CN114601818B - 一种介孔纳米材料、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药工程和纳米材料技术领域，具体涉及新型介孔纳米材料、制备方法及其应用。本发明新型介孔纳米材料为核壳结构，内核为纳米金属和/或纳米金属氧化物，外壳为SiO2；所述新型介孔纳米材料的粒径为50～80nm。以SiO2为壳体将纳米金属和/或纳米金属氧化物封于其内作为新型介孔纳米材料，不仅极大改善了纳米金属和/或纳米金属氧化物在生理介质中的稳定性，同时表现出更优的抗氧化活性，并增强对细胞的保护作用。

Description

一种介孔纳米材料、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药工程和纳米材料技术领域，具体涉及新型介孔纳米材料、制备方法及其应用。
背景技术
氧化应激和低度慢性炎症是肥胖及其代谢合并症相关的潜在机制，如心血管疾病、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病或某些类型的癌症等。尽管生活方式疗法、药物疗法、减肥手术是治疗肥胖的可行方法，但是疗效有限。因此，建立一种持续、有效、安全的治疗方法来阻止相关代谢疾病的日益猖獗仍是一项挑战。在过去的几十年，通过使用抗氧化物质来干扰氧化应激和炎症过程之间的反馈回路的激活，一直是具有吸引力的治疗方法。许多抗氧化治疗如类黄酮、精氨酸、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、白藜芦醇和硒，对肥胖共病具有广泛的保护作用。此外，富含抗氧化剂的饮食，如单不饱和脂肪酸(MUFAs)、w-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)、维生素C、维生素E，可以降低代谢异常的风险。然而，尽管在临床前取得了成功，但富含抗氧化成分的饮食或纯化的抗氧化物质的临床研究，在预防和治疗心脏代谢疾病方面显示出有争议的结果。这归因于上述抗氧化物质的稳定性差、半衰期短、生物利用度低，使得这些抗氧化物质容易被蛋白水解酶或胃肠道酶降解，从而限制了抗氧化物质在体内的功效。
近年来，纳米材料合成和生物工程的进展提供了不同的纳米级药物，如抗氧化纳米颗粒(NPs)，也被称为纳米酶或活性氧(ROS)的纳米药物。这些纳米药物可以实现功能化靶向给药，在组织中停留的时间更长，具有自我再生活性，在低剂量下，提供长期的保护作用。其中，氧化铈纳米颗粒(CeO2-NPs)通过模仿许多内源性抗氧化酶(如SOD，即过氧化氢酶和过氧化物酶)的活性，参与ROS和炎症之间的多样性交叉反应，调节细胞微环境，被广泛使用。CeO2-NPs通常被描述为ROS缓冲器，也就是说，CeO2-NPs只在ROS过量产生的情况下活跃。CeO2-NPs的治疗效果已显示在不同的疾病，包括神经退行性疾病、心脏病、糖尿病和癌症。但由于纳米颗粒尺寸太小，在生理介质中通常呈现高聚集趋势，临床实践中缺乏可再重复性和可扩展性，无法获得分散良好的NPs，导致丧失纳米特性并且诱导促炎免疫反应，达不到预期的治疗效果。
发明内容
针对现有技术纳米药物存在的稳定性差、易聚集导致纳米特性丧失并诱导促炎免疫反应等缺陷，本发明旨在提供一种新型介孔纳米材料，以提高其生理介质的稳定性、ROS清除活性并降低促炎反应；提供上述介孔纳米材料的制备方法以及相应的应用，是本发明的另一个目的。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种新型介孔纳米材料，所述新型介孔纳米材料为核壳结构，内核为纳米金属和/或纳米金属氧化物，外壳为SiO2；所述新型介孔纳米材料的粒径为50～80nm。
本发明采用以SiO2为壳体将纳米金属和/或纳米金属氧化物封于其内作为新型介孔纳米材料，不仅极大改善了纳米金属和/或纳米金属氧化物在生理介质中的稳定性，同时表现出更优的抗氧化活性以及增强对细胞的保护作用，且主要分布于肝脏，而于非肝生物组织中分布极少。
优选地，所述纳米金属为Au和/或Ag，所述纳米金属氧化物为CeO2、TiO2、Gd2O3、Fe3O4中的至少一种。
优选地，所述纳米金属、纳米金属氧化物的粒径为1～20nm。
纳米材料本身存在小尺寸效应，发明人在研究的过程中发现SiO2包覆后形成的复合纳米材料的最优粒径在50-80nm之间，只有在此区间内的材料才有可能应用在医学领域。所以当核心材料粒径大于20nm时，要控制复合纳米材料的整体尺寸，则其二氧化硅壳就很薄，会导致部分核心纳米颗粒不能完全被包裹，稳定性较差；相反，当纳米颗粒粒径相对较小时，其材料的表面积增大、表面暴露原子增多，介孔二氧化硅包裹后的复合材料能够体现更高的反应活性。
优选地，所述新型介孔纳米材料为CeO2@mSiO2、CeO2+Fe3O4@mSiO2、Au+CeO2+Fe3O4@mSiO2、Au@mSiO2、Ag@mSiO2、Fe3O4@mSiO2、Gd2O3@mSiO2、Fe3O4+Au@mSiO2、CeO2+Au@mSiO2或Ag+CeO2+Fe3O4@mSiO2。
第二方面，本发明提供一种新型介孔纳米材料制备的方法，包括如下步骤：
(1)将纳米金属和/或纳米金属氧化物分散于醇溶液中，调节pH为9～10，搅匀制得纳米材料分散液；
(2)将CTAB溶于醇溶液中，配制成浓度为3mg/ml的CTAB溶液；
(3)在超声条件下，将步骤(2)配制的CTAB溶液逐滴加入步骤(1)所述纳米材料分散液中，制得混合液；
(4)向步骤(3)的混合液中加入TEOS，经搅匀、固液分离后，所得固相即为新型介孔纳米材料。
本发明提供的新型介孔纳米材料的制备方法于含醇水溶液、室温和开放的大气条件下进行，这使得该制备过程易于放大，并产生大量分散良好、小尺寸和单分散的产物CeO2@mSiO2等新型介孔纳米复合材料，制备工艺简单、易于放大、成本低、市场应用前景良好。
本发明制备方法具有较高的通用性，能够应用于水性金属和金属氧化物NPs的任何组合的制备，如等离子金或超顺磁性氧化铁等，产生尺寸可控的多组分纳米复合材料，这为安全生产的热处理设备库的开发开辟了道路。
优选地，步骤(4)中加入的TEOS与混合液中CTAB的比例为2μL:1mg。
优选地，醇溶液由乙醇、甲醇或丙醇分散于水中形成，所述醇溶液中醇类物质的体积分数为20％～30％。
第三方面，本发明提供一种将上述新型介孔纳米材料在治疗或预防肥胖症中的应用。
用于治疗或预防肥胖症的新型介孔材料优选为CeO2@mSiO2。
本发明新型介孔材料尤其是CeO2@mSiO2具有促炎细胞因子TNF-α的循环水平正常化，降低高脂血症，改善肥胖诱导的肝脏和脂肪组织基因表达失调，在治疗或预防肥胖症具有较高的应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用以SiO2为壳体将纳米金属和/或纳米金属氧化物封于其内作为新型介孔纳米材料，不仅极大改善了纳米金属和/或纳米金属氧化物在生理介质中的稳定性，同时表现出更优的抗氧化活性和细胞保护作用的增强，具有促炎细胞因子TNF-α的循环水平正常化，降低高脂血症，改善肥胖诱导的肝脏和脂肪组织基因表达失调，在治疗或预防肥胖症具有较高的应用前景。
附图说明
图1为不同内核的新型介孔纳米材料的TEM图、高角度环形暗场(HAADF)图、元素重叠及元素映射图；
图2为CeO2NPs和CeO2@mSiO2新型介孔纳米材料的表征及其抗氧化活性和细胞保护作用相关图；
图3为CeO2@mSiO2减少肥胖Zucker大鼠的非肝脏Ce的生物分布，降低高脂血症和TNF-α的效果图；
图4为CeO2@mSiO2对血清脂质组的效果图；
图5为CeO2@mSiO2对肥胖的Zucker大鼠与肥胖有关的肝和脂肪组织基因表达失调的调节效果；其中图5a为肝脂肪肝阵列分析与代谢相关性脂肪肝疾病和肝胰岛素抵抗相关的必需基因的表达；图5b为脂肪组织阵列分析与食欲，厌食和能量消耗影响以及巨噬细胞浸润有关的必需基因的表达；
图6为CeO2NPs和CeO2@mSiO2在肝脏、血液、脂肪组织中的分布图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例所涉及各原料如无特别说明，均为市售通用产品。
实施例1新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2及其制备方法
一种新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粒径为1～20nm的CeO2纳米颗粒分散于20％(v/v)的乙醇水溶液中，并利用氨水将溶液的pH调节至10.0，持续搅拌30min，制得纳米材料分散液；
(2)将CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解于20％(v/v)的乙醇水溶液中，搅拌30min，配制成浓度为3mg/mL的CTAB溶液；
(3)在超声条件下，将步骤(2)配制的CTAB溶液逐滴加入步骤(1)所述纳米材料分散液中，至少超声处理30min制得混合液。
(4)向步骤(3)的混合液中加入TEOS(正硅酸乙酯)，加入的TEOS与CTAB的比例为2μl:1mg；经搅拌12h后，于16000rpm的转速下，离心分离所得固相即为新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2。
由上述步骤(1)～(4)制得的新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2，如图1b所示，图1b由左至由的四张图依次为CeO2@mSiO2的TEM图、高角度环形暗场(HAADF)图、Ce-Si重叠图、Ce元素映射图；可以看出该新型介孔纳米材料呈核壳结构，内核为CeO2，外壳为SiO2，其粒径为55nm。
参照上述步骤(1)～(4)制备新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2的方法，将步骤(1)中的CeO2纳米颗粒分别替换为Au纳米颗粒、Ag纳米颗粒、Fe3O4纳米颗粒、Gd2O3纳米颗粒依次制得新型介孔纳米材料Au@mSiO2、Ag@mSiO2、Fe3O4@mSiO2、Gd2O3@mSiO2，如图1a所示。
实施例2新型介孔纳米材料CeO2+Fe3O4@mSiO2及其制备方法
一种新型介孔纳米材料CeO2+Fe3O4@mSiO2的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粒径均为1～20nm的CeO2纳米颗粒和Fe3O4纳米颗粒分散于20％(v/v)的乙醇水溶液中，并利用氨水将溶液的pH调节至10.0，持续搅拌30min，制得纳米材料分散液；
(2)将CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解于20％(v/v)的乙醇水溶液中，搅拌30min，制成浓度为3mg/mL的CTAB溶液；
(3)在超声条件下，将步骤(2)制得的CTAB溶液逐滴加入步骤(1)所述纳米材料分散液中，至少超声处理30min制得混合液。
(4)向步骤(3)的混合液中加入TEOS(正硅酸乙酯)，加入的TEOS与CTAB的比例为2μl:1mg；经搅拌12h后，于16000rpm的转速下，离心分离所得固相即得新型介孔纳米材料CeO2+Fe3O4@mSiO2。
由上述步骤(1)～(4)制得的新型介孔纳米材料CeO2+Fe3O4@mSiO2，如图1c所示，图1c由左至由的四张图依次为CeO2+Fe3O4@mSiO2的TEM图、高角度环形暗场(HAADF)图、Fe-Si重叠图、Ce-Si重叠图、Fe元素映射图、Ce元素映射图；该新型介孔纳米材料呈核壳结构，内核为CeO2+Fe3O4，外壳为SiO2，其粒径为65nm。
参照上述步骤(1)～(4)制备新型介孔纳米材料CeO2+Fe3O4@mSiO2的方法，将步骤(1)中的CeO2+Fe3O4纳米颗粒分别替换为Au+Fe3O4纳米颗粒、CeO2+Au纳米颗粒依次制得新型介孔纳米材料Au+Fe3O4@mSiO2、CeO2+Au@mSiO2。
实施例3新型介孔纳米材料Au+CeO2+Fe3O4@mSiO2及其制备方法
参照实施例1制备CeO2@mSiO2的方法制得本实施例新型介孔纳米材料Au+CeO2+Fe3O4@mSiO2，本实施例与实施例1的区别仅在于制备原料中所用纳米颗粒的种类不同，实施例1中以纳米颗粒CeO2为原料，而本实施例则以纳米颗粒Au、CeO2和Fe3O4为原料。
由本实施例所述方法制得的新型介孔纳米材料，如图1d所示，图1d显示了Au+CeO2+Fe3O4@mSiO2的TEM图、HAADF图、Au-Si重叠图、Fe-Si重叠图、Ce-Si重叠图、Si元素映射图、Au元素映射图、Fe元素映射图、Ce元素映射图；该新型介孔纳米材料呈核壳结构，内核为Au+CeO2+Fe3O4，外壳为SiO2，其粒径为80nm。
参照实施例1中步骤(1)～(4)制备新型介孔纳米材料的方法，将步骤(1)中的CeO2纳米颗粒替换为Ag、CeO2和Fe3O4，所制得的新型介孔纳米材料为Ag+CeO2+Fe3O4@mSiO2。
实施例4新型介孔纳米材料在肥胖症治疗中的应用
本实施例以新型介孔纳米材料CeO2@mSiO2为例，评估其对肥胖症的治疗疗效。
(一)CeO2@mSiO2在生理介质中的稳定性以及抗氧化活性
以游离CeO2NPs作为对照，探究CeO2@mSiO2在生理介质中的稳定性以及抗氧化活性，具体方法如下：
首先，对游离CeO2NPs和CeO2@mSiO2进行结构和粒径分析，游离CeO2NPs和CeO2@mSiO2的TEM图、UV-VIS光谱图分别如图2a和图2b所示，游离CeO2NPs和具有核壳结构的CeO2@mSiO2的UV-VIS检测结果表明，在CeO2@mSiO2中所有的游离CeO2NPs均已包覆成功，没有引起纳米颗粒的聚集或者降解现象，重要的是相比于未包裹的CeO2NPs，CeO2@mSiO2是由mSiO2将CeO2NPs包裹其中形成核壳结构，使其在生理介质中保持了胶体的稳定性(图2b)。用DLS测量两种纳米材料分散在细胞培养基(DMEM+10％FBS)中的流体力学直径的时间演变，可以看出在包裹硅壳的情况下，七天内CeO2@mSiO2粒子平均大小和单分散性都保持不变，而游离CeO2NPs的多分散指数持续增加(图2a)。
随后，将CeO2NPs和CeO2@mSiO2均以1μg/ml的CeO2当量，分别等量添加于人肝细胞系HepG2的培养基中，对人肝细胞摄取CeO2@mSiO2的效果进行TEM图像拍摄，如图2c所示，其中图2c左边的两张图分别为人肝细胞系HepG2中CeO2NPs的明场TEM图像和暗场TEM图像；图2c右边的两张图分别为人肝细胞系HepG2中CeO2@mSiO2的明场TEM图像和暗场TEM图像；由图2c可以看出，CeO2NPs和CeO2@mSiO2均在细胞内体样细胞器内观察到，表明细胞培养处理后的游离CeO2NPs和CeO2@mSiO2均被细胞摄取。
分别对CeO2NPs和CeO2@mSiO2的抗氧化活性进行研究，具体采用将HepG2细胞接种于24孔板，分别暴露在含有CeO2NPs和CeO2@mSiO2的培养基中，以2’,7’-二氯荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)为荧光探针，检测测量ROS的产生。
结果如图2d所示，其中，图2d中左上的图像为CeO2NPs和CeO2@mSiO2对媒介物或过氧化氢处理的HepG2细胞的ROS水平图；图2d中右上的图像为CeO2NPs和CeO2@mSiO2对媒介物或过氧化氢处理的HepG2细胞的存活率图；由图2d中左上图像和右上图像可知，当使用游离CeO2NPs时，ROS水平降低了60％，显著地降低了抗氧化活性。而CeO2@mSiO2复合材料的抗氧化活性提高了两倍，并且使活性氧的基础值完全恢复。与上述结果一致，细胞存活率从86±1.1％(H2O2刺激细胞)增加到91±1.1％(CeO2NPs)和94±2.6％(CeO2@mSiO2)。上述结果表明，mSiO2封装的小尺寸CeO2核心即CeO2@mSiO2复合材料具有较强的抗氧化活性，同时增强对细胞的保护作用。
图2d中左下的图像为CeO2@mSiO2存储一年后在相同试验条件下对媒介物或过氧化氢处理的HepG2细胞的ROS水平图；图2d中右下的图像为CeO2@mSiO2存储一年后在相同试验条件下对媒介物或过氧化氢处理的HepG2细胞的存活率图；由图2d中的左下图像和右下图像可知，即便将CeO2@mSiO2存储一年后，CeO2@mSiO2仍然具有良好的抗氧化活性和细胞增殖活性，表明mSiO2封装的小尺寸CeO2核心在生理介质中的稳定性增强，这转化为其抗氧化活性和细胞保护的增强。
(二)CeO2@mSiO2在降低非靶器官中Ce蓄积分布以及降低高脂血症和TNF-α效果
通过以肥胖Zucker大鼠的实验遗传模型为试验对象，以瘦的Zucker大鼠注射生理盐水、肥胖Zucker大鼠分别进行静脉注射生理盐水、游离CeO2NPs、CeO2@mSiO2，探究CeO2@mSiO2在降低非靶器官中Ce蓄积分布以及降低高脂血症和TNF-α效果(见图6)。
具体试验过程如下：
分别对瘦的Zucker大鼠注射生理盐水，第一组肥胖Zucker大鼠注射生理盐水，第二组肥胖Zucker大鼠注射游离CeO2(即CeO2NPS)，第三组肥胖Zucker大鼠注射CeO2@mSiO2。上述四组大鼠在8周龄和9周龄时，分别吸入或注射异氟醚、溶媒(500μl)、CeO2NPS(0.1mg/kg)、CeO2@mSiO2(0.1mg/kg)，每周两次试验过程示意图如图3a所示，上述四组大鼠均在第14周被过量异氟醚安乐死。
将上述经不同处理后的四组14周的小鼠的肝进行切片，并进行苏木精-伊红染色处理，相应的染色切片如图3b所示，其中，图3b中编号1、2、3、4分别为注射生理盐水的瘦鼠、肥胖大鼠、注射CeO2NPS的肥胖大鼠、注射CeO2@mSiO2的肥胖大鼠代表性肝切片。由图3b可知，CeO2@mSiO2处理后的肥胖大鼠肝切片中未观察到任何代谢紊乱或有机毒性诱导的加剧效应。
通过对注射游离CeO2NPs、CeO2@mSiO2的第14周肥胖Zucker大鼠不同组织中铈(Ce)的蓄积情况进行分析，结果如图3c所示，其中，图3c中的上图为Ce在肥胖的Zucker大鼠接受CeO2NPs或CeO2@mSiO2的组织中的生物分布，由此图可以看出，无论是作为游离制剂还是嵌入mSiO2中，CeO2NPs主要存在于肝脏和脾脏，而在肺部和肾部分布相对较低。并且，相对游离态的CeO2NPs，由于CeO2@mSiO2的体积较大，稳定性较高，相对更有利于肝脏的蓄积。与注射或服用游离CeO2NPs的大鼠相比，特别是服用或注射CeO2@mSiO2的大鼠的肺中的Ce含量显著降低70％(p＝0.004)，脾脏中的Ce含量降低34％(p＝0.18)。
分别对上述四组第14周大鼠的血清甘油三酯、LDL-胆固醇、TNF-α和总脂肪酸水平进行分析，结果如图3d所示，与瘦大鼠相比，肥胖大鼠中TNF-α增加了45％，并且经过CeO2@mSiO2治疗后的肥胖大鼠中的TNF-α水平恢复正常。重要的是，TNF-α是一种主要的类似M1的促炎细胞因子，参与与肥胖相关的代谢改变相关的低度炎症。此外，与CeO2NPs处理后的大鼠相比，CeO2@mSiO2处理显著降低了大鼠血清中的甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇，而甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇是众所周知的心血管疾病的主要危险因素。
分光光度分析显示，经CeO2NPs处理后，血清TG和LDL胆固醇水平分别降低了23％和32％，而经CeO2@mSiO2处理后的血清TG和LDL胆固醇水平进一步降低到38％和42％。这与TNF-α在脂质代谢中的已知作用以及先前的结果所显示的CeO2NPs能够恢复促炎症表型并诱导巨噬细胞极化，从通过糖酵解获得能量的M1到使用氧化代谢的M2。值得注意的是，在给药5周后观察到TNF-α的降低和降脂作用，与传统抗氧化剂相比显示出长期的活性。CeO2@mSiO2降低肥胖Zucker大鼠循环软脂酸水平。
上述结果表明，CeO2@mSiO2对肥胖的Zucker大鼠有良好的耐受性，并减少非靶器官中NPs的存在。另外，也表明了介孔封装方法对于小尺寸的核动力源是一种更安全的静脉注射给药方法；此外，二氧化硅表面的容易功能化可以改善不同核动力源在不同临床应用中的受控生物分布。
(三)CeO2@mSiO2降低TNF-α、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的效果
通过CeO2@mSiO2降低TNF-α、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平，以评价CeO2NPs和CeO2@mSiO2纳米复合物在与肥胖相关的低度炎症中的治疗潜力，我们首先测量了两种纳米材料治疗的肥胖Zucker大鼠血清脂肪因子水平。具体如下。
通过对上述四组大鼠血清中的脂肪酸进行检测分析，结果如图4a所示，可见，经游离态的CeO2NPs或CeO2@mSiO2这两种纳米材料处理后，均显著降低了脂肪酸中的C18:0、C18:1n9t、C20:3n6、C22:6n3和C23:0。此外，CeO2@mSiO2处理还显著降低了脂肪酸中的棕榈酸(C16:0)和其他五种脂肪酸，如C14:1、C16:1、C18:1n9c、C18:2n6t和C18:3n3(图4a)。
为了更好地了解CeO2@mSiO2对循环脂质的影响，我们用固相萃取法分离出主要脂质成分，并用气相色谱-质谱(GC-MS)测定衍生脂肪酸。对上述四组大鼠血清总脂肪酸中的甘油三酯(TG)、胆固醇酯(CE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和非酯化脂肪酸(NEFA)含量进行检测分析，结果如图4b所示，与瘦大鼠相比，肥胖大鼠血清TG、胆固醇酯(CE)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)水平升高(图4b)。
肝脏氧化还原失衡已被确定为代谢特征的一个因果决定因素，如与肥胖和胰岛素抵抗相关的高脂血症。由于CeO2基纳米材料的抗氧化和抗炎特性已在前述进行了分析，因此我们下一步的分析重点是CeO2基纳米材料的降脂效果，具体过程及结果如下。
分别以CeO2NPs、CeO2@mSiO2治疗肥胖Zucker大鼠，通过对血清中甘油三酯衍生的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的水平进行质谱分析，结果分别如图4c和图4d所示，结果发现与分光光度法结果一致，CeO2NPs、CeO2@mSiO2这两种纳米材料的作用与TG衍生FA水平的降低有关，在用CeO2NPS治疗的大鼠中，TG衍生的脂肪酸水平降低了44％，用CeO2@mSiO2治疗的大鼠中，TG衍生的脂肪酸降低了51％。对脂质体的分析结果如图4d所示，表明CeO2NPs、CeO2@mSiO2这两种纳米材料类似地减少了TG衍生的不饱和脂肪酸(减少了53％)，而在用TG诱导的饱和脂肪酸的大鼠中，与给予游离CeO2NPs的大鼠(32％)相比，CeO2@mSiO2对减少TG衍生的饱和脂肪酸的影响更大，降低了49％。这是由于CeO2@mSiO2降低甘油三酯中棕榈酸的含量。相比之下，CeO2NPs、CeO2@mSiO2两种纳米材料在降低甘油三酯中的脂肪酸(棕榈酸除外)方面表现出相似的效果，包括极显著降低(降低程度大于70％)促炎和促脂肪生成的ω-6FAs亚油酸(C18:2n6c)和花生四烯酸(C20:4n6)。其他TG衍生的脂肪酸如C16:1、C18:0、C18:1n9c、C18:1n9t、C18:2n6t和C18:3n3也减少了40％到60％(如图4c、图4d所示)。相反，纳米材料并没有显著降低CE、PC或非酯化脂肪酸(NEFA)的水平。最后，尽管CeO2NPs处理后使总PE显著降低64％，但在CeO2@mSiO2处理后的大鼠中，这种降低仅占23％(图4b)。这与PE中C20:4n6含量降低的显著差异(81％对33％)有关。总的来说，这些数据表明CeO2纳米材料能够显著降低肥胖Zucker大鼠血清中TG衍生的脂肪酸，并且纳米复合材料CeO2@mSiO2能够更为显著地降低棕榈酸，而棕榈酸是最丰富和细胞毒性的促炎性饱和脂肪酸。
(四)CeO2@mSiO2对肥胖Zucker大鼠肝脏和脂肪组织代谢和炎症信号相关基因表达的效果
考虑到CeO2纳米材料的氧化还原活性和在肝脏的主要分布，我们接下来评估TNF-α循环水平的降低和降脂效果是否与肥胖大鼠肝脏基因表达的改善有关。为此，从上述四组Zucker大鼠肝脏中提取的总RNA，并使用一组定制的88个基因阵列进行分析，这些基因涉及脂肪因子信号、炎症反应、细胞凋亡、碳水化合物和脂质代谢、胰岛素信号和氧化磷酸化途径。
利用肝脂肪肝阵列分析技术，分析与代谢相关性脂肪肝疾病和肝胰岛素抵抗相关的必需基因的表达，结果如图5所示，图5为CeO2@mSiO2可减轻肥胖的Zucker大鼠与肥胖有关的肝和脂肪组织基因表达失调。其中图5a为肝脂肪肝阵列分析与代谢相关性脂肪肝疾病和肝胰岛素抵抗相关的必需基因的表达；图5b为脂肪组织阵列分析与食欲，厌食和能量消耗影响以及巨噬细胞浸润有关的必需基因的表达。
上述结果显示肥胖Zucker大鼠中与代谢相关性脂肪肝疾病和肝胰岛素抵抗相关的必需基因的整体上调。具体而言，76％的基因上调，其中有20％的基因显著上调，而只有24％的基因下调，其中3％的基因显著下调。Slc2a4、Cd36、Elovl6、G6pd、Apoa1以及其他与糖和脂质代谢、脂肪因子信号和凋亡有关的基因的表达水平显著增加。CeO2纳米材料的治疗对肥胖引起的肝脏基因表达上调有显著的抑制作用，且CeO2@mSiO2处理的治疗组中抑制效果更为显著。具体来说，CeO2NPs降低了68％的基因表达，其中显著降低了8％的基因表达，而CeO2@mSiO2降低了92％的基因表达，其中显著降低了15％的基因表达。
与TNF-α水平的全身性降低一致，在肥胖治疗大鼠的肝脏中，这种细胞因子也被发现下调。纳米材料的肝脏保护作用的进一步证据来自于Mtor和Akt1的表达的正常化，Akt1是多种炎症和代谢信号的汇聚点，Pik3ca编码磷脂酰肌醇3激酶的催化亚基，是TNF受体2的重要下游靶点。这与胰岛素信号和脂质代谢和转运相关基因表达的整体抑制相一致，并强烈表明肝脏中PI3K/AKT/mTOR通路受到抑制，该通路参与了新生脂肪生成、糖异生和肿瘤发生的激活。
值得注意的是，先前在氧化应激下用CeO2NPs处理的肝细胞中观察到参与PI3K/mTOR途径的蛋白质磷酸化降低，CeO2NPs、CeO2@mSiO2两种纳米材料也下调了STAT-3，STAT-3在肥胖和MAFLD中与氧化和炎症环境有关的一个因子，即使在没有NASH或fibrosis的情况下也是如此。此外，这两种纳米材料对肥胖大鼠的Slc2a4(编码胰岛素调节的葡萄糖转运体)和Abcg1(参与脂质稳态)的表达下调。与游离CeO2NPs相比，CeO2@mSiO2处理组还下调了其他8个额外必须基因，该8个额外必须基因包括在氧化磷酸化(Ndufb6)、脂质转运和代谢(Apoa1、Lpl、Abca1)、胰岛素信号(Insr、Pik3r1)、凋亡(Mapk1)和碳水化合物代谢(Gsk3b)。最后，与游离CeO2NPs处理的大鼠比较，CeO2@mSiO2处理的大鼠还降低了12个与碳水化合物代谢(Gsk3b、Rbp4)、胰岛素信号(Igf1、Igfbp1)和脂质代谢和转运(Acsl5、Acsm3、Cyp2e1、Foxa2、Hmgcr、Nr1h3、Nr1h4)相关的基因的表达，其中，Slc27a5在肥胖大鼠中显著降低。这些结果显示了对抗与肥胖相关的肝调节失调，与其增强的ROS清除特性和显著降低TNF-α和棕榈酸一致。
综上，针对现有纳米材料应用存在的问题与挑战，我们研发了一种利用介孔二氧化硅包裹CeO2等金属和/或金属氧化物的新型复合纳米材料，它可以降低与肥胖相关的低度炎症。并证明了介孔涂层二氧化硅最大限度地提高了生理介质的稳定性和内核CeO2等金属和/或金属氧化物的ROS清除活性，并最小化了它们的非肝脏生物分布。此外，与以往的严重炎症模型不同，我们将这款新型纳米复合材料应用于肥胖的Zucker大鼠的实验遗传模型，这是一个轻度炎症自发形成一系列代谢紊乱的模型，在许多方面模仿了与人类肥胖相关的代谢共存病。以内核CeO2为例，与游离CeO2NPs相比，CeO2@mSiO2在很大程度上正常化了促炎细胞因子TNF-α的循环水平，降低了高脂血症，改善了肥胖引起的肝脏和脂肪组织基因表达失调。总的来说，这项研究显示了以CeO2@mSiO2为例的新型介孔纳米材料在治疗肥胖引起的代谢变化方面具有良好的活性，并能用于轻度炎症的治疗，对于轻度炎症的治疗还是许多其他常见疾病如心血管疾病、癌症、慢性肾病、自身免疫性疾病和神经退行性疾病进展的关键机制，故本发明所述新型介孔材料还有望应用于预防或治疗心血管疾病、癌症、慢性肾病、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种介孔纳米材料在制备治疗肥胖症药物中的应用，其特征在于，所述介孔纳米材料为核壳结构，内核为纳米CeO2，外壳为SiO2；所述介孔纳米材料的粒径为50～80nm；
所述介孔纳米材料由如下方法制得：
(1)将纳米CeO2分散于醇溶液中，调节pH为9～10，搅匀制得纳米材料分散液；
(2)将十六烷基三甲基溴化铵溶于醇溶液中，配制成浓度为3mg/ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液；
(3)在超声条件下，将步骤(2)配制的十六烷基三甲基溴化铵溶液逐滴加入步骤(1)所述纳米材料分散液中，制得混合液；
(4)向步骤(3)的混合液中加入正硅酸乙酯，经搅匀、固液分离后，所得固相即为介孔纳米材料CeO2@mSiO2。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述纳米CeO2的粒径为1～20nm。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述步骤(4)中加入的正硅酸乙酯与混合液中十六烷基三甲基溴化铵的比例为2μL:1mg。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述醇溶液由乙醇、甲醇或丙醇分散于水中形成，所述醇溶液中醇类物质的体积分数为20％～30％。
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