CN114617906A - 一种桦褐孔菌提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种桦褐孔菌提取物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然药物化学技术领域，提供了一种桦褐孔菌提取物的制备方法及其应用。为了解决现有胃癌治疗手段存在的缺陷，本发明采用褐孔菌醇提取物对裸鼠荷瘤模型进行治疗，通过实验证明，桦褐孔菌醇提取物可能通过抑制炎性因子的产生，截断肿瘤的发展，通过上调肿瘤抑制蛋白P53、caspase‑9和BAX，下调Bcl‑2，促进胃癌细胞调亡，通过减低MDA的含量、提高SOD含量清除体内过多的自由基，增强机体的抗氧化能力，从而抑制肿瘤生长。由此可见，本发明所述的桦褐孔菌提取物对裸鼠荷瘤模型具有很好的治疗效果，在治疗胃癌方面具有广阔的应用前景，为治疗胃癌的新药研发提供了实验依据。

Description

一种桦褐孔菌提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域，涉及一种桦褐孔菌提取物的制备方法及其应用。
背景技术
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，预后相对较差，严重威胁人类健康。据2018年癌症数据显示，全球胃癌年死亡人数高达78万例，居两性癌症死亡率的第三位，严重威胁人类的生命健康。中国是胃癌高发国家，发病和死亡例数均约占世界的50％，疾病负担严重，是癌症防治的重点。
目前，胃癌的治疗手段主要是手术和放化疗，然而大多数胃癌被发现时已处于晚期，错失最佳手术期，部分患者对放化疗不敏感，或者无法承受放化疗的副作用，无法解决癌细胞弥漫和转移等一系列问题。
天然药物(包括中医药和民族医药)是用来防治疾病的有力武器，与化学药品相比，天然药物除了有着来源广泛、价格低廉和毒副作用低等优点外，在减轻癌症患者临床症状，提高生存质量，提高免疫力，增强放、化疗敏感性，减轻放、化疗不良反应等很多方面都具有优势。从天然产物，特别是大型真菌中筛选抗肿瘤活性物质是抗肿瘤新药物研发的一个重要方向，这为寻找高活性的抗肿瘤化合物具有重要意义。
发明内容
为了克服现有胃癌治疗手段存在的缺陷，寻找治疗胃癌的天然药物提取物，本发明提供了一种桦褐孔菌提取物的制备方法，具体方法如下：
1)取桦褐孔菌与体积分数为70％的乙醇按照0.9kg：10L～1.1kg：10L的料液比混合，浸泡24h；
2)将步骤1)得到的混合物加热回流2h后，对得到的提取液进行过滤，收集上清液，残渣备用；
3)将步骤2)所述残渣按照步骤2)的方法重复提取1～2次；
4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，蒸干至膏状后打粉，得到桦褐孔菌提取物。
在本发明的一个实施例中，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照0.9kg：10L的料液比混合。
在本发明的一个实施例中，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照1.0kg：10L的料液比混合。
在本发明的一个实施例中，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照1.1kg：10L的料液比混合。
在本发明的一个实施例中，步骤2)是将步骤1)得到的混合物置于120℃下回流1h。
在本发明的一个实施例中，步骤4)是将合并后的上清液置于80℃水浴箱中蒸干。
本发明还提供了上述制备方法获得的桦褐孔菌提取物在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。
有益效果
对胃癌BGC-823荷瘤裸鼠的研究结果显示，桦褐孔菌提取物干预后的胃癌BGC-823荷瘤裸鼠与模型组相比较，肿瘤明显缩小。HE切片可见肿瘤细胞凝固性坏死，细胞形态基本可见，细胞核消失，细胞质深染，坏死细胞周围可见炎细胞浸润，血清中的IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF、MDA含量降低，SOD、GSH-Px含量升高，提示桦褐孔菌醇提取物可能通过抑制炎性因子的产生，截断肿瘤的发展，通过减少VEGF，抑制肿瘤的增殖和转移，通过减低MDA的含量、提高SOD、GSH-Px含量清除体内过多的自由基，增强机体的抗氧化能力，从而抑制肿瘤生长。
具体实施方式
实施例1
1)将桦褐孔菌与70％乙醇按照0.9kg：10L的料液比混合，浸泡24h；
2)将步骤1)得到的混合物置于120℃下回流2h，对得到的提取液进行过滤，收集上清液，残渣备用；
3)将步骤2)所述残渣重复提取2次，对得到的提取液进行过滤，收集上清液；
4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，于80℃水浴箱中蒸干至膏状后打粉，得到桦褐菌提取物。
实施例2
1)将桦褐孔菌与70％乙醇按照1.0kg：10L的料液比混合，浸泡24h；
2)将步骤1)得到的混合物置于120℃下回流2h，对得到的提取液进行过滤，收集上清液，残渣备用；
3)将步骤2)所述残渣重复提取2次，对得到的提取液进行过滤，收集上清液；
4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，于80℃水浴箱中蒸干至膏状后打粉，得到桦褐菌提取物。
实施例3
1)将桦褐孔菌与70％乙醇按照1.1kg：10L的料液比混合，浸泡24h；
2)将步骤1)得到的混合物置于120℃下回流2h，对得到的提取液进行过滤，收集上清液，残渣备用；
3)将步骤2)所述残渣重复提取2次，对得到的提取液进行过滤，收集上清液；
4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，于80℃水浴箱中蒸干至膏状后打粉，得到桦褐菌提取物。
桦褐菌醇提取物的药效研究
本研究中所用到的小鼠为雄性裸鼠，小鼠的周龄为3-5周，体重为(20±2)g。
1)裸鼠荷瘤模型的建立
对雄性裸鼠进行清洁级饲养，自由摄入水和饲料一周后，在每只裸鼠腋下皮肤接种0.2mL BGC-823细胞(1×107cells/mL)，每天观察裸鼠肿瘤形成情况。
2)动物组分及给药
裸鼠随机分为7组(空白组、模型组、阴性对照组、阳性对照组(卡培他滨片，325mg/(kg·d)、桦褐孔菌醇提取液高剂量组(312.5mg/ml)、中剂量组(156.25mg/ml)和低剂量组(78.125mg/ml))，每组7只。阴性对照组灌胃给药0.3％羧甲基纤维素钠(CMC)0.4mL/10g，阳性对照组每只裸鼠灌胃给药0.4mL/10g，每天一次，连续21d。
3)荷瘤裸鼠移植瘤的体积变化
每组裸鼠从移植瘤后开始，用游标卡尺分别在第7、14、21天作一次活体肿瘤大小(包括最大长径a和横径b)测量，根据公式V(mm3)＝(a×b2)/2计算肿瘤体积(V)，以每组裸鼠瘤体积平均值为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制移植瘤生长曲线。
4)桦褐孔菌醇提取物对荷瘤裸鼠炎性、氧化相关细胞因子的影响
在实验第22天后，对小鼠摘眼球取血，离心取血清-20℃冻存，ELISA法检测白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)各组裸鼠IL-1、IL-6、TNF-α、MDA和SOD的表达情况如表1所示。
表1桦褐孔菌醇提物对BGC-823荷瘤小鼠炎性、氧化相关细胞因子的影响(X±S，n＝7)
Figure BDA0002834030630000051
注：与模型组对比，标*值P＜0.05；与空白组对比，标#值P＜0.05
IL-1是机体在应激因素和致病因素等的作用下常首先表达的多功能细胞因子，是联系免疫系统和人体其它系统的重要介质，在机体的免疫应答中起重要的作用，是反映机体免疫功能的重要指标。
IL-6是由单核细胞、激活的T淋巴细胞及多种活性细胞分泌的具有生物活性的物质，可诱导免疫细胞的增殖、分化，对机体的天然免疫和获得性免疫都具有重要的作用。
TNF-α对肿瘤细胞具有直接的细胞毒作用和生长抑制作用，可直接抑制和杀伤肿瘤细胞且可诱导肿瘤细胞凋亡，介导免疫应答，以及引起肿瘤微血管损伤和抑制肿瘤血管形成，继而引起肿瘤出血坏死等途径来发挥抗肿瘤作用。IL-1和TNF-α通常同时合成和分泌，且TNF-α能促进IL-1的合成。
活性氧自由基诱导的氧化损伤是某些疾病与衰老的重要原因。现已证明肿瘤的发病与自由基有关，因此，预防和治疗肿瘤时可考虑采用适当的清除自由基的药物或通过自由基机制进行调节和抑制。通过检测抗氧化酶SOD和脂质过氧化物丙二醛MDA的含量，反映桦褐孔菌醇提取物的抗氧化作用。
模型组血清中IL-1、IL-6、TNF-α、MDA含量明显升高，经西药或桦褐孔菌醇提物干预后表达均下调。模型组血清中SOD含量显著下降，经西药或桦褐孔菌醇提物干预后表达均上调。
5)桦褐孔菌醇提取物对荷瘤裸鼠免疫功能的影响
实验第22天后处死裸鼠，摘取脾脏，用生理盐水洗涤，然后用滤纸吸干称重，根据公式脾脏指数＝脾质量(mg)/体质量(g)，计算脾脏指数，结果如表2所示。
表2桦褐孔菌醇提物对BGC-823荷瘤小鼠脾脏的影响
Figure BDA0002834030630000061
Figure BDA0002834030630000062
注：与模型组对比，标*值P＜0.05；与空白组对比，标#值P＜0.05
与空白组相比较，阴性对照组和模型组的脾脏明显增大，其它组别的脾脏变化不大，其中桦褐孔菌醇提物高剂量组和西药组脾脏重量与空白组相近，桦褐孔菌醇提物中、低剂量组脾脏重量略有增大。
6)桦褐孔菌醇提取物对BGC-823荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用
实验第22天后处死裸鼠后称重，摘取瘤块，用生理盐水洗涤，然后用滤纸吸干称重，根据公式抑瘤率＝(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100％，计算抑瘤率，结果如表3所示。
表3桦褐孔菌醇提物抗BGC-823荷瘤小鼠的抑瘤率
Figure BDA0002834030630000071
Figure BDA0002834030630000072
注：与模型组对比，标*值P＜0.05
高剂量组的肿瘤抑制率最好，高于西药组，高、中、低剂量组有浓度趋势，呈浓度依赖性的表现。
7)桦褐孔菌醇提取物对荷瘤裸鼠肿瘤相关因子的影响
取裸鼠瘤块组织，部分瘤体研磨取上清液测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-celllymphoma-2，Bcl-2)、免抗人单克隆抗体(Bax)，观察桦褐孔菌醇提取物调控细胞凋亡的能力；检测抑癌基因P53，观察桦褐孔菌醇提取物对胃癌的抑制作用，结果如表4所示。
表4免疫组织化学法测桦褐孔菌醇提物对四种蛋白的细胞平均光密度值
Figure BDA0002834030630000073
Figure BDA0002834030630000074
Figure BDA0002834030630000075
注：与模型组对比，标*值P＜0.05
Bcl-2、Bax基因是目前己知的细胞调亡中最重要的调控基因，检测Bcl-2、Bax对了解桦褐孔菌醇提取物促进胃癌细胞调亡的机制具有重要意义。线粒体凋亡的发生受Bcl-2蛋白家族成员的调控，肿瘤抑制蛋白p53在调节Bcl-2蛋白家族中具有关键作用。
caspase-9、BAX、P53在西药组和高、中、低剂量组蛋白表达上调，细胞平均光密度值高，模型组和阴性对照组的蛋白表达下调，细胞平均光密度值低，中、低剂量组细胞平均光密度值也呈递减趋势。桦褐孔菌高、中、低剂量组和西药组Bcl-2细胞平均光密度值低，模型组和阴性对照组平均光密度值高，高、中、低剂量组蛋白表达呈递增趋势。

Claims (7)

1.一种桦褐孔菌提取物的制备方法，其特征在于，方法如下：
1)取桦褐孔菌与体积分数为70％的乙醇按照0.9kg：10L～1.1kg：10L的料液比混合，浸泡24h；
2)将步骤1)得到的混合物加热回流2～2.5h后，对得到的提取液进行过滤，收集上清液，残渣备用；
3)将步骤2)所述残渣按照步骤2)的方法重复提取1～2次；
4)合并步骤2)与步骤3)得到的上清液，蒸干至膏状后打粉，得到桦褐孔菌提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照0.9kg：10L的料液比混合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照1.0kg：10L的料液比混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)是将体积分数为70％的乙醇与桦褐孔菌按照1.1kg：10L的料液比混合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)是将步骤1)得到的混合物置于120℃下回流2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)是将合并后的上清液置于80℃水浴箱中蒸干至膏状。
7.权利要求1-6任意一项所述的制备方法获得的桦褐孔菌提取物在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。
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