CN107737945B - 一种复合纳米金颗粒的合成方法及应用 - Google Patents

一种复合纳米金颗粒的合成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机‑无机杂化材料技术领域，公开了一种复合纳米金颗粒及其制备方法和在肿瘤诊断和治疗中的应用。所述复合纳米金颗粒以阳离子分子刷型水溶性共轭聚合物为模板通过静电作用吸引氯金酸并进一步用盐酸羟胺还原得到性质稳定且呈单分散状的复合纳米金颗粒。通过调整氯金酸的用量可控制复合纳米金颗粒的粒径。本发明中合成的金纳米颗粒具有近红外的吸收，因此在诊疗一体化即光声成像指导下的光热治疗方面表现出巨大的潜力；结合其粒径有利于在肿瘤循环、富集、渗透，易代谢及生物毒性小等特性，可将该类金纳米颗粒推广到最终的临床应用。

Description

一种复合纳米金颗粒的合成方法及应用
技术领域
本发明属于有机-无机杂化纳米材料技术领域，尤其涉及一种以阳离子分子刷型水溶性共轭聚合物为模板合成不同粒径纳米级金颗粒的方法及应用。
背景技术
模板法是控制合成纳米结构材料的方法中最重要的技术之一。利用这个强大的工具使用预先存在的具有所需纳米特性的模板直接形成纳米材料，否则很难获得。一般情况下，模板法合成的纳米材料均具有明确的大小、形状和结构，这通常受益于模板的导向效果。模板法虽然具有众多优点，但尚存的问题也亟需得到解决。例如，硬模版法合成低维聚苯胺材料的后处理工艺繁琐，常需要使用强酸、强碱或有机溶剂去除模板，这不仅增加了工艺流程，而且容易破坏纳米结构和性能等。所以现在亟需开发一种便利的、温和的、生物相容性和具有成本效益的纳米颗粒制备方法。
近十年来，癌症已严重威胁人类健康，对癌症的早期诊断和高效治疗是科研工作者长期以来研究工作的热点和难点。在目前的临床实践中，肿瘤的诊断与治疗仍为两个相对独立的过程。这样延长了疾病诊断-治疗的周期，也增加了患者的风险。
光热疗法(PTT)是一种新开发的癌症治疗策略，它利用吸收近红外(NIR)光能产生的热来杀死癌细胞。而且PTT具有高的特异性，更微创，并颇有成效。光热治疗(PTT)是近年来发展的一种治疗肿瘤的新技术。其过程是，光热治疗剂选择性的富集于肿瘤病灶部位，然后用激光对其进行照射，光热疗剂吸收光能转变为热，使肿瘤部位温度升高，从而杀死癌细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前已经有很多报导显示光热疗在活体治疗中取得了良好的效果。相比于传统的化疗和放疗，PTT的优势主要有：1.激光可以选择性照射肿瘤部位，避免了全身效应，达到微创治疗；2.当局部温度达到42℃以上时，癌细胞会因蛋白质变性、DNA合成和修复的削弱、细胞内含氧量或pH值降低等因素的影响而导致死亡，且肿瘤细胞比正常细胞对温度更敏感，从而在一定温度范围内可以选择性杀死癌细胞而正常细胞不受影响；3.非侵入性。在光热治疗过程中，激发光的种类和光热疗剂的作用至关重要。一般来说，人们更多的会选择近红外光(650-1064nm)去激发，主要是因为近红外光组织穿透性强，光毒性低，是肌体组织的安全透射窗口。
高效的治疗自然离不开精确的诊断，光声成像是一类新兴的、很有前景的生物成像技术，近年来正在引起越来越多的关注。顾名思义，光声成像是以光为发射信号，以声波为反馈信号进行的成像过程，结合了光学成像和超声成像的优势。用光声效应进行生物成像是一个富有挑战性的领域，交叉融合了物理学、光学和声学、化学和材料科学、生物医学、工程学等多个学科。目前广泛接受的光声效应产生机理是光-热-声机理。具体过程如下：首先，材料吸收光能产生热量；然后，材料温度升高，体积会随之膨胀；光照停止后，材料冷却收缩。当用周期性的脉冲光源去照射材料时，材料会随着光的变化而周期性膨胀-收缩，造成周围压强波动性变化，这样就产生了声波。光声成像利用近红外与声波在生物组织中的低吸收、低散射，与荧光成像相比组织穿透深度深，最高可达7cm；利用光学成像的高对比度，与超声波成像相比图像的分辨率、信噪比高；同时光声成像与X射线、PET成像相比，对生物体几乎不造成损伤，是一种比较理想的成像手段。所以，对于病患开发诊疗一体化的复合探针具有很重要的临床意义。
由于有机-无机杂化后其各种优异的性能和在生物医学各领域的潜在应用已经受到各方广泛的关注。到目前为止，纳米金颗粒的合成已经十分成熟，但其需要严格的反应条件，例如要在高温下反应。因此，必须开发一种简易的、温和的、生物相容性和具有成本效益的战略。
本发明提供了一种阳离子型共轭聚合物为模板，用温和、简易的方法合成复合纳米金颗粒的过程及该纳米金颗粒在用于治疗癌症领域的用途，该金纳米颗粒，由于其在近红外区仍有较强吸收可以作为光热剂应用于光热治疗和通过光声成像进行疾病的精确诊断。
发明内容
针对现有技术合成纳米金颗粒中存在的问题，本发明提供了一种在简易的、温和的条件下以分子刷型水溶性共轭聚合物为模板通过静电作用进一步用盐酸羟胺还原得到的性质稳定且呈单分散的纳米金颗粒的制备方法及其应用，它在近红外区域有较强的吸收，表现出极高的光热转化效率，有效提高光热治疗的效果，并可用于光声成像进行疾病的诊断。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明提供一种复合纳米金颗粒的制备方法，所述复合纳米金颗粒是以PFNBr为模板通过静电作用吸引氯金酸并进一步用盐酸羟胺还原得到性质稳定且呈单分散状的复合纳米金颗粒，且所述复合纳米金颗粒的粒径为30nm左右。
所述制备方法包括如下步骤：
1)聚合物PFNBr(聚[9,9-二辛基芴-9,9-(双(3'-(N,N-二甲基)-N-乙基铵)丙基芴)]二溴)溶液的配置：将PFNBr聚合物配置成水溶液；
2)以氯金酸HAuCl4为原料，调节溶液的PH在8-9，使其以离子状态存在；
3)将配置好的的PFNBr水溶液和氯金酸溶液共混搅拌反应；
4)向混合液中加入还原剂溶液并搅拌；
5)反应完全后，用离心分离获得产物，4℃冰箱保存。
上述步骤1)中，聚合物PFNBr溶液的浓度为1mg/mL。
上述步骤3)中，搅拌反应为常温下2小时。
上述步骤4)中，所述还原剂为盐酸羟胺，且所述盐酸羟胺溶液的浓度为0.4mg/mL，搅拌反应为37℃下20小时。
上述制备方法中，通过调节氯金酸的用量可以控制复合纳米金颗粒的粒径。
上述制备方法中，以水溶性、稳定性及生物相容性都较好的阳离子共轭聚合物(PFNBr)作为模板，所述PFNBr是由两部分组成，低比例的刚性骨架(聚芴)和高密度的柔性侧链(聚甲基丙烯酸甲酯衍生物)，低比例的芴骨干埋在柔性侧链保持稳定的光学性能，同时带有密集阳离子电荷的多支侧链会产生显著的承载负电荷的能力。采用该单分散型阳离子聚合物作为模板其优点在于：1、与最常用于合成无机材料的模板CTAB相比其毒副作用极小可以忽略、2、从空间拓扑结构角度出发本聚合物在水溶液中不聚集很稳定、3、与碘甲烷和丙磺酸内酯反应得到了阳离子非常丰富的阳离子分子刷，有卓越的承载阴离子的能力。
本发明还提供上述复合纳米金颗粒在肿瘤诊断和治疗领域的应用。上述复合纳米金颗粒在近红外区域有较强的吸收，可用于光热治疗和光声成像。
该复合纳米金颗粒因纳米尺寸所具有的EPR效应，易于富集、渗透在肿瘤部位，通过光声成像可以用于肿瘤的诊断；该复合纳米金颗粒的光热效应使得其可用于光热治疗。
通过试验可知，通过本发明获得的复合纳米金颗粒PAP在进行光声成像时，可以检测到纳米金的最低浓度限为0.01mg/mL，且随着PAP浓度的增加，光声信号线性增加，范围为0.01-1mg/mL。同时，其光热效应方面，和相同大小的金纳米粒子在相同浓度(0.1mg/mL)相比，复合纳米颗粒可以在五分钟内从30℃升温到40℃，增加将近10℃。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明复合型纳米金颗粒，由于引入了无毒，稳定的阳离子分子刷聚合物作为模板并通过温和的方法合成，产物除具有传统纳米金颗粒易代谢，生物毒性小等特性外，其在近红外的吸收得到了提高其有利于它在光声成像以及光热治疗方面的应用。
2)本发明复合型纳米金颗粒，将光声成像与光热治疗结合在一起，其中光声成像为光热治疗提供了可靠的影像依据，便于选择合适的治疗时间与治疗方案。在有效提高光热治疗准确性的同事，又提高了治疗效率，而且该复合纳米金颗粒因纳米尺寸所具有的EPR效应，易于富集、渗透在肿瘤部位。这样，不仅提高了诊断的效率，而且加快了光声成像与光热治疗诊疗一体化的进程。
3)本发明制备的复合纳米金颗粒的性质稳定、水溶性和生物相容性良好、粒径分布均匀。
4)本发明的制备方法简单易操作，条件温和，可控性强。
5)本发明复合型纳米金颗粒相比于相同粒径的传统纳米金颗粒光热转化效率提高了。
附图说明
图1为本发明实施例1中，聚合物PFNBr为模板通过静电作用合成复合纳米金颗粒的过程及其应用的示意图；
图2为本发明实施例1中聚合物PFNBr和不同粒径的复合纳米金的透射电镜(TEM)图；
图3为本发明实施例2中不同照射功率下对复合纳米金颗粒的光热治疗的影响图；
图4为本发明实施例3中复合纳米金颗粒与相同粒径的传统金颗粒Au的紫外可见吸收谱图；
图5为本发明实施例3中复合纳米金颗粒PAP与相同粒径的传统金颗粒Au在体外光声成像和光热治疗的直观对比；
图6为本发明实施例4中复合纳米金颗粒PAP的MTT；
图7为本发明实施例3中复合纳米金颗粒PAP不同浓度条件下与光声信号的关系；
图8为本发明实施例5中复合纳米金颗粒PAP通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，监测随时间变化光声信号的改变；
图9为本发明实施例5中复合纳米金颗粒PAP通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，一段时间后光热治疗的效果图和升温曲线；
图10为本发明实施例5中光热治疗后，荷瘤小鼠肿瘤体积的变化和小鼠体重的变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1
如图1所示，本实施例的复合纳米金颗粒的具体合成方法如下：
1)聚合物PFNBr的溶液的配置：精确称取5mg PFNBr，加入5mL超纯水超声使之完全溶解；
2)在3ml的超纯水中加入50μl的HAuCl4水溶液(1w/v％)，再用0.1mol/L的氢氧化钠调节混合溶液的PH在8-9；
3)在2)的基础上分别加入50μl、70μl或90μl的1)中配好的1mg/L的聚合物，混合液在25℃下混合2h；
4)随后加入0.5ml羟胺盐酸水溶液(0.4mg/mL)，在37℃下搅拌20h；
5)将制备好的复合纳米金颗粒溶液分别于3000Rpm、5000Rpm下梯度离心，除去过大的纳米颗粒和过多的氯金酸。最后收集第二次的离心产物，并用超纯水分散，4℃冰箱储存备用。
使用透射电子显微镜(TEM)观察PFNBr和制得的复合纳米金颗粒：
将复合纳米金粒子分散液滴加到300目涂覆有碳的铜网上、空气中干燥后使用透射电子显微镜观察复合纳米金的粒径，粒径分布较均匀。
TEM研究提供了有效的证据，说明复合纳米金颗粒的粒径可以通过调节氯金酸的量来简单控制。图2是本实施例中聚合物PFNBr和因氯金酸用量不同获得的复合纳米金颗粒的TEM图像(a为PFNBr，b为加入50μl氯金酸获得的复合纳米金颗粒，c为加入70μl氯金酸获得的复合纳米金颗粒，d为加入90μl氯金酸获得的复合纳米金颗粒)，其显示出了PFNBr和不同大小的复合纳米金颗粒，尺寸分别在27，33，45和52nm左右。
实施例2
实施例1中复合纳米金颗粒的光热效应测试：
将实施例1中的纳米金颗粒(33nm)配成0.5mg/mL的溶液，并以PBS缓冲液作为空白对照。将上述配好的溶液(3mL)加入比色皿中，用波长为808nm的一系列的辐射功率照射5min。功率分别为0.5W/cm2、1W/cm2、1.5W/cm2。如图3所示，空白对照蒸馏水在5min内升温约4℃，功率为1.5W/cm2的复合纳米金在5min内升温约22℃，可有效杀死肿瘤细胞，随着辐射功率的升高其升温效率随之增强。由此可见，本发明的复合纳米金颗粒具有较高的光热转化效率，且在短时间内达到有效杀死癌细胞的温度。
实施例3
实施例1中复合纳米金颗粒的光热吸收研究：
将相近纳米粒径的传统纳米金(30nm)和实施例1中的纳米金颗粒(33nm)分别配成0.1mg/mL的溶液，使用光谱仪测试其紫外可见吸收谱图，如图4所示。可看出本实施例的PAP在近红外仍有较强吸收。其用聚合物PFNBr为模板合成的纳米金颗粒的拖尾峰移向了近红外区，说明PAP相较于Au在光声成像和光热治疗方面更有应用价值。
实施例1中复合纳米金颗粒的光声成像性能：
将相近纳米粒径的传统纳米金(30nm)和实施例1中的纳米金颗粒(33nm)分别配成不同浓度的水溶液，并以PBS缓冲液为空白对照组，测试光声成像性能。
通过体外表征：配置不同浓度的纳米金水溶液，分别测试光声信号强度，如图7，发现可以检测到纳米金的最低浓度限为0.01mg/mL，且随着PAP浓度的增加，光声信号线性增加，范围为0.01-1mg/mL。
通过体外表征，如图5(a为体外PAP与相同粒径的同浓度传统金颗粒的光声信号图片，b为不同波长下PAP与相同粒径的同浓度传统金颗粒的光声信号曲线，c为体外PAP与相同粒径的同浓度传统金颗粒的光热信号图片，d为PAP与相同粒径的同浓度传统金颗粒随时间的变化温度的变化曲线)所示，相比于传统金颗粒，本实施例的复合纳米金颗粒可以作为优良的光声成像探针并具有优异的光热治疗疗效。
实施例4
实施例1中复合纳米金颗粒的细胞毒性测试：
将实施例1中的复合纳米金颗粒稀释成一定浓度梯度。先将Hela细胞接种在96孔细胞培养板上，接种量约为每孔0.5×104个细胞，孵育12h后，然后吸弃孔内培养基，加入不同浓度的复合纳米金颗粒200mL，继续培养4h，用波长808nm的二极管红外激光器在1.5W/cm2的辐射强度下照射5min，继续培养20h。对照组与实验组的区别在于不用红外激光器照射继续培养20h。用MTT体外细胞毒性来验证细胞的活性。如图6所示，所有样品在经红外照射的情况下不显示明显毒性。然而，毒性与纳米金的浓度呈依赖关系，当浓度为500mg/mL时细胞毒性最大。以上结果说明，通过本实施例方法制得的复合纳米金是无毒的，只有经过光照作用时，才具有光热杀死癌细胞的功能。
实施例5
实施例1中复合纳米金颗粒的光热治疗性能：
体外表征：将纳米金PAP用不同功率0.5W/cm2、1W/cm2、1.5W/cm2的近红外光照射，观察不同功率下的升温情况，如图3所示。
体内表征：将颗粒尾部静脉注射到小鼠体内，2h后用1.5W/cm2的808nm近红外光照射10min，每隔一天测量肿瘤的体积，称量小鼠的体重，如图10所示。
复合纳米金颗粒PAP注入荷瘤小鼠的肿瘤内后的光声成像，参见图8。从图中可看出，将一定浓度的PAP颗粒注入荷瘤小鼠体内后，随着时间变化，肿瘤区域的信号不断增强。当注入2h后，信号达到最强，说明这是材料在肿瘤部位达到了最大富集，这有利于精确定位肿瘤位置和对肿瘤完成最有效的治疗。
复合纳米金颗粒可实现光声成像指导下的高效光热治疗，参见图9。从图中可看出，该PAP颗粒尾部注射2h后，再用808nm的近红外光照射肿瘤区域10min，温度迅速升，且温差值达到40℃。
参见图10，荷瘤小鼠经过不同模式治疗17天后，肿瘤逐渐变小至最终消失，且效果优于只光照或只注射药物的模式。其中，A1和A2是颗粒通过原位肿瘤注入小鼠体内，经过治疗后半个月内肿瘤体积和小鼠体重的变化曲线。B1和B2是颗粒通过尾静脉注入小鼠体内，经过治疗后半个月肿瘤体积和小鼠体重的变化曲线。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考。以上示意性地对本发明创造及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明创造的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本专利的保护范围。

Claims (2)

1.一种复合纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，所述复合纳米金颗粒是以分子刷型水溶性共轭聚合物为模板，通过静电作用进一步用盐酸羟胺还原得到的性质稳定且呈单分散的纳米金颗粒；所述复合纳米金颗粒的粒径为33nm；其中，对于浓度为0.1mg/mL且直径为33nm的复合纳米金颗粒溶液，其对波长为700nm的光线的吸光度大于0.1；
所述方法包括如下步骤：
1)聚合物PFNBr(聚[9,9-二辛基芴-9,9-(双(3'-(N,N-二甲基)-N-乙基铵)丙基芴)]二溴)溶液的配置：将PFNBr聚合物配置成浓度为1mg/mL水溶液；
2)以氯金酸HAuCl4为原料，调节溶液的PH在8-9，使其以离子状态存在；
3)将配置好的的PFNBr水溶液和氯金酸溶液共混搅拌反应，搅拌反应为常温下2小时；
4)向混合液中加入还原剂溶液并搅拌，所述还原剂为盐酸羟胺，且所述盐酸羟胺溶液的浓度为0.4mg/mL，搅拌反应为37℃下20小时；
5)反应完全后，用离心分离获得产物。
2.一种如权利要求1制备的复合纳米金颗粒在肿瘤诊断和治疗领域的应用，其特征在于，上述复合纳米金颗粒在近红外区域有较强的吸收，可同时用于光热治疗和光声成像。
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