CN114630672A - 肉毒杆菌毒素的微结构制备技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制备技术。本发明的肉毒杆菌毒素的微结构制备技术能够精细调节肉毒杆菌毒素的浓度，减轻其施用于人体时的疼痛，并使毒素能够注射到准确的施用部位。因此，该技术有望在肉毒杆菌毒素安全、方便的医疗应用中得到广泛应用。

Description

肉毒杆菌毒素的微结构制备技术

[技术领域]

本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制备技术。

[背景技术]

从19世纪90年代至今，已发现了各种分泌具有神经毒性作用的毒素的梭菌属，并且在过去70年中研究了这些菌株分泌的毒素的特征(Schant，E.J.等人，Microbiol.Rev.,56:80,1992)。在这些毒素中，肉毒杆菌毒素根据其血清学特征分为七种亚型，包括A型至G型，并且在具有神经系统功能的动物中，通过抑制乙酰胆碱在神经肌肉接头的胆碱能前突触处的胞外分泌，而引起全身性虚弱。已知肉毒杆菌毒素的B、D、F和G型在特定位点裂解小突触泡蛋白，A和E型在特定位点裂解SNAP25，以及C型在特定位点裂解突触融合蛋白。因此，最近已经研究了将肉毒杆菌毒素的神经毒性用于美容或治疗目的。已提出或尝试了通过利用肉毒杆菌毒素技术治疗各种自主神经系统疾病，包括视神经疾病，疼痛和多汗，偏头痛，术后疼痛和内脏疼痛，牛皮癣和皮炎，各种癌症和神经源性炎症。

然而，肉毒杆菌毒素是已知的生物毒素中最致命的物质，人体静脉注射或肌肉注射的半数致死量为1.3-2.1ng/kg，吸入时的半数致死量为10-13ng/kg。如上所述，肉毒杆菌毒素对各种疾病具有很强的治疗效果，但是其毒性也强，很少的量也足以致命，因此，当肉毒杆菌毒素用于活体时，精细的浓度控制技术和向精确部位给药的技术是必需的。

同时，微结构包括微针、微刀片(microblade)、微刀(microknife)、微纤维、微刺(microspike)、微探针、微倒钩(microbarb)、微阵列或微电极，其中，微针是指通过用细针刺穿皮肤来加强药物渗透的技术。特别地，当使用微针递送肉毒杆菌毒素时，毒素通过数十至数百个微针进行注射，因此可以减轻注射引起的疼痛，并且可以克服由于毒素未能精确地施用于所需部位而导致的副作用。

因此，本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术，其中使用了本发明的微结构来减轻肉毒杆菌毒素施用时的疼痛，并有助于在精确的部位少量施用毒素。因此，本发明有望广泛应用于安全便捷的医疗应用中。

[发明内容]

[技术问题]

为了解决上述的现存技术问题，提供了本发明，并且提供了肉毒杆菌毒素的微结构制备技术。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员从下面的描述中可以全面地理解上述未提及的其它问题。

[技术方案]

在下文中，将参照各种实施方式描述本发明。为了全面理解本发明，下文描述中阐述了许多具体细节，例如具体的形式、组成和过程等。然而，某些实施方式可以在缺少一个或多个该些具体细节的情况下实施，或者与其他已知的方法和形式结合实施。在另一实施例中，已知的过程和制备技术没有特别进行详细描述，以免不必要地使本发明难以理解。在本说明书中，对“一个实施方式”或“实施方式”的引用意味着在本发明的一个或多个实施方式中包括结合该实施方式描述的特定特征、形式、组合或性质。因此，在本说明书的各处出现的“一个实施方式”或“实施方式”的表述不一定指本发明的同一个实施方式。另外，特定特征、形式、组合或性质可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。

除另有特别定义外，本说明书中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

在本发明的一个实施方式中，“肉毒杆菌毒素”是由肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒性蛋白。根据形态和功能进行分类，梭菌属内有127或更多种。厌氧革兰氏阳性菌肉毒梭状芽孢杆菌产生肉毒杆菌毒素，其为强效多肽神经毒素，可引起人类和动物的神经麻痹症，称为肉毒中毒。肉毒梭状芽孢杆菌的孢子存在于土壤中，可以在未充分消毒和密封的家庭罐头食品容器中生长，并导致许多肉毒中毒事件。典型地，肉毒中毒症状在食用感染肉毒梭状芽孢杆菌培养物或孢子的食物后18至36小时出现。肉毒杆菌毒素通过肠道内壁时毒性似乎不会衰减，并表现出对胆碱能运动神经元的高亲和力。肉毒杆菌毒素中毒的症状可导致步态障碍、吞咽困难和言语障碍、呼吸肌麻痹及死亡。

A型肉毒杆菌毒素是人类已知最致命的天然生物制剂。市售A型肉毒杆菌毒素(纯化神经毒素复合物)的LD50为约50皮克(即1单位)。有趣的是，根据摩尔数计算，A型肉毒杆菌毒素比白喉毒素更致死18亿倍，比氰化钠更致死6亿倍，比眼镜蛇毒素更致死3000万倍，比霍乱更致死1200万倍。一单位(U)肉毒杆菌毒素可以被定义为个体体重18至20克的雌性瑞士韦伯斯特(Swiss Webster)小鼠腹膜内注射时的LD50。

通常，7种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素以神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G分别表征，通过特定类型的抗体中和来区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型在毒素作用的动物种类以及毒素引起的麻痹程度和持续时间上有所不同。例如，根据大鼠产生麻痹的速度进行测定，A型肉毒杆菌毒素比B型肉毒杆菌毒素强500倍。另外，测定到B型肉毒杆菌毒素在灵长类动物中即使以480U/kg(约为A型肉毒杆菌毒素灵长类LD50的12倍)施用也无毒性。肉毒杆菌毒素被认为以高亲和力结合胆碱能运动神经元，进入神经元并抑制乙酰胆碱的释放。它不仅可以通过吞噬作用和胞吞作用，还可以通过低亲和力受体被进一步吸收。

不管血清型如何，毒素中毒的分子机制是相似的，并似乎均涉及至少3个步骤。在该过程的第一步骤中，毒素通过毒素重链(H链或HC)和细胞表面受体之间的特异性相互作用，结合至靶神经元的突触前膜，各种类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的受体被认为是不同的。重链的羧基末端片段和Hc被认为对将肉毒杆菌毒素靶向细胞表面有重要意义。

在第二步骤中，毒素穿过中毒细胞的细胞质膜。首先，肉毒杆菌毒素通过受体介导的内吞被细胞吞噬，从而形成含有毒素的内体。毒素通过离开内体，进入细胞质中。该步骤被认为是由重链的氨基末端区域(HN)介导的，其在pH约5.5或更低时会引起毒素的构象变化。已知内体具有质子泵，其可降低内体内pH。构象变化使得毒素中的疏水残基暴露，使毒素能够与内体膜连接。随后毒素(或至少毒素的轻链)通过内体膜转运到细胞质中。

肉毒杆菌毒素活化机制的最后一步被认为包括连接重链和轻链的二硫键的减少。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性活性包含在全毒素的轻链中；该轻链是锌(Zn++)肽链内切酶，其选择性地切割蛋白，所述蛋白对含有神经递质的囊泡与质膜的细胞质表面的识别和对接，以及囊泡与质膜的融合是必需的。破伤风神经毒素以及B型、D型、F型和G型肉毒杆菌毒素引起突触小泡蛋白(也称为囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解，该蛋白是突触体膜蛋白。由于这些切割过程中的某一个，存在于细胞质面上的VAMP通常会被移除。血清型A和E切割SNAP-25。血清型C1曾被认为切割突触融合蛋白，但后来发现其切割突触融合蛋白和SNAP-25。除了B型(和破伤风毒素)切断相同的键之外，每种肉毒杆菌毒素特异性地切割不同的键。这些切割均会干扰囊泡-膜对接的过程，从而阻止囊泡内含物向胞外分泌。

肉毒杆菌毒素在临床上已被用于治疗以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉疾病(即运动疾病)。1989年，美国FDA批准了A型肉毒杆菌毒素复合物用于眼睑痉挛，斜视和面肌痉挛的必要治疗。随后，FDA还批准了A型肉毒杆菌毒素用于治疗颈肌张力障碍和治疗眉间纹，并且B型肉毒杆菌毒素被批准用于治疗颈肌张力障碍。与A型肉毒杆菌毒素相比，除它之外的其他肉毒杆菌毒素血清型似乎具有较低的效价和/或更短的作用持续时间。外周肌肉注射A型肉毒杆菌毒素通常在注射后一周内观察到临床疗效。单次肌内注射A型肉毒杆菌毒素产生的症状缓解典型持续时间平均约3个月，但显著更长的治疗作用期也已被报道。

尽管所有血清型的肉毒杆菌毒素似乎都抑制了神经肌肉接头处的神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白，和/或在不同位点切割这些蛋白来发挥作用的。例如，A型和E型肉毒杆菌都切割25kD突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但它们靶向该蛋白的不同氨基酸序列。B型、D型、F型和G型的肉毒杆菌毒素作用于VAMP(也称为突触小泡蛋白)，每种血清型在不同位点切割该蛋白。最后，C1型肉毒杆菌毒素似乎能够切割突触融合蛋白和SNAP-25二者。这些作用机制的差异可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效价和/或作用持续时间。特别地，可以在各种不同的细胞类型中发现肉毒杆菌毒素的底物。

对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型，肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量约为150kD。有趣的是，肉毒杆菌毒素是作为包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子和相关的非毒素蛋白的复合物被梭菌属细菌释放的。因此，A型肉毒杆菌毒素复合物可以以900kD、500kD和300kD形式被梭菌属细菌产生。B型和C1型肉毒杆菌毒素似乎仅作为700kD或500kD复合物产生。D型肉毒杆菌毒素作为300kD或500kD复合物产生。最后，E型和F型肉毒杆菌毒素仅作为约300kD的复合物产生。复合物(即分子量大于约150kD的)被认为包含无毒血凝素蛋白和非毒素无毒非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白(包括相关神经毒素复合物和肉毒杆菌毒素分子)可以针对肉毒杆菌毒素分子的变性提供稳定性，并在摄入肉毒杆菌毒素时保护其免受消化酸伤害。另外，由于肉毒杆菌毒素复合物较大(分子量-约150kD或更大)，肉毒杆菌毒素将从肌内注射肉毒杆菌毒素复合物的部位缓慢扩散。

此外，体外研究表明，肉毒杆菌毒素抑制钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素在脑干组织原代细胞培养物中的释放。此外，据报道，肉毒杆菌毒素能减少脊髓神经元原代培养物中甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，以及在脑突触体中的各种神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP、P物质和谷氨酸)的释放。因此，当以合适的浓度应用时，肉毒杆菌毒素可抑制大多数神经递质的刺激诱导释放。

可以根据已知方法，通过在发酵罐中培养肉毒杆菌培养物，然后收集和纯化发酵混合物来获得A型肉毒杆菌毒素。首先，所有的肉毒杆菌毒素血清型以非活性单链蛋白形式合成，其必须被蛋白酶切割或切开才能具有神经活性。产生肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G常常可以以活性形式从细菌培养物中回收。相比之下，由于肉毒杆菌毒素血清型C1、D和E由非蛋白水解菌株合成，因此从培养物中回收时通常是非活性的。血清型B和F可以由蛋白水解和非蛋白水解菌株二者产生，因此可以以活性或非活性形式回收。然而，举例而言，产生B血清型肉毒杆菌毒素的蛋白水解菌株仅切割产生的毒素的一部分。切断分子与未切断分子的确切比例取决于培养时间和培养温度。因此，如前所述，由于B型肉毒杆菌毒素的效力明显低于A型肉毒杆菌毒素，例如，任意样品中一定比例的B型肉毒杆菌毒素也将是无活性的。临床样品中无活性肉毒毒素分子的存在将增加样品的整体蛋白质负载，这对毒素的临床疗效无益，却与抗原性增加相关。此外，已知在相同剂量水平下，在肌内注射时，相比A型肉毒杆菌毒素，B型肉毒杆菌毒素活性持续时间较短，效力也较低。

肉毒梭状芽胞杆菌的Hall A菌株可以产生高质量结晶A型肉毒杆菌毒素，其特异效价≥3×10⁷U/mg，A260/A278小于0.60，特征为凝胶电泳有分离的条带。可以用已知的尚茨(Schantz)方法获得结晶A型肉毒杆菌毒素。通常，在合适的培养基中培养A型肉毒梭状芽孢杆菌以得到厌氧发酵物，并从中分离和纯化肉毒杆菌毒素A型复合物。这种已知的过程可用于从无毒蛋白质中分离纯亚型的肉毒杆菌毒素，例如，纯化A型肉毒杆菌毒素，其分子量约150kD，特异效价为1-2×10⁸LD50 U/mg或以上；纯化B型肉毒杆菌毒素，其分子量约156kD，特异效价为1-2×10⁸LD50 U/mg或以上；或纯化F型肉毒杆菌毒素，其分子量约155kD，特异效价为1-2×10⁷LD50 U/mg或以上。

肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合物可从本领域已知的化合物制剂商购得，纯肉毒杆菌毒素也可用于制备药物组合物。

通常，与酶一样，肉毒杆菌毒素(一种细胞内肽酶)的生物活性至少部分依赖于，例如其三维构象。因此，A型肉毒杆菌毒素的毒性可以通过加热、各种化学物质、表面划痕和表面干燥来去除。此外，当通过培养、发酵和纯化获得的已知毒素复合物被稀释至非常低的毒素浓度并用于制备药物组合物时，如没有合适的稳定剂，则已知毒素的毒性会被迅速除去。由于当毒素复合物被大量稀释时，其特异性毒性会迅速丧失，因此在每毫升含有几纳克毒素的溶液中稀释几毫克毒素是相当困难的。因为含有毒素的药物组合物可能在配制后的几个月或几年后使用，所以毒素应该用合适的稳定剂稳定处理。因此，在本发明中，为了稳定地控制肉毒杆菌毒素在体内的释放，有必要开发最佳的稳定剂技术。

据报道，A型肉毒杆菌毒素已经在临床上有如下应用：

典型地，对于体内施用一次肉毒杆菌毒素，肌内注射的一般持续时间为约3至4个月。然而，在某些情况下，A亚型可以发挥效果至12个月或以上，当用于治疗腺体，如治疗多汗症时，在某些情况下可持续27个月。

肉毒杆菌毒素除了在外周部位表现出药理作用外，也可以在中枢神经系统中表现出抑制作用。有报道肉毒杆菌毒素能够通过逆向运输溯回到脊髓区域。因此，在外周位置(例如肌内)注射的肉毒毒素可以逆向转运到脊髓。

肉毒杆菌毒素也被建议或用于治疗皮肤、骨骼和肌腱损伤、疼痛、各种自主神经疾病(包括多汗症、紧张性头痛、偏头痛、手术后疼痛和内脏痛)、毛发生长和毛发维护、银屑病和皮炎、肌肉损伤、各种癌症、平滑肌疾病、神经卡压综合征、痤疮、神经源性炎症、眼科疾病、胰腺疾病、前列腺疾病(包括前列腺增生、前列腺癌和尿失禁)、纤维肌痛和梨状肌综合症。

已知经修饰的化学偶联或重组融合到特定靶向部分的梭菌神经毒素或其片段(优选为肉毒杆菌毒素)可被用于施用到脊髓以治疗疼痛，已知靶向的肉毒杆菌毒素(即具有非天然结合部分的)可用于治疗各种病症。

此外，将肉毒杆菌毒素注射到胸肌中以控制胸部痉挛的技术是已知的，并且作为一种经皮肉毒杆菌毒素给药情况下的控释毒素植入物也是已知的。已知肉毒杆菌毒素可以用于：使嘴部的咀嚼或咬合肌肉萎缩，使得自身造成的伤口和由此导致的溃疡可以愈合；治疗良性囊性病变或肿瘤；治疗肛裂；并治疗某些类型的特异性皮炎。

另外，肉毒杆菌毒素可以具有在大鼠福尔马林模型中减轻诱发炎性疼痛的作用。此外，据报道，肉毒杆菌毒素神经阻断可导致表皮厚度的减少。最后，向足部施用肉毒杆菌毒素以治疗足部过度出汗、足趾痉挛、特发性足趾行走和足部肌张力失常是已知的。

破伤风毒素及其衍生物(即，具有非天然靶向部分)、片段、杂交物和嵌合体也可用于治疗。破伤风毒素与肉毒杆菌毒素很相似。因此，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素都是由密切相关的梭菌(破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)和肉毒梭状芽胞杆菌)产生的多肽。此外，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素均是由轻链(分子量：约50kD)和重链(分子量：约100kD)组成的双链蛋白质，所述轻链和重链通过单个二硫键共价结合。因此，破伤风毒素和七种肉毒杆菌毒素(非复合物)的分子量均为约150kD。此外，在破伤风毒素和肉毒杆菌毒素中，轻链均包含表现细胞内生物(蛋白酶)活性的结构域，而重链均包含受体结合(免疫原性)和细胞膜转运结构域。

并且，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素均对突触前胆碱能神经元表面神经节苷脂受体表现出高特异性亲和力。外周胆碱能神经元对破伤风毒素的受体介导内吞作用会导致逆向轴突转运，阻断中枢突触释放抑制性神经递质，以及痉挛性麻痹。相反地，外周胆碱能神经元对肉毒杆菌毒素的受体介导内吞作用几乎不会导致逆向转运、对中毒外周运动神经元的乙酰胆碱胞外分泌的抑制、和松弛性麻痹。

最后，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的生物合成和分子结构彼此相似。因此，破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素之间总体有34％的蛋白质序列同一性，对于某些功能结构域，序列同一性高达62％。

在本发明的一个实施方式中，所述“乙酰胆碱”是一种神经递质，首先作为胆碱和乙酸的酯被发现，其遍布在神经元中。乙酰胆碱的化学式为C₇H₁₆NO₂，分子量为146.21。

尽管有证据表明几种神经调节剂可以由同一神经元释放，但典型地在哺乳动物的神经系统中，一种类型的小分子神经递质仅各由一种神经元释放。神经递质乙酰胆碱由多个脑区中的神经元分泌，特别是运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、分布于骨骼肌中的某些类型的运动神经元、自主神经系统(交感和副交感神经系统)的神经节前神经元、肌梭纤维的袋1纤维(bag 1fiber)、副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的神经节后神经元。原本，交感神经系统的大部分神经节后神经元分泌的神经递质是去甲肾上腺素，只有通向汗腺、立毛肌(piloerector muscle)和某些血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能性的。在多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用(例如通过迷走神经抑制心率)。

自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递到身体中。交感神经系统的神经节前神经元从位于脊髓中间外侧角(intermediolateral horn)中的神经节前交感神经元细胞体延伸而来。从细胞体延伸出来的神经节前交感神经纤维与位于脊椎旁的交感神经节中或椎骨前神经节中的神经节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能性的，因此对神经节应用乙酰胆碱可以刺激交感和副交感神经节后神经元。

乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。毒蕈碱受体被发现存在于所有由副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的神经节后胆碱能神经元所刺激的效应细胞中。烟碱受体被发现存在于肾上腺髓质以及节后神经元细胞表面的自主神经节中，所述神经元位于交感神经和副交感神经系统的神经节前与神经节后神经元之间的突触处。烟碱受体还被发现存在于很多非自主神经末梢中，例如在神经肌肉接头处的骨骼肌纤维膜中。

当小而透明的细胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱即从胆碱能神经元中释放出来。多种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞，分别从大的致密核心囊泡中释放儿茶酚胺和甲状旁腺激素。PC12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养模型。当肉毒杆菌毒素经渗透(通过电穿孔)或直接注射到去神经细胞中时，其能在体外抑制两种化合物从两种细胞中释放。并且已知肉毒杆菌毒素抑制神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物中的释放。

神经肌肉接头是在骨骼肌中，通过肌肉细胞临近的轴突形成的。通过神经系统传递的信号引起末端轴突处的动作电位，并活化离子通道，导致神经递质乙酰胆碱从神经肌肉接头的运动终板处神经元的突触小泡中释放出来。乙酰胆碱穿过细胞外间隙，在肌肉终板的表面上与乙酰胆碱受体蛋白结合。一旦产生了足够的结合，肌肉细胞的动作电位就会引起特异性膜离子通道的变化，从而导致肌肉细胞收缩。然后乙酰胆碱从肌肉细胞中释放出来并在细胞外间隙中通过胆碱脂酶代谢。代谢产物回收到末端轴突中以再加工为乙酰胆碱。

在本发明的一个实施方式中，“微结构”包括微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列或微电极，但不限于此。特别地，在本发明中，所述微结构优选为微针。此外，当制造在本发明的用于医疗目的的微针时，其组成部分优选为“生物相容性或生物可降解材料”。在此，术语“生物相容性材料”是指对人体无毒且化学惰性的材料。此外，术语“生物可降解材料”是指可以在体内通过体液，酶或微生物降解的材料。

在本发明中，所述的微结构被制造为包含本发明的肉毒杆菌毒素组合物，其包含肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂作为活性成分，或者被本发明的肉毒杆菌毒素组合物包被。在此，所述微结构包括任何由本领域所使用的微结构制造方法制造的微结构，但本发明不受限于此。

在本发明的一个实施方式中，术语“微针”是指通过使用精细的针刺透皮肤来加强药物渗透的技术。微针主要用于活体内药物递送、采血、和体内分析物检测。

1998年，首个已知的微结构阵列在佐治亚理工学院(Georgia Institute ofTechnology)制备，其利用半导体工艺技术由硅元件制成，并提出了其作为皮下注射替代技术的可能性。

与其他现有针头不同，微针的特点是无痛穿透皮肤且无创伤，为了无痛穿透皮肤，使侵入性减小的尖端直径是很重要的。此外，由于微针必须穿透10-20μm的角质层(皮肤最强屏障)，因此需要具有足够的物理硬度。此外，为达到毛细管从而提高药物递送效率，合适的长度也需纳入考量。

在先前的面内型(in-plane type)微针被提出后，开发出了各种类型的微针。根据一种使用蚀刻方法制造面外型(out-plane type)固体微针的方法，制造了直径为50-100μm和直径为500μm的固体硅微针，但其无法实现无痛穿透皮肤，并且难以将药物和化妆品成分输送到所需区域。

同时，美国佐治亚大学的普劳斯尼茨(Prausnitz)提出了一种通过蚀刻玻璃或通过光刻成型模具来制备可生物降解的聚合物微针的方法。此外，2006年提出了一种通过在用光刻法制造的模具末端上负载胶囊形式的物质来制备可生物降解的固体微针的方法。该方法虽然有可以自由装载以胶囊形式制备的药物的优势，然而，随着负载药量的增加，微针的硬度降低，因此该方法对需要大量给药的药物的应用受到限制。

2005年，纳米器件和系统公司(Nano Device&Systems)提出了吸收型微针。这种吸收式微针用于药物递送或美容护理，而无需移除插入皮肤的微针。该方法通过将麦芽糖与药物混合制得的组合物注入模具中使其固化，来制备微针。该日本专利提出通过制备吸收式微针对药物进行透皮吸收，但是这类微针在穿透皮肤时会引起疼痛。此外，由于模具制造的技术限制，不可能制造具有不造成疼痛的适当尖端直径和有效递送药物所需的长度(即1mm或以上)的微针。

2008年，美国佐治亚大学的Prausnitz生产的可生物降解微针是在聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和甲基丙烯酸(MAA)的混合物制成的。此外，也有通过将羧甲基纤维素置入锥形模具中制备微针。然而，使用模具的制造方法的局限性在于，需要通过复杂的工艺制造新的模具来控制微针的直径和长度，以及将材料置入模具制造微针的过程复杂且耗时的缺点。

在2008年报道了使用引脚(pin)结构制造皮肤针的装置和方法。该方法是在底座上，通过加热或使用粘性材料的拉伸力，用引脚拉动基底。因为该方法涉及使用引脚结构拉动熔化的或粘性的材料，因此无法克服因需要根据所需样式制造新的引脚结构的步骤带来的成本上升的限制，并且由于存在加热过程，其难以负载各种热敏感生物药物(如激素、疫苗、其他蛋白质药物等)。

同时，皮肤自其表面起，由角质层(<20μm)、表皮(<100μm)和真皮(300-2500μm)构成。因此，为了将药物和生理活性物质递送到特定的皮肤层而不引起疼痛，微针制备为尖端直径约30μm、有效长度为200-2000μm、硬度足以穿透皮肤则能够有效地递送药物和化妆品成分。另外，为了通过可生物降解的固体微针递送药物或生理活性物质，在制造微针的过程中应当避免可能会破坏所述药物和生理活性物质的活性的任何过程，如高温处理或有机溶剂处理等。

由于生产方法的限制，传统的固体微针由限定的材料(如硅、聚合物、金属、玻璃等)制成，由于使用模具技术的制造方法复杂且制造期长，其具有药物变性、硬度不足和药物损失等缺点。因此，一直需要一种微针制造技术，该微针直径需足够小以在穿透皮肤时不引起疼痛，长度需足够长以深入穿透皮肤，具有足够的硬度且对材料无特别限制，并且能使药物的损失降至最低。

在本发明中，所述微结构的特征在于包被有含肉毒杆菌毒素的组合物，并且可以用聚合化合物对其进行预处理以提高包被的稳定性和效率。当所述微结构为微针时，所述聚合化合物优选为聚乳酸(PLLA)材料，而用于预处理的聚合化合物优选为聚乙烯醇(PVA)，但本发明并不限于此。PVA的浓度优选为1-10％，更优选为1-5％，进一步优选为1-3％，进一步优选为2％。

在本发明的一个实施方式中，所述“药物组合物”是指为特定目的施用的组合物。为了本发明的目的，本发明的药物组合物以精确控制的浓度将肉毒杆菌毒素精确施用于所需位置，并且所述药物组合物中可以包括蛋白质和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述“药学上可接受的”载体或赋形剂是指被政府的管理机构批准或在政府批准的药典或其他公认的药典中列出的，用于哺乳动物，尤其用于人类的。

所述含有适用于肠胃外给药的肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构可以被制备为油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，或固体或半固体的形式，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂、增溶剂和/或分散剂。该形式可以是灭菌的，并且可以是流体。其在制造和储存条件下可以是稳定的，并且可以防止诸如细菌或真菌的微生物的污染。或者，含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构可以是用于在使用前用合适的载体重构的无菌粉末。所述药物组合物可以以单位剂量形式、在微针贴剂、在安瓿、或在其它单位剂量或多剂量容器中存在。或者，所述药物组合物可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在使用前需要立即加入无菌液体载体，例如注射用水。即时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒或片剂制备。

在一些非限制性实施方式中，含有作为活性成分的肉毒杆菌毒素的微结构可以配制成液体，或者可以包含在微球形式中。在一个非限制性实施方式中，含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构液体组合物含有0.001-100000U/kg的肉毒杆菌毒素或药学上可接受的化合物和/或混合物。此外，在一个非限制性实施方式中，适用于含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构组合物的赋形剂包括防腐剂、悬浮剂、稳定剂、染料、缓冲剂、抗菌剂、抗真菌剂和等渗剂，例如糖或氯化钠。在此，术语“稳定剂”是指可选地用于本发明的药物组合物中，以增加保存期限的化合物。在一个非限制性实施方式中，稳定剂可以是糖、氨基酸、化合物或聚合物，其中糖可以是单糖、双糖或多糖，并且优选为双糖。双糖分为还原性双糖和非还原性双糖，其中还原性双糖具有游离的“半缩醛”单元，其中两个“还原性糖”中的一个单糖可以作为还原性“醛”，非还原性双糖是由两个单糖的无壳碳之间的缩醛形成键产生的，因此其中没有可以作为还原剂的半缩醛。还原性双糖的实例包括纤维二糖(Cel)和麦芽糖(Mal)，非还原性双糖的实例包括海藻糖(Tre)和蔗糖(Suc)。药物组合物可以含有一种或多种药学上可接受的载体。载体可以是溶剂或分散介质。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、生理盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油及其合适的混合物。

肠胃外制剂可以是灭菌的。灭菌技术的非限制性实例包括使用细菌抑制过滤器、终端灭菌、添加无菌试剂、辐照、应用无菌气体、加热、真空干燥和冷冻干燥。

在本发明的一个实施方式中，术语“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的组合物导入患者体内，并且本发明组合物的施用途径可以是任何能够使本发明的组合物到达目标组织的常规途径。施用途径可以是口服给药、腹膜内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药、腔内给药或鞘内给药，但对于本发明的含有肉毒杆菌毒素组合物作为活性成分的微结构而言，优选使用微针皮内给药。

本发明的治疗方法可以包括施用药学有效量的药物组合物。本发明的有效量可以根据各种因素调整，包括疾病的种类或严重程度，组合物中含有的活性成分和其它成分的种类和含量，制剂的种类，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，组合物的释放速率，疗程和同时使用的药物。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种肉毒杆菌毒素组合物，其含有作为活性成分的肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素；所述增稠剂是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素、钠盐；海藻酸钠；透明质酸；甲基纤维素；羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮；并且其含量为0.05-10wt％；所述稳定剂是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、蔗糖、海藻糖和蔗糖的混合物、蛋氨酸、磷酸钠以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物；并且其含量为0.03-50wt％。作为稳定剂，海藻糖和蔗糖的混合物是约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％海藻糖和约95％、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5％蔗糖的混合物。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种包含肉毒杆菌毒素组合物的微结构，其为选自下组的任何一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种制备肉毒杆菌毒素组合物的方法，所述肉毒杆菌毒素组合物含有混合的肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素；所述增稠剂是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素、钠盐；海藻酸钠；透明质酸；甲基纤维素；羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮；并且其以0.05-10wt％的量混合；所述稳定剂是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、蔗糖、海藻糖和蔗糖的混合物、蛋氨酸、磷酸钠以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物；并且其以0.03-50wt％的量混合。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种用肉毒杆菌毒素组合物包被目标对象的方法，其包括(a)用聚合化合物预处理包被目标对象；(b)混合肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂；(c)将(b)的混合物逐滴加入到(a)滴加的预处理包被对象中，然后进行干燥。在该方法中，所述聚合化合物可以是聚乙烯醇，其使用量为0.5-10wt％，所述肉毒杆菌毒素为A型肉毒杆菌毒素，所述增稠剂是选自下组的一种或多种：羧甲基纤维素、钠盐；海藻酸钠；透明质酸；甲基纤维素；羟乙基纤维素；和聚乙烯吡咯烷酮；所述稳定剂是选自下组的任何一种或多种：海藻糖和/或蔗糖、海藻糖和蔗糖的混合物、蛋氨酸、磷酸钠以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物；所述目标对象是微结构，所述微结构为微针。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种用于包被微结构的组合物，其包括肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素，所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

在用于包被微结构的组合物中，羟乙基纤维素和蔗糖的混合比例(w:w)可以为，相对于1份羟乙基纤维素，蔗糖量为大于30至小于90，50至80，60至80或60至70。

在用于包被微结构的组合物中，羟乙基纤维素和蔗糖的混合比例(w:w)可以为，相对于1份羟乙基纤维素，蔗糖量为大于30至小于90，优选地为50至80，更优选地为60至80，进一步优选地为60至70。

在本发明的另一个实施方式中，提供了包被有用于包被微结构的组合物的微结构。在该方法中，所述微结构是选自下组的任何一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种制备用于包被微结构的组合物的方法，其包括混合肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖。在该方法中，所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素，所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

在本发明的另一个实施方式中，提供了一种使用含肉毒杆菌毒素的组合物包被微结构的方法，其包括(a)混合肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖；(b)用(a)的混合物包被微结构表面。在该方法中，所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素，并且所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

在下文中，将详细逐步描述本发明。

[有益效果]

在具有神经功能的动物中，肉毒杆菌毒素抑制神经肌肉接头的胆碱能前突触处的乙酰胆碱的胞外分泌，从而引起系统性无力。肉毒杆菌毒素的神经毒性功能毒性很强，很少的量也足以致命，因此，当肉毒杆菌毒素用于活体时，精细的浓度控制技术和向精确部位给药的技术是必需的。本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制备技术，其中使用了本发明的微结构来减轻肉毒杆菌毒素施用时的疼痛，并有助于在精确的部位少量施用毒素。因此，本发明有望广泛应用于安全便捷的医疗应用中。

[附图说明]

图1显示了在本发明的一个实施方式中，预处理涂层材料对肉毒杆菌毒素绝对效价的回收率。

图2显示了在本发明的一个实施方式中，与肉毒杆菌毒素混合的增稠剂类型和浓度对肉毒杆菌毒素绝对效价的回收率。

图3显示了在本发明的一个实施方式中，与肉毒杆菌毒素混合的稳定剂类型和浓度对肉毒杆菌毒素绝对效价的回收率。

图4显示了在本发明的一个实施方式中，SA或HA增稠剂与稳定剂的组合的长期稳定性的测定结果。

图5显示了在本发明的一个实施方式中，PVP或HEC增稠剂与稳定剂的组合的长期稳定性的测定结果。

图6显示了在本发明的一个实施方式中，确认含肉毒杆菌毒素的包被组合物的包被均匀性的结果。

图7显示了在本发明的一个实施方式中，通过HEC:Suc组合物混合比例对测量到的包被组合物粘度值进行回归分析的结果。

图8显示了在本发明的一个实施方式中，通过HEC:Suc组合物混合比例对测量到的包被组合物表面张力进行回归分析的结果。

图9显示了在本发明的一个实施方式中，各混合比例的HEC:Suc组合的包被组合物均匀性结果的一组图像。

图10显示了在本发明的一个实施方式中，包被组合物的包被均匀性的结果，表示为通过HEC：Suc组合物混合比例对总像素数的相对标准偏差进行回归分析的结果。

图11显示了在本发明的一个实施方式中，各混合比例的HEC:Suc组合的包被组合物长期稳定性的结果。

[发明实施方式]

为了测试PVP或HEC增稠剂与双糖或氨基酸稳定剂组合的长期稳定性，在制备和滴加肉毒杆菌毒素包被组合物后，在37℃下进行了5周的加速稳定性试验。使用海藻糖(Tre)和/或蔗糖(Suc)作为双糖稳定剂，蛋氨酸(Met)和甘氨酸(Gly)作为氨基酸稳定剂。结果，证实使用PVP或HEC作为增稠剂且双糖或蛋氨酸作为稳定剂的条件是制备肉毒杆菌毒素包被组合物的最佳稳定组合。

[实施例]

以下将参考实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例只是为了更具体地解释本发明，对于本领域普通技术人员来说，本发明的范围并不局限于根据本发明的要点的实施例是显而易见的。

实施例1.肉毒杆菌毒素效价试验稀释系数的确定

由于当2×包被组合物和2×肉毒杆菌毒素组合物彼此混合时，发生的肉毒杆菌毒素效价的损失是未知的，所以进行了初步实验以便在制备肉毒杆菌毒素组合物后即刻确定肉毒杆菌毒素效价的变化。

为此，单独制备了2×包被组合物和2×肉毒杆菌毒素组合物，并以1:1的比例混合，从而制备如下表1所示的混合组合物。

[表1]

对于该混合组合物，使用体外效价测定试剂盒(

Matrix肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒,生物守卫公司(Biosentinel,Inc.))检测肉毒杆菌毒素效价。具体方法按照Dunning FM撰写的现有文献中公开的相同方式实行(J Vis Exp.2014.3.3；(85).doi:10.3791/51170.)。此外，考虑到在制备后效价立即降低的情况，应用了两种稀释系数(75和112.5)。结果如下表2所示。

[表2]

混合组合物的肉毒杆菌毒素效价测量结果表明，回收了50％或更高的绝对效价。然而，对CMC而言，当应用稀释系数112.5时，效价超出了标准曲线的范围，CMC和磷酸钠的效价在制备后立即检测时低于HAS或吐温20的效价。

实施例2.预包被材料的选择

根据PLA(聚(乳酸))基质是否预包被以及预包被材料的种类，进行实验以检查肉毒杆菌毒素效价的变化。

将包被组合物HSA+NaCl、吐温20、CMC和磷酸钠(pH6.0)各6.5μl与肉毒杆菌毒素的混合，滴加到PLA基质(未包被(N)、2％PVA预包被(PVA)或相应的增稠剂(例如，当使用1％HSA+1.8％NaCl作为增稠剂时，PLA基质也用1％HSA+1.8％NaCl包被))上，然后在室温下干燥过夜(O/N)。干燥结束后，将各基质放入含有0.3ml 0.9％NaCl的1.5mL管中，在室温下洗脱毒素30分钟。洗脱结束后，假设在滴加后回收期间肉毒杆菌毒素的效价保持在100％，将各组合物以83.3的稀释系数稀释，进行体外效价测定。测量结果如下表3和图1所示。

[表3]

如上述结果显示，在滴加后的回收过程中，当效力超过标准曲线的范围时，表示为N/D。就磷酸钠的结果而言，发现当用2％PVA预处理包被基质时，效价被稳定地保持。

测定到吐温20在所有基质中均显示低效价，表明它不适合用作包被组合物，对于CMC，其与磷酸钠情况相似，除了用PVA预包被的基质以外，所有基质中均检测不到效价。

实施例3.选择含肉毒杆菌毒素的包被组合物的最佳增稠剂

为了从备选材料中选择包含在包被组合物中的增稠剂，分别以2×浓度制备了8种包被备选材料(2％CMC、1％SA、1％HA、1％MC、1％HEC、2％PVP、1％HSA+1.8％NaCl和0.05M磷酸盐)，并与2×肉毒杆菌毒素溶液(5,000U/3.25μl)混合，制成1:1溶液。将所得溶液6.5μl滴加在2％PVA预处理包被的基质上，然后将所得基质在室温下干燥过夜(O/N)。干燥结束后，将各基质放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并在室温下洗脱毒素30分钟。洗脱结束后，假设在滴加后回收期间效价保持在100％，将各组合物以83.3的稀释系数稀释，进行体外效价测定。结果如下表4和图2所示。

[表4]

如表4所示，每个试验组制备两个样品(样品1和2)，并测量从每个样品中洗脱的毒素两次，结果显示CMC、MC、HEC、PVP和HSA+NaCl包被组合物相对于目标效价的回收率高达80％或以上，特别地，MC和HSA+NaCl的回收率为90％或以上。此外，测定了SA和HA的平均效价回收率为60％或更高，高于磷酸钠的平均效价回收率。

实施例4.选择含肉毒杆菌毒素的包被组合物的最佳稳定剂

为了从备选材料中选择包被组合物中包含的稳定剂，如下表5所示，将2×肉毒杆菌毒素溶液(5,000U/3.25μl)与如表5所示制备的各包被组合物混合成制备1:1的溶液，并将6.5μl的该溶液滴加到2％PVA预包被基质上，然后在室温下干燥过夜(O/N)。干燥结束后，将各基质放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并在室温下洗脱毒素30分钟。洗脱结束后，假设在滴加后回收期间效价保持在100％，将各组合物以83.3的稀释系数稀释，进行体外效价测定。

[表5]

实验结果表明，在所有稳定剂混合条件下，与HSA制备后立即检测的值相比，除了CMC之外的PVP和HEC组显示出90％或更高的回收率。结果如图3所示。

实施例5.含肉毒杆菌毒素的包被组合物的长期稳定性确认

对基于上述实施例1至4的结果所选择的增稠剂(SA，HA，PVP和HEC)和稳定剂(Tre和Met)的混合物的长期稳定性进行确认。

首先，为了检测SA和HA增稠剂和稳定剂组合的长期稳定性，将PLA基质用2％PVA预包被，并滴加2×肉毒杆菌毒素溶液(5,000U/3.25μl)与如表6所示制备的各包被组合物的1:1混合物6.5μl，然后将得到的基质在室温下干燥过夜(O/N)。干燥结束后，将各基质放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，以检测其直到第8天的效价回收率。由于包被组合物中的各种组合中的增稠剂和稳定剂会影响肉毒杆菌毒素效价的测量，因此将每个测试组第1天测量的效价作为参考值(100)，在第8天测得的效价基于第1天的效价进行转换，如图4所示。实验结果表明，在使用SA或HA增稠剂的大多数测试组中，直到第8天，效价保持在相对于第1天效价的50％或更高。

[表6]

制备实施例	备注
		1.SA+Tre 10％	0.5％海藻酸钠,10％海藻糖
2.SA+Tre 15％	0.5％海藻酸钠,15％海藻糖
		3.HA+Tre 10％	0.5％透明质酸,10％海藻糖
4.HA+Tre 15％	0.5％透明质酸,15％海藻糖
		5.HA+Tre 20％	0.5％透明质酸,20％海藻糖
6.HA+Met 10mM	0.5％透明质酸,10mM甲硫氨酸
		7.HA+Met 20mM	0.5％透明质酸,20mM甲硫氨酸
8.HA+Met 30mM	0.5％透明质酸,30mM甲硫氨酸
		9.PVP+Tre 10％	1％聚乙烯吡咯烷酮,10％海藻糖
10.PVP+Met 20mM	1％聚乙烯吡咯烷酮,20mM甲硫氨酸
		11.HAS+NaCl	0.5％人血清白蛋白,0.9％氯化钠
12.NaP	25mM磷酸钠pH 6.0

另外，为了检测PVP和HEC增稠剂和双糖或氨基酸稳定剂的组合的长期稳定性，以与SA和HA试验相同的方式制备肉毒杆菌毒素包被组合物，各组合物滴加后在37℃下进行加速稳定性实验5周。使用海藻糖(Tre)和/或蔗糖(Suc)作为双糖稳定剂，蛋氨酸(Met)和甘氨酸(Gly)作为氨基酸稳定剂。为了准确比较测定值，将每个样品制备后立即检测的效价转换为(100％)，在5周内对比效价回收率。此外，应用作为阳性对照的标准产品

的值以最小化测试之间的误差。结果如下表7和图5所示。

[表7]

制备实施例	制备后立刻检测	1天	8天	22天	36天
						1％PVP	100.0	92.3	71.2	61.1	N/D
1％PVP+10％Tre	100.0	107.9	85.1	70.2	57.2
						1％PVP+30％Suc	100	239.5	154.7	154.7	68.1
1％PVP+Met 20mM	100.0	108.4	105.9	87.7	55.0
						1％PVP+Gly 20mM	100	79.1	N/D	N/D	N/D
0.5％HEC	100.0	80.7	65.2	N/D	N/D
						0.5％HEC+10％Tre	100.0	92.5	88.9	66.0	53.4
0.5％HEC+30％Suc	100.0	81.6	55.7	58.9	53.1
						0.5％HEC+Met 20mM	100.0	104.0	59.9	N/D	N/D
0.5％HEC+Gly 20mM	100	83.2	N/D	N/D	N/D
						HSA+NaCl	100.0	112.7	86.0	61.5	45.6
磷酸钠(pH 6.0)	100.0	105.2	89.4	67.9	-

实验结果证实，相比于阳性对照HSA，使用PVP或HEC作为增稠剂且双糖或蛋氨酸作为稳定剂的条件是制备肉毒杆菌毒素包被组合物的最佳稳定组合。

实施例6.含肉毒杆菌毒素的包被组合物的包被均匀性确认

如何均匀地将组合物包被到基底上，对于要用于包被基底(如微针)的含肉毒杆菌毒素组合物以及组合物中肉毒杆菌毒素的效价稳定性也是非常重要的。因此，使用在实施例5中评估为具有优异的肉毒杆菌毒素效价稳定性的，包含增稠剂+稳定剂的组合物包被2％PVA预包被的基底，使用平均像素数和洋红色占比评估包被均匀性。更具体地，图像设置为CMYK而不是RGB，在每个图像中相同地调整针头尺寸，删除图像的背景(除针头外)，测量针头部分的整个区域，并测量针头部分染色区域的像素数和洋红色占比。结果如表8和表9和图6所示。

[表8]

制备实施例	平均像素数
		HEC+Suc，浸渍包被1次，浸没10秒	392
PVP+Tre，浸渍包被1次，浸没10秒	366
		HEC+Suc，浸渍包被1次，浸没15秒	605
PVP+Tre，浸渍包被1次，浸没15秒	402

[表9]

根据实验结果，微针在每种组合物中浸入10秒或15秒时，在所有情况下，HEC+Suc组合相比于PVP+Tre组合显示出更高的平均像素数。此外，进行包被的时间相同时，HEC+Suc组合中洋红色面积相对于整个微针面积的占比(％)也显著较高(HEC+Suc组合：平均89％，PVP+Tre组合：平均71％)。从上述结果可以看出，与PVP+Tre组合相比，HEC+Suc组合作为包被组合物时实现了均匀包被。

实施例7.确认HEC+Suc组合的最佳混合比例

从实施例5和6可以看出，当包被在微结构上时，与其他增稠剂和稳定剂的组合相比，HEC+Suc组合表现出优异的粘度和优异的稳定性。因此，进行了确定HEC+Suc组合最佳混合比的试验。

实施例7-1.确认各混合比例的HEC+Suc组合的粘度和表面张力

如表10所示，HEC+Suc组合的混合比以w:w设定，除HEC和蔗糖外的剩余部分用蒸馏水填充并以200-400rpm搅拌1小时或以上。将得到的产品送到韩国聚合物测试实验室(Korean Polymer Testing Laboratory)进行分析，测量其粘度和表面张力。

[表10]

在以各种混合比例的HEC+Suc组合制备组合物的过程中，使用搅拌器能够将HS0160，HS0130，HS0110，HS0101和HS1001制备成均匀的溶液。然而，对于HS3001比例，由于粘度急剧增加，以至于可能发生的磁棒无法搅拌的现象，因此无法顺利地制备组合物。因此，从粘度和表面张力测试样品中剔除了HS3001和HS6001配方。在制备过程中，由于HS1001溶液与其他配方相比粘度过高，并且无法测量表面张力，因此该配方被排除在表面张力测量实验之外。

粘度和表面张力的测量回归分析结果如图7和8所示。对粘度测量结果进行单因素方差(one-way ANOVA)分析，结果可以看出，蔗糖占比越高，粘度越高(R2＝96.54％，P＝0.000，粘度＝39.53+0.8806蔗糖)。对表面张力进行测量，通过单因素方差分析可以看出蔗糖比越高，表面张力越低(R2＝87.27％，P＝0.000，表面张力＝64.838-0.05101蔗糖)。

实施例7-2.确认各混合比例的HEC+Suc组合的包被均匀性

根据实施例7-1的粘度和表面张力测量结果，为检测包被均匀性，如下表11所示设置了HEC+Suc组合的混合比。

[表11]

以与实施例6相同的方式进行包被均匀性测试。然而，在样品制备中，HS0101、HS0110、HS0130、HS0160、HS0170和HS0180配方很容易进行制备，但对于HS0190配方，制备质量不受控制，结果制备后第二天从饱和溶液中沉淀出少量蔗糖，使得该配方无法使用。以其他比例进行包被的图像如图9所示。由图像分析结果能够确认，HS0101至HS0130比例下的染料包被图案不规则。随着蔗糖比例的增加，染料包被更均匀，染料的颜色更浓。

对摄得图像的像素数的相对标准偏差进行回归分析的结果如图10所示。实验结果证实，在蔗糖比最低的HS0101中，包被部分的像素数较多(5529)，而蔗糖比第二低的HS0110中，像素数最小(3682)。随后，像素数随着蔗糖混合比逐渐增加，在HS0170中检测到最大像素数(5967)。然后，随着蔗糖含量的增加，像素数趋于再次减少(HS0180＝5207，HS0190＝4955)。此外，回归分析结果可以证实，蔗糖混合比使得贴片中针间的包被图案均匀。

实施例7-3.检测各混合比例的HEC+Suc组合的长期稳定性

为了确认每个混合比例的HEC+Suc组合的组合物是否可以在PLLA贴片上保持肉毒杆菌毒素的效价，测量了肉毒杆菌毒素并将其施用于PLLA贴片，然后在37℃下进行5周加速稳定性评估。为此，制备了如表12中HEC:Suc组合的2×制剂，将其与肉毒杆菌毒素1:1混合，均匀喷洒在2％PVA溶液预处理包被的PLLA片上，然后在培养箱中37℃完全干燥。在第0、1、8、22、36天，收集PLLA片以测量肉毒杆菌毒素的效价，每个样品配制后立即测得的效价基于100％转换，并比较5周的效价回收率。结果如表13和图11所示。

[表12]

[表13]

制备实施例(名称)	制备后即刻	第1天	第8天	第22天	第36天
						HS0170	100.0	88.4	53.6	57.0	61.6
HS0160	100.0	73.0	72.1	79.7	75.8
						HS0130	100.0	52.1	42.0	33.3	41.9
阴性	100.0	58.0	42.9	47.6	38.4

根据实验结果可以看出，在HS0150比例或更低比例下，第36天肉毒杆菌毒素的效价模式与阴性对照相似。当HEC:Suc比为1:30，肉毒杆菌毒素的效价模式似乎与阴性对照相似，在1:60和1:70的实验组中，与阴性对照相比，肉毒杆菌毒素的效价维持在60％或更高(基于第36天)。以上结果可以证实，羟乙基纤维素与蔗糖的混合比例对肉毒杆菌毒素的稳定性起着重要作用，可以看出，使肉毒杆菌毒素具备稳定性的HEC+Suc组合比例应超过1:30。

如上所述，已经详细描述了说明书的特定部分，尽管本领域技术人员很清楚，这种特定技术仅仅是一个优选的实施方式，但说明书的范围并不局限于此。因此，说明书的实质性范围将由所附权利要求及其等同来界定。

[工业实用性]

本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制备技术，其中使用了本发明的微结构来减轻肉毒杆菌毒素施用时的疼痛，并有助于在精确的部位少量施用毒素。因此，本发明有望广泛应用于安全便捷的医疗应用中。

Claims (11)

1.一种用于包被微结构的组合物，其包含肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

4.一种微结构，其被权利要求1所述的组合物包被。

5.根据权利要求4所述的微结构，其中所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

6.一种制备用于包被微结构的组合物的方法，其包括：

将肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖混合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

9.一种使用含肉毒杆菌毒素的组合物包被微结构的方法，其包括：

(a)混合肉毒杆菌毒素、羟乙基纤维素和蔗糖；和

(b)用(a)的混合物包被微结构表面。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素是选自下组的一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述微结构是选自下组的一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。

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