CN114641577A - 用于制备udp-半乳糖的酶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在单一反应混合物中从低成本底物尿苷一磷酸和D‑半乳糖产生UDP‑半乳糖的酶催化方法。所述方法能够(半)连续地或以间歇模式操作。所述方法能够扩展至尿苷原料而不是尿苷一磷酸。此外，能够调整所述方法以产生半乳糖基化的分子和生物分子包括糖、蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽，特别是人乳寡糖(HMO)和(单克隆)抗体。

Description

用于制备UDP-半乳糖的酶方法
发明领域
本发明涉及在单一反应混合物中从低成本底物尿苷一磷酸和D-半乳糖产生UDP-半乳糖的酶催化方法。所述方法能够(半)连续地、以间歇或加料-间歇模式或任何其它操作模式操作。此外，能够调整所述方法以产生半乳糖基化的分子和生物分子包括糖，特别是人乳寡糖(HMO)，蛋白质，糖蛋白，特别是抗体，糖肽，和生物缀合物，特别是碳水化合物缀合物疫苗和抗体-药物缀合物。
发明背景
尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖(UDP-半乳糖或UDP-Gal)是许多生物技术应用和食品技术的关键底物。它是用来治疗自身免疫性疾病的治疗性抗体的半乳糖基化底物。另外，为了制备碳水化合物疫苗以及在增长中的个人化医药领域(即制备用于药物递送的糖纳米材料)中需要UDP-半乳糖。在婴儿食品(人乳)中，半乳糖基化的寡糖构成人乳寡糖的重要组分，和从而有在合成产生的婴儿乳品中包括半乳糖基化的糖的高需求(CarbohydrateResearch 432(2016)62-70)。
然而，尽管有对UDP-半乳糖的高需求(数量级为每年按吨计)，但UDP-半乳糖的可获得性非常有限，甚至对于研究者也如此。迄今，UDP-半乳糖的价格是约2,000美元每克。由于UDP-半乳糖的高价格，不仅基础和应用研究活动受到妨碍，而且工业应用也被阻碍。
合成UDP-半乳糖的生物工程改造策略能够分为体内和体外方法：在代谢上工程改造微生物以便作为其代谢的一部分在细胞内或细胞外产生UDP-半乳糖。然而，缺点是低收率，高水平的不希望副产物，细胞系设计需要的时间和复杂的放大。考虑到法规方面，特别是对于婴儿食品，转基因生物(GMOs)的应用能够严重延缓审批进程。
U.S.专利申请No.09/757,846和Liu et al.(ChemBioChem,2002,3,348-355)公开用产生糖核苷酸的酶和糖基转移酶在体外产生糖缀合物的方法。UDP-Gal通过7酶级联制备，起始自昂贵的葡萄糖1-磷酸和UDP-葡萄糖，总收率35％。酶固定化在Ni NTA琼胶糖珠上，其对较大规模合成并不实用。酶在琼胶糖珠上弱结合并且在对最佳UDP-Gal产生所必需的高离子强度的反应混合物中快速洗除。酶的洗除能够严重妨碍检验过程(特别是对于食品和药物施用)，并且使得必需在各次使用之后将珠再装填。此外，在大量的情况下有毒的镍离子从珠释放至溶液；由此使得它们在合成HMOS中的使用很有可能是不可行的。此外，Ni琼胶糖珠并非机械稳健的；由于其柔软度它们不能用于搅拌槽反应器中，原因是高剪切速率导致琼胶糖珠降解，或者由于压缩不能用于大规模柱填充中。半乳糖从降解的琼胶糖珠释放可以导致酶的底物中毒。
Koizumo et al.(Nature Biotech.1998,16,847)报告相似的UDP-Gal合成，其除了半乳糖和乳清酸原料之外还使用葡萄糖1-磷酸。UTP向半乳糖的转移用两种酶GalT和GalU实现。该方法在10％(v/v)二甲苯存在下进行，在21小时之后实现半乳糖的低反应收率29％。高浓度生物质的使用妨碍大规模应用，原因是显著的质量转移局限。此外，二甲苯具有中等急性毒性。
Muthana et al.(Chem.Commun.,2012,48,2728-2730)报告从单糖和UTP一锅多酶合成UDP-糖，使用来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(BLUSP)的混杂UDP-糖焦磷酸化酶(USP,EC 2.7.7.64)。
长期以来都需要以成本有效的方式从低成本和可容易获得的底物开始产生UDP-半乳糖的方法。
从而，本发明的目的是提供制备UDP-半乳糖的成本有效的且有效率的方法。
本发明的目的通过独立权利要求的教导得以解决。本发明的其它有利特征、方面和细节则体现在本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例中。
发明描述
在生物化学中，核苷酸糖熟知是单糖的活性形式，而在糖基化反应中，核苷酸糖已知充当糖基供体。糖基转移酶(GTFs)是催化糖部分从活化的核苷酸糖向亲核的糖基受体分子转移的酶。从而，在生物化学中，糖基化反应被糖基转移酶催化。
为了充当糖基供体，各单糖必需呈高能量形式，例如核苷酸糖形式，特别是衍生自尿苷二磷酸、鸟苷二磷酸或胞嘧啶二磷酸的核苷酸二磷酸基糖等。熟知的核苷酸糖的实例是UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc，UDP-木糖，UDP-葡糖醛酸，GDP-甘露糖和GDP-岩藻糖。熟知的是，简单单糖向活化的核苷酸糖的转化能够通过核苷三磷酸(NTP)和糖基一磷酸的酶催化反应实现，其中所述糖基一磷酸含有在异头碳位置的磷酸基团。
为了获得核苷二磷酸(NDP)-单糖，需要将所用单糖转化为糖基一磷酸衍生物。通常，所述反应能够通过应用特定酶比如磷酸转移酶和额外磷酸变位酶(如果需要)实现，从而获得所希望的单糖-1-磷酸。磷酸转移酶是分类为EC编号2.7的酶，其催化磷酸化反应。磷酸转移酶根据其受体分子进一步分类。例如，EC 2.7.1的磷酸转移酶是具有醇基团作为受体的磷酸转移酶。磷酸变位酶是异构酶，也即能够催化磷酸基团内部转移的酶。在底物经由磷酸转移酶磷酸化获得单糖-6-磷酸的情况下需要磷酸变位酶，比如D-甘露糖或D-葡萄糖的情况，分别例如甘露糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸。各磷酸变位酶然后催化磷酸基团的内部转移，这分别引起甘露糖-6-磷酸向甘露糖-1-磷酸或葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸转化。
激酶是形成磷酸转移酶家族的一部分的酶。激酶是催化磷酸基团从高能磷酸供给分子转移至特异性底物的酶。该过程称为磷酸化，其中底物获得磷酸基团而高能腺苷三磷酸(ATP)分子则供给磷酸基团。该转酯基化产生磷酰化的底物和ADP。从而，为了获得单糖-1-磷酸，可以应用适宜的激酶比如半乳糖激酶以从D-半乳糖获得半乳糖1-磷酸。
在使用核苷酸基转移酶的情况下，核苷三磷酸(NTP)和单糖-1-磷酸能够被转化为各自的核苷二磷酸(NDP)-单糖。核苷酸基转移酶是含磷基团的转移酶并且分类为EC编号2.7.7。对于不同的天然核苷酸，核苷酸特异性的核苷酸基转移酶是本领域已知的，例如尿苷酰基转移酶转移尿苷酰基-基团，腺苷酰基转移酶转移腺苷酰基-基团，鸟苷酰基-转移酶转移鸟苷酰基-基团，胞苷酰基转移酶转移胞苷酰基-基团和胸苷酰基-转移酶转移胸苷酰基-基团。从而，核苷酸基转移酶适宜催化单糖-1-磷酸与核苷三磷酸的反应，例如半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸(UTP)的反应以获得UDP-半乳糖。在UDP-半乳糖的情况下，尿苷酰基转移酶适于催化与尿苷三磷酸(UTP)的反应。
涉及天然UDP-单糖的尿苷二磷酸(UDP)-单糖是UDP-半乳糖，UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc。上文描述的一般反应方案并未在使用尿苷三磷酸和半乳糖1-磷酸(Gal-1-P)以及特定尿苷酰基转移酶的情况下用于UDP-半乳糖，原因是对UTP：半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.10)的获得十分受限(参见Chem.Commun.,2012,48,2728-2730)。相反，UDP-半乳糖一般用半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(GalT,EC 2.7.7.12)制备自UDP-葡萄糖(例如参见U.S.专利申请No.09/757,846；Nature Biotech.1998,16,847)，由此需要进一步的底物(UDP-葡萄糖或葡萄糖1-磷酸)和进一步的酶GalT。
虽然描述于文献中的UDP-Gal合成有前述缺点，获得NTP-糖的一般反应方案的进一步缺点基于的事实是原料(尤其是各自的核苷三磷酸)非常昂贵从而该合成途径导致NDP-单糖和尤其是UDP-半乳糖的成本密集合成。如上文描述，对于UDP-半乳糖来说本领域需要提供从低成本和可容易获得的原料制备核苷二磷酸单糖、特别是UDP-半乳糖的成本有效的且有效率的方法。
有关UDP-单糖，UDP-半乳糖涉及哺乳动物中天然活化的UDP-糖。因此，对于制备UDP-半乳糖，UMP已被确认为适宜的核苷酸而D-半乳糖已被确认为适宜的单糖。应清楚的是，对于酶催化反应来说至少必须提供适宜的酶。因此发明人已确认UMP和可容易获得的D-半乳糖是在酶促一锅级联反应中制备UDP-半乳糖的适宜原料。
为了提供制备UDP-半乳糖的成本有效且有效率的方法，UMP(尿苷一磷酸)和D-半乳糖被确认为在图1描述的酶级联反应中制备UDP-半乳糖的适宜原料，所述反应由下述组成：(a)从D-半乳糖和腺苷三磷酸(ATP；催化量)形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P)，(b)从UMP和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)，和(c)半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸(UTP)反应生成UDP-半乳糖。预想的是，UDP-半乳糖能够在半乳糖激酶、尿苷一磷酸激酶、多磷酸激酶和葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下从D-半乳糖和尿苷一磷酸直接产生。
令人惊讶地，发明人已发现半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸生成UDP-半乳糖的反应能够有效地用葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(GalU)催化，仅已知该酶催化UTP和α-D-葡萄糖1-磷酸生成二磷酸和UDP-葡萄糖(EC 2.7.7.9)的反应的能力。从而，对于本发明酶级联不需要进一步的单糖底物比如葡萄糖1-磷酸并且不需要半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶。因此，根据本发明产生UDP-Gal的方法优于上文描述的方法，原因是较少的酶用于酶级联并且需要较不昂贵的原料，由此使得本发明方法更有效率，收率高于99％并且更不昂贵(参见实施例2)。
此外，本发明方法优于本领域已知的上文描述的从D-半乳糖和尿苷三磷酸酶合成UDP-半乳糖的方法，原因是能够避免昂贵的尿苷三磷酸原料并且用尿苷一磷酸替换，这获得如本文描述的制备UDP-半乳糖的成本有效的且有效率的方法。
从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
Figure BDA0003626820380000061
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)下式代表的尿苷一磷酸和D-半乳糖
Figure BDA0003626820380000062
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
根据本发明的尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的产生步骤B)包括
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b)通过尿苷一磷酸激酶和多磷酸激酶催化从尿苷一磷酸(UMP)、腺苷三磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c)在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖。
显然，步骤(a)和(b)可以同时或依次进行。另外，它们的顺序可以颠倒为(b)→(a)→(c)。
从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b)通过尿苷一磷酸激酶和多磷酸激酶催化从尿苷一磷酸(UMP)、腺苷三磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c)在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖。
更特别地，根据本发明的尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的产生步骤B)包括
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b1)通过尿苷一磷酸激酶催化从尿苷一磷酸和腺苷三磷酸形成尿苷二磷酸(UDP)；
(b2)通过多磷酸激酶催化从尿苷二磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c)在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖。
显然，步骤(a)可以在步骤(b1)或(b2)之前、同时或之后进行。从而，步骤顺序还可以颠倒为(b1)→(b2)→(a)→(c)。
从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b1)通过尿苷一磷酸激酶催化从尿苷一磷酸和腺苷三磷酸形成尿苷二磷酸(UDP)；
(b2)通过多磷酸激酶催化从尿苷二磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c)在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖。
用于产生UDP-半乳糖的本发明方法具有相对现有技术描述的方法的下述显著优势：
·关于原料的显著成本降低，也即不需要昂贵的UDP或UTP,
·该方法能够以连续方式进行，由此可能允许每年以成吨规模提供UDP-半乳糖,
·不含细胞的过程，由此避免不利的GMO方面(法规、标签),
·直接使用不含细胞的提取物，无生物催化剂纯化的成本,
·酶能够固定化在低成本、可商购和即用的固体载体上,
·关于半乳糖的几乎定量的收率,
·高可放大性使得本发明方法可用于工业应用。
在一种实施方式中，酶固定化在固体载体上。从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述固定化在固体载体上的一组酶。优选，所述一组酶共固定化在固体载体上而不影响各酶的酶活性。
本发明的又一方面涉及的分子和生物分子包括糖、蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽、特别是人乳寡糖(HMO)和(单克隆)抗体的半乳糖基化，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽或半乳糖基化的小分子。
在用于半乳糖基化的本发明方法的一种实施方式中，UTP再生自副产物UDP。因此，仅需要催化量UMP。从而，用于半乳糖基化的本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽或半乳糖基化的小分子；和
E)回收步骤D)中形成的尿苷二磷酸以获得尿苷三磷酸。
优选，所述一组酶共固定化在固体载体上而不影响各酶的酶活性。所述固体载体能够多次重复使用而不影响生产能力，条件是固体载体由高机械强度的聚合物骨架比如用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯组成。因此，本发明的又一方面涉及包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；其中所述一组酶共固定化在用环氧基团官能化的固体载体上。优选，固体载体是甲基丙烯酸盐/酯聚合物。优选，半乳糖基转移酶与所述一组酶共固定化在固体载体上。
发明详述
定义
如本文所用，术语"多磷酸盐"是指任何盐，其含有通过六个或更多个磷酸盐(PO4)四面体的角共享产生的数个P-O-P键，导致形成长链。术语"PolyPn"同义地使用，其中n代表磷酸残基数的平均链长，例如PolyP25是指具有约25个磷酸盐残基的多磷酸盐和PolyP14是指具有约14个磷酸盐残基的多磷酸盐。
如本文所用，术语"尿苷激酶"或是指具有尿苷激酶活性的多肽，也即尿苷激酶催化在腺苷三磷酸存在下尿苷生成尿苷5'-一磷酸的反应。尿苷激酶属于EC类别2.7.1.48。
如本文所用，术语"多磷酸激酶"是指具有多磷酸激酶活性的多肽，也即多磷酸激酶催化下述反应：
Figure BDA0003626820380000121
Figure BDA0003626820380000122
其中N是核苷酸比如鸟苷、腺苷、尿苷等，并且NMP是核苷一磷酸，NDP是核苷二磷酸而NTP是核苷三磷酸。
在尿苷的情况下，多磷酸激酶催化下述反应：
Figure BDA0003626820380000123
Figure BDA0003626820380000124
Figure BDA0003626820380000125
多磷酸激酶属于EC类别2.7.4.1。在本文描述的本发明方法中使用的多磷酸激酶的代表包括但不限于多磷酸激酶1(PPK1)，多磷酸激酶2(PPK2)，2-域多磷酸激酶2(2D-PPK2)和1-域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和多磷酸激酶3(PPK3)。
如本文所用，术语"葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶"是指具有尿苷酰基转移酶活性的多肽，也即UTP：α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶并且催化下述反应：
Figure BDA0003626820380000126
葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶(GalU)属于EC类别2.7.7.9。发明人已发现，葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶也催化UTP转移至α-D-半乳糖1-磷酸：
Figure BDA0003626820380000127
如本文所用，术语"焦磷酸酶"是指具有焦磷酸酶活性的多肽，也即催化下述反应的多肽：
Figure BDA0003626820380000128
其中PPi是指焦磷酸而Pi是指磷酸。
焦磷酸酶属于EC类别3.6.1.1。在该上下文中，术语"二磷酸酶"是指催化二磷酸水解为磷酸的焦磷酸酶多肽。
如本文所用，术语"半乳糖激酶"是指具有激酶活性的多肽，也即催化生成α-D-半乳糖1-磷酸的下述磷酸化的激酶：
Figure BDA0003626820380000131
半乳糖激酶属于EC类别2.7.1.6。
如本文所用，术语"尿嘧啶磷酸核糖基转移酶"是指具有磷酸核糖基转移酶活性的多肽，也即催化下述反应的转移酶：
Figure BDA0003626820380000132
其中PRPP是指磷酰化的戊糖，优选磷酰化的核糖和最优选5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸。示范性地，转移酶是但不限于属于EC类别2.4.2.9的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶或属于EC类别2.4.2.57的AMP磷酸化酶，还已知所述转移酶的活性。
如本文所用，术语"UMP合成酶"是指具有尿苷一磷酸合成酶活性的多肽，也即催化下述反应的合成酶：
Figure BDA0003626820380000133
其中OMP是指乳清苷-5'-磷酸。术语UMP合成酶与乳清苷5'-磷酸脱羧酶同义地使用并且该酶属于EC类别4.1.1.23。
如本文所用，术语"乳清酸磷酸核糖基转移酶"是指具有乳清酸磷酸核糖基转移酶活性的多肽，也即催化下述反应的转移酶：
Figure BDA0003626820380000134
转移酶属于EC类别2.4.2.10。
如本文所用，术语"半乳糖基转移酶"是指具有半乳糖基转移酶活性的多肽，也即催化半乳糖从UDP-Gal向受体(生物)分子转移的多肽。优选，受体是糖比如葡萄糖或N-乙酰基葡糖胺。优选，半乳糖基转移酶是β-半乳糖基转移酶和更优选β-1,4-半乳糖基转移酶，其催化半乳糖通过在半乳糖与受体糖4位之间形成β-糖苷连接从UDP-Gal向受体糖转移：
β-半乳糖基转移酶相对α-半乳糖基转移酶是优选的，原因是末端α-半乳糖基部分并非天然存在于人类中从而可以触发抗体对α-半乳糖基结构的抗体反应等的免疫应答。半乳糖基转移酶属于EC类别2.4.1.-。
"序列同一性百分比"和"百分比同一性"在本文中可互换地用来指多肽之间的比较，并且通过在比较窗口中比较两个最佳排列的序列而确定，其中对于所述两个序列的最佳排列来说在比较窗口中的多肽序列部分与参考序列相比可以包含增加或缺失(也即空隙)。百分比可以计算如下：确定在两个序列中存在的相同氨基酸残基位置的数量从而产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘100从而产生序列同一性百分比。另选地，百分比可以计算如下：确定相同氨基酸残基在两个序列中存在或氨基酸残基与空隙对齐的位置数量从而产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘100从而产生序列同一性百分比。本领域技术人员理解可获得许多建立的算法来比较两个序列。
"参比序列"是指用作序列比较基础的经定义的序列。参比序列可以是更大序列的子集，例如全长多肽序列的片段。一般地，参比序列的长度是至少20个氨基酸残基，长度至少25个残基，长度至少50个残基，或多肽的全长。由于两个多肽可以各自(1)包含在所述两个序列之间相似的序列(也即完整序列的一部分)(2)可以还包含在所述两个序列之间趋异的序列，在两个(或更多个)多肽之间的序列比较一般通过比较所述两个多肽在"比较窗口"中的序列从而鉴定并比较局部区域的序列相似性来进行。在某些实施方式中，"参比序列"能够基于主要氨基酸序列，其中参比序列是能够具有主要序列中的一种或多种变化的序列。
如本文所用，"糖"是指但不限于单糖，二糖，三糖，四糖，五糖，六糖，七糖，八糖…，寡糖，聚糖和多糖。糖优选包含选自下述的单糖单元：
D-阿拉伯糖，D-来苏糖，D-核糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，L-来苏糖，L-核糖，L-木糖，D-核酮糖，D-木酮糖，L-核酮糖，L-木酮糖，D-脱氧核糖，L-脱氧核糖，D-赤藓糖，D-苏阿糖，L-甘油-D-甘露-庚糖，D-甘油-D-甘露-庚糖，D-阿洛糖，D-阿卓糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-古罗糖，D-艾杜糖，D-半乳糖，D-塔罗糖，D-阿洛酮糖，D-果糖，D-山梨糖，D-塔格糖，6-脱氧-L-阿卓糖，6-脱氧-D-塔罗糖，D-岩藻糖，L-岩藻糖，D-鼠李糖，L-鼠李糖，D-奎诺糖，橄榄糖，泰威糖，蛔糖，阿比可糖，泊雷糖，洋地黄毒糖，可立糖，D-葡糖胺，D-半乳糖胺，D-甘露糖胺，D-阿洛糖胺，l-阿卓糖胺，D-古罗糖胺，L-艾杜糖胺，D-塔罗糖胺，N-乙酰基-D-葡糖胺，N-乙酰基-D-半乳糖胺，N-乙酰基-D-甘露糖胺，N-乙酰基-D-阿洛糖胺，N-乙酰基-L-阿卓糖胺，N-乙酰基-D-古罗糖胺，N-乙酰基-L-艾杜糖胺，N-乙酰基-D-塔罗糖胺，N-乙酰基-D-岩藻糖胺，N-乙酰基-L-岩藻糖胺，N-乙酰基-L-鼠李糖胺，N-乙酰基-D-奎诺糖胺，D-葡糖醛酸，D-半乳糖醛酸，D-甘露糖醛酸，D-阿洛糖醛酸，L-阿卓糖醛酸，D-古罗糖醛酸，L-古罗糖醛酸，L-伊杜糖醛酸，D-塔罗糖醛酸，神经氨酸，N-乙酰神经氨酸，N-羟基乙酰基神经氨酸，芹菜糖，Bacillosamine，黄夹竹桃糖，阿可弗里糖，磁麻糖，胞壁酸，N-乙酰基胞壁酸，N-羟基乙酰基胞壁酸，3-脱氧-来苏-庚酮糖酸，酮基脱氧辛酮酸，和酮基脱氧壬酮酸。优选，单糖单元属于α-和β-D/L-碳水化合物的下述组，其包含下述或由下述组成：
α-D-吡喃核糖，α-D-吡喃阿拉伯糖，α-D-吡喃木糖，α-D-吡喃来苏糖，α-D-吡喃阿洛糖，α-D-吡喃阿卓糖，α-D-吡喃葡萄糖，α-D-吡喃甘露糖，α-D-吡喃葡萄糖，α-D-吡喃艾杜糖，α-D-吡喃半乳糖，α-D-吡喃塔罗糖，α-D-吡喃阿洛酮糖，α-D-吡喃果糖，α-D-吡喃山梨糖，α-D-吡喃塔格糖，α-D-呋喃核糖，α-D-呋喃阿拉伯糖，α-D-呋喃木糖，α-D-呋喃来苏糖，α-D-呋喃阿洛糖，α-D-呋喃阿卓糖，α-D-呋喃葡萄糖，α-D-呋喃甘露糖，α-D-呋喃古罗糖，α-D-呋喃艾杜糖，α-D-呋喃半乳糖，α-D-呋喃塔罗糖，α-D-呋喃阿洛酮糖，α-D-呋喃果糖，α-D-呋喃山梨糖，α-D-呋喃塔格糖，α-D-呋喃木酮糖，α-D-呋喃核酮糖，α-D-呋喃苏阿糖，α-D-吡喃鼠李糖，α-D-呋喃赤藓糖，α-D-葡糖胺，α-D-吡喃葡萄糖醛酸，β-D-吡喃核糖，β-D-吡喃阿拉伯糖，β-D-吡喃木糖，β-D-吡喃来苏糖，β-D-吡喃阿洛糖，β-D-吡喃阿卓糖，β-D-吡喃葡萄糖，β-D-吡喃甘露糖，β-D-吡喃葡萄糖，β-D-吡喃艾杜糖，β-D-吡喃半乳糖，β-D-吡喃塔罗糖，β-D-吡喃阿洛酮糖，β-D-吡喃果糖，β-D-吡喃山梨糖，β-D-吡喃塔格糖，β-D-呋喃核糖，β-D-呋喃阿拉伯糖，β-D-呋喃木糖，β-D-呋喃来苏糖，β-D-吡喃鼠李糖，β-D-呋喃阿洛糖，β-D-呋喃阿卓糖，β-D-呋喃葡萄糖，β-D-呋喃甘露糖，β-D-呋喃古罗糖，β-D-呋喃艾杜糖，β-D-呋喃半乳糖，β-D-呋喃塔罗糖，β-D-呋喃阿洛酮糖，β-D-呋喃果糖，β-D-呋喃山梨糖，β-D-呋喃塔格糖，β-D-呋喃木酮糖，β-D-呋喃核酮糖，β-D-呋喃苏阿糖，β-D-呋喃赤藓糖，β-D-葡糖胺，β-D-吡喃葡萄糖醛酸，α-L-吡喃核糖，α-L-吡喃阿拉伯糖，α-L-吡喃木糖，α-L-吡喃来苏糖，α-L-吡喃阿洛糖，α-L-吡喃阿卓糖，α-L-吡喃葡萄糖，α-L-吡喃甘露糖，α-L-吡喃葡萄糖，α-L-吡喃艾杜糖，α-L-吡喃半乳糖，α-L-吡喃塔罗糖，α-L-吡喃阿洛酮糖，α-L-吡喃果糖，α-L-吡喃山梨糖，α-L-吡喃塔格糖，α-L-吡喃鼠李糖，α-L-呋喃核糖，α-L-呋喃阿拉伯糖，α-L-呋喃木糖，α-L-呋喃来苏糖，α-L-呋喃阿洛糖，α-L-呋喃阿卓糖，α-L-呋喃葡萄糖，α-L-呋喃甘露糖，α-L-呋喃古罗糖，α-L-呋喃艾杜糖，α-L-呋喃半乳糖，α-L-呋喃塔罗糖，α-L-呋喃阿洛酮糖，α-L-呋喃果糖，α-L-呋喃山梨糖，α-L-呋喃塔格糖，α-L-呋喃木酮糖，α-L-呋喃核酮糖，α-L-呋喃苏阿糖，α-L-呋喃赤藓糖，α-L-葡糖胺，α-L-吡喃葡萄糖醛酸，β-L-吡喃核糖，β-L-吡喃阿拉伯糖，β-L-吡喃木糖，β-L-吡喃来苏糖，β-L-吡喃阿洛糖，β-L-吡喃阿卓糖，β-L-吡喃葡萄糖，β-L-吡喃甘露糖，β-L-吡喃葡萄糖，β-L-吡喃艾杜糖，β-L-吡喃半乳糖，β-L-吡喃塔罗糖，β-L-吡喃阿洛酮糖，β-L-吡喃果糖，β-L-吡喃山梨糖，β-L-吡喃塔格糖，β-L-呋喃核糖，β-L-呋喃阿拉伯糖，β-L-呋喃木糖，β-L-呋喃来苏糖，β-L-呋喃阿洛糖，β-L-呋喃阿卓糖，β-L-呋喃葡萄糖，β-L-呋喃甘露糖，β-L-呋喃古罗糖，β-L-呋喃艾杜糖，β-L-呋喃半乳糖，β-L-呋喃塔罗糖，β-L-呋喃阿洛酮糖，β-L-呋喃果糖，β-L-呋喃山梨糖，β-L-呋喃塔格糖，β-L-呋喃木酮糖，β-L-呋喃核酮糖，β-L-呋喃苏阿糖，β-L-呋喃赤藓糖，β-L-葡糖胺，β-L-吡喃葡萄糖醛酸，和β-L-吡喃鼠李糖。
糖进一步任选经修饰以携带酰胺，碳酸盐/酯，氨基甲酸盐/酯，羰基，硫羰基，羧基，硫代羧基，酯，硫代酯，醚，环氧，羟基烷基，烯烃基(alkylenyl)，亚苯基，烯基，亚氨基，酰亚胺，异脲，硫代氨基甲酸盐/酯，硫脲和/或脲部分。
如本文所用，术语"糖肽"是指肽，其含有与构成肽的氨基酸残基的侧链共价连接的碳水化合物部分。所述碳水化合物部分形成侧链并且是与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接的O-糖苷或者与天冬酰胺残基的酰胺基氮连接的N-糖苷。
如本文所用，术语"糖蛋白"是指多肽，其含有与构成多肽的氨基酸残基的侧链共价连接的碳水化合物部分。所述碳水化合物部分形成侧链并且是与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接的O-糖苷或者与天冬酰胺残基的酰胺基氮连接的N-糖苷。
如本文所用，术语"蛋白质"是指多肽，其含有或缺少与构成多肽的氨基酸残基的侧链共价连接的碳水化合物部分，包括未糖基化的蛋白质和糖基化的蛋白质。
如本文所用，术语"肽"是指肽，其含有或缺少与构成肽的氨基酸残基的侧链共价连接的碳水化合物部分，包括未糖基化的肽和糖基化的肽。
如本文所用，术语"治疗性抗体"是指可以给予人类或动物从而具有希望效果(尤其治疗疾病)的抗体。所述治疗性抗体一般是单克隆抗体和一般已经基因工程改造。如果抗体是重组抗体，则其可以是人源化的。另选地，治疗性抗体可以是多克隆抗体。
如本文所用，术语"生物缀合物"是指由至少两个相互共价结合的分子组成的分子构建体并且所述分子中至少一个是生物分子，也即生物体中存在的对一种或多种典型生物学过程必需的分子。示范性地，生物缀合物是由共价偶联至载体蛋白的碳水化合物抗原组成的碳水化合物缀合物疫苗，和抗体药物缀合物。
如本文所用，术语"碳水化合物缀合物疫苗"是指含有与免疫原性载体共价结合的碳水化合物抗原的缀合物。碳水化合物抗原能够是但不限于细菌荚膜糖，病毒糖蛋白的糖，孢子虫或寄生物的糖抗原，病原真菌的糖抗原，或对癌细胞特异性的糖抗原。免疫原性载体能够是但不限于，选自类毒素的载体蛋白，包括破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，交叉反应物质197(CRM197)，未分型流感杆菌(H.influenzae)的蛋白D，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)荚膜类型B的外膜蛋白复合物(OMPCs)，绿脓杆菌的外毒素A(EPA)，艰难梭菌(C.difficile)毒素A(CDTA)，肺炎球菌蛋白，比如肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌组氨酸三联体D(PhtD)，解毒的肺炎球菌自溶酶(dPly)，和spr96/2021，S.aureusα毒素和Shiga毒素1b。
术语"固体载体"如本文所用是指不溶的官能化的物质，酶或其它试剂可以直接或经由携带锚定基团的连接体对其附着或固定化，使得酶可以容易地与过量试剂、可溶反应产品、副产物或溶剂(通过洗涤、过滤、离心等)分离。固体载体能够由下述构成：有机聚合物比如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氟乙烯，聚氧乙烯和聚丙烯酰胺，及其共聚物和接枝物。固体载体还能够是无机物，比如玻璃，二氧化硅，受控孔玻璃(CPG)，反相二氧化硅或金属，比如金或铂。固体载体还能够由磁性颗粒组成。用于酶固定化的适宜载体物质概览可参见Zdarta et al.Catalysts 2018,8,92和Datta et al.Biotech 2013 3:1-9。
固体载体的构造可以呈下述形式：珠，整体料，球，粒子，粒子床，纤维垫，颗粒，凝胶，膜，中空纤维膜，混合基质膜或表面。表面能够是平面的，实质平面的或非平面的。固体载体能够是多孔的或无孔的，并且能够具有膨胀或非膨胀特征。固体载体能够经配置呈下述形式：孔、凹陷，或其它容器，器皿，特征或位置。
令人惊讶地，发明人已发现半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸生成UDP-半乳糖的反应能够用葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(GalU)有效地催化，仅已知该酶催化UTP和α-D-葡萄糖1-磷酸生成二磷酸和UDP-葡萄糖反应的能力(EC 2.7.7.9)。从而，本发明酶级联不需要进一步的单糖底物比如葡萄糖1-磷酸和不需要半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶。
因此，根据本发明产生UDP-Gal的方法优于现有技术方法，原因是酶级联需要较少的酶和较少的昂贵原料，由此使得本发明方法更有效率，收率高于99％和更不昂贵(参见实施例2)。
在本发明方法的一种实施方式中，使用更高浓缩的反应混合物以便降低方法成本。从而，UMP和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度优选0.01mM至100,000mM的范围。更优选，UMP和D-半乳糖的浓度范围是0.05mM至50,000mM。更优选，UMP和D-半乳糖的浓度范围是0.1mM至30,000mM。更优选，UMP和D-半乳糖的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中尿苷一磷酸和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
优选，酶在所述一组酶中的浓度是0.0001mg/mL至100mg/mL，按在步骤A)中提供的溶液的总体积计。
作为半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸生成UDP-半乳糖的反应中的副产品，形成焦磷酸(PPi)。尽管焦磷酸在水溶液中不稳定，其仅缓慢地水解为无机磷酸(Pi)。高浓度焦磷酸降低牵涉于UDP-半乳糖形成中的葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的活性，原因是PPi结合金属离子比如Mg2+并且从溶液沉淀。此外，已知焦磷酸抑制尿苷酰基-和鸟苷酰基转移酶能力。焦磷酸酶能够催化焦磷酸水解为磷酸，由此实际上使得UDP-半乳糖形成不可逆。从而，在本发明的优选实施方式中，所述一组酶还包含焦磷酸酶。因此，根据本发明的产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
换言之，本发明产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b1)通过尿苷一磷酸激酶催化从尿苷一磷酸和腺苷三磷酸形成尿苷二磷酸(UDP)；
(b2)通过多磷酸激酶催化从尿苷二磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c')在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖；和
(c”)在焦磷酸酶存在下使焦磷酸转化为磷酸。
优选，在本文描述的本发明方法中所用的焦磷酸酶是无机焦磷酸酶。优选，焦磷酸酶是来自出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)(PmPpA)的无机焦磷酸酶。
多磷酸盐能够与最初溶于含水介质的金属离子(例如Ca2+、Mg2+、Fe2+/3+)形成稳定的可溶于水的配合物。该效果称为螯合并且阻止结合的金属离子参与反应，特别是酶反应。因此，螯合的金属离子特别是Mg2+和Mn2+不能为牵涉于本文描述的本发明方法中的酶充当辅因子。因为特定多磷酸盐螯合特定金属离子的能力随着多磷酸盐链长增加而下降，长链多磷酸盐在本发明中是优选的。更优选的是具有至少14个磷酸残基的多磷酸盐。最优选的是具有至少25个磷酸残基的多磷酸盐。
从而，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。
优选，酶存在于与其它底物的单一反应混合物中。混合物可以是匀相(溶液)或异相的。酶可以固定化在固体载体上或不固定化。从而，根据本发明方法的又一方面在单一反应混合物中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供混合物，包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
(iii)包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
另外，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
(iii)包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
换言之，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供混合物，包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
(iii)包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的至少四种酶；
B)在所述至少四种酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
(iii)包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、任选的焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；和
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
在本文描述的本发明方法中多磷酸盐仅充当能量载体并且在用多磷酸激酶3(PPK3)从ADP再生ATP中用作的磷酸来源。ATP的再生能够通过向本发明方法的酶级联加入1-域多磷酸激酶(1D-PPK)得到增加，其也催化ADP磷酸化生成ATP，优选1-域多磷酸激酶2(1D-PPK2)。此外，核苷磷酸比如ADP在含水介质中不稳定和倾向于快速水解。为了避免ADP因水解为AMP而损失，能够向本发明酶级联与1D-PPK一起或单独加入催化AMP磷酸化生成ADP的2-域多磷酸激酶(2D-PPK)，优选2-域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
因为在本文描述的本发明方法中ATP从ADP和多磷酸盐连续再生，UDP-半乳糖的制备能够用催化量的ATP进行。从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
术语"催化量"在本文中指亚化学计量量的ATP，也即小于本发明方法中所用的半乳糖量的ATP量。优选，ATP的催化量范围是0.000001至0.99摩尔每摩尔D-半乳糖。更优选，ATP的催化量范围是0.000001至0.95摩尔每摩尔D-半乳糖。更优选，ATP的催化量范围是0.000001至0.9摩尔每摩尔D-半乳糖。更优选，ATP的催化量范围是0.000005至0.5摩尔每摩尔D-半乳糖，更优选0.00001至0.1摩尔每摩尔D-半乳糖，更优选0.00001至0.05摩尔每摩尔D-半乳糖，更优选0.00001至0.01摩尔每摩尔D-半乳糖，和最优选0.00001至0.001摩尔每摩尔D-半乳糖。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中以0.000001摩尔至0.9摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.000005摩尔至0.5摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.00001摩尔至0.1摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.00001摩尔至0.05摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.00001摩尔至0.01摩尔每摩尔D-半乳糖的量，和最优选以0.00001摩尔至0.001摩尔每摩尔D-半乳糖的量加入腺苷三磷酸。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中以0.001摩尔至0.9摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.002摩尔至0.8摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.7摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.5摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.2摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.1摩尔每摩尔D-半乳糖的量，和最优选以0.005摩尔至0.05摩尔每摩尔D-半乳糖的量加入腺苷三磷酸。
优选，ATP在步骤A)中提供的溶液中存在的浓度是0.05mM至100mM，更优选0.1mM至90mM，更优选0.1mM至50mM，更优选0.2mM至20mM，更优选0.2mM至10mM，更优选0.2mM至5mM，和最优选0.5mM至3mM。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中腺苷三磷酸在溶液中的浓度范围是0.5mM至3mM。
在备择实施方式中，在本文描述的本发明方法中能够使用ADP或AMP而不是ATP。ATP原位产生自AMP或ADP和多磷酸盐，从而UDP-半乳糖的制备还能够用ADP或AMP作为原料进行。从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和腺苷一磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷二磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
在备择实施方式中，ATP以D-半乳糖的过量使用以便增加空-时收率。从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中ATP量的范围是1至100摩尔每摩尔D-半乳糖，更优选ATP量的范围是1.2至50摩尔每摩尔D-半乳糖，更优选ATP量的范围是1.5至20摩尔每摩尔D-半乳糖和最优选ATP量的范围是2至10摩尔每摩尔D-半乳糖
优选，在本发明方法中，在步骤A)中的所得溶液具有5.0-10.0，优选5.5-9.5，更优选6.0-9.0，还更优选6.5-9.0，仍更优选7.0-9.0的pH值和最优选7.5至8.5的pH值。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷二磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中的所得溶液具有7.5至8.5的pH值。
在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷二磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中的所得溶液具有约8.5的pH值。
在本发明的一种实施方式中，在步骤A)中提供的溶液包含Mg2+离子充当所述一组酶的催化活性的辅助因子。优选，Mg2+离子在步骤A)中提供的溶液中存在的浓度是1mM至200mM，更优选1mM至150mM，更优选2mM至150mM，更优选5mM至100mM，更优选10mM至90mM，更优选15mM至80mM，更优选20mM至80mM和最优选20mM至50mM。
从而，在本发明的一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤；
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐，和催化量腺苷二磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中在步骤A)中的所得溶液具有20mM至80mM，优选20mM至50mM的Mg2+浓度。
用于产生UDP-半乳糖的本发明方法还能够用一组固定化的酶进行。然后将所述酶固定化在固体载体上从而它们保留它们的活性、底物特异性、立体选择性和/或其它特性。适宜的固体载体是例如珠，整体料，球，粒子，粒子床，纤维垫，颗粒，凝胶，膜，中空纤维膜，混合基质膜，表面或其它固相物质。
在一种实施方式中，各酶即葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶固定化在固体载体上。在进一步的实施方式中，各酶即葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶固定化在固体载体上。
在一种实施方式中，所述一组酶中的仅某些酶固定化在固体载体上。在进一步的实施方式中，选自所述一组酶的仅一种酶固定化在固体载体上，所述一组酶包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶，半乳糖激酶，多磷酸激酶或多磷酸激酶类的组合例如1D-和2D-ppk2和ppk3的组合，尿苷一磷酸激酶，和任选的焦磷酸酶。在又一实施方式中，选自所述一组酶的至少一种酶固定化在固体载体上，所述一组酶包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和任选的焦磷酸酶。优选，多磷酸激酶固定化在固体载体上。优选，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶固定化在固体载体上。优选，半乳糖激酶固定化在固体载体上。优选，尿苷一磷酸激酶固定化在固体载体上。优选，焦磷酸酶固定化在固体载体上。
从而，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶结合或固定化在固体载体上。
另外，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶结合或固定化在固体载体上。
另外，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶结合或固定化在固体载体上。
另外，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶的至少一种酶固定化在固体载体上。
优选，本文描述的本发明方法中所用的酶共固定化在固体载体上。按顺序起作用的酶在受限空间中的固定化增加转化的催化效率，原因是底物扩散时间的显著减少。此外，底物的原位形成产生高局部浓度，其导致动力学增强并且能够等于实质的成本节约。共固定化通常通过于固定化前在固体载体上将酶混合来实现。
从而，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共固定化在固体载体上。
另外，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共固定化在固体载体上。
另外，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共固定化在固体载体上。
本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的共固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的共固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述固体载体具有下述形式：珠，整体料，球，粒子，粒子床，纤维垫，颗粒，凝胶，膜，中空纤维膜，混合基质膜或表面。优选，固体载体具有珠的形式。
在所述实施方式中，固定化的酶能够使得便于从UMP和D-半乳糖制备尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，并且在反应完成之后容易地保留固定化的酶(例如通过保留在酶所固定化的珠上)然后在后续运行中重复使用或回收。所述固定化的生物催化过程使得进一步的效率和成本降低成为可能。此外，本发明方法能够以连续方式进行：使步骤A)的进料溶液通过含有固定化在固体载体上的一组酶的反应器。
从而，在一种实施方式中，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供进料溶液，包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的共固定化在固体载体上的一组酶；其中包含所述组的固定化酶的固体载体位于化学反应器中,
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：使得来自步骤A)的进料溶液连续通过化学反应器，所述化学反应器负载包含所述组的固定化酶的固体载体。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供进料溶液，包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和焦磷酸酶的共固定化在固体载体上的一组酶；其中包含所述组的固定化的酶的固体载体位于化学反应器中,
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：使得来自步骤A)的进料溶液连续通过化学反应器，所述化学反应器负载包含所述组的固定化酶的固体载体。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供进料溶液，包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的共固定化在固体载体上的一组酶；其中包含所述组的固定化的酶的固体载体位于化学反应器中,
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：使得来自步骤A)的进料溶液连续通过化学反应器，所述化学反应器负载包含所述组的固定化酶的固体载体。
酶固定化方法是本领域熟知的。酶能够非共价地或共价地结合，比如吸附、共价结合、离子结合、金属结合、交联或结晶。将酶缀合和固定化至固体载体(例如树脂、膜、珠、玻璃等)的各种方法是本领域熟知的并且描述于例如：Yi et al.,Process Biochemistry2007,42,895；Martin et al.,Applied Microbiology and Biotechnology 2007,76,843；Koszelewski et al.,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2010,63,39；Truppo et al.,Org.Process Res.Dev.,2011,15,1033；Mateo et al.,BiotechnologyProgress,2002,18,629。优选，在本发明方法中用于产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的酶共价结合至固体载体。
在本文描述的本发明方法中所用的酶，亦即葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-域多磷酸激酶、2-域多磷酸激酶和焦磷酸酶是技术人员熟知的并且能够通过本领域技术人员熟知的任何方法获得。特别地，酶能够在微生物学培养物中过表达、从其分离或通过重组体方法从其制备，所述微生物学培养物包含细菌培养物比如大肠杆菌、病毒和噬菌体培养物和真核细胞培养物。本文描述的本发明方法不限于来自实验部分描述来源的酶。从而，本发明方法能够用普通蛋白质表达或分离技术用得自各种来源的上文所列酶进行。此外，技术人员熟知根据使用方法的特定应用调整酶的制备。例如，上文所列酶能够通过用非动物来源的细菌生长培养基比如包含土豆胰蛋白胨的Luria-Bertani肉汤在大肠杆菌中表达。
在一种实施方式中，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含SEQ ID NO:4中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，半乳糖激酶包含SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，多磷酸激酶包含SEQ ID NO:3中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，尿苷一磷酸激酶包含SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，1-域多磷酸激酶包含SEQ ID NO:6中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，2-域多磷酸激酶包含SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，焦磷酸酶包含SEQ ID NO:5中描述的氨基酸序列，或者具有与所述序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。
从而，在一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含SEQ ID NO：4中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；其中半乳糖激酶包含SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；其中多磷酸激酶包含SEQ ID NO：3中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；其中尿苷一磷酸激酶包含SEQ ID NO：2中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；其中1-区域多磷酸激酶包含SEQ ID NO：6中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；其中2-区域多磷酸激酶包含SEQ ID NO：7中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列；和其中焦磷酸酶包含SEQ ID NO：5中描述的氨基酸序列，或具有与所述序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列。
得自发酵过程、细胞匀化或细胞裂解的含酶溶液(通常离心和过滤以除去细胞碎片)能够直接用于将酶固定化在固体载体上。从而，不需要进一步的纯化步骤或分离步骤并且发酵肉汤、(粗制或纯化的)细胞裂解液或细胞匀化物能够用于将酶固定化在固体载体上，从而它们保留它们的活性、底物特异性、立体选择性和/或其它特性。
从而，本发明进一步涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从粗制细胞裂解液或细胞匀化物直接固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵肉汤直接固定化在固体载体上而无需预先纯化。
换言之，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵上清液直接固定化在固体载体上而无需预先纯化。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶的至少一种酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶的至少一种酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中所述一组酶的至少一种酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
用于本发明方法中所用酶的固定化的固体载体包括但不限于珠或树脂，所述珠或树脂包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有乙二胺官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有环氧官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/氨基C6间隔物官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/叔胺官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/季胺官能团的聚苯乙烯，具有阳离子/磺酸官能团的聚苯乙烯，具有羧酸酯官能团的聚丙烯酸，具有苯基官能团的聚苯乙烯，具有十八烷基官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有苯乙烯/甲基官能团的聚苯乙烯，具有Ni-NTA官能团的磁性二氧化硅颗粒，或具有磁铁矿核心和带有Ni-NTA官能团的葡聚糖壳的磁性纳米粒子。虽然原则上本领域已知的任何适宜的固体载体都能够用于本发明方法中，但Ni琼胶糖珠或Ni NTA琼胶糖树脂出于上文描述的原因并非优选。
用于固定化本发明方法所用酶的示范性固体载体包括但不限于sepabeads(Resindion)：EC-EP，包括EC-EP/S和EC-EP/M，EP112/S，EP112/M，EP113/S，EP113/M，EP403/M，EP403/S，EC-HFA/M，EC-HFA/S，HFA403/M，HFA403/S，EC-EA/M，EC-EA/S，EP400/SS和EC-HA；包括EC-HA/S和EC-HA/M，relizyme(Resindion)EA403/S；immobeads(ChiralVision)Imm150P，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，IB-ANI1，IB-ANI2，IB-ANI3，IB-ANI4，IB-CAT1，IB-ADS1，IB-ADS2，IB-ADS3和IB-ADS4；Eupergit(
Figure BDA0003626820380000461
GmbH&Co.KG)；LifetechTM(Purolite)ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，ECR8409F，ECR8315F，ECR8309F，ECR1030F，8806F，8415F，1091M，1604；和磁性颗粒(micromod GmbH)：Nano-mag-D和Sicastar-M-CT。
优选，固体载体由选自下述的树脂或珠构成：sepabeads(Resindion)：EC-EP，EC-EP/S，EC-EP/M，EP112/S，EP112/M，EP113/S，EP113/M，EP403/M，EP403/S，EC-HFA/M，EC-HFA/S，HFA403/M，HFA403/S，EC-EA/M，EC-EA/S，EP400/SS和EC-HA；EC-HA/S，EC-HA/M，relizyme(Resindion)EA403/S；immobeads(ChiralVision)Imm150P，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，IB-ANI1，IB-ANI2，IB-ANI3，IB-ANI4，IB-CAT1，IB-ADS1，IB-ADS2，IB-ADS3和IB-ADS4；Eupergit(
Figure BDA0003626820380000462
GmbH&Co.KG)；LifetechTM(Purolite)ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，ECR8409F，ECR8315F，ECR8309F，ECR1030F，8806F，8415F，1091M，1604；和磁性颗粒(micromod GmbH)：Nano-mag-D和Sicastar-M-CT。
更优选，固体载体由选自下述的树脂或珠构成：EC-EP，EP403/M，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，
Figure BDA0003626820380000463
CM，ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，EP403/S，和EP400/SS。
从而，本发明进一步涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述固体载体由选自下述的树脂或珠构成：EC-EP，EP403/M，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，
Figure BDA0003626820380000472
CM，ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，EP403/S，和EP400/SS。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述固体载体由选自下述的树脂或珠构成：EC-EP，EP403/M，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，
Figure BDA0003626820380000471
CM，ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，EP403/S，和EP400/SS。
优选，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述固体载体由选自下述的树脂或珠构成：EC-EP，EP403/M，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，
Figure BDA0003626820380000481
CM，ECR8215F，ECR8204F，ECR8209F，ECR8285，EP403/S，和EP400/SS。
另外，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的固定化在固体载体上的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述固体载体由珠或树脂构成，所述珠或树脂包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有乙二胺官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有环氧官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/氨基C6间隔物官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/叔胺官能团的聚丙烯酸，具有阴离子/季胺官能团的聚苯乙烯，具有阳离子/磺酸官能团的聚苯乙烯，具有羧酸酯官能团的聚丙烯酸，具有苯基官能团的聚苯乙烯，具有十八烷基官能团的聚甲基丙烯酸盐/酯，具有苯乙烯/甲基官能团的聚苯乙烯，具有Ni-NTA官能团的磁性二氧化硅颗粒，或具有磁铁矿核心和带有Ni-NTA官能团的葡聚糖壳的磁性纳米粒子。
在一种实施方式中，酶共价地固定化在用环氧基团官能化的固体载体上，用作固体载体。固体载体比如甲基丙烯酸盐/酯聚合物具有高机械强度，使得它适于在反应器中以多次运行或循环使用。环氧基团与UDP-Gal级联的酶形成很稳定的共价键，从而它们保留它们的活性、底物特异性、立体选择性和/或其它特性，由此最小化酶在合成期间的过早洗脱。因此，所述固体载体能够在多次运行或循环重复使用而不损失酶活性或不降低转化或反应收率(参见图15)。从而，发明人已显示D-半乳糖和UMP向UDP-半乳糖的完全转化能够实现，即使酶所共价固定化的固体载体在多次循环中重复使用也如此。
优选，所述一组酶共固定化在可重复使用的、机械稳定的固体载体上，由此形成稳健的固体酶制备物。
在本发明的上下文中，可重复使用的、机械稳定的固体载体是允许在本发明产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法以及本文描述的其它本发明方法中多次使用的载体，从而共固定化在固体载体上的全部酶保留其大部分活性、底物特异性、立体选择性和/或其它特性或者使它们增加，从而酶并不从固体载体洗脱，并且固体载体并不由于机械应力而显著降解或磨损。此外，酶能够从粗制细胞裂解液或粗制细胞匀化物直接共固定化在可重复使用的、机械稳定的固体载体上并且所述固体载体能够以许多次循环(例如20批次循环和更多)使用；或者在本文描述的本发明方法连续运行的情况下，可重复使用的、机械稳定的固体载体能够在延长的时间内使用。术语"稳健的固体载体"在本文中与可重复使用的、机械稳定的固体载体同义地使用，所述载体i)允许所述一组酶从粗制细胞裂解液或粗制细胞匀化物共固定化，ii)保留共固定化的全部酶的大部分活性或使其增加，iii)允许以许多次循环(例如20批次循环和更多)合成靶标产品，或在本文描述的本发明方法连续运行的情况下，固体载体能够在延长的时间内使用。
优选，可重复使用的、机械稳定的固体载体能够在至少3次循环，更优选在至少4次循环，更优选在至少5次循环，更优选在至少6次循环，更优选在至少7次循环，更优选在至少8次循环，更优选在至少9次循环，更优选在至少10次循环，更优选在至少12次循环，更优选在至少14次循环，更优选在至少16次循环，更优选在至少18次循环，更优选在至少20次循环，更优选在至少25次循环，更优选在至少25次循环，更优选在至少30次循环，和最优选在至少50次循环的本文描述的本发明方法中使用。
从而，本发明的又一方面涉及包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；其中所述一组酶共固定化在具有用环氧基团官能化的高机械强度骨架的聚合物固体载体上。优选，所述一组酶共固定化在用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯聚合物上。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶也包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。
优选，具有高机械强度骨架的固体载体具有珠的形式。优选，珠具有范围150μm-300μm的颗粒尺寸。优选，固体载体是多孔的，其孔直径为
Figure BDA0003626820380000501
在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000502
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000503
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是高孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000504
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是进一步用丁基官能化的。
优选，固体载体是多孔的甲基丙烯酸盐/酯聚合物，其孔直径是
Figure BDA0003626820380000505
在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率甲基丙烯酸盐/酯聚合物，具有
Figure BDA0003626820380000506
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率甲基丙烯酸盐/酯聚合物，具有
Figure BDA0003626820380000507
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是高孔隙率甲基丙烯酸盐/酯聚合物，具有
Figure BDA0003626820380000508
的孔直径。在一种实施方式中，甲基丙烯酸盐/酯聚合物进一步用丁基官能化。
优选，用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯聚合物选自SEPABEADS EC-EP，RELIZYME EP403/M，SEPABEADS EC-HFA/M，RELIZYME HFA403/M，RELIZYME HFA403/S，SEPABEADS EC-HFA/S，RELIZYME EP403/S，RELISORB EP400/SS，
Figure BDA0003626820380000511
CM，LifetechTMECR8215F，LifetechTMECR8204F，LifetechTMECR8209F，LifetechTMECR8285，Imm150P，IB-COV1，IB-COV2和IB-COV3。
从而，本发明也涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共价地固定化在用环氧基团官能化的固体载体上。优选，固体载体是用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯聚合物。
另外，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共价地固定化在用环氧基团官能化的固体载体上。优选固体载体是用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯聚合物。
另外，本发明涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
其中所述一组酶共价地固定化在用环氧基团官能化的固体载体上。优选固体载体是用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯聚合物。
优选，固体载体具有珠的形式。优选，珠具有范围150μm-300μm的颗粒尺寸。优选，固体载体是多孔的，其孔直径为
Figure BDA0003626820380000521
在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000522
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000523
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是高孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000524
的孔直径。在一种实施方式中，固体载体是进一步用丁基官能化的。
优选，固体载体是珠形式的甲基丙烯酸盐/酯聚合物。优选，珠具有范围150μm-300μm的颗粒尺寸。优选，甲基丙烯酸盐/酯聚合物是多孔的，其孔直径为
Figure BDA0003626820380000525
在一种实施方式中，甲基丙烯酸盐/酯聚合物是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000526
的孔直径。在一种实施方式中，甲基丙烯酸盐/酯聚合物是低孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000531
的孔直径。在一种实施方式中，甲基丙烯酸盐/酯聚合物是高孔隙率的，具有
Figure BDA0003626820380000532
Figure BDA0003626820380000533
的孔直径。在一种实施方式中，甲基丙烯酸盐/酯聚合物是进一步用丁基官能化的。
在本发明的进一步的实施方式中，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括额外的步骤C)：
C)分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
在本发明的进一步的实施方式中，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括额外的步骤C)：
C)通过离子交换色谱法分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
从而，本发明进一步涉及产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
C)分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。
从而，在一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
C)分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
其中所述一组酶固定化或共固定化在固体载体上。
在一种实施方式中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖,
C)分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
其中所述一组酶从细胞裂解液共固定化在固体载体上。
优选，多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。
优选，UMP和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。
在本发明的一种实施方式中，尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖产生自尿苷和D-半乳糖。从而，在本发明方法步骤A)中的尿苷一磷酸得自尿苷，磷酸腺苷和尿苷激酶。从而，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i')尿苷和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含尿苷激酶，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶固定化或共固定化在固体载体上。优选，所述一组酶直接从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物共固定化在固体载体上。
优选，尿苷和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
在本发明的一种实施方式中，尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖产生自尿嘧啶，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸(PRPP)和D-半乳糖。从而，在本发明方法步骤A)中的尿苷一磷酸得自尿嘧啶，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶。从而，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i')尿嘧啶、磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含尿嘧啶磷酸核糖基转移酶，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶固定化或共固定化在固体载体上。
在本发明的一种实施方式中，尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖产生自乳清酸，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸(PRPP)和D-半乳糖。乳清酸在乳清酸磷酸核糖基转移酶存在下磷酰化并且所形成的乳清苷5'-磷酸(OMP)通过UMP合成酶脱羧生成尿苷一磷酸。从而，在本发明方法步骤A)中的尿苷一磷酸得自乳清酸，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸，乳清酸磷酸核糖基转移酶和UMP合成酶。从而，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i')乳清酸、磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含乳清酸盐/酯磷酸核糖基转移酶，UMP合成酶，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶固定化或共固定化在固体载体上。
换言之，产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i')尿苷一磷酸，和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
其中在步骤A)中的尿苷一磷酸得自尿苷，腺苷三磷酸和尿苷激酶；或尿嘧啶，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶。
半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子
在本发明的又一方面中，本文描述的本发明方法用于产生半乳糖基化的糖，半乳糖基化的糖肽，半乳糖基化的糖蛋白半乳糖基化的蛋白质，半乳糖基化的肽或半乳糖基化的小分子。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含尿苷激酶，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、焦磷酸酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子,
其中在步骤A)中以0.001摩尔至0.9摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.002摩尔至0.8摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.7摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.5摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.2摩尔每摩尔D-半乳糖的量，更优选以0.003摩尔至0.1摩尔每摩尔D-半乳糖的量，和最优选以0.005摩尔至0.05摩尔每摩尔D-半乳糖的量加入腺苷三磷酸。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
半乳糖基转移酶催化UDP-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基的反应，由此形成半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子和作为副产品的尿苷二磷酸(UDP)。UDP是在步骤B)中、特别是在步骤(b1)中形成的中间体产品，然后能够重复使用或回收。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b1)通过尿苷一磷酸激酶催化从尿苷一磷酸和腺苷三磷酸形成尿苷二磷酸(UDP)；
(b2)通过多磷酸激酶催化从尿苷二磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c)在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子；和
E)回收原位形成的尿苷二磷酸以形成尿苷三磷酸。
从而，在本发明的一种实施方式中产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖，进行如下：
(a)通过半乳糖激酶催化从D-半乳糖和腺苷三磷酸形成半乳糖1-磷酸(Gal-1-P),
(b1)通过尿苷一磷酸激酶催化从尿苷一磷酸和腺苷三磷酸形成尿苷二磷酸(UDP)；
(b2)通过多磷酸激酶催化从尿苷二磷酸和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)；和
(c')在葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶存在下，半乳糖1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖；和
(c”)在焦磷酸酶存在下使焦磷酸转化为磷酸；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子；和
E)回收原位形成的尿苷二磷酸以形成尿苷三磷酸。
由于在本文描述的本发明半乳糖基化方法中回收副产物尿苷二磷酸，在步骤A)中提供的溶液中需要较低量的UMP。从而，在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.0001至0.999，更优选0.0005至0.995，更优选0.001至0.995，更优选0.002至0.99和最优选0.005至0.98。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.05。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.1。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.2。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.5。
在又一实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是1至10，更优选1.2至8，更优选1.5至7，更优选1.6至6和最优选2至5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是1.5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是2。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是10。
优选，产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物分子或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物分子或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子,
F)分离半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
优选，产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子,
F)分离半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
优选，产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶、1-区域多磷酸激酶和/或2-区域多磷酸激酶和任选的焦磷酸酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；
C)分离尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子,
F)分离半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
优选，多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。
优选，UMP和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.02mM至50,000mM。更优选，UMP和D-半乳糖的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
优选，酶在所述一组酶中的浓度是0.0001mg/mL至100mg/mL，按在步骤A)中提供的溶液的总体积计。
优选，ATP在步骤A)中提供的溶液中存在的浓度是0.05mM至100mM，更优选0.1mM至90mM，更优选0.1mM至50mM，更优选0.2mM至20mM，更优选0.2mM至10mM，更优选0.2mM至5mM，和最优选0.5mM至3mM。
优选，在步骤A)中的所得溶液具有范围5.0-10.0，优选5.5-9.5，更优选6.0-9.0，还更优选6.5-9.0，仍更优选7.0-9.0的pH值和最优选范围7.5至8.5的pH值。
优选，在步骤A)提供的溶液中存在的Mg2+离子浓度是1mM至100mM，更优选1mM至90mM，更优选2mM至90mM，更优选5mM至90mM，更优选10mM至90mM，更优选15mM至80mM，更优选20mM至80mM和最优选20mM至50mM。
优选，产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子的方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子；
其中所述一组酶的至少一种酶或半乳糖基转移酶固定化在固体载体上。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶也包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶的各酶和半乳糖基转移酶共固定化在固体载体上。
在一种实施方式中，通过本文描述的本发明方法产生半乳糖基化的乳糖类。从而，在一种实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与乳糖类的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和乳糖类产生半乳糖基化的乳糖类。
优选，半乳糖基化的乳糖类是人乳寡糖。
优选，半乳糖基化的乳糖类选自包含下述的组：乳-N-二糖，乳-N-三糖，3’-半乳糖基乳糖，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳-N-新六糖，乳-N-六糖，乳-N-新八糖，乳-N-新八糖，对-乳-N-新六糖，乳-N-新十糖，2’-岩藻糖基乳糖，2’,3-二岩藻糖基乳糖，乳-N-岩藻戊糖I，乳-N-岩藻戊糖II，乳-N-岩藻新戊糖III，乳-N-二岩藻六糖I，F-对-乳-N-新六糖，F-乳-N-新六糖I，F-乳-N-新六糖II，DF-乳-N-新六糖，α1,2-岩藻糖基化的乳-N-新六糖I，α1,2-二岩藻糖基化的乳-N-新六糖，α1,2-1,3二岩藻糖基化的乳-N-新六糖I，α1,2-1,3二岩藻糖基化的乳-N-新六糖II，α1,2-1,3三岩藻糖基化的乳-N-新六糖I，α1,2-1,3三岩藻糖基化的乳-N-新六糖II，α1,2-1,3-四岩藻糖基化的乳-N-新六糖，3-岩藻糖基乳糖，乳-N-新岩藻五糖I，乳-N-新岩藻五糖V，乳-N-新岩藻五糖II，乳-N-新二岩藻六糖II，乳-N-二岩藻六糖II，α1,3-岩藻糖基化的乳-N-三糖II，二岩藻糖基化的对-乳-N-新六糖，α2,3-唾液酸基乳糖，α2,3-唾液酸基-乳-N-二糖，α2,6-唾液酸基乳糖，α2,6-唾液酸基乳-N-四糖，α2,6-唾液酸基乳-N-新四糖，α2,6-唾液酸基乳-N-新六糖(参见图14)。
在一种实施方式中，通过本文描述的本发明方法产生半乳糖基化的碳水化合物缀合物疫苗。从而，在一种实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与缀合物疫苗的碳水化合物抗原的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和碳水化合物缀合物疫苗产生半乳糖基化的碳水化合物缀合物疫苗。
优选，碳水化合物缀合物疫苗是CRM197缀合物，选自肺炎球菌糖，流感杆菌(H.influenzae)B型糖，和脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W或Y糖；TT缀合物，选自肺炎球菌糖，流感杆菌B型糖，和脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W或Y糖；DT缀合物，选自肺炎球菌糖，流感杆菌B型糖，和脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W或Y糖，肺炎球菌糖蛋白D缀合物，或流感杆菌B型糖OMPC缀合物，其中肺炎球菌糖优选选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。
在一种实施方式中，通过本文描述的本发明方法产生半乳糖基化的抗体药物缀合物。从而，在一种实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与抗体药物缀合物的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和抗体药物缀合物产生半乳糖基化的抗体药物缀合物。
优选，抗体-药物缀合物包含单克隆抗体和细胞毒性试剂。
在优选的实施方式中，半乳糖基化的治疗性蛋白通过本文描述的本发明方法产生(图13A+13B)。从而，在一种实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和治疗性蛋白的糖的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和治疗性蛋白产生半乳糖基化的治疗性蛋白。
优选，治疗性蛋白是免疫球蛋白总类的蛋白质。优选，免疫球蛋白总类的蛋白质是抗体。优选，抗体是单克隆抗体、包括双特异性单克隆抗体和基于抗体的药物。优选，抗体并非完全半乳糖基化的。优选，治疗性蛋白选自：
3F8，8H9，阿西莫单抗，Ascrinvacumab，阿塞珠单抗，阿特珠单抗，Atidortoxumab，阿替奴单抗(Atinuma)，阿托木单抗，Avelumab，Azintuxizumab vedotin，巴匹珠单抗，巴利昔单抗，巴维昔单抗，BCD-100，贝妥莫单抗，Begelomab，Belantamab mafodotin，贝利木单抗，Bemarituzuma，苯拉珠单抗，Berlimatoxumab，Bermekimab，Bersanlimab，柏替木单抗，贝索单抗，贝伐珠单抗，Bezlotoxumab，比西单抗，Bimagrumab，Bimekizumab，Birtamimab，比伐珠单抗mertansine，Bleselumab，兰妥莫单抗，Blontuvetmab，布索珠单抗，Bococizumab，Brazikumab，维布妥昔单抗，布雷奴单抗，布罗芦单抗，Brolucizumab，Brontictuzumab，Burosumab，Cabiralizumab，Camidanlumab tesirine，Camrelizumab，卡那奴单抗，美坎珠单抗，雷坎妥珠单抗，Caplacizumab，卡罗单抗喷地肽，卡芦单抗，Carotuximab，卡妥索单抗，cBR96-多柔比星免疫缀合物，西利珠单抗，Cemiplimab，Cergutuzumab amunaleukin，培舍珠单抗，Cetrelimab，西妥昔单抗，Cibisatamab，Cirmtuzumab，泊西他珠单抗，西妥木单抗，Clazakizumab，克立昔单抗，Clivatuzumabtetraxetan，Codrituzumab，Cofetuzumab pelidotin，Coltuximab ravtansine，可那木单抗，Concizumab，Cosfroviximab，CR6261，克瑞珠单抗，Crizanlizumab，Crotedumab，Cusatuzumab，达西珠单抗，达克珠单抗，达罗托株单抗，培化Dapirolizumab，达妥木单抗，Dectrekumab，Demcizumab，Denintuzumab mafodotin，地舒单抗，Depatuxizumabmafodotin，Derlotuximab biotin，地莫单抗，Dezamizumab，Dinutuximab，Diridavumab，Domagrozumab，阿托度莫单抗，Dostarlima，曲齐妥单抗，DS-8201，Duligotuzumab，Dupilumab，Durvalumab，Dusigitumab，Duvortuxizumab，依美昔单抗，依库珠单抗，埃巴单抗，依决洛单抗，依法珠单抗，Efungumab，Eldelumab，Elezanumab，Elgemtumab，依妥珠单抗，艾西莫单抗，Emactuzumab，Emapalumab，Emibetuzumab，Emicizumab，Enapotamabvedotin，依那妥珠单抗，Enfortumab vedotin，培化恩莫单抗，Enoblituzumab，Enokizumab，Enoticumab，恩妥昔单抗，西依匹莫单抗，依帕珠单抗，Eptinezumab，Erenumab，厄利珠单抗，Ertumaxomab，埃达珠单抗，Etigilimab，依曲利珠单抗，Evinacumab，Evolocumab，艾韦单抗，Fanolesomab，法拉莫单抗，Faricimab，法妥珠单抗，Fasinumab，FBTA05，泛维珠单抗，非扎奴单抗，Fibatuzumab，非拉妥珠单抗，芬妥木单抗，Firivumab，Flanvotumab，Fletikumab，Flotetuzumab，芳妥珠单抗，福雷芦单抗，福拉韦单抗，Fremanezumab，非苏木单抗，Frovocimab，Frunevetmab，Fulranumab，Futuximab，Galcanezumab，加利昔单抗，Gancotama，加尼妥单抗，更汀芦单抗，Gatipotuzumab，加维莫单抗，Gedivumab，吉妥珠单抗奥加米星，吉伏珠单抗，Gilvetmab，Gimsilumab，吉妥昔单抗，格巴妥木单抗vedotin，戈利木单抗，戈米利昔单抗，Gosuranemab，古塞库单抗，Ianalumab，伊巴珠单抗，IBI308，替伊莫单抗，艾芦库单抗，Idarucizumab，Ifabotuzumab，伊戈伏单抗，Iladatuzumab vedotin，IMAB362，Imalumab，Imaprelimab，英西单抗，Imgatuzumab，Inclacumab，雷英妥昔单抗，Indusatumab vedotin，Inebilizumab，英利昔单抗，伊诺莫单抗，伊珠单抗奥加米星，英妥木单抗，Iomab-B，伊匹木单抗，伊妥木单抗，Isatuximab，Iscalimab，Istiratumab，伊利珠单抗，伊卡珠单抗，凯利昔单抗，拉贝珠单抗，Lacnotuzumab，去氧胆酸vedotin，Lampalizumab，Lanadelumab，Landogrozumab，Laprituximab emtansine，Larcaviximab，来瑞珠单抗，来马索单抗，Lendalizumab，Lenvervimab，Lenzilumab，乐德木单抗，Leronlimab，Lesofavumab，Letolizumab，来沙木单抗，利韦单抗，Lifastuzumab vedotin，Ligelizumab，Lilotomab satetraxetan，林妥珠单抗，Lirilumab，Lodelcizumab，Lokivetmab，Loncastuximab tesirine，Lorvotuzumabmertansine，Losatuxizumab vedotin，卢卡木单抗，培化Lulizumab，鲁昔单抗，Lumretuzumab，Lupartumab amadotin，Lutikizumab，马帕木单抗，Margetuximab，Marstacima，马司莫单抗，马妥珠单抗，Mavrilimumab，美泊珠单抗，美替木单抗，米拉珠单抗，明瑞莫单抗，Mirikizumab，Mirvetuximab soravtansine，米妥莫单抗，Modotuximab，莫格利珠单抗，Monalizumab，莫罗木单抗，Mosunetuzumab，莫维珠单抗，帕西妥莫单抗，莫罗单抗-CD3，他那可单抗，那美芦单抗，他那莫单抗，Naratuximab emtansine，纳奈妥单抗，那他珠单抗，Navicixizumab，Navivumab，Naxitamab，奈巴库单抗，奈妥木单抗，Nemolizumab，NEOD001，奈瑞莫单抗，Nesvacumab，Netakimab，尼妥珠单抗，Nirsevimab，Nivolumab，巯诺莫单抗，Obiltoxaximab，Obinutuzumab，Ocaratuzumab，奥瑞珠单抗，奥度莫单抗，奥法木单抗，奥拉妥单抗，Oleclumab，Olendalizumab，奥洛珠单抗，奥马珠单抗，Omburtamab，OMS721，奥那妥珠单抗，Ontuxizumab，Onvatilimab，Opicinumab，莫妥珠单抗，奥戈伏单抗，Orticumab，奥昔珠单抗，Otilimab，Otlertuzumab，奥塞芦单抗，Ozanezumab，奥利珠单抗，帕昔单抗，帕利珠单抗，Pamrevlumab，帕木单抗，Pankomab，帕巴库单抗，Parsatuzumab，帕考珠单抗，Pasotuxizumab，帕替珠单抗，Patritumab，PDR001，Pembrolizumab，Pemtumomab，Perakizumab，培妥珠单抗，培克珠单抗，Pidilizumab，Pinatuzumab vedotin，Pintumomab，Placulumab，Plozalizumab，Pogalizumab，Polatuzumab vedotin，泊奈珠单抗，Porgaviximab，Prasinezumab，Prezalizumab，普立昔单抗，Pritoxaximab，普林木单抗，PRO140，Quilizumab，雷妥莫单抗，雷曲妥单抗，雷韦单抗，Ralpancizumab，雷莫芦单抗，Ranevetmab，雷珠单抗，Ravagalimab，Ravulizumab，雷昔库单抗，Refanezumab，瑞加韦单抗，Relatlimab，Remtolumab，瑞利珠单抗，利妥木单抗，Rinucumab，瑞莎珠单抗，利妥昔单抗，培化Rivabazumab，Rmab，罗妥木单抗，罗来度单抗，Romilkimab，Romosozumab，隆利珠单抗，Rosmantuzumab，Rovalpituzumab tesirine，罗维珠单抗，Rozanolixizumab，卢利珠单抗，SA237，Sacituzumab govitecan，沙马珠单抗，Samrotamab vedotin，Sarilumab，Satralizumab，沙妥莫单抗喷地肽，司库奴单抗，Selicrelumab，Seribantumab，Setoxaximab，Setrusumab，司韦单抗，SGN-CD19A，SHP647，西罗珠单抗，西法木单抗，塞妥昔单抗，Simtuzumab，西利珠单抗，Sirtratumab vedotin，西鲁库单抗，Sofituzumabvedotin，苏兰珠单抗，Solitomab，Sonepcizumab，松妥珠单抗，Spartalizumab，司他芦单抗，硫索单抗，Suptavumab，Sutimlimab，舒维珠单抗，Suvratoxumab，他贝芦单抗，他卡珠单抗tetraxetan，他度珠单抗，Talacotuzumab，他利珠单抗，Tamtuvetmab，他尼珠单抗，帕他莫单抗，Tarextumab，Tavolimab，替非珠单抗，阿替莫单抗，Telisotuzumab vedotin，替妥莫单抗，替奈昔单抗，替利珠单抗，Tepoditamab，替妥木单抗，Tesidolumab，Tetulomab，Tezepelumab，TGN1412，Tibulizumab，替加珠单抗，Tildrakizumab，Timigutuzumab，Timolumab，Tiragotumab，Tislelizumab，Tisotumab vedotin，TNX-650，托珠单抗，Tomuzotuximab，托利珠单抗，Tosatoxumab，托西莫单抗，Tovetumab，曲罗芦单抗，曲妥珠单抗，恩特曲妥珠单抗，TRBS07，曲利珠单抗，曲美木单抗，Trevogrumab，西莫白介素单抗，妥韦单抗，乌妥昔单抗，Ulocuplumab，乌瑞芦单抗，乌珠单抗，乌司奴单抗，Utomilumab，Vadastuximab talirine，Vanalimab，Vandortuzumab vedotin，Vantictumab，Vanucizumab，伐利昔单抗，Varisacumab，Varlilumab，伐利珠单抗，维多珠单抗，维妥珠单抗，维帕莫单抗，维森库单抗，维西珠单抗，Vobarilizumab，伏洛昔单抗，Vonlerolizumab，Vopratelimab，Vorsetuzumab mafodotin，伏妥莫单抗，Vunakizumab，Xentuzumab，XMAB-5574，扎芦木单抗，扎木单抗，Zatuximab，Zenocutuzumab，齐拉木单抗，Zolbetuximab(＝IMAB36，Claudiximab)，和阿佐莫单抗。
优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶。优选，所述一组酶也包含1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶还包含焦磷酸酶和1-域多磷酸激酶和/或2-域多磷酸激酶。优选，所述一组酶的各酶和半乳糖基转移酶共固定化在固体载体上。
在优选的实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在β-1,4-半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和抗体糖的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和抗体产生半乳糖基化的抗体。
在优选的实施方式中本发明方法包括下述步骤：
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)尿苷一磷酸和D-半乳糖；
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖；和
D)在β-1,4-半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和抗体糖的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和抗体产生半乳糖基化的抗体；和
E)回收原位形成的尿苷二磷酸以形成尿苷三磷酸。
由于在本文描述的本发明半乳糖基化方法中回收副产物尿苷二磷酸，在步骤A)中提供的溶液中需要较低量的UMP。从而，在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.0001至0.999，更优选0.0005至0.995，更优选0.001至0.995，更优选0.002至0.99和最优选0.005至0.98。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.05。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.1。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.2。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是0.5。
在又一实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是1至10，更优选1.2至8，更优选1.5至7，更优选1.6至6和最优选2至5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是1.5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是2。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是5。在一种实施方式中，UMP与D-半乳糖的摩尔比是10。
附图描述
图1：显示多酶级联，借此从低成本底物半乳糖、多磷酸盐和UMP酶法合成UDP-半乳糖。反应级联由下述组成：(a)从D-半乳糖和ATP形成半乳糖-1-磷酸(Gal-1P)，(b)从UMP和多磷酸盐形成尿苷三磷酸(UTP)，和(c)半乳糖-1-磷酸与尿苷三磷酸反应生成UDP-半乳糖。任选地，能够将无机二磷酸酶(PmPpa)加入反应级联以便水解抑制葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶的焦磷酸PPi。该级联还能够通过加入1D-PPK2帮助ADP转化为ATP而得以扩展。另外，该级联能够通过加入2D-PPK2活化AMP磷酸化为ADP而得以扩展。此外，该级联能够通过加入1D-PPK2和2DPPK2抑制磷酸腺苷频繁水解而得以扩展。
图2：显示本发明方法的示范性反应方案，用于起始自尿苷或尿嘧啶和5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸产生UDP-半乳糖。从尿苷形成UMP受尿苷激酶催化而从尿嘧啶形成UMP受尿嘧啶磷酸核糖基转移酶催化。
图3：显示通过表达模式B获得的纯化酶混合物的SDS-凝胶。
图4A：显示全部测量化合物的反应时间过程。
图4B：显示在0分钟反应时间之后进料溶液的HPAEC-UV色谱图。
图4C：显示在370分钟反应时间之后取得的等分试样的HPAEC-UV色谱图。
图5A：显示全部测量化合物的反应时间过程。
图5B：显示在0分钟反应时间之后进料溶液的HPAEC-UV色谱图。
图5C：显示在540分钟反应时间之后取得的等分试样的HPAEC-UV色谱图。
图6：显示在14小时反应时间之后的底物、代谢物和产品浓度，如HPAEC-UV/PAD所测。
图7：显示完整UDP-半乳糖级联的流程方案，起始自混合含有过表达的酶的生物质直至在固体载体上进行UDP-半乳糖的合成反应。该流程也适于为了酶固定化筛选各种固体载体。
图8：UDP-半乳糖合成的固体载体筛选结果。浓度通过HPAEC-UV测量。
图9：显示UDP-半乳糖级联与GalT耦合以糖工程改造商业抗体比如利妥昔单抗或赫赛汀的反应方案。
图10：显示利妥昔单抗(A)和通过本发明方法制备的半乳糖基化的利妥昔单抗(B)的电泳图(CGE-LIF分析)。
图11：显示在本发明方法的一阶段过程中半乳糖基化的利妥昔单抗的电泳图(CGE-LIF分析)。
图12：显示在本发明方法的二阶段过程中半乳糖基化的利妥昔单抗的电泳图(CGE-LIF分析)。
图13A：显示在二反应器设置中用于本发明的分子比如糖蛋白或抗体的半乳糖基化的过程方案。
图13B：显示在一步单反应器设置中用于本发明的分子比如糖蛋白或抗体的半乳糖基化的过程方案。将催化量UMP和D-半乳糖多磷酸盐加入含有待半乳糖基化的底物、负载本发明UDP-Gal级联酶和半乳糖基转移酶的珠的反应器。半乳糖基转移酶还可以存在于溶液中而不固定化在珠上。仅需要催化量UMP的原因是半乳糖基化反应中消耗的UDP-Gal在负载本发明UDP-Gal级联酶的珠、半乳糖和多磷酸盐存在下连续再生。
图14：显示示范性半乳糖基化的人乳糖。
图15：示范性地显示共固定化在用环氧基团官能化的甲基丙烯酸盐/酯珠上的UDP-Gal酶级联的可重复使用性。
图16显示在实验H的UDP-Gal级联中形成的中间体和产品。(A)UDP-Gal和尿苷；(B)UMP、UDP和UTP；(C)ADP、AMP和ATP。实验重复三次进行；误差线代表标准偏差。
图17显示在实施例I的UDP-Gal放大实验中形成的浸提物、中间体和产品，与小规模运行直接比较。(A)尿苷；(B)UDP-Gal；(C)UMP；(D)UDP；(E)UTP；(F)ADP；(G)ATP；和(H)AMP。
图18显示(A)含有LNnT的反应产物的色谱图和(B)反应产物的MS/MS谱。
图19显示形成对-乳-N-新六糖(对-LNnH)(实验K)的反应产品的MS/MS谱。
包括下述实施例以展示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应认识到，下文实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明实施当中效果良好的技术，从而能够视为构成其实施的优选模式。然而，本领域技术人员在参考本公开之后应理解，能够在所公开的特定实施方式中进行许多变化并且仍然获得类似或相似的结果而不背离本发明的主旨和范围。
参考本说明书，本发明各种方面的进一步修饰和可选实施方式对本领域技术人员来说将是明显的。相应地，本说明书仅解释为示例性并且用于教导本领域技术人员实施本发明的一般方式的意图。应理解在本文中显示和描述的本发明的形式被视为实施方式的例子。要素和物质可以代替本文说明和描述的那些，部分和过程可以颠倒，并且本发明的某些特征可以独立使用，在获得本发明说明书的益处之后全都对本领域技术人员是明显的。在本文描述的要素中可以进行改变而不背离下文权利要求中描述的本发明的主旨和范围。
实施例
缩写和首字母缩拼词
ADP 腺苷5'-二磷酸
AMP 腺苷5'-一磷酸
ATP 腺苷5'-三磷酸
dH2O 去离子水
IPTG 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷
LGTB 乳-N-新四糖生物合成糖基转移酶
UDP 尿苷5'-二磷酸
UMP 尿苷5'-一磷酸
UTP 尿苷5'-三磷酸
GTP 鸟苷5'-三磷酸
PolyP 多磷酸盐
PPi 焦磷酸
Pi 磷酸
PPK2 多磷酸激酶2
PPK3 多磷酸激酶3
1D-PPK2 1-域多磷酸激酶2
2D-PPK2 2-域多磷酸激酶2
GalU 葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶
GalT UDP-半乳糖基转移酶
BiGalK 半乳糖激酶
GalK 半乳糖激酶
URA6 尿苷一磷酸激酶
UPP 尿嘧啶磷酸核糖基转移酶
PmPpA 出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)无机焦磷酸酶
化学品&试剂
除非另有说明，全部化学品和试剂获自Sigma-Aldrich，并且具有可获得的最高纯度。固体载体得自Resindion，ChiralVision，
Figure BDA0003626820380000802
GmbH&Co.KG和micromod GmbH。
实施例1：酶的制备
将编码酶BiGalK，URA6，PPK3，GalU，1D-PPK2，2D-PPK2和PmPpA的基因克隆入列于表1的标准表达载体。
表1：该实施例中所用的酶
Figure BDA0003626820380000801
转化、培养、表达
对于全部基因表达，将大肠杆菌BL21 Gold(DE3)用作宿主有机体，除非另有说明。
基因表达：一种酶，一种培养(表达模式A)。
质粒和储备培养物
从早先的研究获得大肠杆菌培养物的储备溶液，所述培养物携带具有GalU、PPK3、URA6、PmPpa、1D-PPK2的基因序列的质粒(pET28a，具卡那霉素抗性)(参见[1，2])。储备溶液含有50％甘油并且保持在-20℃。
BiGalK基因序列的基因合成和向具有对氨苄西林的抗生素抗性的表达载体pET100/D-TOPO中的克隆通过供应商和根据早先公开的文献进行[3]。
将购买的质粒转移入大肠杆菌：将1μl质粒储备溶液转移入培养物大肠杆菌BL21Gold(DE3)。然后将溶液在冰上保持1小时，随后在42℃使细胞热休克1分钟。随后，将500μL的LB培养基加入，在37℃将混合物温育20分钟，随后于6000g和4℃离心溶液10分钟。弃去上清液，将细胞丸溶于100μl去离子H2O(dH2O)并在含有氨苄西林的LB琼脂板上铺开。琼脂板在37℃温育。在2mL斜面培养基中产生含有质粒的大肠杆菌细胞的储备溶液。
酶表达
对于异源基因表达，从储备溶液移除等分试样并且在含有相应抗生素的LB琼脂板上铺开。板在37℃培养过夜。在具挡板的摇动烧瓶中，用单一培养物来接种预培养物(分别含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄西林)。培养物一般生长至约4.2的OD600。将分别含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄西林的主要表达培养物典型地用1％预培养物接种并且在37℃培养至约0.6-0.8的OD600。然后将温度变化至16-20℃并且一般用0.4mM IPTG诱导表达。在一般20小时之后，一般在4℃通过6000xg进行30分钟收获培养物。所用培养基的自诱导(AI)培养基，LB和TB培养基。实验所用的培养基的更多细节参见下表2。
表2：详述用于大肠杆菌的生长培养基的内容物。全部培养基在使用前高压消毒。
Figure BDA0003626820380000821
酶纯化
质粒pET28a和pET100/D-TOPO具有N-末端His6-标签，从而酶用离子金属亲和力色谱法纯化，使用来自GE Healthcare的
Figure BDA0003626820380000822
初始系统和HisTrap高效或快速流柱(1mL柱体积)。为了纯化酶，在裂解缓冲剂(50mM HEPES(pH 7.5)，10mM Mg2+，300mM NaCl，10mM咪唑和5％甘油)中超声裂解细胞。
咪唑(500mM)用作在等度洗脱中的洗脱液(50mM HEPES(pH 7.5)，10mM Mg2+，300mMNaCl，500mM咪唑和5％甘油)。使用生产商推荐的标准条件。在纯化之后，酶浓度通过BCA测定测试并且通过SDS-凝胶评价。
基因表达：全部酶，一种培养(表达模式B)。
对于该部分描述的基因表达，使用来自Kerafast Inc的LOBSTR大肠杆菌表达菌株(基于大肠杆菌BL21 Gold(DE3))。将两种基因序列各自克隆入一种特定的表达载体中。形成携带全部三种表达质粒的大肠杆菌菌株。
克隆
对于所用的表达载体的抗性标记物和限制位点参见表3详述。
含有URA6和PPK3的基因序列的pACZDuet载体购自供应商。将GalU和PmPpA的基因序列通过酶法消化切割自分离的pET28a载体并且克隆入pCDFDuet表达载体。将酶法消化、PCR和连接的标准方案用于克隆。将来自pET100-D/TOPO的GalK和来自pET28a的NahK克隆入表达载体pRSFDuet1。空表达载体pCDFDuet和pRSFDuet1购自供应商。
基因构造由供应商基因测序确认。
表3：具有限制位点的基因序列和用于表达模式B的表达载体。
Figure BDA0003626820380000831
转化
通过热休克将全部质粒转化入LOBSTR大肠杆菌细胞(如"基因表达：一种酶，一种培养"部分描述)然后在含有全部选择标记物(氯霉素、大观霉素、卡那霉素)的LB琼脂板上铺板。从而，仅携带全部三种载体的那些细胞能在琼脂板上生长。
酶表达
对于本文描述的表达，使用含有下述浓度抗生素的TB培养基(34μg/mL氯霉素，50μg/mL大观霉素，和30μg/mL卡那霉素)。将细胞以15mL在30℃预培养过夜，并且将200mL原代培养物用1％预培养物接种并且在30℃培养至OD600＝0.8。将温度降至16℃并且加入0.5mMIPTG诱导表达。在20小时之后，通过于6000xg离心30分钟在4℃收获细胞。在裂解缓冲剂(50mM HEPES(pH 7.5)，10mM Mg2+，300mM NaCl，10mM咪唑和5％甘油)中超声裂解细胞。
纯化
如"基因表达：一种酶，一种培养"部分中描述。
酶浓度通过BCA测试来测定并且纯化通过SDS-凝胶评价(参见图3)。
测量
用具有UV(260nm)和脉冲电流检测(PAD)的高效阴离子交换色谱法(HPAEC)来测量反应物浓度。对于分析物分离和定量，开发并和确证步进梯度洗脱方法。色谱分离以系统流速0.5mL/min用无孔薄膜柱CarboPacTMPA1(250x2mm)进行。HPAEC系统(ICS5000)以及全部柱、组分和软件都购自Thermo Scientific(Waltham,USA)。
抗体上的糖通过PNG酶(PNGase)F处理和CGE-LIF分析来分析。分析遵循标准方案。
实施例2：UDP-半乳糖的均相制备-实验A、B和C
来自表达模式B的纯化酶用于这些实验。合成如下进行：不用1D-PPK2(实验A，参见图1途径)和用1D-PPK2(实验B)。反应体积是实验A的12μL和实验B的34μL，在HEPES(pH 7.5)缓冲水溶液中。反应温度是30℃。所用的纯化酶量是400μg。初始底物、缓冲剂、辅因子浓度和所用酶量如表4详述。
用于反应时间过程测量的反应等分试样猝灭如下。对于实验A，对反应取2μL等分试样和在298μL的90℃dH2O中稀释，对于实验B，将5μL稀释在315μL的90℃dH2O中。
表4：实验A和B中的底物、辅因子和缓冲剂浓度以及所用酶量。
化合物 实验A 实验B 实验C
HEPES(mM) 35 25 50
MgCl<sub>2</sub>(mM) 13 10
纯化的酶混合物(μg) 400 400 各种
1D-PPK2(μg) - 5.2 各种
UMP(mM) 3.5 2.8 2.5
ATP(mM) 1.8 1.3 2
D-半乳糖(mM) 3.5 2.8 2.5
PolyP<sub>25</sub>(mM) 5 3.75 6
实验A的反应时间过程示于图4A-C。在370分钟之后，相对UMP和半乳糖实现100％的UDP-半乳糖收率。该结果显示酶的该组合能够实现底物向UDP-半乳糖的完全转化。不存在明显的酶抑制且未发生副反应。检测到AMP，这显示ADP部分水解。
实验B的反应时间过程示于图5A-C。在540分钟之后，相对UMP和半乳糖实现100％的UDP-半乳糖收率。该结果显示酶的该组合能够实现底物向UDP-半乳糖的完全转化。不存在明显的酶抑制且未发生副反应。然而未检测到AMP，这显示在1D-PPK2存在下，在可检测量的ADP水解为AMP(参见实验A)之前ADP足够快速地转化回ATP。
在实验C中，测试各种酶浓度和研究该组合对生产能力的效果。酶如"基因表达：一种酶，一种培养(表达模式A)"部分中的详述表达。反应体积是100μl。在14小时反应时间之后猝灭反应：取得20μl等分试样并且将之稀释在480μl dH2O(90℃)中。
表5：用于实验C中4个反应的酶浓度。.
Figure BDA0003626820380000851
实验C的结果描述于图6。UDP-半乳糖在全部反应中成功形成。
实施例3：UDP-半乳糖的非均相制备-实验D
在实验D中，为了共固定化本发明UDP-半乳糖合成中所用的酶(参见图1)筛选宽范围的可商购固体载体(表7)并且评价它们对合成UDP-半乳糖的效果。如图7描述，将下述方案用于实验：将来自不同的培养物的生物质一起混合[参见图7步骤1]和在4℃以6000xg离心30分钟[步骤2]。所用培养物的组成详述于表8。将细胞丸再悬浮于60mL缓冲剂A[步骤3](参见表6)。超声裂解细胞[步骤4]。在超声之后，将浆料在4℃进行12 000xg离心45分钟[步骤5]除去细胞碎片，随后过滤通过1.2μm和0.8μm过滤器。在离心之后，除去上清液并保持在冰上。将给定质量的各固定化剂(参见表8)加至2mL低结合管。在用缓冲剂A温育大约2小时之后，除去上清液。随后，将0.5mL细胞裂解液加入各管和在4℃温育过夜(～12小时)[步骤6]。将珠用裂解缓冲剂B洗涤(3次)[步骤7]和将阻断缓冲剂(2M甘氨酸)加入，随后温育24小时[步骤8]。随后，弃去阻断缓冲剂和将珠用缓冲剂B(参见表6)洗涤三次。
为了在各种负载酶的珠上试验多酶级联，将含有底物的100μL进料溶液(参见表9)转移至含有珠的各管。反应在30℃和在振摇下(400rpm)进行约20小时。UDP-半乳糖浓度然后通过HPAEC-UV/PAD测量。结果描述于图8。显示的是，酶在共固定化在各式各样的可商购珠上的情况下有活性。
表6：实验D的缓冲剂组成。
Figure BDA0003626820380000861
表7：实验D中测试的固体载体表。
Figure BDA0003626820380000871
表8：用于实验D的含在E.coli中过表达的酶的培养物的总体积。
AI培养基(mL) LB培养基(mL) TB培养基(mL)
GalK 160 80
PPK3 80 120
URA6 120
GalU 200
PmPpa 40
1D-PPK2 80
表9：实验D中所用的进料溶液的浓度。
化合物 浓度(mM)
半乳糖 4.5
UMP 10.1
ATP 30
PolyP<sub>25</sub> 30
MgCl<sub>2</sub> 57
HEPES(pH 7.5) 100
实施例4：抗体的半乳糖基化-实验F和G
在实验F和G中，将固定化在固体载体ECR8285上的UDP-半乳糖级联与购自Sigma-Aldrich的可溶UDP-半乳糖基转移酶(GalT)耦合从而半乳糖基化可商购的抗体利妥昔单抗(购自Evidentic GmbH)。
预测试
在预测试(实验E)中，利妥昔单抗的糖谱通过PNG酶(PNGase)F消化和CGE-LIF分析(参见"测量"部分)。结果描述于图10A。能够发现，仅小部分的抗体Fc-域聚糖是完全半乳糖基化的。为了工程改造抗体的糖谱，将100μg利妥昔单抗与购买的UDP-Gal(购自Sigma-Aldrich，批号U4500)25毫单位GalT(来自Sigma-Aldrich，批号G5507)在50mM HEPES和10mMMnCl2中在30℃温育过夜。结果描述于图10B。CGE-LIF分析显示在反应之后全部检测到的聚糖都是半乳糖基化的。
级联与GalT的耦合
一阶段耦合
在实验F中，将进料溶液(250μL，参见表9)加至含固定化级联的ECR8285珠(52mg固体载体，在酶固定化在珠上之前测量重量)(来自实验D)。随后立即将100μg利妥昔单抗，GalT(25毫单位)和10mM的MnCl2加入。在30℃和于550rpm振摇24小时温育时间之后，反应上清液然后通过PNG酶F消化和CGE-LIF分析进行分析(参见部分"测量")。结果描述于图11。能够发现，全部聚糖都是半乳糖基化的。绝大多数聚糖是完全半乳糖基化的，而较小部分仅展示两个分支之一上的一个半乳糖部分，这指出实现完全半乳糖基化分别是温育时间和反应条件即反应物浓度优化的问题。
二阶段耦合-参见图13
在实验G中，100μg利妥昔单抗在二阶段过程中被半乳糖基化。在第一阶段，用ECR8285上固定化的酶级联来产生UDP-半乳糖。将52mg珠(在酶固定化之前测量重量)与进料溶液(100μL)在30℃温育24小时。在第二阶段，将上清液转移至含有100μg利妥昔单抗、25毫单位GalT和10mM MnCl2的又一反应器。反应物然后在30℃和550rpm温育约24小时。反应上清液通过PNG酶F消化和CGE-LIF分析进行分析(参见部分"测量")(参见图12)。与实验F相同，全部聚糖都是半乳糖基化的，其中绝大多数聚糖在两个分支上均展示半乳糖部分，这指出实现完全半乳糖基化分别是温育时间和反应条件即反应物浓度优化的问题。
实施例5：起始自尿苷合成UDP-Gal-实验H、I、J和K
酶的产生和纯化
该研究中所用的质粒列表示于表10。LOBSTR大肠杆菌活性细胞(Kerafast,US)用作表达宿主。细胞基于热休克方案转化。发酵在补充1.5mM MgSO4和相应抗生素的TB培养基中进行。将细胞在37℃培养直至0.8-1.0的OD600，随后用0.4mM IPTG进行诱导，随后在16℃培养20-24小时。所用全部化学品都来自Carbosynth Ltd。
在培养终点，离心(7000×g，20分钟)收获细胞并将细胞丸再悬浮在裂解缓冲剂(50mM MOPS缓冲剂，300mM NaCl，10mM MgCl2，10mM咪唑和5％甘油，pH 7.4)中，并且通过高压匀化(Maximator，德国)破坏(于800-1000psi通过3次)。将酶用固定化的金属亲和力色谱法(
Figure BDA0003626820380000892
GE Health care Life Sciences，Uppsala，Sweden)和与之组合的1mL或5mL HisTrap HP(GE Health care Life Sciences，Sweden)柱纯化。结合缓冲剂含有50mMMOPS缓冲剂，300mM NaCl，10mM MgCl2，10mM咪唑和5％甘油，pH 7.4。而洗脱缓冲剂由下述组成：50mM MOPS缓冲剂，300mM NaCl，10mM MgCl2，250mM咪唑和5％甘油，pH 7.4。
为了从洗脱缓冲剂除去咪唑和浓缩酶溶液，用
Figure BDA0003626820380000891
Ultra-15离心过滤单元-3KDa MW截止(Merck，德国)进行缓冲剂交换。交换缓冲剂含有50mM MOPS缓冲剂，300mMNaCl，10mM MgCl2，5％甘油，pH 7.4。随后，将渗余物溶液(浓缩的酶)与甘油1:1混合，获得50％甘油中的最终酶溶液。酶储存在-20℃。
表10：该实施例中所用的酶。
Figure BDA0003626820380000901
实验H-起始自尿苷用纯化的酶合成UDP-Gal
反应含有150mM Tris-HCl(pH 8.5)，75mM MgCl2，52mM尿苷，54mM Gal，0.6mMATP，20mM PolyPn，0.07μg/μL UDK，0.12μg/μL URA6/PPK3，0.17μg/μL GALK，0.12μg/μLGALU，0.06μg/μL PmPpa，总体积250μL。UDP-Gal的成功产生和中间体浓度示于图16。收率在24小时之后逼近100％。
实验I-用细胞裂解液从尿苷和Gal大规模产生UDP-Gal
为了制备细胞-裂解液混合下述生物质：UDK，3.46g；URA6/PPK3，5.20g；GALK，5.54g；GALU，5.70g；PmPpA，1.7g，在120mL的50mM HEPES缓冲剂(pH 8.1)中，400mM NaCl，和5％甘油。使混合物三次通过高压匀化器。将不含细胞的提取物于10,000xg离心45分钟。随后，进行小规模(200μL)初步实验找到对UDP-Gal合成适宜的裂解液量。发现的是，10％v/v的细胞裂解液足以进行合成。将这些发现直接用于5000×放大因子的1升规模合成。
为了进行1升实验，选择配有螺旋桨型推进器的旋转烧瓶来模拟搅拌槽反应器的条件。合成条件如下：150mM Tris-HCl(pH 8.5)，58mM尿苷，55mM Gal，6.2mM ATP，20mMPolyPn，和75mM MgCl2。反应在37℃和60rpm进行。为了理解放大对级联效能的效果，进行200μL的平行实验。级联中间体的时间过程示于图17。
实验J-乳-N-新四糖(LNnT)的一锅产生
在这些实验中，HMOS用重组Leloir糖基转移酶和核苷酸糖模块(UDP-Gal和UDP-GlcNAc)合成。首先合成核苷酸糖，随后将反应混合物与糖基转移酶和底物组合以产生靶标HMO。
UDP-Gal基于描述于表11的条件产生。全部反应都以约24小时温育时间，550rpm振摇，在37℃进行。随后，将含有产品UDP-Gal的75μL反应模块转移至含有0.2μg/μL LGTB(乳-N-新四糖生物合成糖基转移酶，来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B(菌株MC58)，在E.coli BL21中表达)，20个单位碱性磷酸酶(AP)，150μL乳-N-三糖(LNTII)，和156mM的MES缓冲剂(pH 5.5)的新小瓶。在温育过夜之后，反应产物的色谱图和MS/MS结果示于图18。
表11：产生UDP-Gal的反应条件。
Figure BDA0003626820380000911
Figure BDA0003626820380000921
实验K-对-乳-N-新六糖(对-LNnH)的一锅产生
将50μL含对-乳-N-新五糖的溶液与40μL的列于表11中的含有UDP-Gal作为反应产物的UDP-Gal反应混合物，和20个单位AP和0.2μg/μL的LGTB在MES缓冲剂(240mM-pH 6.5)中以总体积210μL混合。反应产物的MS/MS谱示于图19。
参考文献：
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<210> 1
<211> 416
<212> PRT
<213> 婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis) ATCC 15697
<220>
<223> 半乳糖激酶
<400> 1
Met Thr Ala Val Glu Phe Ile Glu Pro Leu Thr His Glu Glu Gly Val
1 5 10 15
Ser Gln Ala Thr Lys Leu Phe Val Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Pro Glu
20 25 30
Gly Val Trp Ala Ala Pro Gly Arg Val Asn Leu Ile Gly Glu His Thr
35 40 45
Asp Tyr Asn Ala Gly Leu Cys Leu Pro Ile Ala Leu Pro His Arg Thr
50 55 60
Phe Ile Ala Leu Lys Pro Arg Glu Asp Thr Lys Val Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Asp Lys Val Ala Glu Ala Asp Leu Asp Gly Leu Lys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Asp Gly Trp Ser Ala Tyr Pro Thr Gly Val Ala Trp
100 105 110
Ala Leu Arg Gln Ala Gly Phe Asp Lys Val Lys Gly Phe Asp Ala Ala
115 120 125
Phe Val Ser Cys Val Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ala Ala
130 135 140
Met Thr Cys Ser Thr Ala Leu Ala Leu Asp Asp Val Tyr Gly Leu Gly
145 150 155 160
Tyr Gly Asp Ser Asp Ala Gly Arg Val Thr Leu Ile Asn Ala Ala Ile
165 170 175
Lys Ser Glu Asn Glu Met Ala Gly Ala Ser Thr Gly Gly Leu Asp Gln
180 185 190
Asn Ala Ser Met Arg Cys Thr Glu Gly His Ala Leu Leu Leu Asp Cys
195 200 205
Arg Pro Glu Leu Thr Pro Leu Glu Asn Val Ser Gln Gln Glu Phe Asp
210 215 220
Leu Asp Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu Val Val Asp Thr Gln Ala Pro
225 230 235 240
His Gln Leu Asn Asp Gly Gln Tyr Ala Gln Arg Arg Ala Thr Cys Glu
245 250 255
Glu Ala Ala Lys Ile Leu Gly Val Ala Asn Leu Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Gly Ile Ser Lys Ala Asp Asp Gln Phe Gln Ala Leu Lys Glu Thr Leu
275 280 285
Asp Ala Leu Pro Asp Glu Thr Met Lys Lys Arg Val Arg His Val Val
290 295 300
Thr Glu Ile Glu Arg Val Arg Ser Phe Val Arg Ala Phe Ala Gln Gly
305 310 315 320
Asp Ile Lys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Asn Ala Ser His Asp Ser Leu
325 330 335
Ala Ala Asp Tyr Glu Val Thr Val Pro Glu Leu Asp Ile Ala Val Asp
340 345 350
Val Ala Arg Lys Asn Gly Ala Tyr Gly Ala Arg Met Thr Gly Gly Gly
355 360 365
Phe Gly Gly Ser Ile Ile Ala Leu Val Asp Lys Gly Gln Gly His Glu
370 375 380
Ile Ala Gln Lys Ile Ala Asp Arg Phe Glu Lys Glu Gly Phe Asn Ala
385 390 395 400
Pro Arg Ala Leu Pro Ala Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ser Arg Glu Ala
405 410 415
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> 鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<223> 尿苷一磷酸激酶
<400> 2
Met Gly Ser Val Asp Ala Ala Asn Gly Ser Gly Lys Lys Pro Thr Val
1 5 10 15
Ile Phe Val Leu Gly Gly Pro Gly Ser Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ala
20 25 30
Tyr Ile Val Glu His Tyr Gly Tyr Thr His Leu Ser Ala Gly Asp Leu
35 40 45
Leu Arg Ala Glu Ile Lys Ser Gly Ser Glu Asn Gly Thr Met Ile Gln
50 55 60
Asn Met Ile Lys Glu Gly Lys Ile Val Pro Ser Glu Val Thr Ile Lys
65 70 75 80
Leu Leu Gln Lys Ala Ile Gln Glu Asn Gly Asn Asp Lys Phe Leu Ile
85 90 95
Asp Gly Phe Pro Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala Ala Phe Glu Lys Val
100 105 110
Thr Glu Ile Glu Pro Lys Phe Val Leu Phe Phe Asp Cys Pro Glu Glu
115 120 125
Glu Met Glu Lys Arg Leu Leu Gly Arg Asn Gln Gly Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Asn Ile Glu Thr Ile Arg Lys Arg Phe Lys Val Phe Leu Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Pro Val Ile His Tyr Tyr Glu Ala Lys Gly Lys Val Arg Lys Ile
165 170 175
Asn Ala Ala Lys Pro Ile Glu Ala Val Phe Glu Glu Val Lys Ala Ile
180 185 190
Phe Ser Pro Glu Ala Glu Lys Val Glu Ala
195 200
<210> 3
<211> 301
<212> PRT
<213> 玫瑰杆菌(Ruegeria pomeroyi)
<220>
<223> 多磷酸激酶3
<400> 3
Met Asn Arg Asn Gly Ser Thr Lys Asp Pro Arg Arg Met Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ala Thr Gly Glu Ile Ser Arg Tyr Phe Asn Asp Lys Ala Pro Lys Asp
20 25 30
Ile Arg Arg Ala Ile Glu Lys Ala Asp Lys Asp Asp Ile Leu Ser Thr
35 40 45
Thr Tyr Pro Tyr Asp Ala Glu Met Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Ala Gln
50 55 60
Met Glu Ala Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Leu Gln Ala Trp Ile Lys
65 70 75 80
Gln Ser Gly Ala Arg Val Ala Leu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala
85 90 95
Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Arg Glu Asn Leu Asn Pro Arg
100 105 110
Gly Ala Arg Val Val Ala Leu Ser Lys Pro Thr Glu Ala Glu Arg Ser
115 120 125
Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro Ser Ala Gly Glu
130 135 140
Leu Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Gly Val Val Glu His
145 150 155 160
Val Phe Gly Trp Cys Asp Glu Glu Gln Arg Glu Arg Phe Phe Arg Gln
165 170 175
Val Met Pro Phe Glu His Asp Leu Val Asp Asp Gly Ile His Leu Phe
180 185 190
Lys Phe Trp Leu Asn Val Gly Arg Ala Glu Gln Leu Arg Arg Phe His
195 200 205
Asp Arg Glu Arg Asp Pro Leu Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Val Asp
210 215 220
Ile Ala Gly Leu Asp Lys Trp Glu Ala Tyr Thr Thr Ala Ile Ser Gln
225 230 235 240
Thr Leu Thr Arg Ser His Ser Asp Arg Ala Pro Trp Thr Val Ile Arg
245 250 255
Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Ala Ala Ile Arg Thr Val Leu
260 265 270
Ser Gly Ile Asp Tyr Asp Asn Lys Asp Arg Ala Ala Val Gly Gln Pro
275 280 285
Asp Ala Ala Ile Cys Gly Gly Pro Asp Ile Trp Asp Ala
290 295 300
<210> 4
<211> 302
<212> PRT
<213> E. coli K-12 MG1655
<220>
<223> 葡萄糖1-磷酸尿苷酰基转移酶
<400> 4
Met Ala Ala Ile Asn Thr Lys Val Lys Lys Ala Val Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Arg Met Leu Pro Ala Thr Lys Ala Ile Pro Lys Glu
20 25 30
Met Leu Pro Leu Val Asp Lys Pro Leu Ile Gln Tyr Val Val Asn Glu
35 40 45
Cys Ile Ala Ala Gly Ile Thr Glu Ile Val Leu Val Thr His Ser Ser
50 55 60
Lys Asn Ser Ile Glu Asn His Phe Asp Thr Ser Phe Glu Leu Glu Ala
65 70 75 80
Met Leu Glu Lys Arg Val Lys Arg Gln Leu Leu Asp Glu Val Gln Ser
85 90 95
Ile Cys Pro Pro His Val Thr Ile Met Gln Val Arg Gln Gly Leu Ala
100 105 110
Lys Gly Leu Gly His Ala Val Leu Cys Ala His Pro Val Val Gly Asp
115 120 125
Glu Pro Val Ala Val Ile Leu Pro Asp Val Ile Leu Asp Glu Tyr Glu
130 135 140
Ser Asp Leu Ser Gln Asp Asn Leu Ala Glu Met Ile Arg Arg Phe Asp
145 150 155 160
Glu Thr Gly His Ser Gln Ile Met Val Glu Pro Val Ala Asp Val Thr
165 170 175
Ala Tyr Gly Val Val Asp Cys Lys Gly Val Glu Leu Ala Pro Gly Glu
180 185 190
Ser Val Pro Met Val Gly Val Val Glu Lys Pro Lys Ala Asp Val Ala
195 200 205
Pro Ser Asn Leu Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ala Asp Ile
210 215 220
Trp Pro Leu Leu Ala Lys Thr Pro Pro Gly Ala Gly Asp Glu Ile Gln
225 230 235 240
Leu Thr Asp Ala Ile Asp Met Leu Ile Glu Lys Glu Thr Val Glu Ala
245 250 255
Tyr His Met Lys Gly Lys Ser His Asp Cys Gly Asn Lys Leu Gly Tyr
260 265 270
Met Gln Ala Phe Val Glu Tyr Gly Ile Arg His Asn Thr Leu Gly Thr
275 280 285
Glu Phe Lys Ala Trp Leu Glu Glu Glu Met Gly Ile Lys Lys
290 295 300
<210> 5
<211> 175
<212> PRT
<213> 出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) subsp. multocida str.Pm70
<220>
<223> 无机二磷酸酶
<400> 5
Met Gly Leu Glu Thr Val Pro Ala Gly Lys Ala Leu Pro Asp Asp Ile
1 5 10 15
Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Ala Asn Ser Asp Pro Ile Lys Tyr Glu
20 25 30
Val Asp Lys Glu Ser Gly Ala Leu Phe Val Asp Arg Phe Met Ala Thr
35 40 45
Ala Met Phe Tyr Pro Ala Asn Tyr Gly Tyr Val Asn Asn Thr Leu Ser
50 55 60
Leu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Pro Thr Pro Tyr Pro Leu
65 70 75 80
Gln Pro Gly Ser Val Ile Arg Cys Arg Pro Val Gly Val Leu Lys Met
85 90 95
Thr Asp Glu Ala Gly Ser Asp Ala Lys Val Val Ala Val Pro His Ser
100 105 110
Lys Leu Thr Lys Glu Tyr Asp His Ile Lys Asp Val Asn Asp Leu Pro
115 120 125
Ala Leu Leu Lys Ala Gln Ile Gln His Phe Phe Glu Ser Tyr Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Ala Gly Lys Trp Val Lys Val Asp Gly Trp Glu Gly Val Asp
145 150 155 160
Ala Ala Arg Gln Glu Ile Leu Asp Ser Phe Glu Arg Ala Lys Lys
165 170 175
<210> 6
<211> 304
<212> PRT
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<220>
<223> 1-域多磷酸激酶2
<400> 6
Met Asp Ser Tyr Gly Asp Thr Ser Gly Arg Ile Gly Arg Asp Trp Leu
1 5 10 15
Asp Arg His Asp Glu Glu Leu Glu Gln Glu Leu Leu Asp Asp Glu Leu
20 25 30
Asn Leu Asp Glu Leu Phe Gly Pro Glu Gln Glu Asp Ala Pro Gly Glu
35 40 45
Leu Ser Arg Arg Arg Tyr Phe Arg Glu Leu Phe Arg Leu Gln Arg Glu
50 55 60
Leu Val Lys Leu Gln Asn Trp Val Val His Thr Gly His Lys Val Val
65 70 75 80
Ile Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Val Ile Lys
85 90 95
Arg Ile Thr Gln Arg Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg Val Ala Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Asp Arg Glu Gln Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr
115 120 125
Val Ser His Leu Pro Ala Gly Gly Glu Ile Val Leu Phe Asp Arg Ser
130 135 140
Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Asn Asp
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Glu Glu Phe Phe Arg Ser Val Pro Glu Phe Glu Lys Met
165 170 175
Leu Ala Arg Ser Gly Ile Gln Leu Leu Lys Tyr Trp Phe Ser Ile Ser
180 185 190
Asp Ala Glu Gln His Leu Arg Phe Leu Ser Arg Ile His Asp Pro Leu
195 200 205
Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Leu Glu Ser Arg Arg Arg Trp
210 215 220
Glu Ala Tyr Thr Lys Ala Lys Glu Thr Met Leu Glu Arg Thr His Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ala Pro Trp Trp Val Val Gln Ala Asp Asp Lys Lys Arg Ala
245 250 255
Arg Leu Asn Cys Ile His His Leu Leu Gln Gln Met Pro Tyr Arg Glu
260 265 270
Val Pro Gln Pro Pro Val His Leu Pro Glu Arg Leu Arg His Ala Asp
275 280 285
Tyr Val Arg His Pro Thr Pro Gly Glu Ile Ile Val Pro Glu Val Tyr
290 295 300
<210> 7
<211> 496
<212> PRT
<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<220>
<223> 2-域多磷酸激酶2
<400> 7
Met Phe Glu Ser Ala Glu Val Gly His Ser Ile Asp Lys Asp Thr Tyr
1 5 10 15
Glu Lys Ala Val Ile Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Ala Gln Phe
20 25 30
Glu Leu Lys Gln Gln Ala Arg Phe Pro Val Ile Ile Leu Ile Asn Gly
35 40 45
Ile Glu Gly Ala Gly Lys Gly Glu Thr Val Lys Leu Leu Asn Glu Trp
50 55 60
Met Asp Pro Arg Leu Ile Glu Val Gln Ser Phe Leu Arg Pro Ser Asp
65 70 75 80
Glu Glu Leu Glu Arg Pro Pro Gln Trp Arg Phe Trp Arg Arg Leu Pro
85 90 95
Pro Lys Gly Arg Thr Gly Ile Phe Phe Gly Asn Trp Tyr Ser Gln Met
100 105 110
Leu Tyr Ala Arg Val Glu Gly His Ile Lys Glu Ala Lys Leu Asp Gln
115 120 125
Ala Ile Asp Ala Ala Glu Arg Phe Glu Arg Met Leu Cys Asp Glu Gly
130 135 140
Ala Leu Leu Phe Lys Phe Trp Phe His Leu Ser Lys Lys Gln Leu Lys
145 150 155 160
Glu Arg Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asp Pro Gln His Ser Trp Lys Leu
165 170 175
Ser Pro Leu Asp Trp Lys Gln Ser Glu Val Tyr Asp Arg Phe Val His
180 185 190
Tyr Gly Glu Arg Val Leu Arg Arg Thr Ser Arg Asp Tyr Ala Pro Trp
195 200 205
Tyr Val Val Glu Gly Ala Asp Glu Arg Tyr Arg Ala Leu Thr Val Gly
210 215 220
Arg Ile Leu Leu Glu Gly Leu Gln Ala Ala Leu Ala Thr Lys Glu Arg
225 230 235 240
Ala Lys Arg Gln Pro His Ala Ala Pro Leu Val Ser Ser Leu Asp Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Leu Asp Ser Leu Asp Leu Gly Gln Tyr Leu Asp Lys Asp
260 265 270
Ala Tyr Lys Glu Gln Leu Ala Ala Glu Gln Ala Arg Leu Ala Gly Leu
275 280 285
Ile Arg Asp Lys Arg Phe Arg Gln His Ser Leu Val Ala Val Phe Glu
290 295 300
Gly Asn Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Arg Arg Val Thr Asp
305 310 315 320
Ala Leu Asp Pro Arg Gln Tyr His Ile Val Pro Ile Ala Ala Pro Thr
325 330 335
Glu Glu Glu Arg Ala Gln Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Arg His Ile
340 345 350
Pro Ala Arg Arg Gln Phe Thr Ile Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Gly Arg
355 360 365
Val Leu Val Glu Arg Ile Glu Gly Phe Cys Ala Pro Ala Asp Trp Leu
370 375 380
Arg Ala Tyr Gly Glu Ile Asn Asp Phe Glu Glu Gln Leu Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Ile Ile Val Val Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Gln Thr Gln
405 410 415
Met Glu Arg Phe Lys Glu Arg Glu Lys Thr Pro Tyr Lys Arg Tyr Lys
420 425 430
Ile Thr Glu Glu Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Gln Tyr Val
435 440 445
Asp Ala Val Gly Asp Met Val Asp Arg Thr Ser Thr Glu Ile Ala Pro
450 455 460
Trp Thr Leu Val Glu Ala Asn Asp Lys Arg Phe Ala Arg Val Lys Val
465 470 475 480
Leu Arg Thr Ile Asn Asp Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Lys Lys Asp Lys
485 490 495
<210> 8
<211> 416
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
<220>
<223> 半乳糖激酶
<400> 8
Met Thr Ala Val Glu Phe Ile Glu Pro Leu Thr His Glu Glu Gly Val
1 5 10 15
Ser Gln Ala Thr Lys Leu Phe Val Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Pro Glu
20 25 30
Gly Val Trp Ala Ala Pro Gly Arg Val Asn Leu Ile Gly Glu His Thr
35 40 45
Asp Tyr Asn Ala Gly Leu Cys Leu Pro Ile Ala Leu Pro His Arg Thr
50 55 60
Phe Ile Ala Leu Lys Pro Arg Glu Asp Thr Lys Val Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Asp Val Ala Pro Asp Lys Val Ala Glu Ala Asp Leu Asp Gly Leu Lys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Asp Gly Trp Ser Ala Tyr Pro Thr Gly Val Ala Trp
100 105 110
Ala Leu Arg Gln Ala Gly Phe Asp Lys Val Lys Gly Phe Asp Ala Ala
115 120 125
Phe Val Ser Cys Val Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ala Ala
130 135 140
Met Thr Cys Ser Thr Ala Leu Ala Leu Asp Asp Val Tyr Gly Leu Gly
145 150 155 160
Tyr Gly Asp Ser Asp Ala Gly Arg Val Thr Leu Ile Asn Ala Ala Ile
165 170 175
Lys Ser Glu Asn Glu Met Ala Gly Ala Ser Thr Gly Gly Leu Asp Gln
180 185 190
Asn Ala Ser Met Arg Cys Thr Ala Gly His Ala Leu Leu Leu Asp Cys
195 200 205
Arg Pro Glu Leu Thr Pro Leu Glu Asn Val Ser Gln Gln Glu Phe Asp
210 215 220
Leu Asp Lys Tyr Asn Leu Glu Leu Leu Val Val Asp Thr Gln Ala Pro
225 230 235 240
His Gln Leu Asn Asp Gly Gln Tyr Ala Gln Arg Arg Ala Thr Cys Glu
245 250 255
Glu Ala Ala Lys Ile Leu Gly Val Ala Asn Leu Arg Val Thr Ala Asp
260 265 270
Gly Ile Ser Lys Ala Asp Asp Gln Phe Gln Ala Leu Lys Glu Thr Leu
275 280 285
Asp Ala Leu Pro Asp Glu Thr Met Lys Lys Arg Val Arg His Val Val
290 295 300
Thr Glu Ile Glu Arg Val Arg Ser Phe Val Arg Ala Phe Ala Gln Gly
305 310 315 320
Asp Ile Lys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Asn Ala Ser His Asp Ser Leu
325 330 335
Ala Ala Asp Tyr Glu Val Thr Val Pro Glu Leu Asp Ile Ala Val Asp
340 345 350
Val Ala Arg Lys Asn Gly Ala Tyr Gly Ala Arg Met Thr Gly Gly Gly
355 360 365
Phe Gly Gly Ser Ile Ile Ala Leu Val Asp Lys Gly Arg Ser Gln Glu
370 375 380
Val Ala Gln Lys Ile Ala Asp Glu Phe Glu Lys Gln Gly Phe His Ala
385 390 395 400
Pro Arg Ala Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Pro Ser Ala Ser Arg Glu Ala
405 410 415
<210> 9
<211> 213
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli) K-12
<220>
<223> 尿苷/胞苷激酶
<400> 9
Met Thr Asp Gln Ser His Gln Cys Val Ile Ile Gly Ile Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Gly Lys Ser Leu Ile Ala Ser Thr Leu Tyr Arg Glu Leu
20 25 30
Arg Glu Gln Val Gly Asp Glu His Ile Gly Val Ile Pro Glu Asp Cys
35 40 45
Tyr Tyr Lys Asp Gln Ser His Leu Ser Met Glu Glu Arg Val Lys Thr
50 55 60
Asn Tyr Asp His Pro Ser Ala Met Asp His Ser Leu Leu Leu Glu His
65 70 75 80
Leu Gln Ala Leu Lys Arg Gly Ser Ala Ile Asp Leu Pro Val Tyr Ser
85 90 95
Tyr Val Glu His Thr Arg Met Lys Glu Thr Val Thr Val Glu Pro Lys
100 105 110
Lys Val Ile Ile Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Thr Asp Ala Arg Leu
115 120 125
Arg Asp Glu Leu Asn Phe Ser Ile Phe Val Asp Thr Pro Leu Asp Ile
130 135 140
Cys Leu Met Arg Arg Ile Lys Arg Asp Val Asn Glu Arg Gly Arg Ser
145 150 155 160
Met Asp Ser Val Met Ala Gln Tyr Gln Lys Thr Val Arg Pro Met Phe
165 170 175
Leu Gln Phe Ile Glu Pro Ser Lys Gln Tyr Ala Asp Ile Ile Val Pro
180 185 190
Arg Gly Gly Lys Asn Arg Ile Ala Ile Asp Ile Leu Lys Ala Lys Ile
195 200 205
Ser Gln Phe Phe Glu
210

Claims (15)

1.产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖的方法，包括下述步骤：
Figure FDA0003626820370000011
A)提供溶液，所述溶液包含
(i)下式代表的尿苷一磷酸和D-半乳糖
Figure FDA0003626820370000012
(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和
提供包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；
B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D-半乳糖产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
2.根据权利要求1的方法，其中所述一组酶还包含焦磷酸酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述一组酶还包含1-域多磷酸激酶2。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述一组酶还包含2-域多磷酸激酶2。
5.根据权利要求1或4的方法，其中所述一组酶的至少一种酶固定化在固体载体上。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述一组酶共固定化在固体载体上。
7.根据权利要求6的方法，其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物直接共固定化在固体载体上。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中尿苷一磷酸和D-半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.2mM至15,000mM。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中在单一反应混合物中产生尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤A)中的尿苷一磷酸得自尿苷，腺苷三磷酸和尿苷激酶；或得自尿嘧啶，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶；或得自乳清酸，5-磷酸基-α-D-核糖1-二磷酸，乳清酸磷酸核糖基转移酶和UMP转移酶。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，还包括下述步骤：
D)在半乳糖基转移酶存在下，通过在尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖与糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子的可用羟基之间形成O-糖苷键，从尿苷5′-二磷酸基-α-D-半乳糖和糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子产生半乳糖基化的糖、半乳糖基化的糖肽、半乳糖基化的糖蛋白、半乳糖基化的蛋白质、半乳糖基化的肽、半乳糖基化的生物缀合物或半乳糖基化的小分子。
13.根据权利要求12的方法，其中所述糖、糖肽、糖蛋白、蛋白质、肽、生物缀合物或小分子是抗体或单克隆抗体；或人乳寡糖或生物缀合物，优选碳水化合物缀合物疫苗或抗体药物缀合物。
14.根据权利要求12或13的方法，还包括下述步骤：
E)回收步骤D)中形成的尿苷二磷酸以获得尿苷三磷酸。
15.包含葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；其中所述一组酶共固定化在用环氧基团官能化的固体载体上。
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