CN114644920B - 一种具有自检测功能的纳米探针及其制备方法和生物医学应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有自检测功能的纳米探针及其制备方法和生物医学应用，其中，所述纳米探针由两嵌段聚合物DSPE‑PEG2000与有机小分子通过疏水相互作用自组装形成，所述有机小分子的化学结构式为本发明提供的纳米探针具有稳定性好，光热转换效率高，具有pH和粘度双响应的特性，在肿瘤的微酸环境下，有机小分子LET‑1052内氮原子质子化会导致位于1052nm处吸收峰的增加，实现1064nm激发下的光热治疗，肿瘤细胞死亡后，会引起细胞内粘度的增加，有机小分子LET‑1052分子内旋转受阻，使其位于680nm处的荧光得到增加，利用其荧光的增加程度可以反映细胞死亡程度，进而用于评价光热治疗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，特别涉及一种具有自检测功能的纳米探针及其制备方法和生物医学应用。
背景技术
癌症是人类疾病中的重要问题，也是导致人类死亡的主要原因，极大地增加了公共卫生负担。尽管有许多可行的肿瘤治疗策略，但由于肿瘤的异质性，癌症患者对不同治疗策略表现出不同程度的反应。癌症治疗效果的早期评估对癌症患者有很大的好处，包括识别治疗效果的程度，减少无效治疗的毒副作用，最重要的是，为更有效的替代治疗争取时间，从而实现癌症患者的定制治疗，同时节省医疗费用。
目前肿瘤治疗的评价标准主要是通过医用影像学，如磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)来测量肿瘤大小的变化。但这种方法一般需要治疗后数周观察肿瘤体积缩小情况。基于活检的生物标志物检测是监测癌症治疗效果的另一种方法，但它也存在一些缺点，如需穿透皮肤等组织的侵入式采样方式以及采样点的随机性导致的易出错等。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有自检测功能的纳米探针及其制备方法和生物医学应用，旨在解决现有技术缺少可以用于评估癌症治疗效果的纳米探针的问题。
本发明的技术方案如下：
一种具有自检测功能的纳米探针，其中，所述纳米探针由两嵌段聚合物DSPE-PEG2000与有机小分子通过疏水相互作用自组装形成，所述有机小分子的化学结构式为
一种具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，包括步骤：
提供化学结构式为的有机小分子；
将所述有机小分子和两嵌段聚合物DSPE-PEG2000溶于有机溶剂中，逐滴加入到超声搅拌的水溶液中，滴加完后，再超声搅拌15-30min，随后，在氮气流下除去有机溶剂，得到混合溶液；
将所述混合溶液通过滤膜过滤后离心浓缩，得到所述纳米探针。
所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述有机小分子的制备包括步骤：
将2-苯基吲哚和乙酰氯加入到乙酸酐中，搅拌加热至40-60度，反应4-8h后，再加入N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐，搅拌加热至50-70度，反应6-10h，冷却至常温后，加入乙醚，过滤，滤饼通过硅胶柱分离提纯，得到所述有机小分子，记为LET-1052。
所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述2-苯基吲哚与乙酰氯的摩尔比为1:0.4-0.6。
所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述2-苯基吲哚与N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐的摩尔比为1:0.2-0.3。
所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述有机小分子与两嵌段聚合物DSPE-PEG2000的质量比为1：(5-40)。
所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
一种具有自检测功能的纳米探针的应用，其中，将所述纳米探针用于癌症光热治疗效果评估。
有益效果：本发明提供的纳米探针由两嵌段聚合物DSPE-PEG2000与有机小分子通过疏水相互作用自组装形成，所述有机小分子的化学结构式为本发明的纳米探针具有稳定性好，光热转换效率高，具有pH和粘度双响应的特性，在肿瘤的微酸环境下，有机小分子LET-1052内氮原子质子化会导致位于1052nm处吸收峰的增加，实现1064nm激发下的光热治疗，肿瘤细胞死亡后，会引起细胞内粘度的增加，有机小分子LET-1052分子内旋转受阻，使其位于680nm处的荧光得到增加，利用其荧光的增加程度可以反映细胞死亡程度，进而用于评价光热治疗的效果。有机小分子LET-1052可同时实现以下两点，第一、肿瘤微酸环境诱导的光热治疗的开启，第二、光热治疗导致肿瘤细胞死亡，利用位于680nm处荧光变化程度可即时反映细胞死亡程度，进而用于评价光热治疗的效果，所以该探针具有自检测功能。
附图说明
图1为本发明纳米探针用于癌症光热治疗效果评估的原理图；
图2为本发明具体的实施例中有机小分子LET-1052的合成路线图；
图3为本发明具体的实施例中探针的合成路线图；
图4为本发明具体的实施例中纳米探针的粒径分布图；
图5为本发明具体的实施例中探针在不同pH的磷酸盐缓冲液中的吸收光谱图；
图6为本发明具体的实施例中探针在不同粘度的溶液中的荧光光谱图；
图7为本发明具体的实施例中探针在不同pH的磷酸盐缓冲液中的体外光热升温图；
图8为本发明具体的实施例中不同温度下，经探针孵育后的4T1细胞的NIR-I区荧光成像图(a)和强度变化(b)图；
图9为本发明具体的实施例中探针孵育后的4T1细胞，经1064nm激光器照射不同时间后，不同通道下共聚焦细胞荧光成像图(a)，以及荧光强度变化(b)图；
图10为本发明具体的实施例中荷瘤小鼠经不同条件处理后，在1064nm激光照射下的实时红外热成像照片(a)以及对应的光热升温曲线(b)；(c)利用自检测策略的荧光变化和传统观察瘤体积变化监测光热治疗效果的示意图；(d)不同条件处理后的肿瘤生长曲线；经1064nm激光器照射不同时间下，NIR-I区荧光成像图(e)和荧光强度变化(f)图。
具体实施方式
本发明提供一种具有自检测功能的纳米探针及其制备方法和生物医学应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种具有自检测功能的纳米探针，其中，所述纳米探针由两嵌段聚合物DSPE-PEG2000与有机小分子通过疏水相互作用自组装形成，所述有机小分子的化学结构式为
具体来讲，本发明提供的所述纳米探针具有稳定性好，光热转换效率高，具有pH和粘度双响应的特性。如图1所示，在肿瘤的微酸环境下，有机小分子LET-1052内氮原子质子化会导致位于1052nm处吸收峰的增加，实现1064nm激发下的光热治疗，肿瘤细胞死亡后，会引起细胞内粘度的增加，有机小分子LET-1052分子内旋转受阻，使其位于680nm处的荧光得到增加，利用其荧光的增加程度可以反映细胞死亡程度，进而用于评价光热治疗的效果。因此，本发明将所述有机小分子与两嵌段聚合物DSPE-PEG2000自组装形成的纳米探针可实现以下两个功能：第一、肿瘤微酸环境诱导的光热治疗的开启；第二、光热治疗导致肿瘤细胞死亡，利用位于680nm处荧光变化程度可即时反映细胞死亡程度，进而用于评价光热治疗的效果，所以该探针具有自检测功能。
在一些实施方式中，还提供一种具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其包括步骤：
提供化学结构式为的有机小分子；
将所述有机小分子和两嵌段聚合物DSPE-PEG2000溶于有机溶剂中，逐滴加入到超声搅拌的水溶液中，滴加完后，再超声搅拌15-30min，随后，在氮气流下除去有机溶剂，得到混合溶液；
将所述混合溶液通过滤膜过滤后离心浓缩，得到所述纳米探针。
在本实施例中，所述有机小分子的制备包括步骤：将2-苯基吲哚和乙酰氯加入到乙酸酐中，搅拌加热至40-60度，反应4-8h后，再加入N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐，搅拌加热至50-70度，反应6-10h，冷却至常温后，加入乙醚，过滤，滤饼通过硅胶柱分离提纯，得到所述有机小分子，记为LET-1052。
在一些实施方式中，所述2-苯基吲哚与乙酰氯的摩尔比为1:0.4-0.6。
在一些实施方式中，所述2-苯基吲哚与N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐的摩尔比为1:0.2-0.3。
在一些实施方式中，所述有机小分子与两嵌段聚合物DSPE-PEG2000的质量比为1：(5-40)。在该比例范围内得到的纳米探针具有良好的分散性和稳定性。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷，但不限于此。
在一些实施方式中，还提供一种具有自检测功能的纳米探针的应用，其中，将所述纳米探针用于癌症光热治疗效果评估。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
有机小分子LET-1052的合成
有机小分子LET-1052的合成：如图2所示，2-苯基吲哚(4mol，772mg)和乙酰氯(2.2mol，172mg)加入到乙酸酐(30mL)中，搅拌加热至55度，反应5h后，再加入N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐(1mol，340mg)，搅拌加热至60度，反应8h后，冷却至常温后，加入乙醚(60mL)，过滤，滤饼通过硅胶柱分离提纯，得到所需有机小分子LET-1052。
实施例2
纳米探针的合成
图3为合成纳米探针的路线图，具体方法为：将有机小分子LET-1052(1mg)和两嵌段聚合物DSPE-PEG2000(20mg)溶于二氯甲烷(1mL)，逐滴加入到超声搅拌的水溶液(5mL)中，滴加完后，再超声搅拌15min，随后，在氮气流下除去二氯甲烷。随后用聚醚砜(PES)滤膜(0.22μm)过滤，再使用30kD的超滤管在3500rpm转速，离心15min，用去离子水洗涤3次。得到所需探针。图4是纳米探针的粒径分布图。
实施例3
探针体外pH和粘度响应性研究
首先配置不同pH的磷酸盐缓冲液，探针加入其中后，稳定20min，再进行吸收光谱的测定。图5为探针在不同pH的磷酸盐缓冲液中的吸收光谱图。pH响应性原理为：LET-1052分子内氮的质子化，会导致分子内形成推拉电子体系，引起1052nm处吸收值的增加和641nm吸收值的下降。
配置不同粘度的溶液是通过调节甲醇溶液中甘油的体积比，甘油的比例越大，代表溶液的粘度越大。图6为探针在不同粘度的溶液中的荧光光谱图。随着溶液粘度的增加，探针位于684nm处的荧光强度逐渐增大。以上结果表面探针具有pH和粘度双响应的特性。
实施例4
探针体外光热性能的研究
分别配置不同pH的溶液(pH分别为5.0、6.4、7.4、8.0、9.0)，加入相同体积的探针溶液，使用1064nm激光器，用热成像仪监测溶液的升温效果。图7为探针在不同pH的磷酸盐缓冲液中的体外光热升温图。随着溶液pH值的下降，样品的升温效果越明显。以上结果表明随着探针所在的微环境酸性的增加，探针的光热效果越好。
实施例5
探针在细胞水平的粘度性能表征
4T1细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中，并置于37度、5％CO2条件下培育12h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入相同浓度探针的培养基溶液。继续培养2h后，吸出96孔板中的旧培养基，用PBS冲洗2次。细胞分成3等份，分别放置在不同温度(37度、25度和4度)下30min。随后放在共聚焦显微镜下观察。图8为不同温度下，经探针孵育后的4T1细胞的NIR-I区荧光成像图(a)和强度变化(b)图。随着孵育温度(37度、25度和4度)的下降，4T1细胞经探针孵育后在680nm处的荧光强度逐渐增加，这是因为温度下降，细胞质的流动性下降，粘度增大，从而引起荧光强度的增加。以上结果表明探针可以用于细胞水平的粘度检测。
实施例6
探针在细胞水平的粘度性能随光照时间变化的表征
4T1细胞接种到96孔板中，并置于37度、5％CO2条件下培育12h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入20μM探针的培养基溶液。继续培养6h后，吸出96孔板中的旧培养基，用PBS冲洗2次。细胞分成4等份，每一等份含有细胞数为5×105，使用1064nm激光器(1.0W cm-2)照射不同时间(0、2.5、5、10min)，将光照后的细胞离心，弃去上清液，加入用100μL含10μL的FITC和10μL PI的缓冲液，重悬细胞，室温孵育15分钟，随后再加400μL缓冲液，离心5min，加入500μL缓冲液重新悬浮细胞。离心2min弃去上清液，分别加入500μL 4％多聚甲醛的缓冲液中，再悬浮细胞，室温孵育15min后离心，去除上清液，在500μL添加有1％牛血清白蛋白的缓冲液中重新悬浮细胞。随后离心5min，用4μL缓冲液和12μL甘油重悬细胞。将8μL的细胞悬液置于玻片上，放在共聚焦显微镜下观察。
图9为探针孵育后的4T1细胞，经1064nm激光器照射不同时间后，不同通道下共聚焦细胞荧光成像图(a)，以及荧光强度变化(b)图。4T1细胞经探针孵育，1064nm激光器照射不同时间后，共聚焦细胞荧光成像结果表明随着光照时间的增加，细胞死亡程度逐渐增加，同时荧光强度逐渐增加。以上结果表明光热效果的增加会引起细胞死亡程度增加，细胞整体粘度增大。
实施例7
探针用于动物肿瘤的早期光热治疗效果的监测
雌性Balb/c裸鼠(六周,20-25g)，在裸鼠腿皮下注射2×106 4T1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，使用1064nm激光器进行光热治疗，用热成像仪监测肿瘤组织的升温情况。光照不同时间(0、2.5、5、10min)后，立即利用小动物成像仪观察肿瘤区域的荧光变化。对于治疗实验，荷瘤小鼠随机分为六组：(1)空白组(PBS)；(2)空白组(PBS+激光照射10min)；(3)静脉注射探针(LET-1052+激光照射0min)组；(4)静脉注射探针(LET-1052+激光照射2.5min)组；(5)静脉注射探针(LET-1052+激光照射5min)组；(6)静脉注射探针(LET-1052+激光照射10min)组，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积，同时监测小鼠的体重变化，并按照公式V＝AB2/2计算肿瘤体积(Tumor volume)，其中A是肿瘤的长径，B是肿瘤的短径(mm)。每次测量结果均通过处理前的起始肿瘤体积归一化。
图10为荷瘤小鼠经不同条件处理后，在1064nm激光照射下的实时红外热成像照片(a)以及对应的光热升温曲线(b)。(c)利用自检测策略的荧光变化和传统观察瘤体积变化监测光热治疗效果的示意图。(d)不同条件处理后的肿瘤生长曲线。经1064nm激光器照射不同时间下，NIR-I区荧光成像图(e)和荧光强度变化(f)图。
相对于未注射探针的荷瘤小鼠，注射探针的实验组，1064nm激光器照射荷瘤小鼠肿瘤部位，肿瘤处温度可升至52.9度。同时利用1064nm激光对肿瘤区域照射不同时间来代表光热治疗的程度。从14天的肿瘤生长曲线可以得出，照射10min的实验组对肿瘤的生长有最好的抑制效果并能够完全消除且没有复发。同时，从NIR-I区小动物荧光成像，可以得出随着1064nm激光器照射时间的增加，肿瘤部位荧光强度也逐渐增大，这是因为光照时间增大即光热效果越好，肿瘤细胞死亡程度随之增多，肿瘤部位粘度增大引起NIR-I区荧光强度的增加。由此证明探针不仅可以实现在肿瘤微酸环境下NIR-II区1064nm照射下光热治疗的开启，而且还可利用分子本身粘度响应的特性实现对光热治疗效果的评估。
综上所述，本发明提供的纳米探针通过简单的合成方法，可大量制备，该探针具有良好的pH和粘度响应性，良好的光热稳定性。探针可以用于肿瘤酸性微环境开启的NIR-II区光热治疗，光热治疗引发的肿瘤细胞死亡后，引起肿瘤处粘度的增加，具有粘度响应特性的探针可利用荧光强度的变化反映光热治疗的效果。因此，该探针利用自检测策略实现了肿瘤光热治疗的早期评估。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种具有自检测功能的纳米探针，其中，所述纳米探针由两嵌段聚合物DSPE-PEG2000与有机小分子通过疏水相互作用自组装形成，所述有机小分子的化学结构式为
2.一种具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，包括步骤：
提供化学结构式为的有机小分子；
将所述有机小分子和两嵌段聚合物DSPE-PEG2000溶于有机溶剂中，逐滴加入到超声搅拌的水溶液中，滴加完后，再超声搅拌15-30min，随后，在氮气流下除去有机溶剂，得到混合溶液；
将所述混合溶液通过滤膜过滤后离心浓缩，得到所述纳米探针；
其中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
3.根据权利要求2所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述有机小分子的制备包括步骤：
将2-苯基吲哚和乙酰氯加入到乙酸酐中，搅拌加热至40-60度，反应4-8h后，再加入N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐，搅拌加热至50-70度，反应6-10h，冷却至常温后，加入乙醚，过滤，滤饼通过硅胶柱分离提纯，得到所述有机小分子，记为LET-1052。
4.根据权利要求3所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述2-苯基吲哚与乙酰氯的摩尔比为1:0.4-0.6。
5.根据权利要求3所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述2-苯基吲哚与N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环戊烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐的摩尔比为1:0.2-0.3。
6.根据权利要求2-5任一项所述具有自检测功能的纳米探针的制备方法，其中，所述有机小分子与两嵌段聚合物DSPE-PEG2000的质量比为1：(5-40)。
7.一种如权利要求1所述具有自检测功能的纳米探针的应用，其中，将所述纳米探针在制备癌症光热治疗试剂中的应用。
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