CN114601013B - 一种组成结构特征模拟人乳的酪蛋白胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组成结构特征模拟人乳的酪蛋白胶束及其制备方法,属于乳制品加工技术领域。本发明所述的制备模拟人乳的酪蛋白胶束的方法,包括如下步骤:在复配酪蛋白溶液中加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子,得到混合溶液;之后调整混合溶液的pH为6.7‑7.4,定容,得到所述模拟人乳酪蛋白胶束的溶液;其中,所述复配酪蛋白中β‑、κ‑、αs1‑酪蛋白的质量占比依次为65‑71%、17‑23%、9‑15%;所述模拟人乳酪蛋白胶束溶液中复配酪蛋白的质量浓度为0.3‑0.6%,柠檬酸根离子的浓度为1.5‑4.2mM,钙离子的浓度为4.5‑10.8mM,磷酸根离子的浓度为1.1‑4.5mM。本发明的模拟人乳酪蛋白胶束与人乳酪蛋白胶束相似,且具有低致敏性。
Description
技术领域
本发明涉及一种组成结构特征模拟人乳的酪蛋白胶束及其制备方法,属于乳制品加工技术领域。
背景技术
在不能实现母乳喂养的情况下,婴幼儿配方粉仍然是首选的人乳替代品,其研发目标是在喂养效果上最大限度地达到与人乳一致。人乳是婴儿配方粉研发的黄金标准,婴幼儿配方粉的研发过程就是不断推进模拟人乳的过程。乳中蛋白主要分为酪蛋白和乳清蛋白两大类。目前针对蛋白部分,婴幼儿配方粉的研发策略主要是在酪蛋白和乳清蛋白的比例上模拟人乳。市售婴幼儿配方粉在蛋白的细分组分方面还和人乳有着较大的差距,尤其是其酪蛋白的组成、矿化程度和物理结构与人乳酪蛋白还有较大差异。
牛乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例为8:2,人乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例则为4:6。婴幼儿配方粉中的酪蛋白和乳清蛋白主要源于牛乳,两者的比例通常被调整为4:6,以模拟人乳蛋白组成。婴幼儿配方粉的胃排空速率和消化性往往低于人乳,这与两者在酪蛋白组成和配比上的差异相关。牛乳中含有αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白,四者的比例约为4:1:3.5:1.5,其中αs1-和αs2-酪蛋白致敏性较高。人乳中含有β-、αs1-、κ-酪蛋白,三者的比例约为68:12:20,人乳中不含有αs2-酪蛋白。
乳中酪蛋白主要以胶束结构形式存在。牛乳酪蛋白胶束的平均粒径约为150nm,人乳酪蛋白胶束的平均粒径约为70nm。牛乳酪蛋白胶束的矿化程度高于人乳酪蛋白胶束,牛乳酪蛋白胶束中酪蛋白与钙的摩尔比约为18-19,而人乳酪蛋白胶束中酪蛋白与钙的摩尔比仅为7-9。相比牛乳酪蛋白胶束,人乳酪蛋白胶束的结构也较为松散,牛乳酪蛋白胶束的水合率约为2.3g水/g干胶束,而人乳酪蛋白胶束的水合率高达3.4g水/g干胶束。在25℃下,牛乳中游离酪蛋白的占比约为5%,人乳中游离酪蛋白的占比约为15%。牛乳和人乳酪蛋白胶束组成与结构的不同,导致两者在消化吸收、致敏性、生理功能上也具有较大的差异,这进而会影响婴幼儿的生长发育。
在专利CN1073075A和US5173322中,通过向酪蛋白酸钠溶液中依次加入可溶性钙盐和磷酸盐,再借助超滤进行浓缩并除去多余的盐,制备得到了重组的酪蛋白胶束,可作为咖啡增白剂中脂肪的替代品。在专利US3995070中,通过向酸沉后复溶的酪蛋白溶液中依次加入有机酸盐和钙盐,再通过蒸发浓缩和喷雾干燥,制备得到了重组的酪蛋白胶束,具有较好的溶解性和热稳定性。在上述重组酪蛋白胶束中,酪蛋白组成与牛乳酪蛋白胶束相同。此外,形成天然酪蛋白胶束的体内环境较为复杂,涉及多种离子及其与酪蛋白的相互作用,通过简单的重组工艺难以得到与天然牛乳酪蛋白胶束相似的胶束矿化程度和结构。
在专利CN106259953A中,通过在脱脂乳中添加β-酪蛋白,使制备的婴幼儿配方粉中β-酪蛋白的含量增加。该技术仅仅能使婴幼儿配方粉中β-酪蛋白的相对含量与人乳接近,不能同时使αs1-和κ-酪蛋白的相对含量与人乳接近,且脱脂乳带入的αs2-酪蛋白,其致敏性高。此外,单一β-酪蛋白组分的强化,也不能使婴幼儿配方粉中形成的酪蛋白胶束与天然人乳酪蛋白胶束具有相似的矿化程度和结构。
发明内容
[技术问题]
目前,尚无研究以牛乳、羊乳等动物乳酪蛋白为原料,按照人乳酪蛋白胶束的组成和结构,进行模拟人乳酪蛋白胶束的重组。只有从酪蛋白组成、胶束矿化程度和胶束结构等多方面进行重组,才能得到模拟人乳的酪蛋白胶束,更有利于婴幼儿的消化吸收及其生长发育,且不易致敏。
[技术方案]
为了解决上述问题,本发明选取牛乳或羊乳等动物乳为原料,采用碱性解聚、钙离子沉淀、酸性沉淀、低温解离等选择性分离技术,进行酪蛋白组分的分离纯化;先以人乳的酪蛋白组成为标准,通过酪蛋白组分的混合,实现模拟人乳酪蛋白组成的复配;再以人乳的离子组成为标准,通过关键离子种类、离子加入顺序、离子加入方式和批次、离子浓度等离子调控技术,制备了模拟人乳的酪蛋白胶束,其在酪蛋白组成、矿化程度、胶束结构、消化性方面,与人乳酪蛋白胶束相似,且不易致敏。
本发明的第一个目的是提供一种制备模拟人乳的酪蛋白胶束的方法,包括如下步骤:
在复配酪蛋白溶液中加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子,得到混合溶液;之后调整混合溶液的pH为6.7-7.4,定容,得到所述模拟人乳酪蛋白胶束的溶液;
其中,所述复配酪蛋白中β-、κ-、αs1-酪蛋白的质量占比依次为65-71%、17-23%、9-15%;
所述模拟人乳酪蛋白胶束溶液中复配酪蛋白的质量浓度为0.3-0.6%,柠檬酸根离子的浓度为1.5-4.2mM,钙离子的浓度为4.5-10.8mM,磷酸根离子的浓度为1.1-4.5mM。
在本发明的一种实施方式中,所述复配酪蛋白的制备方法包括如下步骤:
(1)将动物乳于20-30℃、2000-4000g下离心20-40min,得脱脂乳;加入盐酸溶液(4-8M)至pH 4.3-4.9,于5000-15000g下离心10-20min;取酪蛋白沉淀于水中复溶,加入NaOH溶液(1-3M)至pH 10-12,得到酪蛋白复溶液;其中酪蛋白的质量浓度为2-3%;
(2)在酪蛋白复溶液中加入氯化钙至其浓度为50-70mM,于5000-15000g下离心10-20min,得到富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀、以及富集有κ-酪蛋白的上清液;于富集有κ-酪蛋白的上清液中加入盐酸溶液至pH 3-4,离心得富集有κ-酪蛋白的沉淀;取富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀于水中复溶,加入NaOH溶液至pH 6.5-7.5,使得酪蛋白的质量浓度为2-3%;降温至0-8℃,加入盐酸溶液至pH 4.3-4.9,于0-8℃下保持4-8h,离心后取上清液,升温至30-40℃,离心得富集有β-酪蛋白的沉淀;
(3)将富集有κ-酪蛋白的沉淀和富集有β-酪蛋白的沉淀按照6:4-8:2的酪蛋白质量比进行混合,采用截留分子量为5000-10000Da的透析膜,于0-8℃下透析48-96小时,透析外液中加入离子交换树脂Amberlite SR1L Na(0.4-0.6g树脂/g酪蛋白),透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的复配酪蛋白。
在本发明的一种实施方式中,所述动物乳包括牛乳、山羊乳、绵羊乳、水牛乳、牦牛乳、单峰驼乳、双峰驼乳、马乳、驴乳等。
在本发明的一种实施方式中,所述复配酪蛋白溶液是由复配酪蛋白溶于水后所得,酪蛋白的质量浓度为0.6-1.2%。
在本发明的一种实施方式中,所述柠檬酸根离子由柠檬酸钾和柠檬酸钠中的一种或两种的贮备液带入,贮备液中柠檬酸根离子的浓度为150-420mM。
在本发明的一种实施方式中,所述钙离子由氯化钙和硝酸钙中的一种或两种的贮备液带入,贮备液中钙离子的浓度为30-72mM。
在本发明的一种实施方式中,所述磷酸根子由磷酸氢二钾和磷酸氢二钠中的一种或两种的贮备液带入,贮备液中磷酸根离子的浓度为7.3-30mM。
在本发明的一种实施方式中,所述加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子涉及三种离子的2种加入顺序,包括依次加入柠檬酸根离子-钙离子-磷酸根离子,或依次加入磷酸根离子-钙离子-柠檬酸根离子。
在本发明的一种实施方式中,所述加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子涉及三种离子的2种加入方式和3-5个加入批次,包括:
(1)将钙离子、磷酸根离子的贮备液都分为3-5等份(按照体积或者按照质量均可);先全部加入柠檬酸根离子;依次加入1份钙离子、1份磷酸根离子;再重复钙离子和磷酸根离子加入步骤2-4次,直至两种离子加完。
(2)将柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子的贮备液都分为3-5等份;依次加入1份柠檬酸根离子、1份钙离子、1份磷酸根离子;再重复上述三个步骤2-4次,直至三种离子加完。
在本发明的一种实施方式中,所述加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子涉及三种离子加入时的温度控制、搅拌转速以及加入后的平衡时间,依次为35-39℃、500-1000rpm、10-30min。
在本发明的一种实施方式中,所述调整混合溶液的pH是通过添加0.01-0.05M的NaOH溶液或KOH溶液而实现。
在本发明的一种实施方式中,所述定容是采用水定容,是指定容后模拟人乳酪蛋白胶束溶液体积为复配酪蛋白溶液的2-4倍。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的模拟人乳酪蛋白胶束。
本发明的第三个目的是本发明所述的模拟人乳酪蛋白胶束在乳制品加工领域的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述应用包括用于为婴幼儿配方粉的研发和生产提供酪蛋白配料。
在本发明的一种实施方式中,所述的应用是将得到的模拟人乳酪蛋白胶束的溶液通过5-20kDa的有机膜进行超滤,浓缩至20-50倍之后取浓缩液,通过喷雾干燥或冷冻干燥获得酪蛋白配料,用于婴幼儿配方粉的研发和生产。
[有益效果]
(1)本发明所述的模拟人乳酪蛋白胶束,在酪蛋白组成方面,与人乳酪蛋白胶束一致,且无αs2-酪蛋白,具有低致敏性。
(2)本发明所述的模拟人乳酪蛋白胶束,在矿化程度方面,与人乳酪蛋白胶束接近。
(3)本发明所述的模拟人乳酪蛋白胶束,在平均粒径、游离酪蛋白占比、水合率等胶束结构方面,与人乳酪蛋白胶束相似。
(4)本发明所述的模拟人乳酪蛋白胶束,在消化性方面,与人乳酪蛋白胶束相似,在胃液中形成细腻的絮凝颗粒,有利于消化过程中酪蛋白的水解。
附图说明
图1为实施例2、对比例1和2中酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化0、60min后形成絮凝物的结构。
图2为实施例2、对比例1和2中酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化0-60min后形成消化物的SDS-PAGE图。
图3为实施例2、对比例3中酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化0、60min后形成絮凝物的结构。
图4为实施例2、对比例3中酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化0-60min后形成消化物的SDS-PAGE图。
图5为实施例2、对比例4中酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化0、60min后形成絮凝物的结构。
图6为实施例3中离子种类对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。
图7为实施例4中离子加入顺序对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。
图8为实施例5中离子加入方式和批次对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。
图9为实施例6中柠檬酸根离子浓度对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。两条虚线之间的区域代表人乳酪蛋白胶束溶液的吸光度范围。
图10为实施例7中钙离子浓度对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。
图11为实施例8中磷酸根离子浓度对重组酪蛋白胶束溶液吸光度的影响。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解实施例是为了更好地解释本发明,不用于限制本发明。
实施例中涉及的“%”未具体指明的,都是指质量百分比;盐溶液进行等分的时候未具体说明的都是按照体积进行等分。
测试方法:
1、酪蛋白的分离
取酪蛋白胶束溶液,加入盐酸溶液(2M)至pH 4.3(人乳源)或pH 4.6(牛乳源),于10000g下离心15min,所得沉淀即为酪蛋白。
2、胶束相和乳清相的分离
取酪蛋白胶束溶液,于25℃、150000g下离心1h,所得沉淀和上清液分别为胶束相和乳清相。
3、酪蛋白含量的测定
酪蛋白含量的测定采用凯式定氮法,换算系数为6.38。
4、酪蛋白组成的测定
酪蛋白组成的测定采用e2695高效液相色谱仪(Waters Corp.,Milford,MA,USA),采用的色谱柱为XBridge BEH C18(250mm×4.6mm),检测波长为220nm。
5、钙、钾、钠和磷酸根离子含量的测定
参照国标GB5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS),测定钙、钾和钠离子的含量。采用三氯乙酸沉淀蛋白,取上清液,采用ICP-MS测定磷酸根离子的含量。
6、柠檬酸根离子含量的测定
采用三氯乙酸沉淀蛋白,取上清液,采用e2695高效液相色谱仪测定柠檬酸根离子的含量,色谱条件:流动相为98%0.1M KH2PO4(pH 3.0)+2%乙腈(%:体积百分比);流速1.0mL/min;色谱柱为Symmetry C18(250mm×4.6mm);检测波长214nm。
7、吸光度的测定
采用分光光度计测定重组酪蛋白胶束和人乳酪蛋白胶束溶液的吸光度,检测波长为400nm,样品池厚度为10mm。
8、胶束粒径的测定
采用马尔文纳米粒度电位仪(Malvern Instruments Ltd.,Malvern,Worcestershire,UK)测定酪蛋白胶束的粒径分布,蛋白颗粒折光指数设置为1.57。
9、胶束水合率的测定
取胶束相,即超速离心所得沉淀,于103℃干燥7h,由此测得沉淀的干基水分含量即为胶束水合率。
10、婴幼儿体外胃消化
取酪蛋白胶束溶液,与模拟胃消化液(94mM氯化钠、13mM氯化钾、pH 5.3)以63:37的体积比混合,随后用盐酸溶液(1M)缓慢调节pH至5.3,搅拌下加入胃蛋白酶至浓度为268U/mL。消化温度为37℃,时间为0-60min,采用胃蛋白酶抑制剂终止消化反应。
11、蛋白水解效率的分析
采用SDS-PAGE分析蛋白水解效率,取胃消化物,与含5%(体积百分比)β-巯基乙醇的样品缓冲液以1:1的体积比混合,沸水浴3min,上样量为10μL,浓缩胶和分离胶的质量浓度分别为4%和13%。
12、蛋白水解度的测定
称取3.810g四硼酸钠、0.088g二硫苏糖醇、0.100g SDS、0.080g OPA,定容到100mL,得OPA试剂。采用0-10mM的L-亮氨酸溶液作为标准品。取100μL标准品或胃消化物(60min)与2mL OPA试剂混合,避光反应2min,于340nm处测定吸光度,根据标准曲线计算胃消化物的游离氨基含量。
水解度的计算公式如下式(1):
h的计算公式如式(2):
h=(Serine-NH2-β)/α
其中,htot=8.2,α=1.039,β=0.383。
实施例1复配酪蛋白溶液的制备
一种制备复配酪蛋白溶液的方法,包括如下步骤:
取新鲜牛乳于25℃、3000g下离心30min,得脱脂牛乳;
在脱脂牛乳中加入盐酸溶液(6M)至pH 4.6,于10000g下离心15min;取牛乳酪蛋白沉淀于去离子水中复溶,加入NaOH溶液(2M)至pH 11,得到酪蛋白复溶液;其中酪蛋白的质量浓度为2.5%;
在酪蛋白复溶液中加入氯化钙至其浓度为65mM,于10000g下离心15min,得到富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀、以及富集有κ-酪蛋白的上清液;
取富集有κ-酪蛋白的上清液中加入盐酸溶液(6M)至pH 3.8,于10000g下离心15min,得富集有κ-酪蛋白的沉淀;
取富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀于去离子水中复溶,加入NaOH溶液(2M)至pH 7.0,使得酪蛋白的质量浓度为2.5%;降温至4℃,加入盐酸溶液(6M)至pH 4.6,于4℃下保持6h,于10000g下离心15min,取上清液,升温至35℃,于10000g下离心15min,得富集有β-酪蛋白的沉淀。
取富集有κ-酪蛋白的沉淀和富集有β-酪蛋白的沉淀,按照7:3的酪蛋白质量比进行混合,采用截留分子量为7000Da的透析膜,于4℃下透析72小时以除盐,透析外液中加入离子交换树脂Amberlite SR1L Na(0.5g树脂/g酪蛋白),透析结束后进行冷冻干燥,实现模拟人乳酪蛋白组成的复配,即:复配酪蛋白。
上述牛乳酪蛋白沉淀、富集有κ-酪蛋白的沉淀、富集有β-酪蛋白的沉淀、复配酪蛋白的蛋白组成见表1。
表1各样品的酪蛋白组成
实施例2模拟人乳酪蛋白胶束的制备
一种制备模拟人乳酪蛋白胶束的方法,包括如下步骤:
取实施例1中的复配酪蛋白复溶于去离子水中,得到复配酪蛋白的复溶液;其中,酪蛋白的质量浓度为0.8%,复溶液体积为10mL;
配制200μL、230mM的柠檬酸钾溶液,3mL、47.3mM的氯化钙溶液,3mL、18.6mM的磷酸氢二钾溶液;之后将三种盐溶液都分为3等份;
在37℃、800rpm搅拌转速下,向复配酪蛋白的复溶液中依次加入1份柠檬酸钾溶液,搅拌30min;加入1份氯化钙溶液,搅拌30min;加入1份磷酸氢二钾溶液,搅拌30min;再重复上述三个步骤两次,直至三种盐溶液加完;得到混合溶液;
向混合溶液中加入0.01M的氢氧化钠溶液至pH 7.2,采用去离子水将混合溶液定容至20mL,得到所述模拟人乳酪蛋白胶束的溶液;其中,模拟人乳酪蛋白胶束溶液中复配酪蛋白的质量浓度为0.4%,柠檬酸根离子(Cit)的浓度为2.3mM,钙离子(Ca)的浓度为7.1mM,磷酸根离子(P)的浓度为2.8mM。
对比例1人乳酪蛋白胶束
取新鲜人乳(产后3-8个月的成熟乳),于25℃、3000g下离心30min,得脱脂人乳,即为天然人乳酪蛋白胶束的溶液。
对比例2牛乳酪蛋白胶束
取新鲜牛乳,于25℃、3000g下离心30min,得脱脂牛乳,即为天然牛乳酪蛋白胶束的溶液。
将实施例2、对比例1和2中制备的酪蛋白胶束溶液进行理化性质测试,结果如下:
表2实施例2、对比例1和2中酪蛋白胶束溶液的理化性质
从表2可以看出:人乳和牛乳酪蛋白胶束溶液在酪蛋白和离子的组成与含量方面存在较大差异,这使得两者在胶束结构性质方面也存在较大差异。相比牛乳酪蛋白胶束,人乳酪蛋白胶束的平均粒径和矿化程度都较低,游离酪蛋白占比和水合率则较高,这说明其胶束结构较松散。在实施例2所述的制备模拟人乳酪蛋白胶束的方法中,通过酪蛋白复配使得酪蛋白的组成和含量与人乳酪蛋白胶束溶液相同,再通过离子调控使得离子的组成和含量与人乳酪蛋白胶束溶液相同,得到了模拟人乳酪蛋白胶束,其在平均粒径、游离酪蛋白占比、矿化程度和水合率等结构性质方面,与人乳酪蛋白胶束较为接近。
取人乳和牛乳酪蛋白胶束溶液,在50℃下保持30min,随后立即置于150000g下离心1h,取沉淀于去离子水中复溶,得到人乳和牛乳酪蛋白胶束的复溶液,其中,酪蛋白的质量浓度为0.4%,与模拟人乳酪蛋白胶束溶液进行消化性对比研究。与婴幼儿模拟胃液混合后,牛乳酪蛋白胶束溶液形成的絮凝颗粒较大,人乳酪蛋白胶束溶液形成的絮凝颗粒则较小,模拟人乳酪蛋白胶束溶液形成的絮凝颗粒与人乳酪蛋白胶束溶液较为相似(图1)。在消化60min后,牛乳酪蛋白胶束溶液的消化物中仍有一些絮凝颗粒,人乳酪蛋白胶束溶液和模拟人乳酪蛋白胶束溶液的消化物中则无絮凝颗粒。消化物的SDS-PAGE图表明,相比牛乳酪蛋白胶束溶液,人乳酪蛋白胶束溶液中酪蛋白的水解速率更快,模拟人乳酪蛋白胶束溶液中酪蛋白的水解速率与人乳酪蛋白胶束溶液较为接近(图2)。在消化60min后,相比牛乳酪蛋白胶束溶液,人乳酪蛋白胶束溶液中酪蛋白的水解度更高,模拟人乳酪蛋白胶束溶液中酪蛋白的水解度与人乳酪蛋白胶束溶液较为接近。
上述结果表明:模拟人乳酪蛋白胶束溶液和人乳酪蛋白胶束溶液在酪蛋白组成、胶束矿化程度、胶束结构性质方面较为接近,这使得两者在消化性方面也较为接近,且消化性都优于牛乳酪蛋白胶束溶液。
对比例3低、高浓度钙离子诱导复配酪蛋白形成的重组酪蛋白胶束
调整实施例2中氯化钙溶液浓度为34、67mM,使得重组酪蛋白胶束溶液中钙离子浓度为5.1、10.1mM,其它步骤和实施例2保持一致,得到低钙、高钙重组酪蛋白胶束的溶液。
将实施例2、对比例1和3中制备的酪蛋白胶束溶液进行理化性质测试,结果如下:
表3实施例2、对比例1和3中酪蛋白胶束溶液的理化性质
从表3可以看出:相比高钙重组酪蛋白胶束,低钙和中钙重组酪蛋白胶束在平均粒径、游离酪蛋白占比、矿化程度、水合率等结构性质方面,与人乳酪蛋白胶束更为接近。然而低钙重组酪蛋白胶束溶液中游离酪蛋白的占比过高,未参与胶束结构的形成。综合对比表明:中钙重组酪蛋白胶束与人乳酪蛋白胶束在结构性质方面最为接近,因此中钙重组酪蛋白胶束即为模拟人乳酪蛋白胶束。
相比高钙重组酪蛋白胶束溶液,低钙和中钙重组酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中形成的絮凝颗粒更细小(图3),酪蛋白的水解速率更快(图4),酪蛋白的水解度更高,表明低钙和中钙重组酪蛋白胶束溶液的消化性更优,与人乳酪蛋白胶束溶液的消化性更为接近。
对比例4β-酪蛋白与牛乳酪蛋白胶束混合形成的重组酪蛋白胶束
取实施例1中分离的富集有β-酪蛋白的沉淀,采用截留分子量为7000Da的透析膜,于4℃下透析72小时以除盐,透析外液中加入离子交换树脂Amberlite SR1L Na(0.5g树脂/g酪蛋白),透析结束后进行冷冻干燥,得β-酪蛋白纯品。
取β-酪蛋白纯品和脱脂牛乳,按照β-酪蛋白纯品和脱脂牛乳中的酪蛋白的质量比为1:1进行混合,得到所述的重组酪蛋白胶束的溶液。
将实施例2、对比例1和4中制备的酪蛋白胶束溶液进行理化性质测试,结果如下:
表4实施例2、对比例1和4中酪蛋白胶束溶液的理化性质
从表4可以看出:重组酪蛋白胶束溶液与人乳酪蛋白胶束溶液的酪蛋白组成不同,两者中β-酪蛋白的占比相同,而重组酪蛋白胶束溶液中αs1-酪蛋白的占比较高、κ-酪蛋白的占比较低,且含有αs2-酪蛋白。牛乳酪蛋白胶束溶液中αs1-酪蛋白的占比较高,且含有αs2-酪蛋白,这使得β-酪蛋白与牛乳酪蛋白胶束溶液混合后,虽然β-酪蛋白的占比与人乳酪蛋白胶束溶液相同,但其它酪蛋白的占比则不能与人乳酪蛋白胶束溶液相同。综合对比平均粒径、游离酪蛋白占比、矿化程度和水合率等胶束结构性质,表明:相比重组酪蛋白胶束,模拟人乳酪蛋白胶束在结构性质方面,与人乳酪蛋白胶束更为接近。
取重组酪蛋白胶束溶液,在50℃下保持30min,随后立即置于150000g下离心1h,取沉淀于去离子水中复溶,得到重组酪蛋白胶束的复溶液,其中,酪蛋白浓度为0.4%。与模拟人乳酪蛋白胶束溶液进行消化性对比研究。相比重组酪蛋白胶束溶液,模拟人乳酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中形成的絮凝颗粒更细小(图5),消化60min后絮凝颗粒不可见,且酪蛋白的水解度更高,表明模拟人乳酪蛋白胶束溶液的消化性更优,与人乳酪蛋白胶束溶液的消化性更为接近。
对比例5由市售酪蛋白纯品制备的重组酪蛋白胶束
购买市售蛋白纯品κ-酪蛋白、αs-酪蛋白、β-酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司);将各纯品进行酪蛋白组成测试,结果见表5。
表5市售蛋白纯品的酪蛋白组成
取κ-、αs-、β-酪蛋白纯品,按照各原料中酪蛋白的质量比为16.3:1.8:81.9进行混合,得到混合酪蛋白;之后按照实施例2中的方法制备重组酪蛋白胶束。
将实施例2、对比例1和5中制备的酪蛋白胶束溶液进行理化性质测试,结果如下:
表6实施例2、对比例1和5中酪蛋白胶束溶液的理化性质
从表6可以看出:重组酪蛋白胶束溶液与人乳酪蛋白胶束溶液的酪蛋白组成不同,两者中β-、κ-酪蛋白的占比相同,而重组酪蛋白胶束溶液中αs1-酪蛋白的占比较低,且含有αs2-酪蛋白。市售αs-酪蛋白纯品中通常含有一定占比的αs2-酪蛋白,这使得κ-、αs-、β-酪蛋白纯品混合后,虽然β-、κ-酪蛋白的占比与人乳酪蛋白胶束溶液相同,但其它酪蛋白的占比则不能与人乳酪蛋白胶束溶液相同。综合对比平均粒径、游离酪蛋白占比、矿化程度和水合率等胶束结构性质,表明:相比重组酪蛋白胶束,模拟人乳酪蛋白胶束在结构性质方面,与人乳酪蛋白胶束更为接近。相比重组酪蛋白胶束溶液,模拟人乳酪蛋白胶束溶液在婴幼儿模拟胃液中消化后,酪蛋白的水解度更高,表明模拟人乳酪蛋白胶束溶液的消化性更优,与人乳酪蛋白胶束溶液的消化性更为接近。
实施例3模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:离子种类
调整实施例2中离子加入批次为一批,调整实施例2中加入的离子种类为:
第一种:省略柠檬酸根离子、磷酸根离子,加入钙离子(Ca)
第二种:省略柠檬酸根离子,依次加入钙离子、磷酸根离子(Ca+P)
第三种:省略磷酸根离子,依次加入柠檬酸根离子、钙离子(Cit+Ca)
第四种:依次加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子(Cit+Ca+P)
第五种:依次加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子、钾离子(钾离子源于氯化钾)(Cit+Ca+P+K)
其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图6。
相比牛乳酪蛋白胶束,人乳酪蛋白胶束的粒径较小,因而其溶液的浊度相对较低。从图6可以看出:加入Ca或Cit+Ca后体系吸光度值都过低,加入Ca+P后体系吸光度值过高,初步表明简单的离子环境难以诱导形成与人乳酪蛋白胶束相似的胶束结构;加入Cit+Ca+P或Cit+Ca+P+K后体系吸光度值适中,且两者吸光度值无显著差异,初步表明要得到与人乳酪蛋白胶束相似的胶束结构,柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子都为必需;加入Cit+Ca+P+K后体系中钾离子浓度为21.5mM(钾离子源于氯化钾),与人乳酪蛋白胶束溶液相同(表2),表明离子强度对胶束形成影响较小。因此,可优选加入Cit+Ca+P,进行模拟人乳酪蛋白胶束制备的后续优化实验。
实施例4模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:离子加入顺序
调整实施例2中离子加入批次为一批,调整实施例2中的离子加入顺序为:
第一种:依次加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子(Cit+Ca+P)
第二种:依次加入柠檬酸根离子、磷酸根离子、钙离子(Cit+P+Ca)
第三种:依次加入钙离子、柠檬酸根离子、磷酸根离子(Ca+Cit+P)
第四种:依次加入钙离子、磷酸根离子、柠檬酸根离子(Ca+P+Cit)
第五种:依次加入磷酸根离子、柠檬酸根离子、钙离子(P+Cit+Ca)
第六种:依次加入磷酸根离子、钙离子、柠檬酸根离子(P+Ca+Cit)
其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图7。
天然人乳酪蛋白胶束的体内形成过程涉及不同酪蛋白之间、酪蛋白与多种离子之间、不同离子之间的平衡相互作用。从图7可以看出:加入Cit+P+Ca或P+Cit+Ca后体系吸光度值都过低,加入Ca+Cit+P或Ca+P+Cit后体系吸光度值过高,初步表明最后或最先加入钙离子会导致其与酪蛋白的结合程度过低或过高,不利于形成与人乳酪蛋白胶束相似的胶束结构;加入Cit+Ca+P或P+Ca+Cit后体系吸光度值适中,且两者吸光度值无显著差异,初步表明钙离子与酪蛋白的适度结合,有利于形成与人乳酪蛋白胶束相似的胶束结构。因此,可优选依次加入Cit+Ca+P或P+Ca+Cit,进行模拟人乳酪蛋白胶束制备的后续优化实验。
实施例5模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:离子加入方式和批次
调整实施例2中的离子加入方式和批次为:
第一种加入方式:先全部加入柠檬酸根离子;之后批次加入钙离子、磷酸根离子(Ca+P)。
一批:先全部加入柠檬酸根离子,之后全部加入钙离子,最后全部加入磷酸根离子。
二批:将钙离子、磷酸根离子溶液都分为2等份;先全部加入柠檬酸根离子;之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复钙离子和磷酸根离子加入步骤一次,直至两种离子加完。
三批:将钙离子、磷酸根离子溶液都分为3等份;先全部加入柠檬酸根离子;之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复钙离子和磷酸根离子加入步骤二次,直至两种离子加完。
四批:将钙离子、磷酸根离子溶液都分为4等份;先全部加入柠檬酸根离子;之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复钙离子和磷酸根离子加入步骤三次,直至两种离子加完。
第二种加入方式:批次加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子(Cit+Ca+P)。
一批:先全部加入柠檬酸根离子,之后全部加入钙离子,最后全部加入磷酸根离子。
二批:将柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子溶液都分为2等份;先加入1份柠檬酸根离子,之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复上述三个步骤一次,直至三种离子加完。
三批:将柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子溶液都分为3等份;先加入1份柠檬酸根离子,之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复上述三个步骤两次,直至三种离子加完。
四批:将柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子溶液都分为4等份;先加入1份柠檬酸根离子,之后加入1份钙离子,再加入1份磷酸根离子;再重复上述三个步骤三次,直至三种离子加完。
其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束的溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图8:
天然人乳酪蛋白胶束的体内形成过程主要发生在乳腺上皮细胞的高尔基体内,在该过程中,酪蛋白和各种离子连续不断地被转运至高尔基体,通过批次加入离子能更好地模拟人乳酪蛋白胶束的体内形成过程。从图8可以看出:随离子加入批次增加,体系吸光度值呈现为下降趋势,加入批次增加至三以后体系吸光度值趋于稳定,且两种加入方式(Ca+P、Cit+Ca+P)之间相比,体系吸光度值无显著差异。因此,可优选离子加入批次为三、加入方式为Ca+P或Cit+Ca+P,进行模拟人乳酪蛋白胶束制备的后续优化实验。
实施例6模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:柠檬酸根离子浓度
调整实施例2中柠檬酸根离子的浓度为0-7mM,其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束的溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图9。
从图9可以看出:人乳酪蛋白胶束溶液的吸光度值在0.2-0.3之间(该吸光度值经酪蛋白浓度校正);当柠檬酸根离子的浓度在2.1-2.8mM之间时,体系的吸光度值位于人乳酪蛋白胶束溶液吸光度值的范围之内。因此,可优选柠檬酸根离子浓度为2.1-2.8mM,进行模拟人乳酪蛋白胶束的制备。
实施例7模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:钙离子浓度
调整实施例2中钙离子的浓度为0-17.1mM,其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束的溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图10。
从图10可以看出:当钙离子的浓度在6.0-7.2mM之间时,体系的吸光度值位于人乳酪蛋白胶束溶液吸光度值的范围之内。因此,可优选钙离子浓度为6.0-7.2mM,进行模拟人乳酪蛋白胶束的制备。
实施例8模拟人乳酪蛋白胶束制备中关键离子的调控:磷酸根离子浓度
调整实施例2中磷酸根离子的浓度为0-19mM,其它步骤和实施例2保持一致,得到系列重组酪蛋白胶束的溶液。
将得到的系列重组酪蛋白胶束溶液进行吸光度测试,结果见图11。
从图11可以看出:当磷酸根离子的浓度在1.5-3.0mM之间时,体系的吸光度值位于人乳酪蛋白胶束溶液吸光度值的范围之内。因此,可优选磷酸根离子浓度为1.5-3.0mM,进行模拟人乳酪蛋白胶束的制备。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种制备模拟人乳的酪蛋白胶束的方法,其特征在于,包括如下步骤:
在复配酪蛋白溶液中加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子,得到混合溶液;之后调整混合溶液的pH为6.7-7.4,定容,得到所述模拟人乳酪蛋白胶束的溶液;
其中,所述复配酪蛋白中β-、κ-、αs1-酪蛋白的质量占比依次为65-71%、17-23%、9-15%;
所述模拟人乳酪蛋白胶束溶液中复配酪蛋白的质量浓度为0.3-0.6%,柠檬酸根离子的浓度为2.1-2.8mM,钙离子的浓度为6.0-7.2mM,磷酸根离子的浓度为1.5-3.0mM;
所述加入柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子涉及三种离子的2种加入方式和3-5个加入批次,包括:
(1)将钙离子、磷酸根离子的贮备液都分为3-5等份;先全部加入柠檬酸根离子;依次加入1份钙离子、1份磷酸根离子;再重复钙离子和磷酸根离子加入步骤2-4次,直至两种离子加完;
(2)将柠檬酸根离子、钙离子、磷酸根离子的贮备液都分为3-5等份;依次加入1份柠檬酸根离子、1份钙离子、1份磷酸根离子;再重复上述三个步骤2-4次,直至三种离子加完。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述复配酪蛋白的制备方法包括如下步骤:
(1)将动物乳于20-30 ℃、2000-4000 g下离心20-40 min,得脱脂乳;加入盐酸溶液至pH 4.3-4.9,于5000-15000 g下离心10-20 min;取酪蛋白沉淀于水中复溶,加入NaOH溶液至pH 10-12,得到酪蛋白复溶液;其中酪蛋白的质量浓度为2-3%;
(2)在酪蛋白复溶液中加入氯化钙至其浓度为50-70 mM,于5000-15000 g下离心10-20min,得到富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀、以及富集有κ-酪蛋白的上清液;于富集有κ-酪蛋白的上清液中加入盐酸溶液至pH 3-4,离心得富集有κ-酪蛋白的沉淀;取富集有αs-和β-酪蛋白的沉淀于水中复溶,加入NaOH溶液至pH 6.5-7.5,使得酪蛋白浓度为2-3%;降温至0-8℃,加入盐酸溶液至pH 4.3-4.9,于0-8 ℃下保持4-8 h,离心后取上清液,升温至30-40℃,离心得富集有β-酪蛋白的沉淀;
(3)将富集有κ-酪蛋白的沉淀和富集有β-酪蛋白的沉淀按照6:4-8:2的酪蛋白质量比进行混合,采用截留分子量为5000-10000 Da的透析膜,于0-8 ℃下透析48-96小时,透析外液中加入离子交换树脂Amberlite SR1L Na,透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的复配酪蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述柠檬酸根离子由柠檬酸钾和柠檬酸钠中的一种或两种的贮备液带入。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述钙离子由氯化钙和硝酸钙中的一种或两种的贮备液带入。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸根子由磷酸氢二钾和磷酸氢二钠中的一种或两种的贮备液带入。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的模拟人乳酪蛋白胶束。
7.权利要求6所述的模拟人乳酪蛋白胶束在制备乳制品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用包括用于为婴幼儿配方粉的研发和生产提供酪蛋白配料。
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