相比，剪切后Cry1Ac的表达水平的明显下降可能是由于样品的变异性。值得注意的是，在之前描述的与本实验平行进行(在田间和实验室)的实验中(100、200和300DAP)，Cry1Ac表达水平范围在26.9至29.8μg/g新鲜组织之间。然而，本实验中Cry1Ac的表达水平在数值上更高，为36.2和51.1μg/g新鲜组织(60和120DAP)，给出了一种切割后表达量下降的印象。众所周知，由于实验的变异性，各种培养物中的表达量值在不同的采样时间可能会有有变化。在100、200和300DAP时的表达数据(26.9至33.3μg/g新鲜组织)的总体结论在切割后的收集点240至300DAP得到了重复(22.7至29.7μg/g新鲜组织)。在甘蔗(sugarcane)/甘蔗(cane)评估实验的60和120DAP时的较高表达值可归因于实验的变异性，并且很可能并不表明切割本发明的事件后Cry1Ac表达水平有显著降低.
因此得出结论，来自本发明的事件的Cry1Ac和Pat蛋白的表达水平在不同的时间、组织和种植地点是特征性的，都有其在巴西种植的代表性。Cry1Ac蛋白的表达水平在本发明事件的叶片中，在整个栽培周期内保持较高的水平，保证了抗Diatraea saccharalis的预期效果。在来自本发明的事件的茎干中的Cry1Ac和Pat蛋白的表达水平非常低，并且因此，经由食用汤汁或衍生产品的食物接触(接触到异源蛋白)将是极少的。
Western blot
为了鉴定本发明事件所表达的异源蛋白，使用50mg在液氮中冷冻的叶片。在TissueLyser设备中，在25Hz下浸渍10分钟，加入3个钢珠(3mm–Qiagen)。对浸渍后的组织，加入750μl补充Tween 20的生理盐水磷酸盐提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20,pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM,美国)稀释。缓冲液加入后，进行旋涡震荡匀浆，并将混合物在4℃下以9,500RPM离心10分钟。收集所得的上清液，并对总蛋白进行定量。
对Cry1Ac和Pat蛋白质的分析所采用的定量根据ThermoScientificTM CoomassiePlus(Bradford)Protein Assay Kit(23236)-Microplate Procedure的建议来进行。因此，用于获得校准曲线的标准是上述试剂盒提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用在PBST缓冲液中制备的2000、1000、500、250、125和0μg/ml校准物。将每个标准校准物10μL加入板孔中，一式三份。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(Molecular Device)在595纳米(nm)处读取吸光度。总蛋白提取后，2.5μg蛋白提取物与2XLaemmli Sample Buffer(Bio-Rad,美国)混合，通过在100℃加热5分钟进行变性。
作为异源蛋白存在的阴性对照，使用从常规亲本品种(WT)中提取2.5μg蛋白提取物。此外，还准备了阳性对照来检测Cry1Ac和Pat蛋白。第一个阳性对照是用50ng CTC内部纯化合成的Cry1Ac蛋白或1ng可商购的纯化的bar蛋白(Novoprotein，美国)，稀释在从常规亲本品种(WT)叶片中提取的总蛋白溶液中制备的。第二种阳性对照是通过在PBST提取缓冲液中稀释5ng纯化的Cry1Ac蛋白(Genscript，美国)或1ng的bar蛋白(Novoprotein，美国)。或者，向测定中加入其他阳性对照，诸如含有将要分析的相同蛋白的其他遗传修饰的甘蔗事件和商购的Bt11玉米。
将样品变性后应用在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Mini-
Figure BDA0003495290200000501
TGXTMPrecast Gel)上，浸入Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液(Bio-Rad，美国)中，并通过在50V下电泳5分钟，然后在120V下电泳约90分钟而分离。接着，将聚丙烯酰胺凝胶在Tris/甘氨酸转移缓冲液(Bio-Rad，USA)中平衡，加入20％甲醇10-15分钟。PVDF膜用无水甲醇处理。将转移系统安装在装有冷的转移缓冲液的容器中，以在50V的恒定电压下浸泡转移("湿转移")3小时。转移完成后，将膜在4℃下，在不断搅拌下，在封闭液[5％脱脂奶粉(Bio-Rad，美国)和TBS/T(20mM Tris，150mM NaCl，1％Tween20)中封闭16小时，以防止可能的非特异性膜结合。
下一步，用主抗体孵育膜90分钟，以检测和确认Cry1Ac和Pat蛋白的存在和完整性。本测定中使用的多克隆抗体为兔抗-Cry1Ab(Fitzgerald，美国)，其与Cry1Ac和Cry1Ab蛋白都结合；以及兔抗-Bar(Abcam，美国)，其可与PAT/Bar蛋白反应，在TBS/T以1:100稀释(v/v)。
在TBS/T中以3个5分钟(3x5)循环洗涤膜，并与山羊生产的HRP结合的二级抗兔抗体(Sigma)孵育，以1:20,000的浓度或以1:5,000的浓度-v/v(Fitzgerald)孵育60分钟。孵育后，再次用TBS/T洗涤膜(3x5分钟)，根据制造商的说明，在Amersham Hyperfilm ECL X射线胶片(GE Healthcare，USA)上通过Clarit Western ECL Substrate Kit底物反应(Biorad，USA)验证酶联免疫法。X射线胶片对膜的暴露时间从15秒到3分钟不等。
结果显示了，在样品R1和R2中，Cry1Ac蛋白的表达谱表现为两个几乎相同分子量的约69kDa和约66kDa的免疫反应条带，这通常被称为成对物(doublet)。获自位于Piracicaba Polo的两个实验地块的两种样品都是本发明的事件的生物重复。蛋白成对物通常来自由蛋白酶对末端氨基酸残基的移除。正如预期的那样，阴性对照(NC)相反地没有显示免疫反应性。阴性对照由提取自亲本品种的总蛋白组成。在阳性对照1(CP1)中，内部纯化的CT1纯化的Cry1Ac蛋白(50ng)被加入到从亲本栽培品种提取的总蛋白中，近似69和66kDa的条带也存在于其中。在阳性对照1(CP1)中观察到一些低分子量(在50和30kDa之间)的额外条带。这些条带可见，可能是因为用作对照的Cry1Ac蛋白是被部分纯化的(34％纯)，伴有其他细菌蛋白。阳性对照2(CP2)由稀释在PBST提取缓冲液中的商购Cry1Ac(5ng)蛋白(GeneScript)组成。这一蛋白是已被分离的，纯度大于95％，并有一条预期重量的单一条带。
其他阳性对照已被添加到膜上。从Bt11玉米叶片中提取的总蛋白样品(Syngenta，美国)被用作实验的阳性对照(CP3)。这是可行的，因为Western blot检测中使用的多克隆抗体也能与Cry1Ab蛋白发生反应。正如预期的那样，在Bt11(CP3)玉米样品中可以看到Cry1Ab成对物，以及其他重量为40和30kDa的条带，被认为是植物叶片中Cry蛋白的细胞内蛋白质分解的产物。阳性对照4(CP4)由从另一个表达Cry1Ac的甘蔗事件中提取的总蛋白组成。再一次，Cry1Ac蛋白的轮廓以双峰出现。在叶片中没有观察到表明部分Cry1Ac蛋白或更高分子量融合蛋白的其他条带。
通过Western blot也检测了bar选择基因所编码的蛋白质。尽管Pat以低于Cry1Ac蛋白的水平表达，但Western blot检测表明，在本发明事件的所有使用的生物重复中，存在一条预期大小为22kDa的免疫反应带(图15)。
两个阳性对照被添加到膜上。阳性对照1(CP1)相当于1ng纯化的bar蛋白(Novoprotein，中国)稀释在亲本栽培品种的蛋白提取物中。阳性对照2(CP2)是在PBST提取缓冲液中稀释的相同蛋白质。对应于bar蛋白的诊断带在两个对照中都以预期的高度出现，并且与本发明的事件中出现的条带相同，证实了其身份。
除了对应Pat蛋白的条带外，还可以观察到所有样品中存在大约重量为37kDa和50kDa的条带，除了在PBST提取缓冲液中稀释的纯化蛋白(CP2)。阳性对照1中这种条带的存在表明是一种假象，可能是由非特异性抗体与内源性甘蔗蛋白结合产生的。
因此得出结论，本发明的事件所表达的Cry1Ac和Pat蛋白的身份通过Westernblot得到了确认。本发明的事件表达的蛋白质具有预期的大小，并且没有发现所述事件表达截短/融合蛋白的的证据。
实施例5.生物学试验：对甘蔗螟虫(D.saccharalis)的敏感性。
使用目标害虫D.saccharalis(甘蔗螟虫)的生物测定(bioassays)也可用于检测和表征事件CTC91087-6，证明表达的杀虫蛋白Cry1Ac提供的对害虫的防治效果。在本发明的范围内可以考虑不同的生物测定法：例如，叶盘测定法、网室生物测定法、组织稀释法，等等。
对于叶盘测定，收集事件CTC91087-6植物的叶子，切成16mm2的圆盘，并分布在含有凝胶琼脂的生物测定板中。从培养板的每个孔中侵染了D.saccharalis(0-24h龄)新生体，并在27±1℃、相对湿度60±10％、光周期12h:12h(明：暗)下培养7天。孵化结束后，评价存活个体的幼虫死亡率和对幼虫发育的抑制作用，计算相对功效(相对功效＝(1-Mtc/Mev)x100)。将存活的幼虫用Digimizer软件(v 4.6.1)进行图像分析，基于头囊(cephaliccapsule)的宽度评估幼虫阶段。未达到第一龄的幼虫被视为死亡。与评估的转基因事件在遗传上非常相似的非转基因甘蔗品种可以用作测定对照。
为了表征事件在实验室中控制目标害虫D.saccharalis的功效，用CTC91087-6事件(两个物候阶段，110和220DAP)的植物组织进行叶盘测定。以非转基因甘蔗CTC9001作为对照(WT)。实验设计是完全随机的，每个处理有四个重复(每个重复112个新生虫)。当比较常规品种(CT79-TC)和CTC91087-6事件在用叶盘喂养7天后，平均观察到96％(df＝4；P<0.0001)的死亡率。另外，基于头囊宽度的测量，观察到100％的存活个体没有发育到第1龄期以后，证明在用转基因事件喂养后，D.saccharalis的发育受到高度抑制(图17)。
对于网室生物测定，将转基因事件的幼苗种植在网室苗圃中，其中将植物种植在与自然环境条件相似的土壤中，但为受控的环境，防止自然侵染的发生。至少每20或30天进行5次侵染，每分蘖含有20-35个D.saccharalis卵。将所有被感染的茎秆采收并纵向切开，以量化损害，进行评估。侵染强度的计算方法是将有损伤的节间数除以节间总数，结果乘以100(侵染强度)。计算有效损害百分比，考虑昆虫造成损害的节间总数除以地块中评价的总茎数。
进行网室试验，以表征CTC91087-6事件与其亲本品种CTC9001(WT；非转基因)相比，在随机块设计中控制螟虫攻击的功效，有4组重复。每个实验地块由8丛甘蔗植株组成，每15天接受10次约30个D.saccharalis卵的人工侵染。8个月后，计算两个品种的侵染强度(II)和有效损害量。CTC91087-6事件在控制侵染和损害中的相对功效通过公式[100-(事件II＊100)/WT II均值]来计算。
在人工侵染下，相比于其非转基因亲本品种CTC9001(WT)，CTC91087-6在控制D.saccharalis侵染方面的相对效力高于99.6％，在控制茎秆损伤(长度)方面的相对效力高于99.9％。D.saccharalis对CTC91087-6茎秆造成的损害明显可见地低于常规甘蔗CTC9001(图18)。在CTC91087-6和非转基因品种CTC9001之间，在所评价的两个参数中都存在统计学差异(t检验，P＜0.05)(df＝16；P＜0.0001)，表明在D.saccharalis大规模侵染下，该事件抑制了害虫造成的损害。
在甘蔗常规生产上，当侵染强度低于3％时，D.saccharalis被认为是受控制的(Gallo等人，2002)。对于CTC91087-6，侵染强度低于0.01％，加强了事件对其主要目标害虫的控制效果。
除了采用使用人工侵染的生物测定来观察D.saccharalis的侵染程度和造成的损害外，还可以基于直接从种植CTC91087-6的田间收集的信息来观察侵染和损害百分比。例如，可以通过定义实验区域进行茎秆取样切割，并计量节间有损害和无损害的数量来计算侵染强度(II)，而得到自然侵染评价。
在为开发本发明的事件而进行的试验中，计算了四个实验区的侵染强度(II)：Piracicaba、Barrinha和Valparaiso(SP)和Quirinópolis(GO)。常规品种CTC 9001(亲本；非转基因)被用作对照。该测定说明了事件CTC91087-6与亲本品种(CTC9001)相比对D.saccharalis侵染的抗性：在所有四个实验区中，与亲本品种(CTC 9001＝WT)相比，观察到CTC91087-6植物的侵染强度更低(合并分析；图16)。
在描述了优选实施例之后，应该理解，本发明的范围包括其他可能的变化，并且仅受所附权利要求的内容限制，包括其可能的等同物。
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Claims (42)

1.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少14个连续的核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少15个连续的核苷酸。
3.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少16个连续的核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13。
6.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸。
7.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少15个连续的核苷酸。
8.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少16个连续的核苷酸。
9.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:22。
13.包含正向引物和反向引物的引物对，其中正向引物包括SEQ ID NO:6且反向引物包括SEQ ID NO:7，或正向引物包括SEQ ID NO:8且反向引物包括SEQ ID NO:9。
14.一种检测来自事件CTC91087-6的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且
e)检测扩增产物的存在。
15.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
16.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物由包含选自SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
17.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。
18.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一个引物对由包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
19.权利要求14的方法，其中正向引物包含SEQ ID NO:6且反向引物包含SEQ ID NO:7，或正向引物包含SEQ ID NO:8且反向引物包含SEQ ID NO:9。
20.权利要求14的方法，其中扩增产物包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
21.权利要求14的方法，其中扩增产物的检测是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
22.一种检测来自事件CTC91087-6的转基因甘蔗的材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针，其设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组的序列的14个或更多个连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；并且
e)检测探针的实际杂交。
23.一种检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC91087-6)的转基因甘蔗的材料的试剂盒，其包含用于检测多核苷酸的存在的工具，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18和/或SEQ IDNO.19的至少14个连续的核苷酸和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述工具包含设计成与包含选自SEQ ID NO:22和SEQID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合的引物对，其中至少一对引物包含选自由SEQ ID NO.23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述工具包含含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。
26.基因构建体，其包含SEQ ID NO:1。
27.权利要求26的基因构建体，其包含SEQ ID NO:14。
28.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
29.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
30.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，其中所述植物是抗虫的。
31.来自权利要求28的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19。
32.权利要求28的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养物。
33.从权利要求32的组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
34.来自权利要求28的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子的用途，其中这样的用途意在再生植物、生产种子、种植植物田或加工制造植物产品。
35.一种商品产品，由权利要求28的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。
36.一种产生事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括以下步骤：
a)将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有草铵膦的培养基中选择含有功能片段的经转化细胞；以及
e)再生经转化的甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
37.权利要求36的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
38.一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是权利要求28的植物，并由此生产子代甘蔗植物。
39.一种由权利要求38的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和来自所述植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
40.一种制造事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，以产生事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中所述转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有提高的抗虫性。
41.一种培育CTC91087-6事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括在包含昆虫侵染的条件下种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中，与在相同条件下种植的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。
42.一种事件CTC91087-6的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
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