CN113975389B - 一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂及其制备方法与抗肿瘤的应用 - Google Patents
一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂及其制备方法与抗肿瘤的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂及其制备方法与应用。将荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子在溶液中混合，得到介孔Fe3O4‑荧光分子纳米粒子；再将介孔Fe3O4‑荧光分子纳米粒子、巨噬细胞共培养，得到巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂。利用磁共振、光热效应与治疗的功能，将光热治疗和多模态成像相结合，从而构建一种基于巨噬细胞负载介孔氧化铁（MFe3O4‑Cy5.5）纳米诊疗制剂。本发明构建巨噬细胞负载介孔氧化铁（MFe3O4‑Cy5.5）纳米诊疗制剂的方法简单，并且具备优异的生物相容性和较长的体内血液循环时间，能够应用到脑胶质瘤的诊断和治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学诊疗一体化领域，尤其是涉及一种多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的构建及其抗肿瘤应用。
背景技术
目前，癌症是世界上最致命的疾病之一，其中脑胶质瘤是最常见的颅腔内的神经系统肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的40-45%，因其恶性程度高、侵袭度强、术后复发率高，并且通过手术、放疗及化疗等综合治疗，患者的中位生存期任低于16个月，是一类非常危险的脑肿瘤。如果在早期治疗时能通过MRI准确区分脑胶质瘤，可以帮助临床医生进行诊断为手术提供有力的技术支撑。脑胶质瘤的MRI图像具有形状多变、结构复杂、灰度不均匀等特征，并且受患者的年龄，患病严重程度和其他因素等影响，导致脑胶质瘤的图像诊断受到影响。
脑胶质瘤的临床治疗的首选方法是外科切除，并且脑胶质瘤的切除程度与生存率有关。由于脑胶质瘤具有高度侵袭性，肿瘤细胞浸润到正常的脑组织使胶质瘤不能通过手术完全切除、切除处剩余肿瘤边缘被认为是胶质瘤复发的主要原因。肿瘤最大程度切除及神经功能最小化损伤是手术成功的关键，是胶质瘤患者的生存率的影响因素。因此，实时确定肿瘤边界、检测切除区域是很有意义的。术中磁共振成像（MRI）、荧光成像已经被引入来帮助区分肿瘤组织和的正常脑组织。手术过程中不可避免的脑移位会影响术前MRI及荧光成像的准确性。因此术中成像有助于明确肿瘤组织边界，最大限度地切除肿瘤降低复发风险，以及减少正常神经功能的损伤，有助于患者恢复。
光热治疗法(Photothermal therapy，PTT)是一种强有力的肿瘤治疗手段，利用近红外区域的光热转换试剂将光能转换成热能，引起肿瘤部位产生局部热能，引起细胞膜结构破坏以及细胞核内的DNA、RNA和蛋白质变性而造成肿瘤细胞的不可逆的损伤，进而达到杀死肿瘤细胞的效果。
基于纳米颗粒的多功能系统因其固有的优势克服了传统癌症诊断和治疗技术效率低的缺点，成为一种有效诊断和治疗癌症的新方法。其中，Fe3O4纳米粒子被FDA批准用于临床治疗，其本身具有良好的生物相容性、可降解性、磁靶向性、磁热性能，目前已广泛应用于生物医学领域的诊断和治疗。联合纳米技术和分子生物学的多功能纳米颗粒系统已经成为癌症早期诊断、实时成像和精确治疗的有力工具。理想的纳米诊疗一体化系统不仅要包含纳米粒子独特的物理、化学和医学特性，还要成为有效传递抗癌药物的智能载体，实现多模态成像和联合治疗效果。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂及其构建方法，其活性成分是超顺磁性介孔氧化铁偶联Cy5.5纳米粒子，拥有良好的吞噬介孔Fe3O4能力、靶向到脑胶质瘤的能力。利用磁共振、光热效应与治疗的功能，将光热治疗和多模态成像相结合，从而构建一种基于巨噬细胞负载介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂。本发明构建巨噬细胞负载介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂的方法简单，并且具备优异的生物相容性和较长的体内血液循环时间，能够应用到脑胶质瘤的诊断和治疗中。
本发明还提供上述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，该技术运用光热治疗和MRI/PA多模态成像技术的优点，操作简单、实用性强。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂，包括介孔Fe3O4纳米粒子、荧光分子及巨噬细胞；优选的，荧光分子为Cy5.5。本发明的巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂由介孔Fe3O4纳米粒子、荧光分子及巨噬细胞组成，可以通过血脑屏障靶向到脑胶质瘤后在肿瘤区域富集，在红外激光照射下产生良好的光热效应。本发明合成的介孔Fe3O4纳米粒子呈现球状，优选荧光分子为Cy5.5，巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂称为MFe3O4-Cy5.5。
本发明公开了上述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，包括以下步骤：将荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子在溶液中混合，得到介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子；再将介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子、巨噬细胞共培养，得到巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂。
上述技术方案中，荧光分子为Cy5.5，得到的介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子称为介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子；介孔Fe3O4纳米粒子为球状或者类球状结构，粒径为150-220 nm，优选180-190 nm。
上述技术方案中，荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子的质量比为4～6∶1，优选5∶1；溶液为PBS溶液；混合为避光下搅拌10～15小时，搅拌参数为常规技术，使两者分散即可。再将荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子在溶液中混合，然后经过脱盐柱，可到介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子；所述脱盐柱可以为PD10柱。
上述技术方案中，共培养在多孔板或者试管中进行；如：选择多孔板，巨噬细胞以4×103-6×103/孔，优选5×103/孔接种在多孔板上；如选择试管，巨噬细胞以4×106/孔～6×106/孔，优选5×106/管加入试管内；共培养20～30小时，再经过洗涤、离心，得到巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂。介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子以水溶液形式加入，浓度为0～250μg/mL，不包括0，优选为10～50μg/mL；具体培养条件为常规巨噬细胞的培养条件；巨噬细胞的来源也为常规技术。
有益效果
（1）本发明采用温和的反应条件制备了稳定巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂，该方法制备简单，具有产业化实施的前景。
（2）本发明合成的巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂具有良好的MRI/PA/optical imaging多模态成像效果，为多功能造影剂的研发奠定了良好的基础。
（3）本发明合成的巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂具有光热治疗性能，为治疗提供一种新方法。
（4）本发明合成的巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂具有穿透血脑屏障功能，为改善脑胶质瘤的治疗提供新方法。
（5）本发明所合成的介孔氧化铁纳米粒子可用于制备可实现体内多模态成像和光热治疗一体化的多功能纳米粒子，具有很高的实用价值。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明所制备的介孔Fe3O4纳米粒子形貌的TEM图（左）与SEM图（右）；
图2为本发明所制备的介孔Fe3O4纳米粒子超顺磁性验证图；
图3为本发明所制备的Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的体外成像性能及光热性能 不同浓度下Fe3O4-Cy5.5纳米粒子MRI成像性能图（A），不同浓度下Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的荧光成像性能图（B），不同浓度下Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的光声成像性能图（C），不同浓度下Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的光热性能图（D）和升温曲线图（E）；MFe3O4-Cy5.5细胞形态图（F）；
图4为本发明所制备的Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的细胞毒性和细胞成像性能 不同浓度Fe3O4-Cy5.5纳米粒子对巨噬细胞的细胞毒性图（A），巨噬细胞修饰不同浓度Fe3O4-Cy5.5纳米粒子后的MR成像性能图（B），不同孵育时间的巨噬细胞的MR成像性能图（C），巨噬细胞荧光成像及吞噬性能图（D），不同浓度Fe3O4-Cy5.5纳米粒子在巨噬细胞内的PA成像性能图（E）；
图5为本发明所制备的Fe3O4-Cy5.5纳米粒子对巨噬细胞迁移的影响图；
图6为本发明所制备的Fe3O4-Cy5.5纳米粒子与本发明所制备的巨噬细胞修饰的Fe3O4-Cy5.5的小鼠体内成像对比图（A），及随着时间延长磁共振信号强度对比图（B）；
图7为本发明所制备的Fe3O4-Cy5.5纳米粒子与本发明所制备的巨噬细胞修饰的Fe3O4-Cy5.5的小鼠体内荧光成像对比图；
图8为本发明所制备的MFe3O4-Cy5.5纳米粒子具体治疗方案（A），及治疗效果对比图（B），MFe3O4-Cy5.5纳米粒子与Fe3O4-Cy5.5纳米粒子体内光声成像对比图（C）；
图9为本发明所制备的MFe3O4-Cy5.5纳米粒子通过尾静脉注射经不同处理后 0、3、10天后大鼠脑进行磁共振图。
具体实施方式
本发明中，超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIONs）作为细胞标记造影剂，可以改变T2加权成像核磁共振成像中产生信号的弛豫时间。小分子荧光探针具有良好的光学性能和良好的生物相容性，在生物医学领域得到了广泛的应用，其中近红外荧光（NIRF）染料常用于活体光学成像。Cy5.5作为一种NIRF染料，由于其高荧光量子产率、高摩尔吸光指数和无光敏性而被广泛采用。但是，肿瘤血管化程度高，淋巴引流不畅。因此，通过增强通透性和滞留效应（EPR）往血管内注射纳米粒通自发地穿过血管到达肿瘤，这种方法实际上是无效的，在实体肿瘤中，只有不到2%的纳米粒到达肿瘤部位(B. Dalzon, et al. Nanoscale 11(19)(2019) 9341-9352.)。而且由于血脑屏障，纳米粒在到达神经胶质瘤的比例将会更低(Y.H.Bae, et al. J Control Release 153(3) (2011) 198-205.)。由于血脑屏障的存在，现有纳米颗粒到达胶质瘤的比例不高，本发明的原代巨噬细胞负载Fe3O4-Cy5.5靶向胶质瘤能够被趋化因子吸收到肿瘤组织中，通过多种医学成像技术的联合、优势互补，有望将精细的解剖结构和分子功能信息有机结合，实现精准的肿瘤的诊断与治疗。
为了使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述说明。但本发明保护范围并不有限于以下具体实施例。本发明涉及的原料都为常规产品，具体制备方法以及测试方法都为现有技术。
实施例1
介孔Fe3O4纳米粒子的合成与表征
2.16 g FeCl3•6H2O、4.7 g二水合柠檬酸三钠和1.8 g尿素依次加入到160 mL蒸馏水中，搅拌20 min得到澄清的溶液，随后加入1.0 g聚丙烯酰胺（PAM）；然后将其转移到200mL的水热釜中，置于烘箱中在200℃反应12 h，反应后得到的产物介孔Fe3O4纳米粒子，接着用乙醇和蒸馏水各洗三遍，最后分散在水中，置于4℃冰箱中保存，备用。
介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的制备
将Cy5.5(25mg)和介孔Fe3O4纳米粒子(5mg)水溶液加入PBS溶液(5mL)中，室温下避光常规搅拌12小时，然后过PD10柱，去除溶液中剩余的Cy5.5，再离心（1000 rpm，5 min）处理，得到介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子，最后分散在水中，置于4℃冰箱中保存，备用。
所制备的介孔Fe3O4纳米粒子用TEM、SEM进行表征，见图1，从表征结果显示所合成的产物介孔Fe3O4纳米粒子具有粗糙的表面，并且表面缝隙的存在说明介孔Fe3O4纳米粒子具有多孔结构，形貌类似为球状而且颗粒粒径较为均一，且粒径保持在190-200 nm。
介孔Fe3O4纳米粒子超顺磁性测试。取3 mL 介孔Fe3O4纳米粒子溶液于5 mL透明的玻璃瓶中，超声10 min，使其均匀分散，随后在玻璃瓶旁边放置一块长方形的磁铁，待10min后介孔Fe3O4纳米粒子全部被吸到玻璃瓶的一边（靠磁铁的一边），见图2所示，本发明所合成的介孔Fe3O4纳米粒子具有优越的超顺磁性，显示出很好的磁靶向性能。
介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子体外成像测试。将不同浓度的Fe3O4-Cy5.5分散在含有12wt%明胶去离子水中（0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 Fe mM/kg），按照浓度梯度整齐排列，置于3.0T MRI扫描仪中进行检测，其横向（r2）弛豫度通过8通道相控阵头线圈测量，结果如图3A所示。将不同浓度的Fe3O4-Cy5.5水溶液（0, 1.9，3.9，7.8，15.6，31.2，62.5，125 μg/mL）加入至EP管中，按照浓度梯度整齐排列，至于小动物成像仪成像，结果如图3B所示。采用MOST光声断层扫描成像仪测量不同浓度的Fe3O4-Cy5.5的PA成像性能，首先将不同浓度的Fe3O4-Cy5.5分散在质地均匀的琼脂糖凝胶中，浓度分别为0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60μg/mL、90 μg/mL、175 μg/mL，随后取出1 mL分装到1.5mL离心管中，上机进行光声扫描测量，测量结果显示（图3C），随着Fe3O4-Cy5.5浓度的上升，Fe3O4-Cy5.5的光声信号强度也逐渐增加，而且呈现明显的线性相关关系。
介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的光热转换性能测试。为了研究介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的光热效果，首先将材料依次配成浓度为 0、25、50、100、150、200 μg/mL Fe3O4-Cy5.5的水溶液。然后取300 μL配制好的溶液放置于300 μL的离心管中，接着使用功率密度为1W/cm2的808 nm激光器照射10 min，与此同时用近红外热成像相机记录溶液实时温度变化，如图3D、E所示，是不同浓度的介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子经功率密度为1 W/cm2的激光照射10min后的升温曲线，相对于空白对照组水，介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的加入可以促使溶液温度明显升高，说明该纳米粒子具有很好的光热效果。
在无菌条件下采集4周大SD大鼠股骨和胫骨的骨髓细胞，过滤并离心（1000 rpm，5min），然后用25ng/mL Recombinant Colony Stimulating Factor 1(MCSF)在DMEM中培养7天，用于以下实验。
实施例2 巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂
将巨噬细胞种在每孔5×103密度的96孔板上，然后在37℃下用5%二氧化碳培养24小时。接下来，加入200 μL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为10、25、50、100、150、200、250 μg/mL，不加Fe3O4-Cy5.5纳米粒子作对照组），继续培养24小时后，用PBS洗涤介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子，离心（1000 rpm，5 min）收集后，含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞（MFe3O4-Cy5.5）沉淀在管底。巨噬细胞的形态如图3F所示，显示巨噬细胞与25μg/mL Fe3O4-Cy5.5共培养24小时后的形态。看得出来大量介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子被细胞吞噬，细胞形态发生改变仍然完好无损。
为了研究介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子对巨噬细胞的细胞毒性，将巨噬细胞种在每孔5×103密度的96孔板上，然后在37℃下用5%二氧化碳培养24小时，接下来，加入200 μL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为10、25、50、100、150、200、250 μg/mL，不加Fe3O4-Cy5.5纳米粒子作对照组），继续培养24小时通过MTT测定法检测细胞活性，结果如图4A。
将200 μL不同浓度的介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为10、25、50、100、150、200、250 μg/mL，不加Fe3O4-Cy5.5纳米粒子作对照组）加入巨噬细胞（5×106每管）并在37℃下5% CO2中培养24小时。用PBS洗涤并离心收集后含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞在试管底部沉淀。核磁共振成像图像采集于3.0T临床MRI机上，结果如图4B。
将200 μL50μg/mL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液加入巨噬细胞（5×106每管）并在37℃下5% CO2中培养不同时间（0、0.5、1、2、4.5、9、12、24、36 h）。用PBS洗涤并离心收集后含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞在试管底部沉淀。核磁共振成像图像采集于3.0T临床MRI机上，结果如图4C。
将巨噬细胞种在每孔5×106密度的96孔板上，然后在37℃下用5%二氧化碳培养24小时。接下来，加入200μL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为10、25、50、100、150、200、250 μg/mL，不加Fe3O4-Cy5.5纳米粒子作对照组），继续培养24小时后，用PBS洗涤介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子，离心（1000 rpm，5 min）收集后，含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞沉淀在管底，加入4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，结果如图4D所示，4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核是蓝色的，Cy5.5是红色的。随着Fe3O4-Cy5.5纳米粒子的增加，红色面积增大，光强度增大，逐渐显示出除细胞以外的形态。这一结果表明，介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子被巨噬细胞吞噬，而不是附着到细胞膜或其他地方。
将巨噬细胞种在每孔5×106密度的96孔板上，然后在37℃下用5%二氧化碳培养24小时。接下来，加入200 μL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为10、25、50、100、150、200、250 μg/mL，不加Fe3O4-Cy5.5纳米粒子作对照组），继续培养24小时后，用PBS洗涤介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子，离心（1000 rpm，5 min）收集后，含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞沉淀在管底，利用多光谱光声层析成像系统（MSOT inVision 128；iThera Medical，德国）对不同浓度的介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子孵育的产品进行测试，并使用基于线性模型的反演方法重建图像，结果如图4E所示。
实施例3 介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子对C6细胞的迁移以及光热实验测试
将200 μL不同浓度的介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（分别为0、10、25、50、100、150μg/mL）加入巨噬细胞（5×106每管）并在37℃下5% CO2中培养24小时。用PBS洗涤并离心收集后含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞在试管底部沉淀。再分别以2×105每孔滤器的密度接种在Transwell上室内，使用与C6细胞培养48小时后从无血清培养基获得的条件无血清培养基（500 mL）填充下部隔室，然后在37°C、5%CO2下培养24小时；Transweall过滤器用PBS洗涤，然后用4%多聚甲醛固定20分钟，用PBS冲洗。粘附在Transwell过滤器上的细胞用0.1%结晶紫染色30分钟。接下来，再次用PBS清洗特兰斯韦尔过滤器。没有通过转基因过滤器迁移的细胞用棉签擦拭。用光学显微镜观察和计数迁移的细胞，参见图5，以迁移到新鲜的无血清DMEM的原始巨噬细胞作为对照，在对照组中观察到最小的迁移。当C6条件培养基(C6-CM)应用于底腔时，当共培养的Fe3O4-Cy5.5浓度为25μg/mL或以下时，对巨噬细胞定向的肿瘤细胞迁移影响不大，即使巨噬细胞与Fe3O4-Cy5.5共孵育，浓度高达100μg/mL，与0μg/mL相比，迁移率保持接近80%。
动物实验。被麻醉的雄性大鼠的头部被固定在立体定向注射器中。沿中线切开头皮，并使用直径1毫米的牙钻在距离前囟横向3毫米的颅骨上钻孔。使用50μL汉密尔顿注射器将1.5×105个C6细胞注入右尾状核，深度为5mm。注射结束10分钟后，针头被慢慢拔出；根据常规方法，在0、3、6、9天对大鼠进行MIR成像观察肿瘤变化，如能明显看到变大则建模成功。所有动物实验均在苏州大学（中国苏州）机构动物护理和使用委员会的指导下进行。
将200μL介孔Fe3O4-Cy5.5纳米粒子水溶液（25 μg/mL）加入巨噬细胞（5×106每管）并在37℃下5% CO2中培养24小时。用PBS洗涤并离心收集后含Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞在试管底部沉淀，记为负载Fe3O4-Cy5.5的巨噬细胞（MFe3O4-Cy5.5），用PBS 定容至1mL，用于以下动物实验。
实施例4 体内成像
造模10天后进行活体MR成像，观察模型大鼠肿瘤生长情况。8只成功构建的大鼠模型随机分为两组（每组4只），然后通过尾静脉注射1mL Fe3O4-Cy5.5或1mL MFe3O4-Cy5.5。尾静脉注射后，测量胶质瘤区域的磁共振信号强度变化。采用T2加权快速自旋回波序列对大鼠脑进行MRI扫描：TR=3000ms，TE=82ms，切片厚度=2mm，FoV=80×80。大鼠MRI扫描时间点为尾静脉注射后0、1、3、5天。结果见图6A；随着时间延长磁共振信号强度对比图参见图6B。
体内荧光成像。将8只成功构建的大鼠模型随机分为两组（每组4只大鼠），然后通过尾静脉注射Fe3O4-Cy5.5或巨噬细胞装载Fe3O4-Cy5.5（每只大鼠1×106 个），剂量为1mL(3mg/kg Fe)。尾静脉注射后，12小时后，处死大鼠并进行开颅手术，脑肿瘤采用全脑光学成像系统进行成像，成像结果如图7。
实施例5 MFe3O4-Cy5.5纳米粒子的光热治疗性能测试
为了探究本发明合成的MFe3O4-Cy5.5纳米粒子光热治疗的治疗效果，参照图8A的实验流程，将8只成功构建的大鼠模型随机分为两组（每组4只大鼠），手术去除可见的脑肿瘤，然后通过尾静脉注射1mL Fe3O4-Cy5.5或1mL MFe3O4-Cy5.5溶液，尾静脉注射后，第3天用808纳米激光（1 W/cm2）照射胶质瘤切除后的大鼠头部，脑肿瘤的照射时间控制为5分钟（称为PTT术）；第7天再通过尾静脉注射1mL Fe3O4-Cy5.5或1mL MFe3O4-Cy5.5溶液，尾静脉注射后，第9天用808纳米激光（1 W/cm2）照射胶质瘤切除后的大鼠头部，脑肿瘤的照射时间控制为5分钟（称为PTT术）。PTT术后，在不同时间通过MRI监测肿瘤体积，肿瘤体积的计算公式如下：肿瘤体积=长度×（宽度）2×π/6。
结果如图8B，与原肿瘤（切除后）相比，第3天和第10天通过尾静脉注射MFe3O4-Cy5.5纳米粒子的肿瘤体积显著减少，证明MFe3O4-Cy5.5+NIR具有抑制脑瘤的生长作用。相比之下，用NIR、Fe3O4-Cy5.5、Fe3O4-Cy5.5+NIR或MFe3O4-Cy5.5治疗的大鼠的脑瘤则没有生长抑制作用。
使用PACT系统(λex=800nm)对肿瘤区域进行成像，见图8C，Pre为第0天胶质瘤切除后的大鼠头部，Post为第1天尾静脉注射纳米药物后的大鼠头部。
将8只成功构建的大鼠模型随机分为两组（每组4只大鼠），手术去除可见的脑肿瘤（此时为Pre），然后通过尾静脉注射1mL Fe3O4-Cy5.5或1mL MFe3O4-Cy5.5溶液，尾静脉注射48小时后，用808纳米激光（1 W/cm2）照射胶质瘤切除后的大鼠头部；脑肿瘤的照射时间控制为5分钟。PTT术后，在不同时间通过MRI监测肿瘤体积，见图9。
现有技术为了提高MRI的影像对比度，常用的是顺磁性钆类对比剂（如钆喷酸葡胺），钆类对比剂在注射后会迅速分布在周围组织间隙，主要经肾脏排泄。钆类对比剂通过缩短组织的T1纵向弛豫时间增高T1加权图像上信号及亮度，增强正常组织与病变组织之间的分辨率，其自身不产生信号(Riccarda Delfino, et al. Toxicol Lett 301(1) (2019)157-167.)。但由于血脑屏障的阻隔，使得此类对比剂在脑内浓度较低。只有在血脑屏障受到肿瘤侵犯或其他药物作用时，才能通过血脑屏障分布在细胞外间隙，强化肿瘤组织信号。钆类对比剂呈现的强化区域只显示肿瘤的浸润范围及大体轮廓。但在临床治疗中发现少数脑胶质瘤，即便使用钆类对比剂后，其强化区域与肿瘤实际大小并不完全一致或吻合。其主要原因是由于肿瘤引起的瘤周水肿导致肿瘤与临近正常脑组织的信号对比不明显，使得钆类对比剂在肿瘤边界确定方面的准确性下降(Khairnar S, et al. J Med ImagingRadiat Sci 50(4) (2019) 575-589)。再有该类对比剂具有成像时间短，无靶向选择性，有可能导致肾源性系统性纤维化（NSF）及血脑屏障破坏等缺点。
本发明公开了一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂的构建及其抗肿瘤应用，首先在Fe3O4的表面修饰Cy5.5形成Fe3O4-Cy5.5纳米粒子，使用巨噬细胞负载Fe3O4-Cy5.5获得MFe3O4-Cy5.5复合物。合成的制剂具有磁共振、光声成像以及光热成像与光热治疗的功能，具有良好的生物相容性、可降解性，可以通过血脑屏障靶向到脑胶质瘤处实现精准靶向治疗。产品可用于光热治疗（PTT）、核磁成像（MRI）以及光声成像实现诊疗一体化。此外磁共振、光声以及光热成像联合的多模态成像手段，发挥各模态优势、弥补不足，实现对肿瘤部位的多模态精准成像与治疗一体化。综上所述本专利发明的一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁（MFe3O4-Cy5.5）纳米诊疗制剂具有优异的MRI/PA/PTT多模态成像和光热治疗的功能，实现肿瘤多模态成像和光热治疗的需求。
Claims (9)
1.一种巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂，其特征在于，包括介孔Fe3O4纳米粒子、荧光分子及巨噬细胞；介孔Fe3O4纳米粒子、荧光分子位于巨噬细胞内；所述介孔Fe3O4纳米粒子的制备方法为，2.16 g FeCl3•6H2O、4.7 g二水合柠檬酸三钠和1.8 g尿素依次加入到蒸馏水中，搅拌得到澄清的溶液，随后加入1.0 g聚丙烯酰胺；然后将其转移到水热釜中，置于烘箱中在200℃反应12 h，反应后得到的产物介孔Fe3O4纳米粒子。
2.根据权利要求1所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米制剂，其特征在于，荧光分子为Cy5.5。
3.权利要求1所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子在溶液中混合，得到介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子；再将介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子、巨噬细胞共培养，得到巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂。
4.根据权利要求3所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，荧光分子为Cy5.5；介孔Fe3O4纳米粒子的粒径为150 nm～220 nm。
5.根据权利要求3所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子的质量比为4～6∶1。
6.根据权利要求3所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，混合为避光下搅拌10～15小时。
7.根据权利要求3所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，将荧光分子与介孔Fe3O4纳米粒子在溶液中混合，然后经过脱盐柱，得到介孔Fe3O4-荧光分子纳米粒子。
8.权利要求1所述巨噬细胞负载的多功能介孔氧化铁纳米诊疗制剂在制备肿瘤诊疗制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
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