CN114621306A - 化合物、其制备方法与用途 - Google Patents

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张少桥
王明
李汉东
章文蔚
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Abstract

本发明提出了化合物、其制备方法与用途。所述化合物具有式(Ⅰ)所示结构，该化合物作为Linker，通过两步反应即可完成拼接，所得拼接化合物具有很好的化学稳定性和光学性质，用于基因测序，该合成路线快速、直接、高效，且原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。

Description

化合物、其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及化合物、其制备方法及用途。
背景技术
第一代基因测序法即Sanger法，采用的是直接测序法，其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。
ABI公司在Sanger法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒，即BigDyeTM试剂，接着再结合毛细管电泳，产生了ABI3730和ABI3500等非常成功的测试仪器，主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％。基于Sanger原理的毛细管电泳法的ABI3730，ABI3500以及其必须的BigDye测序试剂，仍是业内公认的超高精度测序的黄金标准。
BigDyeTM试剂包括Acceptor Dye、Linker、ddNTP三部分组成，以ddTTP-Linker-dTMRA为例，其目前的合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000021
合成步骤：首先合成ddTTP，然后经过酰胺化、水解、酰胺化、水解四步反应得到ddTTP-Linker，之后再与dTMRA反应，完成最后的拼接，得到BigDyeTM试剂。
BigDyeTM试剂目前的合成方法中，以ddNTP为起始原料，经过五步反应才可完成与Dye的最终拼接，考虑到ddNTP的不稳定性，反应过程较复杂、产率极低、分离纯化难度较大，不能够用于大量的合成，故该方法具有较大的改善空间。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了化合物、其制备方法与用途，该化合物作为Linker，通过两步反应即可完成拼接，所得拼接化合物具有很好的化学稳定性和光学性质，用于基因测序，该合成路线快速、直接、高效，且原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物为式(Ⅰ)所示结构，
Figure BDA0002828973930000031
其中，各R1～R10分别独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6环烷基、3-8个原子组成的杂环基或者R1～R10连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被选自下列的至少一个基团取代：1至4个卤素原子、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代；X为H、卤素或氨基。
根据本发明实施例的化合物可以作为中间体，制备得到荧光标记的核苷酸，用于基因测序，使得合成路线快速、直接、高效，且原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，所述组合物还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，各R1～R10分别独立地为H、卤素、C1-6烷基。
根据本发明的实施例，各R1～R10分别独立地为H；X为Cl。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物为式(Ⅱ)所示结构，
Figure BDA0002828973930000032
其中，R1～R10及X的定义同前面所述；R11为-ddNTP。
根据本发明的实施例的化合物含有氨基，可以作为中间体，制备得到荧光标记的核苷酸，用于基因测序，使得合成路线快速、直接、高效，且原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，所述ddNTP选自包括ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP中的任一种。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物为式(Ⅲ)所示结构，
Figure BDA0002828973930000041
其中，R1～R10、X及R11的定义同前面所述；R12与-OH连接形成荧光素。
根据本发明的实施例的化合物具有很好的化学稳定性和光学性质，可以作为应用于DNA测序，终止DNA链延伸，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，所述荧光素选自包括dTMRA、dRox、dR6G、dR110中的任一种。
根据本发明的实施例，所述化合物为下列至少一种：
Figure BDA0002828973930000042
Figure BDA0002828973930000051
Figure BDA0002828973930000061
发明人发现，上述6个化合物用于DNA测序时，能够较好地满足机器、酶等各种条件，可以有效地终止DNA链延伸。
在本发明的又一方面，本发明提出了制备前面所述式(Ⅰ)所示化合物的方法。根据本发明实施例，所述方法包括：
Figure BDA0002828973930000062
发明人对式(I)所示化合物的合成路线进行深入研究，将式(Ⅰ-a)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第一溶剂中与式(Ⅰ-b)所示化合物发生第一酸胺缩合反应，能够高效得到式(I)所示化合物，减少副反应的发生。
根据本发明的实施例，所述缩合剂为TNTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第一溶剂为二甲基甲酰胺。发明人对第一酸胺缩合反应的条件进行大量优化，发现在上述条件下，可以较好地促进反应进行，提高反应效率，且减少副反应。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅰ)所示化合物进行液相色谱纯化。发明人发现，采用液相色谱纯化能够有效分离纯化产品，提高产品收率和纯度。
根据本发明的实施例，制备式(Ⅰ-a)所示化合物的方法包括：
Figure BDA0002828973930000063
发明人对式(Ⅰ-a)所示化合物的合成路线进行了深入的研究，将式(Ⅰ-a-a)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第二溶剂中，与式(Ⅰ-a-b)所示化合物发生第二酸胺缩合反应，能够有效得到式(Ⅰ-a)所示化合物，减少副反应的发生。
根据本发明的实施例，所述缩合剂为TNTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第二溶剂为二甲基甲酰胺。发明人对第二酸胺缩合反应的条件进行大量优化，发现在上述条件下，可以较好地促进反应进行，提高反应效率，且减少副反应。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅰ-a)所示化合物进行液相色谱纯化。发明人发现，采用液相色谱纯化能够有效分离纯化产品，提高产品收率和纯度。
根据本发明的实施例，制备式(Ⅰ-b)所示化合物的方法包括：
Figure BDA0002828973930000071
式(Ⅰ-b-a)所示化合物在碱性条件下，对其中一个氨基进行Boc保护，然后对另一氨基进行三氟乙酰基保护，脱Boc保护，通HCl气体，以便得到式(Ⅰ-b)所示化合物。
根据本发明的实施例的方法，式(Ⅰ-b-a)所示化合物的两个氨基先后进行Boc保护和三氟乙酰基保护，在酸性条件下脱去Boc保护，且三氟乙酰保护氨基不受影响，从而在与式(Ⅰ-a)所示化合物进行第一酸胺缩合反应时，能够得到目标产物，提高反应收率。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备式(Ⅱ)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：所述式(Ⅰ)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第三溶剂中，与
Figure BDA0002828973930000072
进行第三酸胺缩合反应，其中，R11的定义同前面所述。采用酸胺缩合反应能够有效得到式(Ⅱ)所示化合物，减少副反应的发生。
根据本发明的实施例，所述缩合剂包括TNTU和/或HBTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第三溶剂为二甲基甲酰胺。发明人对第三酸胺缩合反应的条件进行大量优化，发现在上述条件下，可以较好地促进反应进行，提高反应效率，且减少副反应。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅱ)所示化合物进行液相色谱纯化。发明人发现，采用液相色谱纯化能够有效分离纯化产品，提高产品收率和纯度。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备式(Ⅲ)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：所述式(Ⅱ)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第四溶剂中，与荧光素发生第四酸胺缩合反应。采用酸胺缩合反应能够有效得到式(Ⅲ)化合物，减少副反应的发生。如前所述，式(I)所示化合物含有羧基和三氟乙酰胺基，作为Linker化合物，该化合物在缩合剂、缚酸剂的作用下，与ddNTP发生酸胺缩合反应，然后在碱性条件下，脱去相应的氨基保护基(例如三氟乙酰基)，得到含有氨基的化合物(式(II))，该化合物进一步和荧光素在缩合剂、缚酸剂的作用下再次进行酸胺缩合反应，得到式(III)所示化合物。整体反应路线设计合理，减少具有ddNTP结构的化合物参与反应的次数，该合成路线快速、直接、高效，且原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。
根据本发明的实施例，所述缩合剂包括TNTU、TSTU和/或DSC，所述缚酸剂包括DIPEA和/或DMAP，所述第四溶剂包括二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜。发明人对酸胺缩合反应的条件进行大量优化，发现在上述条件下，可以较好地促进反应进行，提高反应效率，且减少副反应。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅲ)所示化合物进行液相色谱纯化。发明人发现，采用液相色谱纯化能够有效分离纯化产品，提高产品收率和纯度。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述式(Ⅲ)所示化合物在基因测序中的应用。如前所述，式(Ⅲ)所示化合物具有很好的化学稳定性和光学性质，可以应用于DNA测序，终止DNA链延伸，且整个合成路线原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种基因测序试剂盒。根据本发明实施例，所述基因测序试剂盒含有前面所述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)所示的化合物。如前所述，式(Ⅲ)所示化合物具有很好的化学稳定性和光学性质，可以应用于DNA测序，终止DNA链延伸，且整个合成路线原子经济性高、操作简便、低成本，易于大规模生产，具有广泛的应用前景。该试剂盒中，既可以直接提供式(Ⅲ)所示的化合物，也可以提供式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示化合物，当需要使用进行测序之前，按照前面所述方法合成式(Ⅲ)所示的化合物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：V3-linker-TFA的合成(对应式(1)中各R1～R10分别独立地为H；X为Cl)
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000091
a)a-1.(Boc)2二碳酸二叔丁酯,TEA(三乙胺)/DCM(二氯甲烷)；a-2.CF3COOEt；a-3.HCl/EA(乙酸乙酯)；b)TNTU,DIPEA/DMF；c)TNTU,DIPEA/DMF
将化合物1(5g,36.8mmol,3.0eq)和三乙胺(7.43g,73.6mmol,6.0eq.)加入到500mL烧瓶，用二氯甲烷(150mL)进行完全溶解，反应液降温至0℃；将二碳酸二叔丁酯(2.5g,11.5mmol,1.0eq.)缓慢滴入反应液中，保持反应温度为0℃，搅拌16小时。在室温下滴加CF3COOEt(2.85g,23mmol,2.0eq.)，然后反应在室温下搅拌2小时，减压浓缩得到粗品,进行柱层析纯化(石油醚和乙酸乙酯体积比2：1洗脱)，得到2.1g白色固体。用乙酸乙酯(50mL)进行完全溶解；在室温下通HCl气体2小时，然后反应在室温下搅拌4小时，反应结束后，将反应液抽滤，得到白色固体化合物2(1.6g)。
1H-NMR(400M,DMSO-D6):δ(ppm)8.93(s,1H),8.71(s,2H),7.21-7.31(m,4H),4.3(s,2H),4.2(s,2H)。
将化合物4(816mg,3.2mmol,1.2eq.)加入到100mL单口烧瓶，用无水DMF(10mL)进行完全溶解；在室温下加入TNTU(1.272g,3.2mmol,1.2eq.)和DIPEA(1.344g,9.6mmol,3.6eq)，在30℃下反应60-90min(TLC:DCM:MeOH:甲酸＝30:1:1(v/v/v))；然后将化合物3(1.18g,2.67mmol,1eq.)加入至反应液中，在30℃下反应过夜。反应结束后，用有机滤膜过滤后，送制备HPLC分离，色谱条件：
色谱柱：YMC–Actus ODS-A-HG 250*30mm C18柱；流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表1。
表1
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
3 30 5 95
5 30 8 92
16 30 10 90
19.5 30 10 90
20 30 40 60
23 30 60 40
23.5 30 5 95
27 30 5 95
目标产物出峰时间约为18min，冻干得到化合物5(867mg)。
1H-NMR(400M,DMSO-D6):δ(ppm)13.11(s,1H),12.68(s,1H),10.45(s,1H),9.78-9.81(t,1H),9.09-9.12(t,1H),8.55-8.58(t,1H),8.22(s,1H),8.11-8.13(t,1H),7.54(s,1H),7.51(s,1H),6.74(s,1H),6.3-6.55(m,4H),3.93(s,2H)。
将化合物5(867mg,1.4mmol,1.0eq.)加入到50mL单口烧瓶，用无水DMF(10mL)进行完全溶解；在室温下加入TNTU(509mg,1.4mmol,1.0eq.)和DIPEA(540mg,4.2mmol,3.0eq.)，在30℃下反应90min，TLC点板检测(DCM:MeOH:甲酸＝10:1:0.5)；然后将化合物2(449mg,1.68mmol,1.2eq.)加入至反应液中，在30℃下反应4h。反应结束后，用有机滤膜过滤后，送制备HPLC分离，色谱条件：色谱柱：YMC–Actus ODS-A-HG 250*30mm C18柱；流动相：A乙腈，B0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表2。
表2
Figure BDA0002828973930000101
Figure BDA0002828973930000111
目标产物出峰时间约在22min，冻干得到V3-Linker-TFA(386mg)。
1H-NMR(400M,DMSO-D6):δ(ppm)9.94-9.97(t,1H),9.35-9.38(t,1H),8.77-8.80(t,1H),8.48(s,1H),8.25-8.27(t,1H),7.82(s,1H),7.51(s,1H),7.21-7.32(m,4H),6.74(s,1H),6.5-6.63(m,4H),4.64-4.66(m,2H),4.47-4.49(d,2H),4.33-4.34(d,2H)。
实施例2：ddTTP-V3-linker-dTMRA的合成(对应式(Ⅲ-1))
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000112
将化合物V3-Linker-TFA(100mg，1.0eq)溶于3mL无水DMF中，依次加入HBTU(54mg，1.2eq)、DIPEA(18.6mg，1.2eq)，30℃活化3h。将ddTTP(72mg，1.2eq)加入到活化后的V3-Linker-TFA中，30℃反应过夜。送LC-MS监测，显示有部分未转化完全，补加2.4eq DIPEA，再次过夜反应。然后加入20mL 25～28％氨水，室温搅拌反应1h，减压浓缩至无溶剂蒸出，制备HPLC纯化，色谱条件：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000113
30*25010um；流动相：A乙腈，B 0.1mol/LTEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表3。
表3
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
3 30 5 95
5 30 20 80
17 30 30 70
20 30 35 65
23 30 40 60
23.5 30 5 95
26 30 5 95
目标产物出峰时间约在19min，冻干得到ddTTP-V3-linker(250mg，纯度93％，产率68％)。MS:[M+1]+＝1227.4。
将化合物dTMRA(20mg,0.04mmol,1.0eq)、DSC(12.3mg,0.047mmol,1.2eq)和DMAP(5.8mg,0.047mmol,1.2eq)加入到5mL棕色瓶中，1mL DMF溶解完全，25℃反应4h；TLC监测，活化产物生成，将化合物ddTTP-V3-linker(49mg,0.04mmol,1.0eq)溶于1mL水加入反应液中，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品，用制备HPLC分离纯化，色谱条件：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000122
30*25010um；流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表4。
表4
Figure BDA0002828973930000121
Figure BDA0002828973930000131
目标产物出峰时间约在16min，冻干得到深红色固体，即ddTTP-V3-linker-dTMRA(2mg，收率3％)。MS:M+＝1710.1。
实施例3：ddCTP-V3-linker-dRox的合成(对应式(Ⅲ-2))
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000132
a)1.HBTU,DIPEA,DMF,30℃；2.氨水，30℃。b)DSC,DMAP,DMF,25℃
将化合物V3-Linker-TFA(100mg，1.0eq)溶于3mL无水DMF中，依次加入HBTU(54mg，1.2eq)、DIPEA(18.6mg，1.2eq)，30℃活化3h。将ddCTP(72mg，1.2eq)加入到反应液1中，30℃搅拌2h，然后加入200mL 25～28％氨水，继续搅拌1h。减压浓缩后，进行制备HPLC纯化，色谱条件：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000134
30*250 10um流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表5。
表5
Figure BDA0002828973930000133
Figure BDA0002828973930000141
目标产物出峰时间约在15.5min，冻干得到ddCTP-V3-Linker(约180mg，产率60％，纯度99％)。MS:[M+1]+＝1226.3。
将化合物dRox(20mg,0.033mmol,1.0eq)、DSC(10mg,0.039mmol,1.2eq)和DMAP(4.76mg,0.039mmol,1.2eq)加入到5mL棕色瓶中，1mL DMF溶解完全，25℃下反应4h；TLC监测，活化产物生成，将化合物ddCTP-V3-Linker(40.5mg,0.033mmol,1.0eq)溶于1mL水加入到反应液中，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品；粗品用制备HPLC分离纯化，色谱条件：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000142
30*250 10um；流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表6。
表6
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
3 30 5 95
5 30 32 68
24 30 32 68
26 30 40 60
27 30 40 60
28 30 5 95
32 30 5 95
目标产物出峰时间约在25min，冻干得到深紫色固体，即ddCTP-V3-linker-dRox(7mg，收率11.6％)。MS:M+＝1811.8。
实施例4：ddATP-V3-linker-dR6G的合成(对应式(Ⅲ-3))
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000151
将V3-Linker-TFA(200mg，0.24mmol，1.0eq)溶于5mL无水DMF中，依次加入HBTU(110mg，0.29mmol，1.2eq)、DIPEA(38mg，0.29mmol，1.2eq)，30℃活化3h；然后加入ddATP(157mg，0.29mmol，1.2eq)，30℃反应12小时。最后加入10mL 25～28％氨水中，室温搅拌反应1h，减压浓缩后，进行制备HPLC纯化，色谱条件：色谱柱：YMC-Actus prep C18 30×250mm，流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)，HPLC梯度设置见表7。
表7
Figure BDA0002828973930000152
Figure BDA0002828973930000161
目标产物出峰时间约在15min，冻干得到ddATP-V3-Linker(180mg，产率60％，纯度99％)。MS:[M+1]+＝1250.7。
将化合物dR6G(30mg,0.057mmol,1.0eq)、TSTU(20.7mg,0.069mmol,1.2eq)和DIPEA(9.0mg，0.069mmol,1.2eq)加入到10mL棕色瓶中，加5mL DMSO溶解完全，25℃活化4h；TLC监测，活化产物生成，加入化合物ddATP-V3-Linker(86mg，0.069mmol,1.2eq)，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品；粗品用制备HPLC分离纯化，色谱条件如下：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000162
30*250 10μm；流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表8。
表8
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
2 30 5 95
3 30 29 71
19 30 32 68
21.5 30 32 68
22 30 5 95
26 30 5 95
目标产物出峰时间约在18.5min，冻干得到深紫色固体，即ddATP-V3-linker-dR6G(18mg，产率18％)。MS:M+＝1760.3。
实施例5：ddGTP-V3-linker-dR6G的合成(对应式(Ⅲ-4)
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000171
将化合物V3-Linker-TFA(300mg,0.36mmol,1.0eq)溶于5mL无水DMF中，依次加入HBTU(163mg,0.43mmol,1.2eq)、DIPEA(56mg,0.43mmol,1.2eq)，30℃活化3h；再加入ddGTP(234mg,0.43mmol,1.2eq)，30℃搅拌12小时。最后加入10mL 25～28％氨水，室温搅拌反应1h。减压浓缩后，进行制备HPLC纯化，色谱柱：YMC-Actus prep C1830×250mm，流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)，HPLC梯度设置见表9。
表9
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
2 30 5 95
3 30 17 83
12 30 17 83
12.5 30 40 60
15 30 40 60
16 30 5 95
18 30 5 95
目标产物出峰时间约在15min，冻干得到ddGTP-V3-Linker(220mg，纯度99.15％，MS:[M+1]+＝1249.2)，产率51％，最大吸收波长495.5nm。
称取化合物R6G(20mg,0.038mmol,1.0eq)于10mL棕色瓶中，加5mL DMSO溶解，依次加入TSTU(13.8mg，0.046mmol,1.2eq)、DIPEA(6.0mg，0.046mmol,1.2eq)，25℃活化4h；TLC监测，活化产物生成，加入化合物ddGTP-V3-Linker(58mg，0.046mmol,1.2eq)，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品；制备HPLC纯化，色谱条件如下：色谱柱：Actus ODS-AHG
Figure BDA0002828973930000181
30*250 10μm；流动相A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见表10。
表10
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
3 30 5 95
5 30 13 87
8 30 15 85
17 30 17 83
19 30 17 83
21 30 20 80
22 30 5 95
25 30 5 95
目标产物出峰时间约在21min，冻干得深紫色化合物，即ddGTP-V3-linker-dR6G(12mg，产率15％)。MS:M+＝1775.3。
实施例6：ddGTP-V3-linker-dR110的合成(对应式(Ⅲ-5))
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000191
将化合物2(20mg,0.045mmol,1.0eq)、TSTU(16.4mg，0.054mmol,1.2eq)和DIPEA(6.8mg，0.054mmol,1.2eq)加入到10mL棕色瓶中，加2.5mL DMSO溶解，25℃活化4h；TLC监测，活化产物生成，加入化合物1(62mg，0.054mmol,1.2eq)，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品；粗品用制备HPLC分离纯化，色谱条件如下：色谱柱：Actus Triant-C18
Figure BDA0002828973930000192
30*250 5μm；流动相：A乙腈，B0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见下表11。
表11
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
2 30 5 95
3 30 25 85
22 30 27 83
24 30 45 55
25 30 5 95
26 30 5 95
目标产物出峰时间约在12.5min，冻干得到深紫色化合物，即ddGTP-V3-linker-dR110(15mg，产率20％)。M+＝1705.2。
实施例7：ddATP-V3-linker-dR110的合成(对应式(Ⅲ-6))
合成路线如下：
Figure BDA0002828973930000201
将化合物2(20mg,0.045mmol,1.0eq)、TSTU(16.25mg,0.054mmol,1.2eq)和DIPEA(6.9mg，0.054mmol,1.2eq)加入到10mL棕色瓶中，加5mL DMSO溶解完全，25℃活化4h；TLC监测，活化产物生成，加入化合物1(56.2mg，0.045mmol,1.0eq)，25℃反应12h；LCMS监控：取少许反应液，加水稀释，LCMS显示有产物生成。反应结束后，加水稀释得到粗品；粗品用制备HPLC分离纯化，色谱条件如下：色谱柱：Actus Triant-C18
Figure BDA0002828973930000202
30*250 5μm；流动相：A乙腈，B 0.1mol/L TEAB(pH＝7.5-7.8)；HPLC梯度设置见下表12。
表12
时间/min 流速(mL/min) A％ B％
0 30 5 95
3 30 5 95
5 30 15 85
8 30 17 83
12 30 19 81
15 30 19 81
15.5 30 30 70
18 30 5 95
20 30 5 95
目标产物出峰时间约在17min，冻干得到深紫色固体，即ddATP-V3-linker-dR110(5mg，产率6.7％)。M+＝1675.3。
实施例8：荧光光谱和吸收光谱的研究
采用日立F-4600荧光分光光度计对化合物的最大发射波长和最大吸收波长进行检测，结果见下表13。
表13
化合物 最大发射波长(nm) 最大吸收波长(nm)
ddATP-V3-linker-dR6G 584 552.5nm
ddCTP-V3-linker-dRox 529.6 605.5nm
ddGTP-V3-linker-dR6G 579 553.5nm
ddTTP-V3-linker-dTMRA 603.6 577.5nm
ddATP-V3-linker-dR110 545.8 500.5nm
ddGTP-V3-linker-dR110 564.6 621.5nm
由表13的内容可知，本发明的化合物具有很好的能量共振转移效率，将其与现有的BigDyeTM试剂相关参数进行了比对，发现两者具有相近的特性。同时，根据DNA测序原理，试剂在反应后激发出可检测的荧光信号，若波长合适，即可检出，若波长不合适，则无法检出。经试验验证了本发明的化合物均可以被检出。由此，表明本发明的化合物能够较好地用于DNA测序。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式(Ⅰ)所示结构，
Figure FDA0002828973920000011
其中，
各R1～R10分别独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6环烷基、3-8个原子组成的杂环基或者R1～R10连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基可被一个或多个氢、1至4个卤素原子、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基所取代；
X为H、卤素或氨基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，各R1～R10分别独立地为H、卤素、C1-6烷基；
优选，各R1～R10分别独立地为H；X为Cl。
3.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式(Ⅱ)所示结构，
Figure FDA0002828973920000012
其中，R1～R10及X的定义同权利要求1；
R11为-ddNTP；
任选地，所述ddNTP选自包括ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP中的任一种。
4.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式(Ⅲ)所示结构，
Figure FDA0002828973920000021
其中，R1～R10、X及R11的定义同权利要求3；
R12与-OH连接形成荧光素；
任选地，所述荧光素选自dTMRA、dRox、dR6G、dR110中的任一种。
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述化合物为下列至少一种：
Figure FDA0002828973920000022
Figure FDA0002828973920000031
6.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征在于，包括：
Figure FDA0002828973920000041
式(Ⅰ-a)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第一溶剂中与式(Ⅰ-b)所示化合物发生第一酸胺缩合反应；
任选地，所述缩合剂为TNTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第一溶剂为二甲基甲酰胺；
任选地，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅰ)所示化合物进行液相色谱纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
制备式(Ⅰ-a)所示化合物的方法包括：
Figure FDA0002828973920000042
式(Ⅰ-a-a)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第二溶剂中，与式(Ⅰ-a-b)所示化合物发生第二酸胺缩合反应；
任选地，所述缩合剂为TNTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第二溶剂为二甲基甲酰胺；
任选地，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅰ-a)所示化合物进行液相色谱纯化；
任选地，
制备式(Ⅰ-b)所示化合物的方法包括：
Figure FDA0002828973920000043
式(Ⅰ-b-a)所示化合物在碱性条件下，对其中一个氨基进行Boc保护，然后对另一氨基进行三氟乙酰基保护，脱Boc保护，通HCl气体，得到式(Ⅰ-b)所示化合物。
8.一种制备权利要求3所述化合物的方法，其特征在于，包括：
所述式(Ⅰ)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第三溶剂中，与
Figure FDA0002828973920000051
进行第三酸胺缩合反应，其中，R11的定义同权利要求3；
任选地，所述缩合剂包括TNTU和/或HBTU，所述缚酸剂为DIPEA，所述第三溶剂为二甲基甲酰胺；
任选地，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅱ)所示化合物进行液相色谱纯化。
9.一种制备权利要求4所述化合物的方法，其特征在于，包括：
所述式(Ⅱ)所示化合物在缩合剂和缚酸剂的作用下，在第四溶剂中，与荧光素发生第四酸胺缩合反应；
任选地，所述缩合剂包括TNTU、TSTU和/或DSC，所述缚酸剂包括DIPEA和/或DMAP，所述第四溶剂包括二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜；
任选地，所述方法进一步包括：将所述式(Ⅲ)所示化合物进行液相色谱纯化。
10.权利要求4或5所述化合物在基因测序中的应用。
11.一种基因测序试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～5任一项所述化合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103484106A (zh) * 2013-09-05 2014-01-01 上海交通大学 四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途
CN111763190A (zh) * 2019-04-02 2020-10-13 湖北华大基因研究院 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用

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