CN111763190A - 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用 - Google Patents

二氯罗丹明染料的合成方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111763190A
CN111763190A CN201910262706.8A CN201910262706A CN111763190A CN 111763190 A CN111763190 A CN 111763190A CN 201910262706 A CN201910262706 A CN 201910262706A CN 111763190 A CN111763190 A CN 111763190A
Authority
CN
China
Prior art keywords
formula
compound
friedel
radical
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910262706.8A
Other languages
English (en)
Inventor
张少桥
朱永豪
周远
王明
李汉东
章文蔚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei Huada Gene Research Institute
Original Assignee
Hubei Huada Gene Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei Huada Gene Research Institute filed Critical Hubei Huada Gene Research Institute
Priority to CN201910262706.8A priority Critical patent/CN111763190A/zh
Publication of CN111763190A publication Critical patent/CN111763190A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

本发明公开了二氯罗丹明染料的合成方法及其应用，以及制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。该方法包括：将式(I‑a)所示化合物与式(I‑b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物。该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料。

Description

二氯罗丹明染料的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及有机合成领域，具体地，本发明涉及二氯罗丹明染料的合成方法及其应用。
背景技术
罗丹明是一类典型的氧杂蒽类化合物。罗丹明类染料是指以罗丹明为母体，经过官能团修饰得到的一系列染料衍生物。该类染料具有光稳定性好、对pH不敏感、荧光量子产率高，较宽的波长范围以及化学合成和修饰简单等优点，是一种重要的荧光小分子染料探针，广泛应用于生物样品的染色与荧光标记中，也广泛的应用于分析化学领域。
二氯罗丹明化合物与典型的罗丹明染料类似，它作为一种能量转移荧光染料已经在多篇文献和专利中有所描述，主要应用于分子生物学、细胞生物学和分子遗传学。例如，用来标记脱氧核苷酸、二脱氧核苷酸、多核苷酸，测定DNA序列及碎片分析，是一类用于多重检测的荧光染料；还有一些作为荧光标记可以附着在用荧光磷酸化试剂合成的新生或完整的寡核苷酸链上制作成商业化试剂。以上的所有应用都基于可以得到高纯度、单一的目标罗丹明染料，但现有文献和专利都没有其具体的合成及纯化方法。
ABI公司在Sanger法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒，即BigDyeTM试剂，接着再结合毛细管电泳，产生了ABI3730和ABI3500等非常成功的测试仪器，主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％。基于Sanger原理的毛细管电泳法的ABI3730，ABI3500以及其必须的BigDye测序试剂，仍是业内公认的超高精度测序的黄金标准。
BigDyeTM试剂包括Acceptor Dye、连接链(Linker)、ddNTP三部分组成，以ddTTP-Linker-dTMRA为例，该路线中Acceptor Dye(二氯罗丹明染料)是dTMRA，简要合成方法是3-二甲氨基苯酚和3,6-二氯-1,2,4-偏苯甲酸酐在多聚磷酸里加热到180-190摄氏度，经过酸洗，水洗得到的产物性状差，纯度低，并不利于其后期的反应和应用。
另外还有一些报道，罗丹明类荧光染料典型制备方法是通过合适的氨基酚与各种苯甲酸、邻苯二甲酸、苯酐、磺基苯甲酸及其酸酐反应，用浓硫酸、无水氯化锌及其他Lewis酸作催化剂缩合，由于分子结构中含有共轭π键和较活泼的助色基团，通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，可以设计合成出许多罗丹明类衍生物。但受限其产率不高，不容易得到高纯度、单一的目标罗丹明染料而不适用于大量的合成，使其应用也收到很大局限。
因此，开发一种简单、高收率的合成二氯罗丹明类化合物的方法迫在眉睫。
发明内容
现有技术中，以BigDyeTM试剂目前的合成方法为例，Acceptor Dye(二氯罗丹明染料)作为一种关键荧光试剂，在文献报道中的反应过程较复杂、产率极低、分离纯化难度较大且条件苛刻，得到的不是干净且单一的产物，不能够用于大量的合成。
基于上述问题的发现，发明人提出了一种简单的、快速的、高效的合成二氯罗丹明染料的方法以及纯化方法，该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除不必要的影响因素，如大大提高BigDyeTM试剂合成的成功率。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，
Figure BDA0002015805090000021
其中，R1、R2各自独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-8环烷基、3-8个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代。根据本发明实施例的方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除了不必要的影响因素，例如大大提高后续BigDyeTM试剂合成的成功率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的双脱氧核糖核苷酸，如BigDyeTM试剂，所述BigDyeTM试剂由二氯罗丹明染料、连接链、ddNTP组成，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。需要说明的是，现有技术中BigDyeTM试剂包括：受体染料(Acceptor Dye)、连接链(Linker)、双脱氧核苷酸类似物(ddNTP)组成，本申请的试剂盒是在现有技术的基础上，将其中的受体染料的合成方法替换成本申请的合成方法，连接链、双脱氧核苷酸类似物的合成以及其余后续测序中的应用同现有技术。根据本发明的实施例的试剂盒测序准确，精度高。
在本发明的第三方面，本发明提出了另一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的dNTP，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。
在本发明的第四方面，本发明提供一种二氯罗丹明染料标记的多核苷酸。根据本发明的一些实施例，二氯罗丹明染料还可以标记更多种物质用于物质分析。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，包括：利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的；以及基于测序合成过程中所检测到的荧光信号，确定待测样本的核苷酸序列。需要说明的是，本发明利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记的方法、以及测序方法是现有技术中的一般方法，区别在于，本发明中的二氯罗丹明染料是根据本发明实施例的方法合成的。根据本发明实施例的方法测序准确度高。
附图说明
图1是根据本发明实施例的制备获得的dTMRA(I-1)与标准品LC谱图；
图2是根据本发明实施例的制备获得的dTMRA(I-1)与标准品MS谱图；
图3是根据本发明实施例的制备获得的dROX(II-1)与标准品LC谱图；
图4是根据本发明实施例的制备获得的dROX(II-1)与标准品MS谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出，实施例都伴随有结构式和化学式的图解。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能像权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或像本发明申请所控制的范围。
本发明中“室温”指的是温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另外一些实施例中，“室温”指的是20℃，22.5℃，25℃，27.5℃等等。
在本发明的上下文中，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值以内的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。每当公开一个数值范围中的一个下限，DL，和一个上限，DU，时，任何处于该公开了的范围之内的数值会被明确地公开。
本发明所述的各滴加过程以及所述的各步反应均在一定温度条件下进行，任何适合使用于各滴加过程或各反应过程的温度均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的温度及温度范围，均视为本发明的包含范围。本发明给出了各滴加过程较佳的温度或温度范围，以及各反应较佳的反应温度。
本发明所述的各反应步骤所使用的溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本发明的包含范围。本发明给出了各反应步骤所使用的较佳的溶剂。
本发明所述的溶剂中水分的含量，没有特别的限制。任何在一定程度上能在本发明中使用的溶剂含量，均视为本发明所述的溶剂。如溶剂中水分的含量大约小于0.05％，小于0.1％，小于0.2％，小于0.5％，小于5％，小于10％，小于25％，小于30％，或为0％。
本发明中，“第一”、“第二”等类似术语仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，除非另有明确具体的限定，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等。
本发明将应用以下定义除非其他方面表明。根据本发明的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本和化学药品手册，75，thEd，1994来定义。另外，有机化学一般原理见"Organic Chemistry,"Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,and"March's Advanced Organic Chemistry,"by Michael B.Smith and Jerry March,John Wiley&Sons,New York:2007，因此所有的内容都融合了参考文献。
术语“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-C6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
本发明使用的术语“烷基”包括1-6个碳原子，或1-4个碳原子，或1-3个碳原子，或1-2个碳原子饱和直链或支链的单价烃基，其中烷基可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。烷基基团更进一步的实例包括，但并不限于甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、正庚基和正辛基等等。
术语“杂原子”表示一个或多个O、S、N、P和Si，包括C，N，S和P任何氧化态的形式；伯、仲、叔胺和季铵盐的形式；或者杂环中氮原子上的氢被取代的形式，例如，N(像3，4-二氢-2H-吡咯基中的N)，NH(像吡咯烷基中的NH)或NR(像N-取代的吡咯烷基中的NR)；或杂环中的-CH2-被氧化，形成-C(＝O)-的形式。
术语“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本发明中所使用的术语“烷氧基”，涉及到烷基，像本发明所定义的，通过氧原子连接到化合物分子的其它部分上。一些实施例中，烷氧基为C1-4烷氧基；这样的实例包括，但并不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基等。并且所述烷氧基可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“卤代烷基”表示烷基可以被一个或多个卤素原子所取代的情况。一些实施例中，卤代烷基为卤代C1-6烷基。另一些实施例中，卤代烷基为卤代C1-3烷基。这样的实例包括，但并不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氯-乙烯基、2,2-二氟乙基、二氟甲氧基、三氟甲氧基等。所述的“卤代烷基”基团可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“烷氨基”包括“N-烷基氨基”和“N,N-二烷基氨基”，其中氨基团分别独立地被一个或两个烷基基团所取代。其中一些实施例是，烷基氨基是C1-6烷基氨基或(C1-6烷基)氨基基团。另外一些实施例是，烷基氨基是C1-3烷基氨基或(C1-3烷基)氨基基团。这样的实例包括，但并不限于N-甲氨基、N-乙氨基、N,N-二甲氨基和N,N-二乙氨基等等。所述的烷氨基基团可以任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“环烷基”表示含有3-8个碳原子的，单价或多价的饱和单环，双环或三环碳环体系，但绝不包含芳香环。在一实施方案中，环烷基包含3-7个碳原子；在另一实施方案中，环烷基包含3-6个碳原子；在又一实施方案中，环烷基包含5-6个碳原子。这样的实例包括，但并不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。所述环烷基基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“杂环基”是指包含3-8个环原子的饱和或部分不饱和的单环、双环或三环，绝不包含芳香环，其中至少一个环原子为杂原子。在一实施方案中，“杂环基”包含3-8个环原子；在一实施方案中，“杂环基”包含3-7个环原子；在另一实施方案中，“杂环基”包含5-8个环原子；在又一实施方案中，“杂环基”包含3-6个环原子；还在一实施方案中，“杂环基”包含5-6个环原子；再在一实施方案中，“杂环基”包含4-6个环原子；除非另外说明，杂环基可以是碳基或氮基，杂原子具有如本发明所述的含义。杂环基的实例包括，但不限于：环氧乙烷基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、吡咯烷基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、1,3-二氧环戊基、二硫环戊基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二噁烷基、二噻烷基、噻噁烷基、高哌嗪基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂
Figure BDA0002015805090000061
基、二氮杂
Figure BDA0002015805090000062
基、硫氮杂
Figure BDA0002015805090000063
基和2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基。杂环基中-CH2-基团被-C(＝O)-取代的实例包括，但不限于：2-氧代吡咯烷基、氧代-1,3-噻唑烷基、2-哌啶酮基、3,5-二氧代哌啶基和嘧啶二酮基。杂环基中硫原子被氧化的实例包括，但不限于环丁砜基和1,1-二氧代硫代吗啉基。所述的杂环基基团可以任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“傅克酰基化反应”是在强路易斯酸做催化剂条件下，让酰氯与苯环进行酰化的反应。此反应还可以使用羧酸酐作为酰化试剂，反应条件类似于烷基化反应的条件。反应的试剂最常用为酰氯，其次为酸酐，要求易解离成碳基正离子；反应的溶剂最常用为二氯甲烷，还有二氯乙烷、硝基甲烷、硝基苯和二硫化碳等；反应的催化剂最常用为三氯化铝，还有无水氯化锌、三氯化铁、四氯化钛等。
除非其他方面表明，本发明所描述的结构式包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构，几何异构或构象异构)：例如含有不对称中心的R、S构型，双键的(Z)、(E)异构体，和(Z)、(E)的构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体、几何异构体或构象异构体的混合物都属于本发明的范围。
除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所用的术语“一个”、“一种”、“该”以及本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)所使用的类似术语可以被解释为既包括单数，又包括复数。
在本说明书中，如果在化学名称和化学结构间存在任何差异，结构是占优的。
根据本发明实施例的二氯罗丹明染料可以应用于分子生物学、细胞生物学和分子遗传学中。例如，二氯罗丹明染料可以用来标记脱氧核苷酸、二脱氧核苷酸、多核苷酸，测定DNA序列及碎片分析，是一类用于多重检测的荧光染料，还可以作为荧光标记，附着在用荧光磷酸化试剂合成的新生或完整的寡核苷酸链上制作成商业化试剂。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度(℃)。除非其他方面表明，试剂购买于商品供应商如Okeanos、麦克林、阿拉丁、国药等，使用时都没有经过进一步纯化。
荧光吸收采用Nanodrop 1000测定，步骤为：启动软件，选择UV-VIS测量模式，初始化仪器完成后，清洗加样孔，然后加入Buffer，点击Blank，完成后，用无尘纸将Buffer擦干净即可上样，开始测量。测量完成后，点击Show Report查看结果，选择Save保存结果。
制备式(I)和式(II)所示化合物的方法
在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，
Figure BDA0002015805090000071
其中，R1、R2各自独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-8环烷基、3-8个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代。根据本发明实施例的方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除了不必要的影响因素，大大提高反应的成功率。
根据本发明的实施例，R1、R2各自独立地为H、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C5-6环烷基、5-6个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C1-3卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-6烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基以及R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代。
根据本发明的实施例，所述式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物的摩尔比为2:1。
根据本发明的实施例，所述傅克酰基化反应后，进一步包括纯化处理。由此，能分别得到高纯度的式(I)和式(II)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述纯化处理是通过高效制备液相色谱处理进行的。
根据本发明的实施例，，所述高效制备液相色谱的条件如下所示：
流动相：乙腈和0.1M TEAB，流速：30ml/min，色谱柱：250*30mm C18柱，等度洗脱。
根据本发明的实施例，所述纯化处理前进一步包括第一过滤处理，所述第一过滤处理是通过有机相滤膜进行的。由此，能过滤掉不溶性杂质。
根据本发明的实施例，所述傅克酰基化反应是通过如下方式进行的：将第一式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物发生第一傅克酰基化反应，以便获得式(III)所示化合物，将式(III)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物发生第二傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，其中，所述第一式(I-a)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物构成所述式(I-a)所示化合物，
Figure BDA0002015805090000091
由此，操作简单，收率高，副产物少，提纯更简单。
根据本发明的实施例，所述第一式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物的摩尔比为1:(1～1.5)。
根据本发明的实施例，所述第一式(I-a)所示化合物、式(I-b)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)。
根据本发明的实施例，所述第一傅克酰基化反应是在溶剂为甲苯、回流的条件下进行12-24小时。
根据本发明的实施例，所述第一傅克酰基化反应后、第二傅克酰基化反应前进一步包括将第一傅克酰基化反应液减压旋蒸获得固体。
根据本发明的实施例，所述第二傅克酰基化反应是在溶剂为丙酸、催化剂为硫酸的条件下进行的。
根据本发明的实施例，所述第二傅克酰基化反应是先在温度为130～190℃的条件下进行6-10h，之后在温度为110-150℃的条件下进行12-24h。
根据本发明的实施例，在第二傅克酰基化反应后进一步包括调pH处理，所述调pH处理后的反应液的pH为7～8。
根据本发明的实施例，所述调pH处理是通过添加NaOH进行的。
根据本发明的实施例，所述傅克酰基化反应是在溶剂为丙酸、温度为150～170℃的条件下进行24-72h。由此，能用一锅法制备得到式(I)和式(II)所示的化合物，操作简单，收率高，副产物少，提纯更简单。
根据本发明的实施例，所述傅克酰基化反应是在无水无氧的条件下进行的。
根据本发明的实施例，进一步包括将所述傅克酰基化反应后的反应液进行减压蒸馏、溶解、过滤处理，以便获得滤液，所述滤液构成式(I)和/或式(II)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述溶解处理是通过添加TEAB水进行的。
根据本发明的实施例，所述TEAB是以1mol/L的溶液形式存在。
根据本发明的一个具体实施例，通过减压蒸馏蒸除掉溶剂后，再往里面加入TEAB中和残留的丙酸，使溶液体系呈弱碱性，之后再加水稀释，然后再进行过滤处理。根据本发明的另一个实施例，过滤处理后的滤饼用甲醇进行洗涤，至洗出的滤液无色。
根据本发明的实施例，所述式(I-a)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure BDA0002015805090000101
根据本发明的实施例，所述式(I)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure BDA0002015805090000102
根据本发明的实施例，所述式(II)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure BDA0002015805090000103
试剂盒
在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的双脱氧核糖核苷酸，如BigDyeTM试剂，所述BigDyeTM试剂由二氯罗丹明染料、连接链、ddNTP组成，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。需要说明的是，现有技术中BigDyeTM试剂包括：受体染料(Acceptor Dye)、连接链(Linker)、双脱氧核苷酸类似物(ddNTP)，本申请的试剂盒是在现有技术的基础上，将其中的受体染料的合成方法替换成本申请的合成方法，连接链、双脱氧核苷酸类似物的合成以及其余后续测序中的应用同现有技术。根据本发明的实施例的试剂盒测序准确，精度高。
在本发明的第三方面，本发明提出了另一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含二氯罗丹明染料标记的dNTP，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的。
在本发明的第四方面，本发明提供一种二氯罗丹明染料标记的多核苷酸。根据本发明的一些实施例，二氯罗丹明染料还可以标记更多种物质用于物质分析。
测序方法
在本发明的第五方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，包括：利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记，所述二氯罗丹明染料是根据前面所述的方法合成的；以及基于测序合成过程中所检测到的荧光信号，确定待测样本的核苷酸序列。需要说明的是，本发明利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记的方法、以及测序方法是现有技术中的一般方法，区别在于，本发明中的二氯罗丹明染料是根据本发明实施例的方法合成的。根据本发明实施例的方法测序准确度高。
下面简写词的使用贯穿本发明：
LCMS 液相色谱-质谱联用
NaOH 氢氧化钠
HPLC 高效液相色谱
TEAB 三乙胺-碳酸缓冲液
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
Figure BDA0002015805090000111
(1)在10mL单口烧瓶中，将化合物3-二甲胺基苯酚(I-a1)(250mg,1.8mmol,0.5eq)和3,6-二氯-1,2,4-偏苯甲酸酐(I-b)(470mg，1.8mmol，0.5eq)溶入10mL甲苯中，升温至110℃回流反应12h。反应过程中会析出部分固体，LCMS显示固体为部分产物，液体为中间体(III-1)。
(2)将步骤(1)中的反应液冷却至室温，减压旋蒸得到棕红色固体，然后依次加入丙酸10mL、1滴2M的硫酸以及3-二甲胺基苯酚(250mg,1.8mmol,0.5eq)，升温至170℃回流反应6h，然后再降温至120℃反应12h。LCMS显示固体为产物，液体中的中间体(III-1)完全消失。
(3)待反应液完全冷却，加入8ml 50％NaOH将反应液调制PH＝7～8之间，过有机相滤膜后进行制备分离。
制备HPLC的条件：
流动相：A:乙腈，B:0.1M TEAB，见表1，
流速：30ml/min，
色谱柱：YMC-Actus ODS-A-HG 250*30mm C18柱，
表1：
时间(min) 总流量 CH<sub>3</sub>CN(A) 0.1M TEAB(B)
0 30 5 95
3.00 30 5 95
5.00 30 22 78
15.00 30 22 78
22.00 30 25 75
22.50 30 5 75
28.00 30 5 95
制备分离得到dTMRA(I-1)35mg，纯度为96.5％；dTMRA(II-1)44mg,纯度97.6％。产率为9％，最大荧光吸收用Nanodrop 1000测定为568nm。其与标准品LC-MS谱图如图1和图2所示。由此，可见本实施例的反应条件温和，且制备分离得到dTMRA(I-1)的纯度远高于现有技术。
实施例2
Figure BDA0002015805090000121
(1)在50毫升的单口瓶中加入化合物I-a2(1.16g,6.13mmol,1.0eq)，丙酸(20mL)溶解，再向溶液中加入3,6-二氯-1,2,4-偏苯甲酸酐(I-b)(800mg,2.11mmol,1eq)，于氮气保护下150℃搅拌反应48小时。LCMS监测反应，中间体及原料均反应完全时，降至室温，停止反应。
(2)减压蒸除溶剂，加10mL 1mol/L TEAB中和残留的丙酸，使溶液体系呈弱碱性，再加50mL水稀释，过滤，滤饼再用甲醇(50mL)洗涤，至洗出的滤液无色，之后再用滤膜过滤后进行制备HPLC纯化。
制备HPLC的条件：
流动相：A:乙腈，B:0.1M TEAB，见表2，
流速：30ml/min，
色谱柱：YMC-Actus ODS-A-HG 250*30mm C18柱，
表2：
时间(min) 总流量 CH<sub>3</sub>CN(A) 0.1M TEAB(B)
0 30 5 95
3.00 30 5 95
5.00 30 25 75
12.00 30 30 70
15.00 30 35 65
20.00 30 40 60
21.00 30 50 50
23.00 30 50 50
24.00 30 5 95
28.00 30 5 95
制备分离得到dROX(II-1)150mg，纯度97％；dROX(II-2)146mg,纯度98％。产率为16％，最大荧光吸收用Nanodrop 1000测定为595nm。其与标准品LC-MS谱图如图3和图4所示。由此，可见本实施例的反应条件温和，且制备分离得到dROX(II-1)的纯度远高于现有技术。
对比例1
与实施例2不同点在于：反应中未有氮气保护，其余步骤与实施例2完全相同。产率为4.8％。
对比例2
与实施例2不同点在于：所述化合物(I-a2)与化合物(I-b)摩尔比为3:1，其余步骤与实施例2完全相同。产率为7％。
对比例3
与实施例1不同点在于：所述第二步傅克酰基化反应温度是在130℃回流反应6h，然后再降温至120℃反应12h条件下进行的，其余步骤与实施例1完全相同。产率为3％。
对比例4
与实施例1不同点在于：所述第二步傅克酰基化反应温度是在190℃回流反应6h，然后再降温至120℃反应12h条件下进行的，其余步骤与实施例1完全相同。产率为0.5％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法，其特征在于，包括：
将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，
Figure FDA0002015805080000011
其中，R1、R2各自独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C3-8环烷基、3-8个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基、C1-6卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-8个环原子形成的杂环基，R2与R4连接形成5-8个环原子形成的杂环基，其中，所述5-8个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基取代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，R1、R2各自独立地为H、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C5-6环烷基、5-6个原子组成的杂环基，
R3、R4各自独立地为H、卤素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基、C1-3卤代烷基，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-6烷氧基、C1-3烷氨基取代，
或R1与R3连接形成5-6个环原子形成的杂环基以及R2与R4连接形成5-6个环原子形成的杂环基，其中，所述5-6个环原子形成的杂环基未被取代或被1、2、3或4个卤素、氨基、C1-3烷基、C1-3烷氧基、C1-3烷氨基取代。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物的摩尔比为2:1；
任选地，所述傅克酰基化反应后，进一步包括纯化处理；
任选地，所述纯化处理是通过高效制备液相色谱处理进行的；
任选地，所述高效制备液相色谱的条件如下所示：
流动相：乙腈和0.1M TEAB，
流速：30ml/min，
色谱柱：250*30mm C18柱，
梯度洗脱；
任选地，所述纯化处理前进一步包括第一过滤处理，所述第一过滤处理是通过有机相滤膜进行的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述傅克酰基化反应是通过如下方式进行的：
将第一式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物发生第一傅克酰基化反应以便获得式(III)所示化合物，
将式(III)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物发生第二傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，其中，所述第一式(I-a)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物构成所述式(I-a)所示化合物，
Figure FDA0002015805080000021
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物的摩尔比为1:(1～1.5)；
任选地，所述第一式(I-a)所示化合物、式(I-b)所示化合物与第二式(I-a)所示化合物的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；
任选地，所述第一傅克酰基化反应是在溶剂为甲苯、回流的条件下进行12-24小时；
任选地，所述第一傅克酰基化反应后、第二傅克酰基化反应前进一步包括将第一步傅克酰基化反应液减压旋蒸获得固体；
任选地，所述第二傅克酰基化反应是在溶剂为丙酸、催化剂为硫酸的条件下进行的；
任选地，所述第二傅克酰基化反应是先在温度为130～190℃的条件下进行6-10h，之后在温度为110-150℃的条件下进行12-24h；
任选地，在第二傅克酰基化反应后进一步包括调pH处理，所述调pH处理后的反应液的pH为7～8；
任选地，所述调pH处理是通过添加NaOH进行的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述傅克酰基化反应是在溶剂为丙酸、温度为150～170℃的条件下进行24-72h；
任选地，所述傅克酰基化反应是在无水无氧的条件下进行的；
任选地，进一步包括将所述傅克酰基化反应后的反应液进行减压蒸馏、溶解、过滤处理，以便获得滤液，所述滤液构成式(I)和/或式(II)所示化合物；
任选地，所述溶解处理是通过添加TEAB、水进行的；
任选地，所述TEAB是以1mol/L的溶液形式存在。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述式(I-a)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure FDA0002015805080000031
任选地，所述式(I)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure FDA0002015805080000032
任选地，所述式(II)所示的化合物包括选自如下之一的结构：
Figure FDA0002015805080000041
8.一种试剂盒，其特征在于，包含二氯罗丹明染料标记的双脱氧核糖核苷酸，所述二氯罗丹明染料是根据权利要求1～7任一项所述的方法合成的。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括二氯罗丹明染料标记的dNTP，所述二氯罗丹明染料是根据权利要求1～7任一项所述的方法合成的。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括二氯罗丹明染料标记的多核苷酸，所述二氯罗丹明染料是根据权利要求1～7任一项所述的方法合成的。
11.一种测序方法，其特征在于，包括：
利用二氯罗丹明染料对核糖核酸或脱氧核糖核酸进行荧光标记，所述二氯罗丹明染料是根据权利要求1～7任一项所述的方法合成的；以及
基于测序合成过程中所检测到的荧光信号，确定待测样本的核苷酸序列。
CN201910262706.8A 2019-04-02 2019-04-02 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用 Pending CN111763190A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910262706.8A CN111763190A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910262706.8A CN111763190A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111763190A true CN111763190A (zh) 2020-10-13

Family

ID=72718592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910262706.8A Pending CN111763190A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111763190A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621306A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 湖北华大基因研究院 化合物、其制备方法与用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6017712A (en) * 1996-06-27 2000-01-25 Lee; Linda 4,7-dichlororhodamine dyes
US6191278B1 (en) * 1999-11-03 2001-02-20 Pe Corporation Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof
US20050112781A1 (en) * 2000-05-25 2005-05-26 Lee Linda G. 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides
JP2011241372A (ja) * 2010-04-23 2011-12-01 Nippon Kayaku Co Ltd ローダミン染料
CN106946838A (zh) * 2017-05-08 2017-07-14 苏州高德瑞仪器有限公司 一种温和条件下快速制备带多个活泼官能团的罗丹明染料的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6017712A (en) * 1996-06-27 2000-01-25 Lee; Linda 4,7-dichlororhodamine dyes
US6191278B1 (en) * 1999-11-03 2001-02-20 Pe Corporation Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof
US20050112781A1 (en) * 2000-05-25 2005-05-26 Lee Linda G. 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides
JP2011241372A (ja) * 2010-04-23 2011-12-01 Nippon Kayaku Co Ltd ローダミン染料
CN106946838A (zh) * 2017-05-08 2017-07-14 苏州高德瑞仪器有限公司 一种温和条件下快速制备带多个活泼官能团的罗丹明染料的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIBO YU等: "From Spirolactam Mixtures to Regioisomerically Pure 5- and 6-Rhodamines: A Chemodosimeter-Inspired Strategy", 《ORG. LETT.》 *
段二红: "罗丹明类衍生物的合成及表征", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *
颜范勇等: "罗丹明类荧光染料的合成及应用", 《化学进展》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621306A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 湖北华大基因研究院 化合物、其制备方法与用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1338597C (en) Reagents for the preparation of 5&#39;-tagged oligonucleotides
EP1907560B1 (en) Compounds and methods for labeling oligonucleotides
US7439341B2 (en) Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
US20060292616A1 (en) Single molecule miRNA-based disease diagnostic methods
AU2003275018A1 (en) Anthraquinone quencher dyes, their methods of preparation and use
CN112321588B (zh) 一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用
CN112174885B (zh) 对二甲氨基苯乙烯喹啉衍生物及其合成方法和在核酸荧光探针中的应用
CA2902992A1 (en) Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
KR101880502B1 (ko) 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
CN111763190A (zh) 二氯罗丹明染料的合成方法及其应用
CN108516979B (zh) 一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用
Zare et al. Trityl chloride (TrCl): efficient and homogeneous organocatalyst for the solvent‐free synthesis of 14‐aryl‐14H‐dibenzo [a, j] xanthenes by in situ formation of carbocationic system
US20100228023A1 (en) ONE STEP PROCESS FOR THE PREPARATION OF SUBSTITUTED 5, 10-DIHYDRODIBENZO [b,e][1, 4]DIAZEPINE-11-ONES
WO2023019983A1 (zh) 一种核酸荧光染料及其制备和应用
US20080177091A1 (en) Methods for producing and purifying phenolphthalein
EP1223226B1 (en) Novel fluorescent dye and method of measuring nucleic acid
JP2002327130A (ja) 新規蛍光色素及び核酸の測定方法
CN109206454A (zh) 一类基于双核铱(ⅲ)配合物的g-四链体选择性探针
CN108949159B (zh) 一种检测钯离子的荧光探针及其合成方法和应用
CN113308131A (zh) 一种羧基修饰的近红外方酸染料及其制备方法与应用
CN106518850A (zh) 一种匹莫苯丹的化学合成方法
Satake et al. Ratiometric fluorescence detection of pyrimidine/purine transversion by using a 2-amino-1, 8-naphthyridine derivative
Sajadi et al. K4 [Fe (CN) 6] as non-toxic source of cyanide for the cyanation of aryl halides using Pd-Beta zeolite as a heterogeneous catalyst
CN116589475B (zh) 一种2&#39;,4&#39;,5&#39;,7&#39;-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法
CN114685530B (zh) 一类基于异喹啉的聚集诱导发光分子及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201013