CN114605450B - 一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物中的应用 - Google Patents

一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物中的应用。所述硼携带剂是在苄胍类化合物和酪氨酸基础上修饰得到，本发明所述化合物通过取代、保护及脱保护等反应得到，易于制备，成本低，且对肿瘤细胞具有高亲和力，特异性地响应肿瘤区域，具有良好稳定性和低的生物毒性等特点。可用于硼中子俘获疗法(BNCT)，治疗恶性肿瘤，经放射性同位素如18F等标记的化合物还可用于PET成像诊断，可同时实现成像诊断和精准治疗。

Description

一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是指一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物中的应用。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，其死亡率仅次于心血管疾病，居各类疾病死亡率第二位，而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。根据目前癌症的发病趋势，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。尽管癌症发生的确切机制目前仍不清楚，但是如果能在早期对癌症进行诊断，并尽早采取手术、放疗或化疗(或这几种方法的结合)，大多数肿瘤患者是有存活可能性的。
一种有前景的治疗方法，硼中子俘获疗法(Boron Neutron Capture Therapy，BNCT)是一种放射治疗形式，其需要两个要素：10B和低能量的热中子。10B是以在肿瘤中积累的含硼化合物的形式对要治疗的对象进行给药的。然后，使用来自核反应器或回旋加速器的低能热中子对要治疗的对象进行辐射。
BNCT治疗过程：先给患者注射靶向性含硼药物，使10B能聚集在肿瘤细胞中，而正常组织细胞10B含量很少，之后用中子照射肿瘤部位。中子与10B发生俘获反应产生ɑ粒子和7Li粒子，而ɑ粒子和7Li粒子在细胞中的射程分别为9μm和5μm。这些粒子产生的电离辐射损伤作用仅限于摄取10B的细胞，从而达到选择性杀死目标细胞，对未摄取10B的正常组织细胞损伤极少。因此，理论上BNCT是治疗癌症的完美手段。
BNCT中一个重要的问题是为硼原子寻找无毒的载体分子，使其在肿瘤细胞中聚集，从而确保足够的选择性。为了获得高治疗比，这样的化合物在肿瘤中应当优先释放出15-30μg/g(ppm，即百万分之一)的10B平均浓度以保证其具有高选择性和低毒性。目前处于临床试验的两种硼携带剂是巯基-闭合式-十二烷硼酸二钠(BSH)和1，4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)。虽然BSH和BPA已经在临床上被证实是完全有效的，但是这两种试剂仅有对肿瘤细胞中等的选择性以及在肿瘤细胞中较低的保留时间。而且由于BSH有被空气氧化的倾向，因此具有有限的化学稳定性，而BPA虽然在化学方面是无毒的，但仅含有低重量百分比的硼(5％)，因此在肿瘤组织中获得治疗量的硼浓度需要使用大量该药物。
间碘苄胍是肾上腺素神经元阻滞剂溴苄胺和胍乙啶的类似物，也是神经递质去甲肾上腺素的功能性类似物。间碘苄胍能与肾上腺素受体结合，且具有高度特异性，可与富含肾上腺素受体的组织和器官结合，如肾上腺髓质、心肌以及相关肿瘤。
放射性同位素标记的间碘苄胍用于肿瘤的成像已被用于医学诊疗中，在PET成像的基础上结合治疗组件，实现肿瘤成像与治疗一体化是技术发展的方向。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种含硼苄胍类化合物及其合成与其在制备诊疗一体化药物中的应用。
一种含硼苄胍类化合物，所述含硼苄胍类化合物结构式为：
其中，B为10B。
在本发明的一个实施例中，所述含硼苄胍类化合物中的F至少一个为18F。
在本发明的一个实施例中，所述含硼苄胍类化合物结构式如式(1)或式(2)所示：
其中，B为10B。
所述的含硼苄胍类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在有机溶剂中，将化合物氟化盐混合，室温下反应3-6h得到/>
(2)将Na18F或者K18F水溶液调节至酸性，加入步骤(1)中所述并混合，进行加热反应，得到所述含硼苄胍类化合物，其中，B为10B。
本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述有机溶剂为MeCN、丙酮、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述氟化盐为氟化钾或氟化钠。
本发明的一个实施例中，步骤(1)中，化合物与氟化盐的摩尔比为1:3-10。
本发明的一个实施例中，步骤(1)中，通过以下方法制备得到：
一、将苄溴类化合物与盐酸胍通过取代反应，再通过保护基的作用，得到稳定的苄胍类化合物。
二、将步骤一制备的苄胍类化合物与镁试剂在四氢呋喃体系中反应；接着将得到的格式试剂与三甲氧基硼烷反应，生成硼携带剂。
三、将步骤二获得产物用蒎二醇类似物保护硼基，接着在二氯甲烷锂盐溶液中进行氯代反应，最后在双(三甲基硅基)氨基锂存在下反应，氨基化得到产物。
本发明的一个实施例中，步骤(2)中，加热反应温度为70-100℃。
一种组合物，所述组合物包括所述的含硼苄胍类化合物或药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
本发明的一个实施例中，所述载体选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和藻酸中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述稀释剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙和结晶纤维素中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述润滑剂选自微粉硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、滑石粉和无水硅胶中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述粘合剂选自阿拉伯胶、明胶、糊精、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述湿润剂选自十二烷基硫酸钠。
本发明的一个实施例中，所述矫味剂可以为阿斯巴甜、甜菊甙、蔗糖、麦芽糖醇和柠檬酸中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述助悬剂选自阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素和硬脂酸铝凝胶中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述表面活性剂选自卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯和单硬脂酸甘油酯中的一种或多种。
本发明的一个实施例中，所述防腐剂选自对羟苯甲酸甲酯或/和对羟苯甲酸丙酯。
所述的含硼苄胍类化合物，或所述的组合物在制备治疗肿瘤PET成像试剂中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为神经内分泌肿瘤。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为嗜铬细胞瘤。
所述的含硼苄胍类化合物，或所述的组合物在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为神经内分泌肿瘤。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为嗜铬细胞瘤。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明引入放射性的18F，该化合物可以作为PET探针，发展出全新的诊疗一体化的含硼试剂，用于BNCT治疗极具创新性。该类化合物易于制备、成本低、并且具有良好的生物性能，在肿瘤细胞摄取、积累和保留方面具有明显优势，并没有出现毒性的现象，在BNCT方面具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明18F标记的含硼化合物应用于荷瘤小鼠的PET图像。
图2是本发明18F标记的含硼化合物注射后主要脏器及肿瘤的分布情况。
图3是本发明荷瘤小鼠的不同器官的硼吸收量。
图4是本发明不同剂量含硼化合物注射荷瘤小鼠后PET显像情况。
图5是本发明制备18F标记的含硼化合物的合成路线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1化合物Ia的制备
(1)化合物A2的制备
将3.3g钠加入20mL超干乙醇中，再加入2mmol盐酸胍，并回流15min，将反应液过滤。并将2mmol的化合物A1(528mg，2mmol)的无水乙醇溶液加入到滤液中，并加热回流36h。通过旋转蒸发除去反应溶剂得到化合物A2，所得化合物A2的质量为189mg(0.78mmol)，该反应的收率为39％.化合物A2的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,D2O):δ8.56(s,3H),7.43(t,1H),7.04-7.10(m,3H),4.56(d,2H),3.92(s,2H),2.00(s,1H)。
(2)化合物A3的制备
将4-二甲氨基吡啶(488mg，4mmol)添加到化合物A2(9.68g，40mmol)的THF(100mL)溶液中，在5h内缓慢加入二碳酸二叔丁酯(17.464g，80mmol)的THF(100mL)溶液，并将所得混合溶液在室温搅拌过夜，之后加入另一份二碳酸二叔丁酯(7.336g，24.8mmol)的THF(40.0mL)溶液，混合搅拌3h以驱动反应完成。将反应混合物进行真空浓缩，并将得到的无色固体与150mL的1％乙酸水溶液混合搅拌30分钟，将所得混合液进行过滤，收集沉淀物并用水洗涤，最后将沉淀物进行真空干燥得到无色固体化合物A3，其中化合物A3质量为13.37g，该反应的收率为52％。化合物A3的核磁数据为1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.45(s,1H),7.00-7.10(d,3H),4.98(s,2H),4.56(s,2H)1.35(s,36H)。
(3)化合物A4和化合物A5的制备
a，将0.486g(20mmol)镁屑加入到250mL的三口烧瓶中，加入5mg的碘，然后加入100mL无水四氢呋喃，将温度加热到50℃后，再慢慢让其自然降温至40℃，然后向此悬浮液在2h内使用滴液漏斗逐步加入6.430g化合物A3和50mL无水四氢呋喃组成的混合溶液，引发格式反应。反应引发后温度会迅速上升，用冰水浴将温度降低至10-15℃，再慢慢滴加剩余的化合物A3混合溶液，滴加完毕后室温反应8h。
b，称量1.56g(15mmol)硼酸三甲酯，加入500mL三口烧瓶中，再加入200mL四氢呋喃稀释，将烧瓶放入低温浴槽中温度降到-15℃以下。然后慢慢把步骤a中最终反应液滴加到硼酸三甲酯中，滴加时间为2.5h，然后在低温下反应10h。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干去除溶剂，用二氯甲烷重结晶，以投入的化合物A3为基准，最终收获化合物A4(3.2mmol 2.03g)，两步总收率为32％。化合物A5的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.56(s,1H),7.01-7.09(t,3H),4.99(s,2H),3.39(s,6H),1.89(s,2H),1.30(s,36H)。
(4)化合物A6的制备
将化合物A5(1.271g,2mmol)溶解在无水THF(10mL)中，向反应混合物中加入(+)-蒎二醇(766mg,4.5mmol)，在室温下搅拌反应3h，真空浓缩得到粗产物，以石油醚/乙酸乙酯(7:3)为洗脱液，通过柱层析纯化产物。最终得到化合物A6(815.8mg，1.1mmol)，产率为55％。化合物A6的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.43(t,1H),7.01-7.09(m,3H),4.97(s,2H),3.24(t,1H),1.83(s,2H),1.62-1.42(m,5H),1.38(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.99(s,6H).
(5)化合物A7的制备
(二氯甲基)锂是通过将正丁基锂(2.27g，35mmol,13mL正己烷溶液)滴加到干燥的二氯甲烷中(4.6g，54mmol)得到。在-100℃和氩气下的无水四氢呋喃中，加入上述得到的90％(二氯甲基)锂后，形成白色沉淀。将1000mL无水四氢呋喃缓慢加入剧烈搅拌的(二氯甲基)锂浆液中，将化合物A6(20.03g，27mmol)加入上述溶液。10min后，将反应温度升至-78℃并继续搅拌反应30min，然后在5min内滴加无水氯化锌溶液(5.5g，400mmol,40.4mL乙醚溶液)。使反应混合物升温至室温，搅拌2h后，向反应混合物中加入乙醚(50mL)得到悬浮液，将所得悬浮液用饱和氯化铵溶液洗涤。蒸发溶剂并将油状残余物溶解在戊烷(30mL)中，用盐水洗涤并用硫酸镁干燥，在真空下除去戊烷以获得油状原料的化合物A7(6.71g)，该反应的产率为32％。化合物A7的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.55(t,1H),7.30-7.23(m,3H),4.97(s,2H),4.88(s,1H),3.24(t,1H),1.62-1.42(m,5H),1.38(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.98(s,6H).
(6)化合物S1的制备
在干燥的微波消解管内，加入化合物A7(7.76g，10mmol)，抽真空和氮气换气3次。用注射器加入无水丙酮20mL和溶解有10mmol氨气的正丁醇，并缓慢加热至80℃，保持20h，然后将反应液转移至100mL圆底烧瓶，真空浓缩得到粗产物，加入无水丙酮溶解粗产物，过滤去除不溶性盐，将滤液再次进行真空浓缩，加20mL热丙酮溶解，再滴加5mL乙醚沉淀。过滤分别用100mL乙醚和100mL稀盐酸溶液(1M)洗涤，真空干燥滤渣得到化合物S1，化合物S1的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.45(t,1H),7.10-7.00(m,6H),4.97(s,4H),3.24(t,1H),1.62-1.42(m,5H),1.38(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.98(s,6H).
(7)化合物S2的合成
将化合物S1(77.18mg，0.1mmol)加入5mL的反应瓶中，同时加入KF(0.1mL，0.3mmol)溶液、HCl(0.06mL，0.4mmol)和0.2mL MeCN溶剂，室温下反应3h，得到产物粗品。将产物粗品用无水乙醚洗涤若干次得到纯化合物S2，所得化合物S2的质量为30mg，该反应的收率为46％。S2的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δppm 7.21(d,2H)，7.05(t,5H)，4.98(s,2H),4.00(t,1H),3.1-3.4(s,2H),1.38(s,36H).
(8)化合物Ia的合成
用盐酸水溶液调节100μL 1M的K18F水溶液的pH值至2，并加入与K18F相同物质的量的化合物S2，混合搅拌均匀并在85℃下加热0.5h，之后加入1mL生理盐水淬灭反应，最终得到化合物Ia。所得化合物Ia通过放射HPLC验证了其放射化学纯度，其中放射化学纯度超过99％，该反应的收率为30％。化合物Ia的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.7-8.6(d,2H)，7.24-7.00(m,7H),4.0-3.98(t,3H),3.1-3.4(s,3H)，2.0(s,1H).
实施例2化合物Ib的制备
(1)化合物B2的制备
将1.65g钠加入15mL超干乙醇中，再加入1mmol盐酸胍并回流15min，将反应液过滤。并将1mmol的化合物B1(264mg，1mmol)的无水乙醇溶液加入到滤液中，并加热回流36h。通过旋转蒸发除去反应溶剂得到化合物B2，所得化合物B2的质量为155mg(0.64mmol)，该反应的收率为64％.化合物B2的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,D2O):δ8.73(s,3H),7.13(s,4H),4.55(s,2H),3.92(s,2H),2.10(s,1H)。
(2)化合物B3的制备
将4-二甲氨基吡啶(244mg，2mmol)添加到化合物B2(4.84g，20mmol)的THF(80mL)溶液中，在5h内缓慢加入二碳酸二叔丁酯(8.732g，40mmol)的THF(90mL)溶液，并将所得混合溶液在室温搅拌过夜，之后加入另一份二碳酸二叔丁酯(3.668g，12.4mmol)的THF(40.0mL)溶液，混合搅拌3h以驱动反应完成。将反应混合物进行真空浓缩，并将得到的无色固体与100mL的1％乙酸水溶液混合搅拌30分钟，将所得混合液进行过滤，收集沉淀物并用水洗涤，最后将沉淀物进行真空干燥得到无色固体化合物B3，其中化合物B3质量为5.4g，该反应的收率为42％。化合物B3的核磁数据为1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.11(s,4H),4.98(s,2H),4.56(s,2H)1.35(s,36H)。
(3)化合物B4和化合物B5的制备
a，将0.243g(10mmol)镁屑加入到250mL的三口烧瓶中，加入3mg的碘，然后加入80mL无水四氢呋喃，将温度加热到50℃后，再慢慢让其自然降温至40℃，然后向此悬浮液在2h内使用滴液漏斗逐步加入3.215g化合物B3和40mL无水四氢呋喃组成的混合溶液，引发格式反应。反应引发后温度会迅速上升，用冰水浴将温度降低至10-15℃，再慢慢滴加剩余的化合物B3混合溶液，滴加完毕后室温反应8h。
b，称量0.78g(7.5mmol)硼酸三甲酯，加入500mL三口烧瓶中，再加入100mL四氢呋喃稀释，将烧瓶放入低温浴槽中温度降到-15℃以下。然后慢慢把步骤a中最终反应液滴加到硼酸三甲酯中，滴加时间为2.5h，然后在低温下反应10h。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干去除溶剂，用二氯甲烷重结晶，以投入的化合物B3为基准，最终收获化合物B4(1.6mmol 1.015g)，两步总收率为32％。化合物B5的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.11(s,4H),4.99(s,2H),3.39(s,6H),1.89(s,2H),1.30(s,36H)。
(4)化合物B6的制备
将化合物B5(0.636g,1mmol)溶解在无水THF(10mL)中，向反应混合物中加入(+)-蒎二醇(383mg,2.25mmol)，在室温下搅拌反应3h，真空浓缩得到粗产物，以石油醚/乙酸乙酯(7:3)为洗脱液，通过柱层析纯化产物。最终得到化合物B6(407.9mg，0.55mmol)，产率为55％。化合物B6的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.13(s,4H),4.97(s,2H),3.24(t,1H),1.83(s,2H),1.62-1.42(m,5H),1.38(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.99(s,6H).
(5)化合物B7的制备
(二氯甲基)锂是通过将正丁基锂(2.27g，35mmol,13mL正己烷溶液)滴加到干燥的二氯甲烷中(4.6g，54mmol)得到。在-100℃和氩气下的无水四氢呋喃中，加入上述得到的90％(二氯甲基)锂后，形成白色沉淀。将1000mL无水四氢呋喃缓慢加入剧烈搅拌的(二氯甲基)锂浆液中，将化合物B6(20.03g，27mmol)。10min后，将反应温度升至-78℃并继续搅拌反应30min，然后在5min内滴加无水氯化锌溶液(5.5g，400mmol,40.4mL乙醚溶液)。使反应混合物升温至室温，搅拌2h后，向反应混合物中加入乙醚(50mL)得到悬浮液，将所得悬浮液用饱和氯化铵溶液洗涤。蒸发溶剂并将油状残余物溶解在戊烷(30mL)中，用盐水洗涤并用硫酸镁干燥，在真空下除去戊烷以获得油状原料的化合物B7(6.07g)，该反应的产率为30％。化合物B7的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.23(s,4H),4.97(s,2H),4.88(s,1H),3.21(t,1H),1.61.40(m,5H),1.37(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.97(s,6H).
(6)化合物T1的制备
在干燥的微波消解管内，加入化合物A7(15.52g，20mmol)，抽真空和氮气换气3次。用注射器加入无水丙酮50mL和溶解有20mmol氨气的正丁醇，并缓慢加热至80℃，保持20h，然后将反应液转移至250mL圆底烧瓶，真空浓缩得到粗产物，加入无水丙酮溶解粗产物，过滤去除不溶性盐，将滤液再次进行真空浓缩，加40mL热丙酮溶解，再滴加10mL乙醚沉淀。过滤分别用150mL乙醚和150mL稀盐酸溶液(1M)洗涤，真空干燥滤渣得到化合物T1，化合物T1的核磁数据为:1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ7.23(s,4H),4.95(s,4H),3.14(t,1H),1.62-1.42(m,5H),1.35(s,36H),1.29-1.24(d,4H),0.98(s,6H).
(7)化合物T2的合成
将化合物T1(154.36mg，0.2mmol)加入25mL的反应瓶中，同时加入KF(0.67mL，2mmol)溶液、HCl(0.12mL，0.8mmol)和0.4mL MeCN溶剂，室温下反应6h，得到产物粗品。将产物粗品用无水乙醚洗涤若干次得到纯化合物T2，所得化合物T2的质量为60mg，该反应的收率为46％。化合物T2的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δppm 7.18(d,2H)，7.05(t,3H)，4.98(s,2H),4.00(t,1H),3.1-3.4(d,2H),1.38(s,36H).
(8)化合物Ib的合成
用盐酸水溶液调节100μL 1M的Na18F水溶液的pH值至2，并加入与K18F相同物质的量的化合物T2，混合搅拌均匀并在85℃下加热0.5h，之后加入1mL生理盐水淬灭反应，最终得到化合物Ib。所得化合物Ib通过放射HPLC验证了其放射化学纯度，其中放射化学纯度超过99％，该反应的收率为30％。化合物Ib的核磁数据：1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.56(d,3H)，7.18(d,2H),7.00(m,3H),6.98(m,2H),4.0-3.4(t,5H),2.0(s,1H)。
测试例实施例1中所得化合物Ia的体外试验
细胞培养：细胞株选自来源于人的神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH、SK-N-BE(2)、KELLY以及来源于大鼠的嗜铬细胞瘤细胞株PC-12；培养基为DMEM，且DMEM培养基中添加了10％的FCS和PEST(青霉素100IU/mL和链霉素100mg/mL)。将四种细胞分别平铺在组织培养皿上，在37℃下，且具有5％CO2平衡湿润空气的温育器中进行孵育培养。为了细胞的分离，将细胞用细胞消化液进行胰蛋白酶化，其中细胞消化液为胰蛋白酶-EDTA溶液，其中胰蛋白酶-EDTA溶液中含有质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA、不含钙和镁的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
1，化合物Ia的细胞摄取实验
(1)神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH对不同的硼化合物的摄取情况
使用Petri培养基分别配制硼酸(BA)溶液、维生素B12共轭的硼(BB)溶液、1,4-二羟基硼基苯丙氨酸(BPA)溶液与化合物Ia溶液，并将上述四种溶液分别加入SK-N-SH细胞培养液中温育6h，其中培养液中细胞密度为75％，且以上四种含硼化合物溶液以相对于硼含量(5×10-4M硼)的等摩尔浓度加入并溶解在Petri培养基中，四种化合物均设置两组平行试验。去除含硼Petri培养基，并加入冷PBS缓冲液并去除细胞中过量的Petri培养基，且用来结束温育。将细胞从培养皿上取下并收集细胞，将收集到的细胞在冷的PBS缓冲液中离心形成沉淀收集细胞样品。
(2)利用Bradford标准程序对上述沉淀所得细胞样品进行总蛋白分析。步骤包括，通过直流原生质原子发射光谱(DCP-AES)对细胞样品进行硼分析：在60℃下用硫酸和硝酸的混合液(体积比为1:1)对细胞样品(50-130mg)硝化处理2h；随后加入TritonX-100和水，使得终溶液中各物质的浓度为：50mg细胞样品/mL、15％总酸v/v和5％Triton X-100v/v。神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH对四种不同的硼化合物的摄取结果见表1。
由表1可以看出，神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH对化合物Ia具有较高的活性摄取率，神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH对化合物Ia的摄取量相当于硼酸(BA)、硼苯丙氨酸(BPA)或与维生素B12共轭的硼(BB)的10-85倍，由此可见，神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH对化合物Ia中硼的摄取量明显高于对硼酸(BA)、硼苯丙氨酸(BPA)或与维生素B12共轭的硼(BB)中硼的摄取量。
对于两个平行试验(平行试验1和平行试验2)中的不同硼化合物来说，硼含量表示为SK-N-SH细胞中总细胞蛋白的函数(μg硼/g细胞蛋白)(在平行试验1和平行试验2中培养基中硼含量分别为7.0μg硼/mL培养基和7.8μg硼/mL)。
表1不同的硼化合物的细胞摄取(μg硼/g细胞蛋白)
2，不同肿瘤细胞对化合物Ia的摄取情况
(1)将来源于人的神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH、SK-N-BE(2)、KELLY以及来源于大鼠的嗜铬细胞瘤细胞株PC-12以低细胞密度(细胞密度为40-50％)以及高细胞密度(细胞密度为90-100％)平铺在Petri培养皿上进行培养(DMEM培养基)，加入(1)中所得浓度为5×10-4M的化合物Ia溶液并温育6h。去除含硼组织培养基，并加入冷PBS缓冲液去除细胞上过量的培养基，且用来结束温育。将细胞从培养皿上取下并收集细胞，将收集到的细胞在冷的PBS缓冲液中离心形成沉淀收集细胞样品，待用。
(2)利用Bradford标准程序对沉淀所得细胞样品进行总蛋白分析，步骤包括，通过直流原生质原子发射光谱(DCP-AES)对细胞样品进行硼分析：在60℃下用硫酸和硝酸的混合液(体积比为1:1)对样品(50-130mg)硝化处理2h；加入Triton X-100和水，使得终溶液中各物质的浓度为：50mg细胞样品/mL、15％总酸v/v和5％TritonX-100v/v。实验结果见表2。
由表2可知，对于以低细胞密度和高细胞密度测试的四种细胞株SK-N-SH、SK-N-BE(2)、KELLY以及PC-12，对化合物Ia均具有较高的摄取量，由此可见，化合物Ia是一种高效的硼载体。其中，硼含量表示为总细胞蛋白的函数(μg硼/g细胞蛋白)。
表2不同细胞对化合物Ia的摄取量(μg硼/g细胞蛋白)
3，化合物Ia的细胞内保留实验
(1)将PC12细胞以75％的细胞密度平铺在petri培养皿上进行培养(培养基为DMEM培养基)，加入1，4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)溶液或化合物Ia溶液并温育18h，温育结束去除培养液中的培养基，加入DMEM培养基继续培养待用，之后将培养所得细胞样品分别在时间点0、2和7h进行取样，其中0时间点代表细胞与含硼化合物共温育18h的细胞，以此类推2h和7h的细胞样品。其中，1，4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)溶液或化合物Ia溶液均以相对于硼含量(5×10-4M硼)的等摩尔的浓度加入细胞培养液中。将细胞从培养皿上取下并收集细胞，将收集到的细胞在冷的PBS缓冲液中离心形成沉淀收集细胞样品，待用。
(2)利用Bradford标准程序对沉淀所得细胞样品进行总蛋白分析，步骤包括，通过直流原生质原子发射光谱(DCP-AES)对细胞样品进行硼分析：在60℃下用硫酸和硝酸的混合液(体积比为1:1)对样品(50-130mg)硝化处理2h；加入Triton X-100和水，使得终溶液中各物质的浓度为：50mg细胞样品/mL、15％总酸v/v和5％Triton X-100v/v。实验结果见表3。
由表3可知，随着时间的推移，对于1，4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)，PC12细胞内的1，4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)含量越来越少直至为0，说明BPA在PC12细胞中存留时间较短；对于化合物Ia，在培养基中的化合物Ia完全耗尽，PC12细胞内的化合物Ia的含量，随着时间的推移，依然具有较高含量，尤其是在7h时，保留在肿瘤细胞中的化合物Ia为总摄取的41％，依然保持着高保留量。
表3不同时间点PC12细胞中的硼含量
硼化合物 0h 2h 7h
BPA 0.074 0 0
化合物Ia 0.82 0.59 0.41
4，化合物Ia的细胞毒性试验
(1)将传代培养的小鼠成纤细胞L-929细胞用培养基制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，将该细胞悬液接种于96孔细胞培养板(100μg/孔)中，并置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。细胞贴壁生长后，去除细胞培养液，分别加入含有化合物Ia的培养基(化合物Ia的浓度为5mmol/L)和等量的不含有化合物Ia的培养基，并分别作为试验组和对比组，置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养；培养2天和7天后取出，加入MTT溶液并继续在培养箱中培养4h；吸除细胞培养液，加入DMSO，震荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为630nm下测定其吸光度值，并根据其吸光度按公式计算细胞的相对增殖度(RGR)，结果见下表4-5。
表4 MTT比色法测得的细胞相对增殖度(RGR)结果
序号 时间(天) 相对增殖度RGR(％)
1 2 110
2 7 100
注：
表5细胞相对增殖度情况表
反应 相对增殖度RGR(％)
0级 ≧100
1 80～99
2 50～79
3 23～49
4 1～22
5 0
由表4-5可知，利用细胞相对增殖度来评定细胞的毒性反应，化合物Ia并没有出现任何的毒性现象。
5，化合物Ia应用于荷瘤小鼠的PET图像及注射后主要脏器及肿瘤的分布情况
将PC-12细胞注射于6周大小雌性裸鼠前肢皮下，构建荷瘤裸鼠模型。
将荷瘤裸鼠的尾静脉注射3.7MBq(100μCi)化合物Ia，注射完成后，在60min时使用七氟烷进行麻醉，随后进行10min/bed的静态PET显像，结果如图1所示，由图1可知，化合物Ia可以在肿瘤部位大量富集，完全满足BNCT所需的硼含量，可作为潜在的硼携带试剂应用于BNCT；图1-图2表明化合物Ia主要由肾脏进行代谢，除心、脾、肾脏、肝、小肠等主要代谢器官外，其余正常组织均无明显摄取，且肿瘤部位摄取明显。
图1及图2结果显示：化合物Ia可以在肿瘤部位蓄积，肿瘤的T/N值满足BNCT的要求(T/N值＞3)。
6，荷瘤小鼠的PET图像与硼吸收量之间的关系
对荷瘤裸鼠体内注射3.7MBq 18F标记的化合物Ia与20mg未标记18F Ia(S2)的混合物，注射完成后，在60min时使用七氟烷进行麻醉，进行10min/bed的静态PET显像，结果如图3所示。图3结果进一步证实：化合物Ia在肿瘤中富集的程度可以满足BNCT所需的硼含量(＞20μg/g)。
7，不同剂量含硼化合物注射荷瘤小鼠后PET显像情况
使用不同剂量的未标记18F化合物Ia(0.1、1、10、20mg)和3.7MBq 18F标记的化合物Ia溶液混合注射入荷瘤裸鼠体内进行PET显像，结果如图4所示，结果显示，PET图像中的肿瘤及心、脾、肾脏、肝、小肠主要器官的放射性浓聚程度较为稳定，没有明显差异，因此本发明化合物Ia能够实现对药物在动物体内的富集进行实时、定量、活体成像监控。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种含硼苄胍类化合物，其特征在于，所述含硼苄胍类化合物结构式：
其中，B为10B；
所述含硼苄胍类化合物中的F至少一个为18F。
2.权利要求1中所述的含硼苄胍类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在有机溶剂中，将化合物氟化盐混合，
室温下反应3-6h得到
(2)将Na18F或者K18F水溶液调节至酸性，加入步骤(1)中所述并混合，进行加热反应，得到所述含硼苄胍类化合物，其中，B为10B。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述与氟化盐的摩尔比为1:3-10。
4.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述氟化盐为氟化钠或氟化钾。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1中所述的含硼苄胍类化合物或药学上可接受的载体。
6.权利要求1中所述的含硼苄胍类化合物或权利要求5所述的组合物在制备治疗肿瘤PET成像试剂中的应用；所述肿瘤为神经内分泌肿瘤。
7.权利要求1所述的含硼苄胍类化合物或权利要求5所述的组合物在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用；所述肿瘤为神经内分泌肿瘤。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述神经内分泌肿瘤为嗜铬细胞瘤。
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