CN1146455A - 核黄素的纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵后肉汤中回收和纯化核黄素的方法。还公开了一种(进一步)纯化已从发酵后肉汤中回收并根据需要经用无机酸处理、过滤和用水洗已纯化到一定程度的核黄素的方法。本发明的进一步的方面是加入无机酸将发酵后肉汤的pH值调到大约5至7以取代加热步骤。
Description
本发明涉及回收和纯化发酵得到的核黄素的方法。
如众所周知，核黄素(维生素B2)具有有价值的保键、医药(如抗脚气病)和生长促进性质，因而被广泛地用作食品和饲料添加剂。其也可用作食品的黄色着色剂。另外，已知可用合成方法及各种不同的发酵方法，特别是可经在适当的营养培养基中培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)而产生之。依据适当的包括分离/回收和纯化步骤在内的特定生产方法，可使此得到的核黄素满足某些质量要求，例如用于动物饲料中，但不能满足其他应用，特别是用于人类食品中。然而在过去，尽管广泛深入地研究了合成后或发酵后分离/回收及纯化方法，却一直没有达到适于其预期使用目的预期质量。
本发明的目的是提供回收和纯化以发酵方法产生的核黄素的方法，即回收和纯化发酵已达到令人满意的程度，最好是发酵完成后存在于所谓发酵肉汤(所说的肉汤下文称为“发酵后肉汤”)中的核黄素的方法，该方法可使核黄素产物至少达到适于预期应用目的之可接受的质量。
本发明提供了从发酵后肉汤中回收和纯化核黄素的方法，其特征在于以下基本步骤：
(i)在大约45℃至120℃将所说的发酵后肉汤加热约10分钟至2小时，以进行巴氏灭菌，
(ii)将巴氏灭菌后的肉汤离心一次或多次，以得到主要由核黄素组成的产物，
(iii)在大约80℃至130℃温度下用无机酸水溶液将前述步骤得到的产物处理约30分钟至24小时和
(iv)从上述步骤的含水酸性介质中过滤收集核黄素并用水洗涤之，及选择性步骤：
(v)干燥前述步骤收集的洗过的产物，以提供达到实质性纯度的核黄素。
以这种方式回收并纯化的核黄素一般具有至少96％的纯度，并且在加适当的添加剂配制并加工如喷雾干燥后，其很适于在动物食物方面的应用。
本发明还提供了(进一步)纯化已从发酵后肉汤中回收并根据需要经用无机酸水溶液处理、过滤和用水洗后已纯化到一定程度的核黄素的方法，该方法的特征在于以下基本步骤：
(vi)从浓盐酸和水中结晶所说的核黄素，
(vii)从上述步骤的酸性介质中过滤收集固体核黄素并用水洗涤之，以及
(viii)干燥前述步骤收集的洗涤过的产物，以提供高纯度的核黄素。
用于以这种方式(进一步)纯化的，即包括前面指出的步骤(vi)、(vii)和(viii)的起始核黄素较好是用上文提到的包括步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)，并且还可包括步骤(v)的方法回收和纯化的。但其也可以只是在步骤(i)和(ii)之后得到的核黄素。产物是高纯度的，即纯度一般至少为98％，并且继后很适于人类使用，特别是用于食品和药物中。
可用任何适当方法完成用于产生将根据本发明的方法回收和纯化的核黄素的发酵过程本身。已知的发酵方法包括在适当的营养培养基中，通常在需氧条件下培养枯草芽孢杆菌(B.sabtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、flaveri假丝酵母(Candida flaveri)、丙酮丁醇酸菌(Clostridiumacetobutylicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)和Xylinus拟酵母(Torulopsis xylinus)。用于生产核黄素的实际发酵方法对本发明来说是无关紧要的。但就本发明方法的基本条件而言，优选的发酵产生核黄素的培养的微生物是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。无论使用什么发酵方法，确定发酵已达到满足的程度，特别是发酵完成的技术也是已知的，并且包括HPLC。
本发明方法的起始点是上文提到的了酵后肉汤。按照步骤(i)在大约45℃至120℃的温度范围将所说的肉汤加热大约10分钟至2小时。一般说来，为了以这种方式进行“巴氏灭菌”，需要高达120℃以上的温度，和短至约10分钟的时间。在这些条件下加热和巴氏灭菌的作用是失活前面发酵后余留的微生物，防止过度的肉汤自溶并且在长时间里维持或造成相对低的肉汤粘度，从而使继后的离心(步骤(ii)能够更加容易和有效地进行。在加热期间，较好在大约50℃至70℃的较窄的温度范围内进行加热，有利地搅拌发酵后肉汤。将加热期间限制在少于大约45分钟也是优选的条件。虽然在加热步骤(i)前无需改变发酵后肉汤的pH值，但必要时可经加入适当量的无机酸较好是浓盐酸或硫酸将其调整到大约5至7的范围。这种酸化作用的目的是与加热的目的一样的，并且事实上甚至可替代加热步骤(i)。
下一步骤，即步骤(ii)包括一次或多次离心已经过巴氏灭菌的发酵后肉汤。在将肉汤移入离心装置的正常过程中，根据需要可以包括在室温下的中间存放过程，肉汤将受到相当程度的冷却，特别是可冷却到大约40℃至20℃的温度。但这种冷却并不是必需的，并且不必采取特殊手段来完成这一冷却过程。但在开始(第一次)离心之前较好使肉汤的温度保持在上述温度范围之内。该肉汤是固体核黄素和生物量在含有来自前述发酵的溶解的营养物质，盐等的含水培养基中的悬浮液形式的。
离心本身是用于从较稀的生物量中分离较浓的核黄素，从而在重复离心之间将分离的较稠层常规悬浮在去离子水中以进一步离心。每次离心之后，所分离的较稠层均比前次离心富集更多的核黄素。如果进行一次以上的离心，则加到从离心管中分离的固体(核黄素)层中以进一步离心的去离子水的量一般约为所说分离的或排放的固体层重量的2至6倍。如上文所指出的，所离心的核黄素、生物量和含水介质之混合物的温度不是严格的，并可在大约15℃至大约80℃范围内，但在单次离心或几次离心的第一次期间，实践中这一温度一般约为20℃至40℃。在继后的离心期间，所离心之混合物的温度较好为室温。就用于离心的相对离心力(RCF)来说，单次或第一次离心的RCF范围一般约为2500xg至3000xg，较好约为2600xg至2800xg。继后的离心较好在RCF大约600xg至750xg的范围内进行。适当的离心装置，特别是所谓离心滗析器如Flottweg ZILα和Flottweg Z18-3可从市场上购得并且完全适合于本使用目的；在这种装置中，为达到最佳效果，有关参数如转简和螺卷轴间的差速、溢流直径及原料和液体排放的流速可能是有所不同的。已发现，进行2-4次特别是3次离心，是可使核黄素材料在分离后达到足够的纯度，使之处在适宜的状态以便在后续加工步骤中进一步纯化。
在完成上述加工步骤(i)和(ii)例如经过3次离心后，所分离的核黄素材料一般可具有大约90％的纯度。
本发明方法的步骤(iii)包括在上述温度和时间条件下加热在先与无机酸水溶液一起离心后分离的核黄素，因而如步骤(i)一样，实际的加热方法不是重要的。但所说的加热是在大约6至10巴的压力下使用超加热的气流进行的。此外，加热温度高至大约130℃所需的时间可短至大约30分钟。已经确定了各种优选的加热温度范围与时间的组合，即于大约90℃至130℃加热大约30分钟至6小时，特别是于大约100℃至125℃加热大约1至3小时，以及于大约80℃至100℃加热大约8至16小时。在该处理步骤中，原则上可利用任何一种无机酸，如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸及这些酸的混合物，但较好是使用盐酸。无机酸水溶液中酸(如HCl)浓度一般约为0.1至2％(重量)，无机酸水溶液中核黄素的浓度一般约为3至10％(重量)。使核黄素与无机酸接触的实际技术一般包括将核黄素悬浮在水中，然后加入浓酸，或者将核黄素悬浮在较少的浓酸中并向悬浮液中加入水。所使用的水较好是去离子的。然后通常在搅拌下加热该悬浮液。
上述处理步骤(iii)的目的是水解作为不期望的杂质存在的生物量，从而将其转化成在含水无机酸中呈可溶形式的物质。同时，所存在的任何DNA也受到降解(水解)，并且高分子量杂质如蛋白质和多糖被分解并也被转化成可溶形式。在该加工步骤完成后核黄素仍以基本上未被溶解的形式存在。
在下一个处理步骤(iv)中，从含水酸性介质中分离出经过前述酸处理步骤后基本上已没有生物量和其他杂质的核黄素，并用水洗涤之。可在室温或高达125℃甚至可能高达约130℃的升高温度下用介质进行过滤。在完成前述酸处理步骤后直接进行过滤步骤(iv)，即在这两个步骤间不作任何冷却处理是很便利的，并且这确实代表了本发明的优选特征。还较好在大约70℃至90℃的温度范围下进行过滤，而不依赖于是否也在同样温度下进行前述酸处理步骤。根据滤器具(其对本发明不是重要的)的性质和其他因素的不同，过滤可进行大约3至4小时。在收集了核黄素之后，可以反复用水，最好是用去离子水洗涤，一般可在滤器上或将其悬浮在水较好是去离子水中过滤，并精滤。在任何洗涤过程中，洗涤水本身可以处于室温或更高温度，甚至高达约80℃。
如果要将核黄素配制成动物饲料或其添加剂，一般可进行干燥步骤(v)。这一干燥步骤一般在大约70℃至90℃，较好在大约80℃，在降低的压力下较好在大约60至30mmHg下进行。如上文所指出的，该阶段的核黄素一般有至少96％的纯度。但如果要进一步纯化核黄素，特别是要将其供人使用，可以删去干燥步骤(v)，以利于上文限定的其他三个处理步骤(vi)、(vii)和(viii)。
处理步骤(vi)包括从浓盐酸和水中结晶出有待进一步纯化的核黄素，并可于所选择的特定温度下将核黄素溶解在最小量，或至少不大于最小量太多的浓盐酸中，然后使核黄素在浓盐酸中制成的溶液与水较好是去离子水接触以促进核黄素沉淀，特别是结晶。所说的接触可经将溶液加入例如倒入水中而方便地完成。可于室温或更高温度如大约80℃下，但较好在室温下使核黄素溶解于盐酸中。盐酸浓度较好为大约25％至35％。必要时可向溶液中加入吸附剂活性碳和/或助滤剂如纤维素或硅藻土，然后在与水接触之前过滤之。核黄素的盐酸溶液对水的体积比一般在大约1∶5至1∶15范围内，较好为大约1∶7至1∶12。沉淀/结晶可适当地发生在大约20℃至95℃的温度，较好在大约80℃的温度条件下。
然后过滤由前述处理步骤得到的核黄素在含水酸介质中的悬浮液并按照处理步骤(vii)用水洗涤如此收集的核黄素。该过程可按上述步骤(iv)的相似的方法完成，但建议所用温度不超过大约40℃。过滤和洗涤较好用大约室温至40℃的介质来进行。
最后，干燥步骤(vii)中收集的核黄素(步骤(viii))。该步骤也是在如前所述的步骤(v)的相似条件下进行的。如此纯化的核黄素一般具有至少98％的高纯度，并可根据需要直接用来加工成食品或医药。
本发明的其他方面在于对上述包括步骤(i)至(iv)并且亦可包括(v)的方法的改变，这种改变包括用步骤(ia)增强或取代第一个步骤(i)，即加入适当量的无机酸如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸，较好是(浓)盐酸或硫酸，将发醇后肉汤的pH值调到大约5至7范围内。在加入酸过程中可适当地搅拌发酵后肉汤。
一般说来，各处理步骤可以分步进行，或者作为连续程序的一部分连续完成两个或多个步骤。后者的例子是不包括如上所述的中间冷却的连续酸处理和过滤步骤((iii)和(iv))。
借助下列实施例举例说明本发明。
实施例1
按已知方法使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)发酵生产核黄素。然后将发酵后肉汤于大约60℃加热约30分钟以进行巴氏灭菌。
用离心滗析器(Tanabe 23LL-V)离心一部分(约6,900L)发酵后肉汤。离心在相对离心力(RCF)为2,800xg，转筒和螺卷轴间的差速(DS-BS)为10rpm。且叶轮直径(ID)为240mm条件下进行。发酵后肉汤以2,700L/h的速度供入离心滗析器内。将固体排出物1(核黄素纯度：55.7％)送入下一个离心步骤进行加工处理。
在5KL发酵罐悬浮容器中用生产用水悬浮固体排出物1(约1，180kg)，得到3,330L悬浮液。搅拌30分钟后，以1,500L/h的速度将悬浮液供入离心滗析器。以2,800xg的RCF和10rpm的DS-BS及240mm的ID进行离心。将固体排出物2(核黄素纯度：76.9％)送入下一个处理步骤。
在5KL发酵罐悬浮容器中用生产用水悬浮固体排出物2(约740kg)得到3,330L悬浮液。搅拌30分钟后，将悬浮液以1,200L/h的速度供入离心滗析器。离心主要以1,630xg的RCF、8rpm的DS-BS和240mm的ID进行。固体排出物3称重为552kg，并具有72.6％的含湿量和87.4％的核黄素纯度。
将大约550kg核黄素浆液(固体排出物3)悬浮在4KL玻璃衬里的容器内的去离子水和盐酸中。将固体物和盐酸的浓度调整到3.9％(重量)固含量和0.6％(重量)HCl含量。将核黄素悬浮液加热到大约120-125℃，在搅拌下于该温度范围保持约60分钟，然后冷却到80℃。
使用橡胶衬里的离心机(Mitsubishi Krauss-Maffei，Peeler Cen-trifuge Type HZ125)过滤按前述步骤的经酸处理的悬浮液。于80℃用2,000L去离子水，再于20-30℃用200L去离子水洗核黄素滤饼，得到约190kg具有30.5％含湿量和97％核黄素纯度的湿“核黄素96％”。
在3KL混合容器中混合338L 35％盐酸和115L去离子水，并向此盐酸溶液中供入180kg湿“核黄素96％”。将混合物搅拌1小时。从容器中取样品溶液并证实核黄素的溶解。向混合容器中引入1kg活性碳(Takeda Shirasagi-A，50％湿度)并将溶液搅拌1小时。然后加入0.6kg助滤剂(Nippon Paper Industries KC-Floc，纤维素)并将混合物搅拌30分钟。将混合物从混合容器移入橡胶衬里的溶解溶器中进行过滤。
准备两个橡胶衬里的金刚石(Sparkler)滤器用于过滤。第一个滤器包含Toyo No.424滤纸，第二个滤器垫有Toyo NA10滤纸。然后用加压空气将橡胶衬里的溶解容器中的盐酸溶液供入Sparkler滤器中，并在储留罐中收集滤液。在进一步证实滤液中没有活性碳污染之后，将储留罐中的滤液转移到溶解容器中。然后将滤液转入滤液罐内。用加压空气将留在滤器中的溶液转入滤液罐内。用130L35％盐酸60L去离子水的混合物清洗溶解容器和滤器。还将过滤的洗涤溶液转入滤液罐内。从滤液罐中取样品溶液，不能检测到活性碳的污染。
将7,500L去离子水装入17KL玻璃衬里的结晶容器中并加热至78-82℃。将滤液罐中的核黄素的盐酸溶液以300-350L/h的流速倒入结晶器中，致使核黄素在热水中结晶。将混合物搅拌1小时，然后在不搅拌情况下使之冷却。在混合物的温度冷却至50℃后，经搅拌使混合物进一步冷却到40℃以下。
将1,300L去离子水装入2KL橡胶衬里的新浆液罐中。将结晶器中的核黄素浆液供入搅拌卸料滤器中。用去离子水洗过滤的核黄素并分离到新浆液罐中，并使滤液排放到废水处理厂。
用离心机(Mitsubishi Krauss-Maffei，Peeler Gentrifuge Type HZ125)以950rpm离心过滤除去悬浮的核黄素结晶并用500L去离子水冲洗之。在一容器中收集约140kg滤饼并移入10KL锥形干燥器中。
将核黄素的滤饼装入锥形干燥器内并在60-35mmHg压力下于68-72℃干燥8小时。然后将干燥器冷却到35℃以下并可在塑料袋中收集约90kg干粉末。将此产物称为“核黄素98％”。
分析结果：
表1中显示了核黄素96％和98％的纯度。经分光光度检测(E值＝328)重结晶核黄素的含量为100.2％。就杂质来说，从核黄素98％中除去6，7-二甲基-8-核糖基-2，4-二氧四氢蝶啶(DMRL)，而8-羟甲基核黄素则是在重结晶期间形成的。检测核黄素96％和98％中的光色素。根据光谱检测结果，按上述方法得到的核黄素98％比合成的核黄素98％含有较少杂质。核黄素98％的质量符合EP/BP和USP的说明书的规定。
表1
| 核黄素96％ | 核黄素98％ | |
| 纯度：分光光度检测HPLC | 97.2％97.0％ | 100.2％99.5％ |
| 杂质：DMRL8-羟甲基核黄素光色素 | 0.06％未测出0.10％ | 未测出0.14％0.11％ |
实施例2
使用枯草芽孢杆菌按已知方法发酵产生核黄素。将发酵后肉汤于大约60℃加热约30分钟以进行巴氏消毒，然后泵入肉汤储存罐作进一步加工处理。
以大约3.0m3/h的流速将肉汤连续加料于第一离心滗析器。以2,800xg的相对离心力(RCF)进行第一次离心。将从该离心滗析器排出的固体物送入浆液罐，并使用管线内混合器加生产用水再次制成浆液。然后以大约1.5m3/h的流速将浆液送入第二个离心滗析器。以700xg的RCF进行第二次离心。用生产用水将从第二个离心滗析器中排出的固体物重新制成浆液并以大约1.5m3/h的速度供入第三个离心滗析器。以700xg的RCF进行第三次离心。将第三步骤固体物与去离子水和35％盐酸混合并移入储存罐进行酸处理。从储存罐中泵出35％盐酸。将离心滗析器中的上清流层供入水相接受罐并排放到废水处理厂。
将含有3％固体物和0.7％HCl的核黄素浆液供入三个玻璃衬里的反应器。将浆液加热到125℃保持2小时并在反应器中冷却到80℃。然后将反应器中的浆液以大约2.5m3/h的流速供入连续的真空滤器。用热去离子水洗滤饼并收集于混合罐内。将滤液和洗涤水排放到废水处理厂。
再在混合罐中用去离子水将过滤的核黄素制成浆液(约65％湿度)并连续地送入装配有空气加热器、抽风机和螺旋进料器的喷雾型干燥器。以大约70kg/h的速度将干燥的产物收集到产物接受器中。将产物接受器中的产物“核黄素96％”送入包装系统并包装在散装袋或盒装袋容器中。
实施例3
在一次产生核黄素的发酵中，用枯草芽孢杆菌发酵48小时后，以蒸汽温度为120℃的蒸汽套加热器加热2000L发酵容器。以这种方式将发酵后肉汤加热45分钟达到60℃，在58-62℃范围内保持30分钟(巴氏灭菌)并在1小时时间内使之冷却到25℃。经巴氏灭菌的发酵后肉汤具有下述性质：
气味：微酸；颜色：桔黄；密度：1.037g/ml(20℃)；pH值：6.93(20℃)；核黄素滴度：18.45g/L(HPLC)。
在Flottweg ZILd离心滗析器上离心大约900L经巴氏灭菌的肉汤。完成巴氏灭菌后立即启动离心机。借助固定在发酵器上的大约0.5巴的压力将肉汤送入离心滗析器。调整参数设定(转筒和螺卷轴间的差速、溢水口直径、槽深度、干燥和集合体带、滗析器体积、液体排放流量和相对离心力)后，使滗析器以2600xg的RCF运转约30分钟，然后取固体和液体排出物样品进行分析。将液体排出物收集到400L搅拌容器中并加入28％氢氧化钠水溶液(液体排出物的11/20L)调到pH≥11。将溶液于碱性pH下保持30分钟，使液体排入废水处理厂并用工业用水彻底清洗该滗析器。
在此第一次离心后共得到61.4kg固体排出物(产物1)，并将此产物于4℃下储存过夜。
将第一次离心的产物(1)重新悬浮在装于400L容器内的去离子水中得到230L悬浮液，该悬浮液具有下列特征：
气味：微酸；颜色：桔黄；密度：1.028g/ml(于20℃)；pH值：7.45(于20℃)；粘度：2.28cSt(于20℃)；核黄素浓度：52.49g/L(HPLC)。
用Watson-Marlow 701S/R蠕动泵(硅管，内径φ：10mm，外径φ：15mm)将核黄素悬浮液泵入Flottweg ZLKd离心滗析器。调整参数标定值后使滗析器以650xg的RCF运转约15分钟，然后取固体和液体排出物样品进行分析。
收集液体排出物并按第一次离心时的相似方法处理。
该第二次离心后得到共45.6kg固体排出物(产物2)，并直接进一步处理该产物。
将产物2重新悬浮于去离子水中得到210L具有下列特征的悬浮液：
气味：微酸；颜色：桔黄；密度：1.021g/ml(于20℃)；pH值：8.21(于20℃)；粘度：1.37cSt(于20℃)；核黄素浓度：54.13g/L(HPLC)。
用Watson-Matlow 701S/R蠕动泵(同上所述)将核黄素悬浮液泵入Flottweg ZILd离心滗析器中。调整参数标定值后，使滗析器以650xg的RCF运转大约15分钟，然后取固体和液体排出物样品进行分析。收集液体排出物并按前述离心的相似方法处理之。
该第三次离心后得到共36.4kg固体排出物(产物3)。
使用包括最佳值在内的不同离心滗析器参数设定值，重复进行上述离心的结果如下列表2中所示：
表2
| 离心后分离的核黄素 | 第一次离心 | 第二次离心 | 第三次离心 | 总过程 |
| 核黄素的产率核黄素的纯度物料通过量 | 96.8％59.7％132l/h | 97.6％86.5％114l/h | 99.1％91.3％114l/h | 93.5％91.3％- |
从发酵后肉汤中回收并按上述方法经三次离心纯化后得到所谓“90％核黄素”，然后按实施例1(从第5段)和2(从第2段)所述的相似方法完成酸处理(iii)、过滤和冲洗(iv)、结晶(vi)、过滤和冲洗(vii)及干燥(viii)步骤，以根据需要得到“核黄素96％”和/或“核黄素98％”。
实施例4
用发酵后肉汤以实验室规模进行两次对照实验。第一次实验(A)中，用25％盐酸将发酵后肉汤酸化到pH5，但不加热，然后回收核黄素；第二次实验(B)中将发酵后肉汤于大约60℃加热约30分钟(巴氏灭菌)，然后回收产物。
每种情况下均将1L发酵后内汤以1100xg的RCF离心5分钟(在带有甩平式转子258-963的Mistral 6000离心机上，以2，000rpm离心)。弃去上清液，伴随搅拌15分钟将固体较浓厚物料(沉淀物)重新悬浮在去离子水中。然后将如此得到的核黄素以630xg的RCF离心5分钟(在同样离心机上，1500rpm)，弃去新的上清液并将沉淀再悬浮于水中。以这种方法进行最后一次(第三次)离心后，在真空中将所得到的沉淀物于80℃干燥20小时，然后粉碎并于这些条件下继续干燥4小时。
在每个阶段检测有关产物的产率和纯度：取2ml核黄素悬浮液于110℃真空干燥30分钟以确定经干燥的残留物的重量，并取10ml核黄素悬浮液分析核黄素浓度(纯度)。
下列表3中给出了这些实验的结果：
表3
| 第一次离心：核黄素产率纯度第二次离心：核黄素产率纯度第三次离心：核黄素产率纯度总回收率：核黄素产率纯度 | 实验 | |
| A | B | |
| 95％50％99％78％100％89％95％89％ | 96％54％100％84％99％94％95％94％ | |
从发酵后肉汤中回收并按上述方法经三次离心纯化后得到所谓的“90％核黄素”，然后根据需要按实施例1(从第5段)和2(从第2段)中所述的相似方法，经酸处理(iii)、过滤和冲洗(iv)、结晶(vi)、过滤和冲洗(vii)及干燥(viii)步骤，得到“核黄素96％”和/或“核黄素98％”。
实施例5
将133g“核黄素90％”(30g核黄素、3g生物量、100g水)、120ml1M盐酸和440ml去离子水混合成含5％固体物的悬浮液。加入50μl辛醇作为消泡剂。在以300rpm搅拌下将浆液于100℃加热10分钟。由地在加热到100℃期间核黄素结晶的形状改变，所以当浆液的粘度增加时须将搅拌速度降低至75rpm。然后将浆液移入蒸汽容器并于120-125℃加热60分钟。将核黄素浆液冷却到80℃后于滤纸(Machery omd Nagel 713，φ90mm)上真空过滤。于80℃用300ml去离子水洗涤滤饼。用300ml去离子水使核黄素重新浆化。搅拌下将浆液于80℃加热15分钟。然后在滤纸上于80℃真空过滤核黄素浆液。用300ml温度80℃的去离子水洗滤饼。于80℃真空干燥所得到的核黄素并粉碎之。如此得到的称为“核黄素96％”的核黄素产物一般具有至少96％的纯度，并且是高质量的。
实施例6
在室温下搅拌10分钟使30g“核黄素90％”溶解在105ml 25％盐酸(3.5ml/g核黄素)中。加入0.9g Norit SX2活性炭。溢大约8分钟将溶液加热到80℃，然后于该温度保持20分钟。在顶部有1.0gClarcel的双层滤纸(Machery and Nagel 713，φ40mm)上真空过滤热溶液。根据所用“核黄素90％”的质量，过滤时间为10-70分钟。在80℃搅拌下以2ml/分钟的流速将滤液(约117m1)导入840ml(为所用酸的8倍体积)去离子水中。5和10分钟的加入核黄素的晶种。当核黄素沉淀完全时，再于80℃将结晶体浆液搅拌30分钟。然后在60分钟内将浆液冷却到大约25℃。真空下在滤布(DACRON DA-50)上过滤核黄素浆液。用300ml去离子水洗滤饼，然后再用300ml去离子水制成浆液并于23℃下搅拌15分钟。真空下在滤布上过滤核黄素浆液并用300ml去离子水再用300ml甲醇(FLUKA puriss.)洗滤饼。在真空烘箱中80℃干燥所得到的核黄素，使之达到恒重并粉碎之。如此得到的称为“核黄素98％”的核黄素产品一般具有至少98％的纯度，并且有特别高的质量。
实施例7
在室温下搅拌10分钟，将30g“核黄素90％”溶解在105ml 25％盐酸(3.5ml/g核黄素)中。经大约8分钟将溶液加热到80℃并在此温度下保持20分钟。在真空下，于双层滤纸(Machery and Nagel 713，过滤时间可以是1-6分钟。80℃搅拌(300rpm)下，将滤液(约121ml)以2ml/分钟的流速导入840ml(为所用盐酸8倍体积)去离子水中。5和10分钟后加入核黄素的晶种。当核黄素沉淀完全时，再于80℃将结晶体浆液搅拌30分钟。然后在60分钟之内将浆液冷却到大约25℃。真空下在滤布(DACRON DA-50)上过滤浆液。用300ml去离子水洗滤饼后，再用300ml去离子水制成浆液并于23℃搅拌15分钟。在滤布上真空过滤核黄素浆液并用300ml去离子水，再用300ml甲醇(FLUKA puriss.)洗滤饼。在真空烘箱中80℃干燥所得到的核黄素达到恒重并粉碎之。如此得到的称为“核黄素98％”的核黄素一般具有至少98％的纯度，并且有特别高的质量。
实施例8
将90.4g“核黄素90％”(30.74g核黄素、34％杂质和56.3g水)悬浮在120ml 1M盐酸和460ml去离子水中，并向悬浮液中加入50μl消泡剂辛醇。搅拌下将总混合物于100℃加热30分钟，然后在蒸汽容器中于120-125℃加热60分钟。
将悬浮液冷却到80℃并在过滤瓶中通过Machevy and Nagel(MN)713滤纸(φ90mm)过滤收集结晶。在用300ml去离子水(80℃)洗过如此收集的核黄素结晶后将其重新悬浮在300ml去离子水中，并在搅拌下将悬浮液于80℃加热15分钟。然后按前述方法滤出结晶，于80℃用300ml去离子水洗，于80℃真空干燥20小时，并在粉碎后继续真空干燥2小时。
以这种方法得到29.07g有近100％纯度的“核黄素96％”，其产率约为95％。
实施例9
搅拌10分钟使30.0g干燥的“核黄素90％”(92.8％纯度)溶解在105ml 25％(W/V)盐酸中，之后加入0.9g Norit SX2活性炭。将混合物于80℃搅拌20分钟。然后在过滤瓶中通过覆盖有1.0gClarcel的双层MN713滤纸(φ40mm)过滤该混合物。
搅拌下将滤液以2ml/分钟的流速加到840ml去离子水(80％)中，并加入核黄素晶体作为晶种。出现核黄素沉淀后，再将所得悬浮液搅拌30分钟，然后在60分钟内冷却到25℃。
使用Dacron DA-50滤布(φ90mm)的过滤瓶内的悬浮液中滤出核黄素结晶，并于20℃用300ml去离子水清洗之。于20℃在300ml去离子水中将如此收集的核黄素重新制成浆液，再次滤出结晶并按前述方法清洗，然后再用300ml甲醇洗。
于80℃真空干燥如此收集并洗过的核黄素至恒重后，以大约93％的产率得到几乎有100％纯度的25.1g“核黄素98％”。
实施例10
经3步骤离心后分离“核黄素90％”并在生产装置中与去离子水和盐酸混合。将如此得到的悬浮在稀酸溶液中的核黄素的各种样品于室温下储存于储存罐中。从储存罐中取各样品溶液用于涉及本发明的酸处理和过滤步骤(步骤(iii)和(iv))的实验。在每种情况下，均将核黄素在稀盐酸中制成的浆液在大气压下，在分液瓶中搅拌下于90℃和120℃加热一定时间，然后用热水洗经过过滤的热的(没有冷却)，收集的固体物，于80℃真空干燥约12小时并检测如此得到的“核黄素96％”的纯度。下列表4中给出了由本发明方法的该分批处理步骤(iii)和(iv)所得到的有关数据及结果。
表4
| 实验序号 | 测得的“核黄素90％”的纯度 | 酸处理的条件 | 测得的“核黄素96％”的纯度 | |||
| 固体物浓度(％重量) | 稀盐酸浓度(％重量) | 温度(℃) | 时间(小时) | |||
| ABCDEFGHI | 87.487.487.489.889.889.892.792.792.7 | 6.356.356.356.196.196.196.066.066.06 | 1.11.11.10.90.90.90.80.80.8 | 9090120909090909090 | 8101121416101214 | 96.296.297.496.096.496.896.396.596.8 |
实施例11
在根据本发明方法步骤(iii)和(iv)的连续酸处理和过滤程序进行的另一组实验中，将“核黄素90％”浆液在浓度为0.8％(重量)的稀盐酸中的各样品以72ml/小时的速度输入加热瓶中，在其中以90℃加热，然后仍以72ml/小时的速度连续输入第二个加热瓶并在该烧瓶中以90℃加热一段时间。不经冷却，以72ml/小时的流速将第二个烧瓶的加热的内容物连续移入过滤单元并进行热过滤。最后，用热水洗收集的固体物，在真空下80℃干燥约12小时并检测如此得到的“核黄素96％”的纯度。下列表5中给出了由该连续酸处理和过滤步骤得到的有关数据和结果：
表5
| 实验序号 | 测得的“核黄素90％”的纯度 | 酸处理的条件 | 测得的“核黄素96％”的纯度 | |
| 固体浓度(％重量) | 在两烧瓶中的总加热时间(小时) | |||
| ABCDE | 92.790.391.391.391.3 | 5.796.195.665.665.66 | 1414121314 | 97.096.396.796.797.3 |
Claims (11)
1.从发酵后肉汤中回收的和纯化核黄素的方法，其特征在于下列基本步骤
(i)于大约45℃至120℃将所说的发酵后肉汤加热大约10分钟至2小时以进行巴氏灭菌，
(ii)将如此巴氏灭菌的肉汤离心一次或多次以得到主要由核黄素组成的产物，
(iii)用无机酸水溶液于大约80℃至大约130℃的温度将上述步骤的产物处理大约30分钟至24小时和
(iv)经过滤从前述步骤的含水酸介质中收集核黄素并用水洗涤之，以及选择性步骤：
(v)干燥前述步骤收集的洗过的产物，以提供有实质性纯度的核黄素。
2.(进一步)纯化已从发酵后肉汤中回收并且根据需要用无机酸水溶液处理、过滤及用水洗涤已纯化到一定程度的核黄素的方法，该方法的特征在于以下基本步骤：
(iv)从浓盐酸和水中结晶所说的核黄素，
(vii)经过滤从前述步骤的酸介质中收集固体核黄素并用水洗涤之，以及
(viii)干燥前述步骤中收集和洗涤过的产物，以提供高纯度的核黄素。
3.根据权利要求2的方法，其中欲如此纯化的核黄素是从发酵后肉汤中回收并以权利要求1的方法纯化的。
4.根据权利要求2的方法，其中欲如此纯化的核黄素是从以权利要求1的处理步骤(i)和(ii)发酵后肉汤中回收的。
5.根据权利要求1的方法，其中通过加入适当量的无机酸将发酵后肉汤的pH值调到大约5至7这一步骤而增强或取代步骤(i)。
6.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中欲被回收和/或纯化的核黄素是已经过培养微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)而发酵产生的。
7.根据权利要求1和3至6中任何一项的方法，其中步骤(i)是于大约50℃到70℃的温度范围将发酵后肉汤加热少于约45℃分钟而进行的。
8.根据权利要求1和3至7中任一项的方法，其中步骤(ii)包括三次离心。
9.根据权利要求1、3和5至8中任一项的方法，其中步骤(iii)是于大约90℃至130℃的温度范围内用无机酸水溶液将步骤(ii)的产物处理大约30分钟至6小时，特别是于大约100℃至125℃的温度范围处理大约1至3小时而完成的。
10.根据权利要求1、3和5至8中任何一项的方法，其中步骤(iii)是于大约80℃至100℃的温度范围用无机酸水溶液将步骤(ii)的产物处理大约8至16小时而完成的。
11.根据权利要求1、3和5至10中任何一项的方法，其中步骤(iv)是在完成前面的步骤(iii)后，于这两个步骤之间没有经过冷却而直接完成的。
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