CN114644698A

CN114644698A - 水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用

Info

Publication number: CN114644698A
Application number: CN202011516664.5A
Authority: CN
Inventors: 梁彦; 王永红; 武小伟; 袁运栋
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN114644698B

Abstract

本发明公开了水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用。本发明提供了OsREM20蛋白或其相关生物材料在调控植物穗粒数和产量中的应用。本发明运用CRISPR‑Cas9的方法突变OsREM20基因，发现其能显著降低水稻的每穗粒数、每株粒数、单株产量(g)、一级枝梗数、株高、穗长；而过表达OsREM20基因则能够显著增加水稻的每穗粒数、每株粒数、单株产量(g)、一级枝梗数、株高、穗长。可见，OsREM20基因在调控水稻穗粒数和增产方面具有重要作用，本发明对于培育高产植物品种具有重要意义。

Description

水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，养育了全世界近半数的人口，水稻的产量直接关系着世界粮食安全。我国是世界上最大的水稻生产国及消费国，水稻的生产问题对我国的意义尤为重大。培育高产、稳产的水稻新品种，进一步提高我国水稻产量，将有助于保证我国粮食安全。

上世纪50年代，以半矮化育种为特征的第一次“绿色革命”，使得全世界水稻产量翻了一番。水稻植株的半矮化，显著提高了收获指数，解决了因大量施肥导致的植株倒伏和减产问题，促进水稻单产大幅度提高。二十世纪70年代，以杂种优势利用为代表的三系、两系杂交水稻的选育成功和大面积推广，使得水稻产量实现了第二次飞跃，为解决当时我国粮食安全问题做出了历史性的贡献。但在此之后相当长的时间内，水稻产量的提高就一直徘徊不前，进入了瓶颈期。近些年来，水稻分子遗传学家和育种家们合作，通过揭示和改良水稻产量的遗传基础，提出了培育具有无效分蘖少、茎秆粗壮抗倒伏、穗大粒多、产量高等理想株型(Ideal Plant Architecture,IPA)特征的水稻新品种，力求实现水稻产量的新飞跃。目前科学家利用分子设计育种技术，将若干产量调控的功能基因以最优组合方式聚合在一起，已经培育出一系列具备理想株型的水稻新品种，显著的提高了水稻产量。

水稻的产量是一个复杂的农艺性状，由每穗粒数、有效分蘖数、结实率和千粒重等因素所共同决定，而这些因素都与穗部性状紧密相关。在水稻的产量构成因素中，每穗粒数的变异幅度最大，对产量的贡献也最大，如何进一步提高水稻的穗粒数实现持续增产，一直是育种家们与分子生物学家所关注和研究的重点。近年来，揭示水稻穗发育的遗传基础，从分子水平上阐明穗粒数的调控机制已经成为水稻穗型遗传改良和高产育种相关理论研究的重要方向，已取得了很大的进展。

发明内容

本发明的目的是提供水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用。

第一方面，本发明要求保护OsREM20蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

P1、调控植物每穗粒数；

P2、调控植物每株粒数；

P3、调控植物单株产量；

P4、调控植物一级枝梗数；

P5、调控植物株高；

P6、调控植物穗长。

其中，所述相关生物材料可为能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达OsREM20的DNA，该DNA不但可包括启动OsREM20基因转录的启动子，还可包括终止OsREM20转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述OsREM20基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或Gateway系统载体等，如pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用ZmEREB167构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述OsREM20蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

上述应用中，所述OsREM20蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物的每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加。所述OsREM20蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物的每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小。

第二方面，本发明要求保护能够使植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性提高的物质在(a1)-(a6)中的应用：

(a1)增加植物每穗粒数；

(a2)增加植物每株粒数；

(a3)增加植物单株产量；

(a4)增加植物一级枝梗数；

(a5)增加植物株高；

(a6)增加植物穗长。

所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第三方面，本发明要求保护能够使植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性降低的物质在(b1)-(b6)中的应用：

(b1)减少植物每穗粒数；

(b2)减少植物每株粒数；

(b3)减少植物单株产量；

(b4)减少植物一级枝梗数；

(b5)降低植物株高；

(b6)减小植物穗长。

所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第四方面，本发明要求保护一种培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的植物的方法。

本发明所要求保护的培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的植物的方法，可包括使受体植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第五方面，本发明要求保护一种培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的植物的方法。

本发明要求保护的培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的植物的方法，可包括使受体植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第六方面，本发明要求保护一种培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达OsREM20蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加。所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，向所述受体植物中导入能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子可通过向所述受体植物中导入含有所述核酸分子的重组载体实现。

其中，所述核酸分子(OsREM20基因)可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

第七方面，本发明要求保护一种培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达OsREM20蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小。所述OsREM20蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，对所述受体植物中能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明中，具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的；以所述植物基因组中OsREM20基因中存在的符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的具体实施方式中，所述靶序列具体为5’-GACAAGCTGTACATGACAAT-3’或5’-TTGGTTATTGATAAGTGCCT-3’。

在上述第六方面和第七方面所述方法中，将重组表达载体或基因编辑载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述第六方面和第七方面所述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子具体可为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述OsREM20蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述OsREM20蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为水稻。

在本发明的具体实施方式中，所述水稻为野生型水稻Kitaake。

实验证明，本发明运用CRISPR-Cas9基因组编辑的方法，定点突变了OsREM20基因，发现功能缺失突变体能显著降低水稻的每穗粒数、每株粒数、单株产量(g)、一级枝梗数、株高、穗长；而过表达OsREM20基因的转基因材料则能够显著增加水稻的每穗粒数、每株粒数、单株产量(g)、一级枝梗数、株高、穗长。可见，OsREM20基因在调控水稻穗粒数和增产方面具有重要作用，本发明对于培育高产植物品种具有重要意义。

附图说明

图1为过表达OsREM20基因的转基因水稻的性状鉴定结果。A为35S启动子驱动OsREM20过表达载体示意图；B和C为OsREM20过表达植株株型(B，标尺：20厘米)及穗型(C，标尺：5厘米)；D为通过RT-qPCR检测过表达植株中OsREM20基因的表达量，结果用水稻内源基因Actin进行标准化，3次独立实验；E-K为OsREM20过表达植株表型的统计分析。**代表差异极显著，P<0.01，15次独立测试，T检验。NS：差异不显著。

图2为OsREM20基因突变体的性状鉴定结果。A为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsREM20基因突变体的靶标示意图；B为OsREM20两个基因敲除突变体CR-osrem20-1及CR-osrem20-2的鉴定结果；C-E为CR-osrem20-1及CR-osrem20-2突变体植株的株型(C，标尺：20厘米)、穗型(D，标尺：5厘米)及单株粒数(E，标尺：5厘米)比较；F-M为OsREM20基因敲除突变体表型的统计分析。**代表差异极显著，P<0.01，15次独立测试，T检验。NS：差异不显著。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、OsREM20基因在调控水稻穗粒数和增产方面的研究

本发明所涉及的OsREM20基因来源于水稻，其蛋白质序列如SEQ ID No.1所示，基因组序列如SEQ ID No.2所示，CDS序列如SEQ ID No.3所示。

一、过表达OsREM20基因可以增加水稻穗粒数和单株产量

1、过表达载体的构建

使用引物组合35S-OsREM20-F与35S-OsREM20-R，以水稻Kitaake幼苗cDNA为模板，扩增获得OsREM20基因序列。

35S-OsREM20-F：5’-CGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGTCAAAATTAAGACAGCAA-3’(下划线部分为酶切位点Kpn I的识别序列)。

35S-OsREM20-R：5’-TACGAACGAAAGCTCTGCAGTTATTTTTCAAGAGAGTAGAT-3’(下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列)。

继而使用无缝克隆试剂盒(Clontech，货号：639648)将扩增获得的OsREM20基因片段(SEQ ID No.3)同源重组到经Kpn I-HF和Pst I-HF酶切后的双元载体pCAMBIA-NLuc(记载于“Chen,H.M.,Zou,Y.,Shang,Y.L.,Lin,H.Q.,Wang,Y.J.,Cai,R.,Tang,X.Y.,andZhou,J.M.(2008).Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.Plant Physiol.146:368-376.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)上，并经测序验证证实正确后得到过表达质粒p35S:OsREM20(图1中A)。

2、转化水稻

受体材料为早熟粳稻品种Kitaake。

农杆菌介导的水稻遗传转化主要参照已发表的方法(Hiei et al.,1994)，具体如下：

(1)水稻成熟胚培养：水稻成熟种子去壳后用2.5％(w/v)左右的次氯酸钠溶液消毒，在无菌水冲洗6次后点播于NB培养基上诱导愈伤组织。挑选色泽淡黄、表面光滑和致密的胚性愈伤组织用于转基因研究。

(2)农杆菌培养：采用电击转化的方法将目标质粒(步骤1构建的过表达载体p35S:OsREM20)转入农杆菌菌株EHA105，继而涂布于含有50mg/L卡那霉素或壮观霉素和25mg/L利福平的LB固体培养基平板上，在26-28℃培养生长48h后，挑取阳性单克隆接种于含50mg/L卡那霉素或壮观霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中培养16h，室温4,000rpm离心10min收集菌体，用浸染液充分悬浮收集的农杆菌菌体，用于转化水稻愈伤。

(3)农杆菌浸染：将生长良好的愈伤组织转移到100mL无菌三角锥形瓶中，与农杆菌浸染液共同培养10min，期间不时晃动三角瓶。然后将水稻材料取出，在无菌滤纸上吸去多余浸染液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的添加100μM乙酰丁香酮的NB固体培养基上，在22℃条件下暗培养2天，然后转入含有潮霉素和羧苄青霉素的NB培养基上进行筛选培养。

(4)抗性愈伤组织的筛选、分化及植株再生：在经过一次筛选，二次筛选等连续四轮的抗性筛选后，挑选生长旺盛的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行为期30天至40天的分化培养，继而将分化出的水稻幼苗转移至生根培养基上进行生根壮苗，炼苗生长大约20天后，移栽到大田。

3、OsREM20过表达水稻植株的鉴定

取转基因当代(T0)的叶片进行基因组DNA的提取，并以此为模板利用引物组合35S-F和OsREM20-R进行基因型的鉴定，扩增包括35S启动子和OsREM20基因在内的1026bp融合基因构建p35S:OsREM20，明确所获得的T0代材料中是否具有相应的p35:OsREM20转基因构建体。

35S-F：5’-AAACCTCCTCGGATTCCATTGCC-3’。

OsREM20-R：5’-TTATTTTTCAAGAGAGTAGAT-3’。

进一步，对鉴定阳性的转基因材料进行了OsREM20基因表达量的检测，利用BIO-RAD公司的SsoFast EvaGreen supermix试剂盒对提取完成的转基因材料RNA样品，进行荧光定量PCR检测，检测OsREM20基因的定量引物为：

qOsREM20-F：5’-GTCAAGACTATCTGCCTATCC-3’。

qOsREM20-R：5’-CGTGCTTCTGCTACTTTGA-3’。

以水稻Actin基因为内参，检测内参基因的引物为：

qActin-F：5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’。

qActin-R：5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’。

4、OsREM20过表达水稻植株的性状鉴定

将步骤3鉴定阳性的纯合T₃代转基因水稻(编号为OX-1和OX-2)、野生型Kitaake，种子在25℃条件下浸种3天，进而在28℃培养间催芽1天。将露白后的水稻种子播种于苗床上，进行常规育秧。在1个月培养后按每穴1株移栽至稻田，实验材料的种植株行距为17cm×20cm。实验用地为北京市昌平区北七家试验农场。水肥及病虫害防治等田间管理均按照当地生产条件进行。在水稻成熟期用皮尺测量水稻株高、穗长等，计数统计分蘖数目、抽穗期、一级枝梗数、每穗粒数、每株粒数等，每个实验材料统计15株植株数据。

对鉴定得到的转基因阳性株系进行分析发现，与野生型材料(KT)相比，过表达OsREM20基因的转基因材料表现出整株显著增高、穗明显增大及籽粒数显著增加的表型(图1中B-D)。统计分析结果显示过表达OsREM20基因的转基因材料的株高、穗长、一级枝梗数、每穗粒数、每株粒数及单株产量(g)，与野生型(KT)相比均显著增加(图1中E-K)。

二、敲除OsREM20基因可以降低水稻穗粒数和单株产量

1、CRISPR-Cas9基因编辑质粒的构建

利用在线敲除靶点设计网站(http://crispr.dbcls.jp/)在OsREM20基因的编码区内设计不同位置的两个single-guide(sg)RNA(图2中A)，继而分别退火形成引物二聚体。

靶序列1：5’-GACAAGCTGTACATGACAAT-3’。

针对靶序列1的引物序列：

OsREM20-crisp-1F：5’-CAGGACAAGCTGTACATGACAAT-3’；

OsREM20-crisp-1R：5’-AACATTGTCATGTACAGCTTGTC-3’。

靶序列2：5’-TTGGTTATTGATAAGTGCCT-3’。

针对靶序列2的引物序列：

OsREM20-crisp-2F：5’-CAGTTGGTTATTGATAAGTGCCT-3’；

OsREM20-crisp-2R：5’-AACAGGCACTTATCAATAACCAA-3’。

针对OsREM20基因，直接利用T4 DNA连接酶将其引物二聚体与BspQI酶切后的pVKmp-lib克隆载体(记载于“Meng,X.,Yu,H.,Zhang,Y.,Zhuang,F.,Song,X.,Gao,S.,Gao,C.,and Li,J.(2017).Construction of a genome-wide mutant library in rice usingCRISPR/Cas9.Mol.Plant 10:1238-1241.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用)进行连接，分别构建载体pVKmp-lib-OsREM20-target1和pVKmp-lib-OsREM20-target2，测序鉴定正确后用于转基因研究。

2、转化水稻

参照步骤一2进行。

3、OsREM20敲除水稻突变株的鉴定

取转基因当代(T₀代)的水稻叶片，进行基因组DNA的提取，并以此为模板利用引物组合CR-OsREM20-JD-F和CR-OsREM20-JD-R进行目的片段的PCR扩增，扩增产物经Sanger测序系统进行突变的检测。

检测OsREM20基因的鉴定引物为：

CR-OsREM20-JD-F：5’-CATCTCACGCAACATTTCTT-3’。

CR-OsREM20-JD-R：5’-TGCTTGAGTAGTCTAGGAAT-3’。

经过目标基因序列比对分析，本发明获得了在相应gRNA识别位点处编辑的纯合突变体材料CR-osrem20-1(插入单个碱基A)和CR-osrem20-2(插入单个碱基T)(图2中B)。序列分析发现在突变体中上述编辑形式会导致OsREM20基因发生移码突变，翻译提前终止。

4、OsREM20敲除水稻突变株的性状鉴定

参照步骤一4进行。

结果显示：OsREM20敲除水稻突变株CR-osrem20-1和CR-osrem20-2突变体均表现出明显的稀穗表型(图2中D)，其株高和单株产量较野生型也明显降低(图2中C和E)，然而，CR-osrem20-1和CR-osrem20-2突变体的分蘖数和抽穗期，与野生型相比并没有表现出显著差异(图2中G和H)，说明功能缺失OsREM20基因主要是相对特异的影响水稻穗部分生组织发育性状，而并不直接控制水稻分蘖、抽穗期等性状。详细的统计分析发现，OsREM20基因功能缺失突变体材料CR-osrem20-1和CR-osrem20-2的株高、穗长、一级枝梗数、每穗粒数、每株粒数及单株产量，与野生型相比均显著降低(图2中F、I-M)。

本发明上述结果表明OsREM20基因是控制水稻的穗粒数及单株产量的正调控因子。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 水稻基因OsREM20在调控穗粒数和产量中的应用

<130> GNCLN203032

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

Met Val Lys Ile Lys Thr Ala Ser Gln Asp Tyr Leu Pro Ile Pro Val

1 5 10 15

Ala Val Thr Lys Ala Ser Arg Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Lys Leu

20 25 30

Met Thr Ala His Gly Leu Lys Ile Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Arg

35 40 45

Asp Lys Leu Tyr Met Thr Ile Gly Trp Lys Glu Phe Ile Gln Glu Ala

50 55 60

Gly Leu Lys Met Gly Glu Ser Lys Ser Val Val Phe Arg Thr Leu Ser

65 70 75 80

Lys Ser Arg Leu Asn Val Ile Ile Phe Asn Lys Glu Gly Tyr Ser Arg

85 90 95

Cys Pro Ile Pro Asp Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ile Asn Asn Gln Ser

100 105 110

Ser Ser Ala Pro Ser Phe Ser Thr Lys Ser Thr Ala Pro Arg His Pro

115 120 125

Ser Phe Thr Asn Val Glu Gly Arg Val His Lys Thr Lys Ser His Lys

130 135 140

Asn Glu His Ile Gln Leu Arg Phe Lys His His Thr Gly Ser Thr Ser

145 150 155 160

Thr Ala Asn Thr Lys Arg Ile Val Lys Asp Met Cys Cys Tyr Asn Lys

165 170 175

Arg Met Lys Leu Ser Ser Glu Val Lys Asn Tyr Val Arg Asp Ile Ala

180 185 190

Gln Phe Leu Asp Tyr Ser Ser Lys Phe Tyr Ile Val Thr Met Lys Asn

195 200 205

Ile His Glu Val Arg Gln Gly Gly Lys Ile Phe His Leu Gln Ser Ile

210 215 220

Tyr Ser Leu Glu Lys

225

<210> 2

<211> 947

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

atggtcaaaa ttaagacagc aagtcaagac tatctggtga gcttaacaag aaatatttta 60

tgtcttgtac agtatgctga ctttacaagt gctaatacaa attttcaatt atacagccta 120

tcccagttgc agttacaaaa gcatctaggc ttaagcatgg acgaactctc aagttaatga 180

ctgcacatgg cttgaagatc cgcgtcaaag tagcagaagc acgtgacaag ctgtacatga 240

caataggatg gaaggaattc atacaagaag ctggcttaaa gatgggagaa tctaaatctg 300

ttgttttcag gaccttatca aaatcaagac tcaatgtgat catatttaac aaagaaggat 360

atagtagatg tccaattcca gataaagcgg ccaaggcact tatcaataac caatcatctt 420

ctgcaccaag cttttcaacc aaatcaactg cgcctcgtca tccatctttt accaacgttg 480

aaggtattaa cttcactttt actcactgta ttttcagctt tatctaactt tcttactatg 540

atttgccttt caggtagagt ccacaaaact aaatcacaca aaaacgaaca catccaactc 600

aggttcaagc accatactgg atcaacttct acaggtccaa atactttact tattactttc 660

aatgaaattc tttcaatgaa attcatcaat ttttttttct tctatagtga gaaaaatgct 720

tatccacttt ttttcccgca gccaacacaa aacgcattgt caaagatatg tgctgctata 780

acaaacggat gaagctatca agtgaagtaa agaactacgt tagagatatt gcacaattcc 840

tagactactc aagcaaattc tacattgtta ctatgaaaaa cattcatgaa gtaagacagg 900

gtggtaagat ctttcacttg caatcaatct actctcttga aaaataa 947

<210> 3

<211> 690

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

atggtcaaaa ttaagacagc aagtcaagac tatctgccta tcccagttgc agttacaaaa 60

gcatctaggc ttaagcatgg acgaactctc aagttaatga ctgcacatgg cttgaagatc 120

cgcgtcaaag tagcagaagc acgtgacaag ctgtacatga caataggatg gaaggaattc 180

atacaagaag ctggcttaaa gatgggagaa tctaaatctg ttgttttcag gaccttatca 240

aaatcaagac tcaatgtgat catatttaac aaagaaggat atagtagatg tccaattcca 300

gataaagcgg ccaaggcact tatcaataac caatcatctt ctgcaccaag cttttcaacc 360

aaatcaactg cgcctcgtca tccatctttt accaacgttg aaggtagagt ccacaaaact 420

aaatcacaca aaaacgaaca catccaactc aggttcaagc accatactgg atcaacttct 480

acagccaaca caaaacgcat tgtcaaagat atgtgctgct ataacaaacg gatgaagcta 540

tcaagtgaag taaagaacta cgttagagat attgcacaat tcctagacta ctcaagcaaa 600

ttctacattg ttactatgaa aaacattcat gaagtaagac agggtggtaa gatctttcac 660

ttgcaatcaa tctactctct tgaaaaataa 690

Claims

1.OsREM20蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

P1、调控植物每穗粒数；

P2、调控植物每株粒数；

P3、调控植物单株产量；

P4、调控植物一级枝梗数；

P5、调控植物株高；

P6、调控植物穗长；

所述相关生物材料为能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述OsREM20蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物的每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加；和/或

所述OsREM20蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物的每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小。

3.能够使植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性提高的物质在(a1)-(a6)中的应用：

(a1)增加植物每穗粒数；

(a2)增加植物每株粒数；

(a3)增加植物单株产量；

(a4)增加植物一级枝梗数；

(a5)增加植物株高；

(a6)增加植物穗长；

和/或

能够使植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性降低的物质在(b1)-(b6)中的应用：

(b1)减少植物每穗粒数；

(b2)减少植物每株粒数；

(b3)减少植物单株产量；

(b4)减少植物一级枝梗数；

(b5)降低植物株高；

(b6)减小植物穗长；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

4.一种培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的植物的方法，包括使受体植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

5.一种培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的植物的方法，包括使受体植物中OsREM20蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

6.一种培育每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达OsREM20蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比每穗粒数增加和/或每株粒数增加和/或单株产量增加和/或一级枝梗数增加和/或株高增加和/或穗长增加；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

7.一种培育每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达OsREM20蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比每穗粒数减少和/或每株粒数减少和/或单株产量减少和/或一级枝梗数减少和/或株高降低和/或穗长减小；

所述OsREM20蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求6中，向所述受体植物中导入能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子是通过向所述受体植物中导入含有所述核酸分子的重组载体实现的；

权利要求7中，对所述受体植物中能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子进行抑制表达是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：能够表达所述OsREM20蛋白的核酸分子为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为水稻。