CN114599978A

CN114599978A - 使用c-met抑制剂治疗癌症患者的方法

Info

Publication number: CN114599978A
Application number: CN202080055590.1A
Authority: CN
Inventors: 杨岚; 施前; S·瑞德卡; 余国良; F·M·贝内代蒂; X·张; B·马
Original assignee: Zhejiang Guanke Meibo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Guanke Meibo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-06-07
Also published as: EP3980783A1; JP2022535880A; CA3142642A1; WO2020244654A1; EP3980783A4; US20220252603A1

Abstract

本申请一般地涉及分子生物学和生长因子调控领域。更具体地，本申请涉及基于增加的c‑Met表达和至少一种c‑Met基因改变(例如，c‑Met突变、c‑Met融合基因和c‑Met基因扩增)的鉴定，使用c‑Met抑制剂治疗癌症患者的方法。

Description

使用C-MET抑制剂治疗癌症患者的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年06月06日提交的PCT/CN2019/090294，2019年06月25日提交的PCT/CN2019/092706和2019年10月08日提交的PCT/CN2019/109906的优先权，其公开的内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及癌症治疗。特别地，本发明涉及使用基于c-MET基因改变(例如，c-Met基因突变、c-Met融合基因、c-Met基因扩增)或c-Met表达水平的c-Met抑制剂治疗癌症患者的方法。

背景技术

肝细胞生长因子受体，也称为c-Met，是一种受体酪氨酸激酶，其调控多种不同细胞信号转导通路，包括参与增殖、运动、迁移和侵袭的通路。由于其在肿瘤发生和癌症进展中重要的细胞过程中的多效作用，已证明c-Met在多种恶性肿瘤中过表达，如小细胞肺癌(SCLC)和NSCLC(Olivero等，Br J Cancer,74:1862-8(1996)和Ichimura等，Jpn J CancerRes,87:1063-9(1996))，并且被认为是抗癌疗法中的重要靶点。

专门针对c-Met的抑制剂代表了一种有吸引力的新型靶向治疗方法。例如，Sattler等(辉瑞；此前是Sugen)首次报道了一种新型c-Met小分子特异性抑制剂SU11274在作为模型的由致癌Tpr-Met转化的细胞以及在SCLC中的有效性(Sattler等，Cancer Res,63,(17),5462-9(2003))。最近，c-Met的小分子抑制剂，如APL-101和Capmatilib，在临床上显示出对肺癌和脑肿瘤的有希望的有效性。然而，临床数据表明，很多癌症患者对c-Met抑制剂没有应答，并且c-Met抑制剂的有效性是有限的。因此，迫切需要开发使用c-Met抑制剂治疗癌症患者的新方法。

发明内容

在一个方面中，本公开内容提供了一种用于预测患有癌症的对象对使用c-Met抑制剂治疗的反应性的方法，所述方法包括检测来自对象的癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增、c-Met表达水平或其组合；以及确定癌症是否可能对使用所述c-Met抑制剂的治疗有反应。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：检测来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平；检测所述癌症样品中的c-Met基因突变、c-met基因融合或c-Met基因扩增；确定所述活性c-Met的表达水平高于c-Met的参考表达水平；和确定所述对象可能对使用所述c-Met抑制剂的治疗有反应。

在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括：检测来自对象的癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增、c-Met表达水平或其组合；确定所述癌症是否可能对使用c-Met抑制剂的治疗有反应；和当所述癌症可能对使用所述c-Met抑制剂的治疗有反应时，向所述对象施用c-Met抑制剂，和当所述癌症不太可能对使用所述c-Met抑制剂的治疗有反应时，向所述受试者施用除c-Met抑制剂以外的抗癌剂。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：检测来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平；检测所述癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合或c-Met基因扩增；确定所述活性c-Met的表达水平高于c-Met的参考表达水平；确定所述对象可能对使用c-Met抑制剂的治疗有反应；和向所述对象施用所述c-Met抑制剂。

在某些实施方式中，所述活性c-Met的表达水平是mRNA水平或蛋白水平。在某些实施方式中，所述活性c-Met是野生型c-Met、突变的c-Met、c-Met融合或其组合。

在某些实施方式中，所述c-Met基因突变导致产生具有选自下组的氨基酸变化的突变的c-Met蛋白：K6N、V13L、G24E、E34A、E34K、A347T、M35V、A48G、H60Y、D94Y、G109R、S135N、D153A、H159R、E167K、E168D、E168K、T17I、P173A、R191W、S197F、T200A、A204PfsTer3、F206S、L211W、G212V、S213L、T222M、L238YfsTer25、S244Y、I259F、T273N、F281L、E293K、K305_R307del、A320V、S323G、G344R、M362T、N375K、N375S、V378I、H396Q、C397S、S406Ter、F430L、F445L、L455I、T457HfsTer21、P472S、E493K、Y501H、L515M、L530V、V546M、R547Q、S572N、R591W、K595T、R602K、L604I、L604V、T618M、T621I、M630T、M636V、I638L、G645R、T646A、T651S、G679V、R731Q、S752Y、F753C、P761S、V765D、K783E、F804C、R811H、E815D、T835PfsTer7、G843R、I852F、I852N、Y853H、D882N、D882Y、E891K、L905_H906delinsY、H906Y、V910F、Q931R、V937I、V941L、Q944Ter、L967F、R976T、L982_D1028del、R988C、Y989C、Y989Ter、A991P、T995N、V1007I、P1009S、T1010I、M1013I、S1015Ter、D1028H、S1033L、R1040Q、Y1044C、Q1085K、G1120V、G1137A、L1158F、S1159L、R1166Q、R1166Ter、R1184Q、R1188Ter、D1198H、V1238I、A1239V、D1240N、Y1248H、A1299V、L1330YfsTer4、I316M、I333L、A1357V、V1368D、A1381T、L1386V和S1403Y及其组合。

在某些实施方式中，所述c-Met基因融合导致产生选自下组的基因融合产物：ACTG1/MET、ANXA2/MET、CAPZA2/MET、DNAL1/MET、FN1/MET、GTF2I/MET、KANK1/MET、MECP2/MET、MET/AGMO、MET/ANXA2、MET/CAPZA2、MET/CAV1、MET/IGF2、MET/INTU、MET/ITGA3、MET/NEDD4L、MET/PIEZO1、MET/PLEC、MET/POLR2A、MET/SLC16A3、MET/SMYD3、MET/ST7、MET/STEAP2-AS1、MET/TES、MET/TTC28-AS1、MGEA5/MET、PPM1G/MET、RPS27A/MET、ST7/MET、TES/MET、ZKSCAN1/MET及其组合。

在某些实施方式中，所述癌症选自下组：肺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液系统癌症、白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。

在某些实施方式中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌或肝细胞癌。

在某些实施方式中，所述癌症样品是组织或血液。

在某些实施方式中，使用新一代测序检测所述c-Met基因突变、所述c-Met基因融合或所述c-Met基因扩增。

在某些实施方式中，使用扩增测定、杂交测定、测序测定或免疫测定检测所述活性c-Met的表达水平。

在某些实施方式中，所述c-Met抑制剂选自下组：克唑替尼、卡博替尼、特泊替尼、AMG337 APL-101(PLB1001，伯瑞替尼)、SU11274、PHA665752、K252a、PF-2341066、AM7、JNJ-38877605、PF-04217903、MK2461、GSK1363089(XL880，福雷替尼(foretinib))、AMG458、替凡替尼(ARQ197)、INCB28060(INC280，卡马替尼)、E7050、BMS-777607、沃利替尼(volitinib)、HQP-8361、美乐替尼、ARGX-111、奥妥珠单抗(onartuzumab)、利妥木单抗、依玛妥珠单抗和XL184。

在某些实施方式中，所述c-Met抑制剂是抗-c-Met抗体。

在某些实施方式中，所述c-Met抑制剂包含下式的化合物

其中：

R¹和R²独立地是氢或卤素；

X和X¹独立地是氢或卤素；

A和G独立地是CH或N，或者CH＝G被硫原子代替；

E是N；

J是CH、S或NH；

M是N或C；

Ar是芳基或杂芳基，其任选地被1-3个独立地选自以下的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_3-7环烷基、卤素、氰基、氨基、-CONR⁴R⁵、-NHCOR⁶、-SO₂NR⁷R⁸、C_1-6烷氧基-、C_1-6烷基-、氨基-C_1-6烷基-、杂环基和杂环基-C_1-6烷基-，或者两个连接的取代基与其所附接的原子一起形成与所述芳基或杂芳基稠合的4-6元内酰胺；

R³是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤代C_1-6烷基、卤素、氨基或-CONH-C_1-6烷基-杂环基；

R⁴和R⁵独立地是氢、C_1-6烷基、C_3-7环烷基、杂环基-C_1-6烷基，或者R⁴和R⁵与其所附接的N一起形成杂环基；

R⁶是C_1-6烷基或C_3-7环烷基；和

R⁷和R⁸独立地是氢或C_1-6烷基。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在此呈现的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开内容。

图1显示了APL-101在LU0858 PDX模型上的效果。

图2显示了APL-101在LU1902 PDX模型上的效果。

图3显示了APL-101在LU2503 PDX模型上的效果。

图4显示了APL-101在MKN45 CDX模型上的效果。

图5显示了通过Western印迹测量的在不同肿瘤细胞系中c-Met和融合衍生物的蛋白表达。包括A549作为阴性对照，因为已知该细胞系中的c-Met表达非常低。

具体实施方式

在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本公开内容的实施或测试中也可以使用与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利都被明确地和单独地指示为通过引用并入本文，并且通过引用并入本文以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本公开内容无权因在先公内容开而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

本领域技术人员在阅读本公开内容后将意识到，本文描述和说明的各个实施方式中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本公开内容的范围或精神的情况下，其可以容易地与其它几个实施方式中的任一个的特征分离或组合。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

定义

提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其它科学或医学术语(term)或术语(terminology)旨在具有生物学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有普遍理解含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为与本领域通常理解的术语定义存在实质性差异。

如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用。

如本文所用，术语“施用”指向对象提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。

如本文所用，“抗体”包括天然存在的免疫球蛋白以及非天然存在的免疫球蛋白，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体(例如，人源化鼠源抗体)和异源缀合抗体(例如，双特异性抗体)。抗体片段包括结合抗原的那些(例如，Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv和rIgG)。亦参见，例如，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York(1998)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双功能抗体(diabodies)、三功能抗体(triabodies)和四功能抗体(tetrabodies)。术语“抗体”进一步包括多克隆和单克隆抗体。

如本文所用，术语“癌症”是指任何涉及异常细胞生长的疾病，包括影响身体任何组织、器官或细胞的所有阶段和所有形式的疾病。该术语包括所有已知的癌症和肿瘤病况，无论其特征是恶性、良性、软组织或实体，以及所有阶段和分级的癌症，包括转移前和转以后的癌症。在通常情况下，可以根据癌症所在或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态对癌症进行分类。如本文所用，癌症类型包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、粒细胞性白血病、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文家族肿瘤、尤文氏肉瘤、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、心脏病、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤。

术语“癌症样品”包括含有一种或多种癌细胞的生物样品或来自生物来源的样品。生物样品包括来自体液(例如，血液、血浆、血清或尿液)的样品，或例如通过组织活检来自细胞、组织或器官，优选疑似包含或基本上由癌细胞组成的肿瘤组织的样品。

术语“c-Met”是指编码称为肝细胞生长因子受体(HGFR)的蛋白的原癌基因。c-Met蛋白由c-Met的前体(pro c-Met)裂解产生的α链和β链组成，通过二硫键形成二聚体。c-Met是一种穿透细胞膜的受体，整个α链和部分β链存在于细胞外(参见，例如，Mark等，TheJournal of Biological Chemistry(1992)267:26166-71；Ayumi I,Journal of Clinicaland Experimental Medicine(2008)224:51-55)。亦参见针对人c-Met及其α链和β链的GenBank登录号：NP_000236.2。已经表明，癌症中异常的c-Met激活与不良预后相关，其中异常活跃的c-Met引发肿瘤生长、为肿瘤提供营养的新血管的形成以及癌症向其他器官扩散。

术语“活性-c-Met”是指具有c-Met催化结构域的蛋白或编码其的核苷酸。活性c-Met可以是野生型c-Met蛋白。在某些实施方式中，活性c-Met可以是突变的c-Met蛋白，但保留了如同野生型c-Met蛋白的催化活性。在某些实施方式中，活性c-Met可以是c-Met融合蛋白，例如，与第二蛋白融合的c-Met或其片段，所述第二蛋白保留了如同野生型c-Met蛋白的催化结构域。在某些实施方式中，与野生型c-Met蛋白相比，活性c-Met蛋白可能具有增加的催化活性。

如本文所用，术语“c-Met改变”或“c-Met基因改变”是指在生物体或染色体外DNA的基因组中c-Met基因的核苷酸序列的改变。c-Met基因改变包括一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入。例如，c-Met基因改变可以是c-Met基因突变，其中一个或多个核苷酸从c-Met基因中缺失、替换为其他核苷酸或插入到c-Met基因中。c-Met基因改变还可以是融合，其中c-Met基因的片段与至少另一个基因的片段或另一个核苷酸序列融合，或上述的任何组合。c-Met基因改变还包括c-Met基因扩增，其中c-Met基因的拷贝数增加。

如本文所用，“c-Met抑制剂”是指能够抑制c-Met蛋白表达或活性的药剂。c-Met抑制剂的实例包括但不限于克唑替尼、卡博替尼、特泊替尼、AMG337 APL-101(PLB1001，伯瑞替尼)、SU11274、PHA665752、K252a、PF-2341066、AM7、JNJ-38877605、PF-04217903、MK2461、GSK1363089(XL880，福雷替尼(foretinib))、AMG458、替凡替尼(ARQ197)、INCB28060(INC280，卡马替尼)、E7050、BMS-777607、沃利替尼(volitinib)、HQP-8361、美乐替尼、ARGX-111、奥妥珠单抗(onartuzumab)、利妥木单抗、依玛妥珠单抗XL184和在US20150218171中公开的化合物。

术语“互补性”指核酸与另一核酸序列通过传统的Watson-Crick或其它非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比表示可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％>、70％>、80％>、90％和100％互补性)。

需要注意的是，在本公开内容中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性或开放式的，不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。

术语“确定”、“评估”、“测量”和“检测”可以互换使用，并且是指定量和半定量确定。在旨在进行定量和半定量测定时，可以使用短语“确定水平”目标多核苷酸或多肽或者“检测”目标多核苷酸或多肽。

术语“杂交”是指核酸分子在严格条件下优选与特定核苷酸序列结合、形成双螺旋或杂交。术语“严格条件”指杂交和洗涤条件，在该条件下，探针将优选与其靶子序列杂交，并在较小程度上或者根本不与混合群中的其他序列(例如，来自组织活检的细胞裂解物或DNA制备物)杂交。在核酸杂交背景下的严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。核酸杂交的广泛指南参见例如Tijssen Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bio logy—Hybridization with Nucleic Acid Probespart I,Ch.2,“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays,”(1993)Elsevier,N.Y。通常，高严格杂交和洗涤条件选择为比特定序列在规定的离子强度和pH值下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH值下)。选择非常严格的条件以等于特定探针的Tm。用于在Southern或Northern印迹中在阵列或过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的实例是42℃，使用标准杂交溶液(参见，例如，Sambrook和Russell Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.)Vol.1-3(2001)ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY)。高严格洗涤条件的实例是在72℃下于0.15M NaCl中约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下0.2×SSC洗涤15分钟。通常，在高严格洗涤之前进行低严格洗涤以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双螺旋的中等严格洗涤的实例是在45℃下l×SSC 15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双螺旋的低严格洗涤的实例是在40℃下4×SSC至6×SSC 15分钟。

术语“基因产物”或“基因表达产物”是指由基因编码的RNA或蛋白。

术语“c-Met表达水平”和“c-Met的表达水平”是指样品中存在的c-Met表达的量或数量。这样的量或数量可以以绝对方式表示，即样品中c-Met表达的总量，或者以相对方式表示，即样品中c-Met的浓度或百分比。可以在RNA水平(例如，以mRNA的量或数量)或在蛋白水平(例如，以蛋白或蛋白复合物的量或数量)测量c-Met表达的水平。在某些实施方式中，c-Met表达水平可以在c-Met蛋白水平的一个子集上测量，例如，磷酸化c-Met蛋白的水平。

术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线形或环状的。

在患者对癌症疗法的应答的上下文中使用的术语“反应的”或“反应性”可互换使用，是指患者对治疗的有益反应，而不是不利反应，即，不良事件。在患者中，有益反应可以用很多临床参数表示，包括可检测到的肿瘤消失(完全缓解)、肿瘤尺寸缩小和/或癌细胞数量减少(部分缓解)、肿瘤生长停滞(疾病稳定)、抗肿瘤免疫应答增强、可能导致肿瘤消退或排斥；与肿瘤相关的一种或多种症状在一定程度上缓解；治疗后存活时间增加；和/或在治疗后的给定时间点死亡率降低。肿瘤尺寸和/或癌细胞数量和/或肿瘤转移的持续增加表明对治疗缺乏有益反应，因此反应性降低。

如本文所用，术语“对象”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在很多实施方式中，对象是人类。对象可以是患者，其是指呈现于医疗提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“对象”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。对象可能患有或易患疾病或病症，但可能会或可能不会表现出疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“样品”是指从对象获得并含有一种或多种目标c-Met基因改变的生物样品。样品的实例包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、尿液、阴道液、子宫或阴道冲洗液、胸膜液、腹水、脑脊液、唾液、汗液、泪液、痰液、支气管肺泡灌洗液等，以及组织，如活检组织(例如，活检的骨组织、骨髓、乳腺组织、胃肠道组织、肺组织、肝组织、前列腺组织、脑组织、神经组织、脑膜组织、肾组织、子宫内膜组织、宫颈弥漫性淋巴结组织、肌肉组织或皮肤组织)，石蜡包埋的组织。在某些实施方式中，样品可以是包含癌细胞的生物样品。在一些实施方式中，样品是从肿瘤获得的新鲜或存档样品，例如通过肿瘤活检或细针抽吸。样品还可以是任何含有癌细胞的生物流体。根据医院或诊所通常遵循的标准方案从对象收集样品，如在组织活检期间。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”指减少癌症(例如，乳腺癌、肺癌、卵巢癌等)或癌症症状的影响的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指癌症的严重程度或癌症的症状降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，如果与对照相比，对象的一种或多种疾病症状减少10％，则认为治疗疾病的方法是一种治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或者10％和100％之间的任何减少百分比。应理解，治疗不一定指疾病、病况或者疾病或病况的症状的治愈或完全消融。

c-Met基因改变

本文所述的方法和组合物部分基于c-Met基因改变的发现，其在癌症样品中的存在表明癌症患者对c-Met抑制剂的反应性。在某些实施方式中，c-Met基因改变包括但不限于c-Met基因突变、c-Met基因融合和c-Met基因扩增。

原癌基因c-MET编码受体酪氨酸激酶(RTK)c-Met。上皮-内皮来源的细胞广泛表达c-MET，其对胚胎发育和组织修复至关重要。肝细胞生长因子(HGF)是唯一已知的c-Met受体配体，主要在间充质来源的细胞中表达。在正常条件下，c-Met在配体结合后二聚化和自磷酸化，这反过来为介导下游信号传导的蛋白建立活性对接位点，导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT、v-src肉瘤病毒癌基因同源物(SRC)、信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路的激活。这种激活会引起多种多效性生物反应，导致细胞生长、散射和运动性增加、侵袭、防止细胞凋亡、分支形态发生和血管生成。然而，在病理条件下，c-Met的不当激活可能赋予癌细胞增殖、存活和侵袭/转移的能力。

c-Met的失调和随之而来的异常信号转导可能通过不同的机制发生，包括基因扩增和激活突变。据报道，c-Met在多种癌症中过度表达，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌和胃癌。这种过表达可能是转录激活、缺氧诱导的过表达的结果，或c-Met基因扩增的结果。尽管基因扩增是c-Met的常见基因改变，并且据报道与NSCLC、结直肠癌和胃癌的不良预后有关，但在非遗传性癌症患者中很少发现c-Met基因的致癌突变。潜在的致癌突变主要涉及产生替代剪接的点突变，该剪接编码缺少外显子14的较短蛋白，外显子14编码c-Met的近膜结构域；激酶结构域中的点突变，其使酶具有组成型活性；和Y1003突变，其使Cb1结合位点失活，导致组成型c-Met表达。而相比之下，已将其他几个突变(即，N375S、R988C和T1010I)报告为SNP，因为已发现它们缺乏转化能力。在本公开内容中，发明人惊奇地发现，当癌症患者使用c-Met抑制剂治疗时，一些c-Met基因改变表明反应性。

在某些实施方式中，本公开内容的c-Met基因改变导致c-Met基因的外显子14在转录过程中跳跃。

在某些实施方式中，本文公开的c-Met基因改变是c-Met基因突变，其导致突变的c-Met蛋白具有表1所示的氨基酸改变。

本公开内容的发明人还惊奇地发现导致c-Met基因融合的c-Met基因的一些改变表明正用c-Met抑制剂治疗的癌症患者的反应性。

如本文所用，“基因融合”指嵌合基因组DNA、嵌合信使RNA、截短的蛋白或由第一基因的至少一部分与第二基因的至少一部分融合产生的嵌合蛋白。基因融合不需要包括整个基因或基因的外显子。

在某些实施方式中，c-Met基因融合产生的基因融合产物如表2中所示。

本文所用的基因融合产物“ACTG1/MET”指上游基因ACTG1与下游基因MET融合。具有类似表达的其它基因融合产物也可以同样解释。

“c-Met基因扩增”是指细胞中g-Met基因的拷贝数增加。在某些实施方式中，c-Met基因扩增导致c-Met基因过表达。

组合C-Met生物标志物

在一个方面中，本公开内容涉及多种c-Met相关生物标志物在癌症治疗中的用途。在某些实施方式中，存在多个c-Met相关生物标志物表明患有癌症的对象对c-Met抑制剂的反应性增强。在某些实施方式中，c-Met相关生物标志物包括c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增和c-Met基因水平。

在某些实施方式中，存在活性c-Met的表达增加和至少一个c-Met基因改变(如c-Met基因突变、c-Met基因融合和c-Met基因扩增)两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测在来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平增加和选自c-Met基因突变、c-Met基因融合和c-Met基因扩增的c-Met基因改变两者；和向所述对象施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，在癌症中活性c-Met表达水平增加和c-Met基因改变的组合表明所述癌症c-Met活性失调以及具有基因组不稳定性。在某些实施方式中，在癌症中活性c-Met表达水平增加和c-Met基因改变的组合表明，c-Met活性失调是癌症的驱动因素，这使得癌症对c-Met抑制剂敏感。

在某些实施方式中，存在c-Met基因突变和c-Met基因扩增两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因突变和c-Met基因扩增两者；和向所述对象施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，c-Met基因突变导致外显子14跳跃。

在某些实施方式中，存在c-Met基因突变和c-Met表达水平增加两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因突变和c-Met表达水平增加两者；和向所述对象施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，c-Met基因突变导致外显子14跳跃。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加导致c-Met蛋白水平增加。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加是c-Met蛋白的磷酸化增加。

在某些实施方式中，存在c-Met基因扩增和c-Met表达水平增加两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因扩增和c-Met表达水平增加两者；和向所述对象施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加导致c-Met蛋白水平增加。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加是c-Met蛋白的磷酸化增加。

在某些实施方式中，存在至少两个c-Met基因突变表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中至少两个本文所述的c-Met基因突变；并向所述受试者施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，至少两个c-Met基因突变中的一个导致外显子14跳跃。

在某些实施方式中，存在c-Met基因突变和c-Met基因融合两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因突变和c-Met基因融合两者；并且向所述受试者施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，c-Met基因突变导致外显子14跳跃。

在某些实施方式中，存在c-Met基因融合和c-Met基因扩增两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因融合和c-Met基因扩增两者；并且向所述受试者施用c-Met抑制剂。

在某些实施方式中，存在c-Met基因融合和c-Met表达水平增加两者表明对c-Met抑制剂的应答增加。在这种情况下，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法，包括：检测来自对象的癌症样品中c-Met基因融合和c-Met表达水平增加两者；并且向所述受试者施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加导致c-Met蛋白水平增加。在某些实施方式中，c-Met表达水平增加是c-Met蛋白磷酸化增加。

在某些实施方式中，在患有癌症的对象中存在多个c-Met相关生物标志物表明所述对象具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的机会对c-Met抑制剂的治疗产生应答。

c-Met基因改变或c-Met基因表达的检测试剂

在一个方面中，本公开内容提供了用于检测本文公开的c-Met基因改变或c-Met基因表达的检测试剂。

在某些实施方式中，检测试剂包括可与c-Met基因或c-Met mRNA的多核苷酸杂交的引物或探针。

如本文所用，术语“引物”是指由于靶多核苷酸序列的序列内引物的至少一部分的序列互补性而能够与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。引物可以具有至少8个核苷酸的长度，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，引物可与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互补性。可用作引物的寡核苷酸可以根据固相亚磷酰胺三酯法使用自动合成仪化学合成，所述固相亚磷酰胺三酯法在Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.(1981)22:1859-1862首先描述，所述自动合成仪如在Needham-Van Devanter等，Nucleic Acids Res.(1984)12:6159-6168中所描述。

引物可用于核酸扩增反应，其中将引物延伸以产生多核苷酸的新链。有经验的技术人员可以使用本领域公知的常识容易地设计引物，使得其可以与本文提供的c-Met基因突变或基因融合的靶核苷酸序列的核苷酸序列特异性退火。通常，引物的3’核苷酸被设计为与相应核苷酸位置的靶序列互补，以通过聚合酶提供最佳引物延伸。

如本文所用，术语“探针”是指由于靶多核苷酸序列的序列内探针的至少一部分的序列互补性，可以与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸或其类似物。示例性探针可以是例如DNA探针、RNA探针或蛋白核酸(PNA)探针。探针可以具有至少8个核苷酸的长度，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，探针可与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互补性。探针也可根据上述固相亚磷酰胺三酯方法化学合成。DNA和RNA探针的制备方法及其与靶核苷酸序列杂交的条件在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等编著，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，第10章和第11章中有所描述。

在某些实施方式中，本文提供的引物和探针被可检测地标记。适于标记引物和探针的可检测标记的实例包括，例如，生色团、放射性同位素、荧光团、化学发光部分、颗粒(可见的或荧光的)、核酸、配体或催化剂，如酶。

在某些实施方式中，检测试剂包括与c-Met蛋白特异性结合的抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其抗原结合片段，其能够与靶蛋白抗原特异性结合。抗体可以通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体库中选择抗体来鉴定和制备，也可以通过对家兔或小鼠等动物进行免疫来制备多克隆和单克隆抗体(参见，例如，Huse等，Science(1989)246:1275-1281；Ward等，Nature(1989)341:544-546)。

在某些实施方式中，可以理解的是，抗体被修饰或标记以适当地用于各种检测测定。在某些实施方式中，抗体被可检测地标记。

样品制备

可以从对象获得适合进行本文提供的方法的任何生物样品。在某些实施方式中，样品可以通过用于检测c-Met基因改变的所需方法进一步处理。

在某些实施方式中，所述方法还包括从生物流体样品(如外周血样品)或从对象获得的组织样品中分离或提取癌细胞(如循环肿瘤细胞)。癌细胞可以通过免疫磁性分离技术分离，如可从Immunicon(Huntingdon Valley,Pa.)获得的技术。

在某些实施方式中，可以处理组织样品以进行原位杂交。例如，组织样品可以在固定在玻璃显微镜载玻片之前进行石蜡包埋，然后用溶剂(通常是二甲苯)脱蜡。

在某些实施方式中，所述方法还包括从样品中分离核酸，例如，DNA或RNA。各种提取方法都适用于从细胞或组织中分离DNA或RNA，如酚氯仿提取，以及在例如，Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology(1997)John Wiley&Sons，和Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.(2001)中描述的各种其他方法。

还可以使用市售试剂盒分离DNA和/或RNA，包括，例如，the NucliSens提取试剂盒(Biomerieux,Marcy l'Etoile,France)、QIAamp^TM微型血液试剂盒、Agencourt Genfind^TM、

微型柱(Qiagen)、

RNA微型试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和Eppendorf Phase Lock Gels^TM。有经验的技术人员可以容易地按照生产厂商的方案提取或分离RNA或DNA。

检测c-Met基因改变或c-Met表达水平的方法

本公开内容的方法包括从患有或疑似患有癌症的对象获得的样品中检测本文所述的c-Met基因改变或c-Met表达水平。可以使用本领域公知的恰当方法在DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA)水平检测c-Met基因改变，如c-Met基因突变、c-Met基因融合或c-Met基因扩增，所述方法包括但不限于扩增测定、杂交测定和测序测定。可以使用本领域公知的恰当方法在RNA(例如，mRNA)水平或蛋白水平检测c-Met表达水平，所述方法包括但不限于扩增测定、杂交测定、测序测定和免疫测定。

扩增测定

核酸扩增测定涉及复制靶核酸(例如，DNA或RNA)，从而增加扩增的核酸序列的拷贝数。扩增可以是指数的或线性的。示例性核酸扩增方法包括但不限于使用聚合酶链反应扩增("PCR"，参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR Protocols:A Guide ToMethods And Applications(Innis等编著，1990))、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)；定量PCR，如

巢式PCR、连接酶链反应(见Abravaya,K.,等，Nucleic Acids Research,23:675-682,(1995))、分支DNA信号扩增(参见，Urdea,M.S.等，AIDS,7(suppl 2):S11-S14,(1993))、可扩增RNA报告基因、Q-β复制(参见，Lizardi等，Biotechnology(1988)6:1197)、基于转录的扩增(参见，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:1173-1177)、自返式DNA扩增、链置换激活、循环探针技术、自持序列复制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:1874-1878)、滚环复制(美国专利号5,854,033)、基于等温核酸序列的扩增(NASBA)和基因表达系列分析(SAGE)。

在某些实施方式中，核酸扩增测定是基于PCR的方法。PCR由一对与待扩增的靶核酸序列杂交的引物启动，然后通过聚合酶延伸引物，所述聚合酶使用靶核酸序列作为模板和dNTP作为构建块合成新链。然后，将新链和目标链变性，以允许引物结合以进行下一个延伸和合成循环。在多个扩增循环之后，目标核酸序列的总拷贝数可以呈指数增长。

在某些实施方式中，可以使用嵌入双链DNA时产生信号的嵌入剂。示例性试剂包括SYBR GREEN^TM和SYBR GOLD^TM。由于这些试剂不是模板特异性的，因而假定信号是基于模板特异性扩增产生的。这可以通过监测作为温度函数的信号来确认，因为模板序列的熔点通常远高于，例如，引物二聚体等。

在某些实施方式中，可以使用带有可检测标记的引物或带有可检测标记的探针，以允许检测对应于该引物或探针的c-Met基因改变。在某些实施方式中，可以使用具有不同可检测标记的多个标记引物或标记探针，以使得同时检测多个c-Met基因改变。

杂交测定

核酸杂交测定使用探针与靶核酸杂交，从而允许检测靶核酸。杂交测定的非限制性实例包括Northern印记、Southern印记、原位杂交、微阵列分析和基于多重杂交的测定。

在某些实施方式中，用于杂交测定的探针被可检测地标记。在某些实施方式中，用于杂交测定的基于核酸的探针是未标记的。这种未标记的探针可以固定在诸如微阵列的固体支持物上，并且可以与被可检测地标记的靶核酸分子杂交。

在某些实施方式中，杂交测定可以通过分离核酸(例如，RNA或DNA)、分离核酸(例如，通过凝胶电泳)，然后将分离的核酸转移到适宜的滤膜(例如，硝酸纤维素滤膜)上来进行，其中探针与靶核酸杂交并允许检测。参见，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook等编著，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，第7章。探针和靶核酸的杂交可以通过本领域公知的方法检测或测量。例如，杂交放射性自显影检测可以通过将杂交滤膜暴露于照相胶片来进行。

在一些实施方式中，杂交测定可以在微阵列上进行。微阵列提供了一种同时测量大量靶核酸分子水平的方法。靶核酸可以是RNA、DNA、从mRNA逆转录的cDNA或染色体DNA。可以允许靶核酸与包含基材的微阵列杂交，所述基材具有以高达每平方厘米基材表面数百万个探针的密度排列的多个固化核苷酸探针。样品中的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描进行检测。确定阵列上每个探针的杂交强度并将其转换为代表RNA或DNA相对水平的定量值。参见，美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316。

使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述在例如美国专利号5,384,261中。尽管经常采用平面阵列表面，但阵列可以制造在几乎任何形状的表面上，甚至可以在多个表面上制造。阵列可以是在小珠、凝胶、聚合物表面、纤维，如光纤、玻璃或任何其他适宜基材上的肽或核酸，参见，美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。阵列可以以允许对全包式设备进行诊断或其他操作的方式进行封装。有用的微阵列也可商购获得，例如，来自Affymetrix的微阵列、来自Nano String Technologies的微阵列、来自Panomics的QuantiGene 2.0多重测定。

在某些实施方式中，杂交测定可以是原位杂交测定。原位杂交测定可用于检测存在c-Met基因扩增。可用于原位杂交测定的探针可以是突变或基因融合特异性探针，其与特定c-Met基因突变或基因融合杂交以检测目标特定突变或基因融合的存在与否。用于原位杂交的独特序列探针的使用方法描述在美国专利号5,447,841中，其通过引用并入本文。可以使用荧光显微镜和针对每个荧光团的适当滤光片查看探针，或者通过使用双或三带通滤波器组来观察多个荧光团。参见，例如，Bittner等的美国专利号5,776,688，其通过引用并入本文。任何适宜的显微成像方法都可用于使杂交探针可视化，包括自动数字成像系统。替代地，可以使用流式细胞术等技术来检查探针的杂交模式。

测序方法

可用于测量c-Met基因改变的测序方法涉及靶核酸的测序。可以使用本领域公知的任何测序，以检测目标c-Met基因改变。在通常情况下，测序方法可以分为传统或经典方法和高通量测序(新一代测序)。传统测序方法包括Maxam-Gilbert测序(也称为化学测序)和Sanger测序(也称为链终止法)。

通过使用不同于传统方法(如Sanger测序)的方法，高通量测序或新一代测序具有高度的可扩展性，并且能够一次性对整个基因组或转录组进行测序。高通量测序包括合成测序、连接测序和超深度测序(如在Marguiles等，Nature 437(7057):376-80(2005)中所描述的)。合成测序涉及通过在聚合酶扩增中掺入标记的核苷酸或核苷酸类似物来合成靶核酸的互补链。在成功掺入标记核苷酸之后即刻或之后，测量标记的信号并记录核苷酸的身份。在重复掺入、检测和鉴定步骤之前去除掺入核苷酸上的可检测标记。合成测序方法的实例是本领域公知的，并且例如描述在美国专利号7,056,676、美国专利号8,802,368和美国专利号7,169,560中，其通过引用并入本文。合成测序可以在固体表面(或微阵列或芯片)上使用折叠PCR和锚定引物进行。靶核酸片段可通过与锚定引物杂交并且桥式扩增而附着于固体表面。例如，在

测序平台中使用该技术。

焦磷酸测序涉及将靶核酸区域与引物杂交，并通过在聚合酶存在下依次掺入对应于碱基A、C、G和T(U)的脱氧核苷酸三磷酸来延伸新链。每个碱基掺入都伴随着焦磷酸的释放，焦磷酸被硫酸化酶转化为ATP，从而驱动氧化荧光素的合成和可见光的释放。由于焦磷酸的释放与掺入的碱基数量等摩尔，因而发出的光与任一步骤中添加的核苷酸数量成正比。重复该过程直到确定整个序列。

在某些实施方式中，本文所述的c-Met基因突变、基因融合或基因扩增通过全转录组鸟枪法测序(RNA测序)检测。已描述了RNA测序的方法(参见Wang Z,Gerstein M和SnyderM,Nature Review Genetics(2009)10:57-63；Maher CA等，Nature(2009)458:97-101；Kukurba K&Montgomery SB,Cold Spring Harbor Protocols(2015)2015(11):951-969)。

免疫测定

本文使用的免疫测定通常涉及使用与c-Met蛋白特异性结合的抗体。可以使用本领域公知的方法获得此类抗体(参见，例如，Huse等，Science(1989)246:1275-1281；Ward等，Nature(1989)341:544-546)，或者可以从市售来源获得。免疫测定的实例包括但不限于Western印记、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫沉淀、夹心测定、竞争测定、免疫荧光染色和成像、免疫组织化学(IHC)和荧光活化细胞分选(FACS)。有关免疫学和免疫测定程序的总数，参见Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr编著，7^th ed.1991)。此外，免疫测定可以以多种配置中的任何一种进行，这在酶免疫测定(Maggio编著，1980)；和Harlow&Lane，同上中广泛综述。关于一般免疫测定的综述，另参见Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology,第37卷(Asai编著，1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr编著，7^th ed.1991)。

在某些实施方式中，将c-Met表达水平测量为c-Met蛋白子集的水平，如修饰的c-Met蛋白的水平，例如，磷酸化的c-Met蛋白。在这种情况下，可以使用与修饰的c-Met蛋白特异性结合的抗体检测c-Met表达水平。

本文提供的用于测量c-Met表达水平的任何测定和方法都可以适用或优化以用于自动和半自动系统，或床旁测定系统。

可以使用本领域公知的适当方法将本文所述的c-Met表达水平归一化。例如，可以将c-Met表达水平归一化为标准标记物的标准水平，其可以预先确定、同时确定或在从对象获得样品后确定。标准标记物可以在同一测定中运行，也可以是来自此前测定的已知标准标志物。又例如，可以将c-Met表达水平归一化为内部对照，其可以是内部标记物，或者多个内部标记物的平均水平或总水平。

与参考水平的比较

在某些实施方式中，本文公开的方法包括将检测的c-Met表达水平与参考c-Met水平比较的步骤。

术语“参考c-Met标记”是指代表参考样品的c-Met表达水平。在某些实施方式中，参考样品是从健康对象或组织获得的。在某些实施方式中，参考样品是癌组织或肿瘤组织。在某些实施方式中，参考c-Met水平是使用与检测测试样品中的c-Met表达水平相同或相当的测量方法或测定法获得的。

在某些实施方式中，参考c-Met水平可以预先确定。例如，参考c-Met水平可以基于在一般癌症或肿瘤样品或来自相同类型肿瘤或血液癌症的组织的集合中的c-Met水平的测量来计算或概括。又例如，参考c-Met水平可以基于在一般癌症或来自一般癌症或肿瘤群体的平均癌症或肿瘤样品中通常观察到的c-Met水平的统计。

在某些实施方式中，本文提供的方法中的比较步骤涉及确定检测到的c-Met表达水平与参考c-Met水平之间的差异。与参考c-Met水平的差异可以是升高或降低。

在某些实施方式中，将与参考c-Met水平的差异进一步与阈值进行比较。在某些实施方式中，可以通过统计方法设置阈值，以便如果与参考c-Met水平的差异达到阈值，则可以认为这种差异具有统计学意义。在L.D.Fisher&G.vanBelle,Biostatistics:AMethodology for the Health Sciences(Wiley-Interscience,NY,1993)中描述了有用的统计分析方法。统计显着性可以基于置信度(“p”)值确定，可以使用未配对的双尾t检验计算。小于或等于，例如，0.1、0.05、0.025或0.01的p值通常可用于表示统计显着性。可以通过本领域众所周知的方法确定置信区间和p值。参见，例如，Dowdy和Wearden,Statistics forResearch,John Wiley&Sons,New York,1983。

使用c-Met抑制剂治疗

在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于治疗患有癌症的对象的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：检测来自对象的癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增及其组合，和向所述对象施用c-Met抑制剂。在某些实施方式中，所述方法包括：检测来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平；检测所述癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合或c-Met基因扩增；确定活性c-Met的表达水平高于c-Met的参考表达水平；确定所述对象可能对使用c-Met抑制剂的治疗产生应答；和向所述对象施用c-Met抑制剂。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂选自下组：克唑替尼、卡博替尼、特泊替尼、AMG337APL-101(PLB1001，伯瑞替尼)、SU11274、PHA665752、K252a、PF-2341066、AM7、JNJ-38877605、PF-04217903、MK2461、GSK1363089(XL880，福雷替尼(foretinib))、AMG458、替凡替尼(ARQ197)、INCB28060(INC280，卡马替尼)、E7050、BMS-777607、沃利替尼(volitinib)、HQP-8361、美乐替尼、ARGX-111、奥妥珠单抗(onartuzumab)、利妥木单抗、依玛妥珠单抗和XL184。

在一些实施方式中，c-Met抑制剂包括下式的化合物

其中：

R¹和R²独立地是氢或卤素；

X和X¹独立地是氢或卤素；

A和G独立地是CH或N，或者CH＝G被硫原子代替；

E是N；

J是CH、S或NH；

M是N或C；

R⁶是C_1-6烷基或C_3-7环烷基；和

R⁷和R⁸独立地是氢或C_1-6烷基。

在一些实施方式中，c-Met抑制剂选自下组：

在某些实施方式中，c-Met抑制剂是APL-101(此前称为CBT-101，参见US20150218171，其全部内容通过引用并入)，其具有下式：

在某些实施方式中，c-Met抑制剂可以与药学上可接受的载体一起配制。载体当存在时可以以任何合适的量与c-Met抑制剂共混，如基于c-Met抑制剂和载体的总体积或重量，以载体重量计5％至95％的量。在一些实施方式中，载体的量可以具有5％、10％、12％、15％、20％、25％、28％、30％、40％、50％、60％、70％或75％的任何一个的下限到20％、22％、25％、28％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的任何一个的上限(高于下限)的范围。在一个具体实施方式中，载体的量可以根据具体剂型、c-Met抑制剂的相对量、包含载体在内的组合物的总重量、载体的理化性质以及其他因素的考虑来确定，如制剂领域的普通技术人员所公知的。

c-Met抑制剂可以以任何所需和有效的方式施用：用于口服，或作为局部施用至眼的软膏或滴剂，或以任何适当的方式胃肠外或其它施用，如腹腔内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴管内。此外，c-Met抑制剂可以与其他治疗联合施用。如有需要，c-Met抑制剂可以被包封或以其他方式防止胃或其他分泌物。

本文公开的c-Met抑制剂剂量的适宜的非限制性实例是从约1mg/kg至约2400mg/kg每天，如从约1mg/kg至约1200mg/kg每天、75mg/kg每天至约300mg/kg每天，包括从约1mg/kg至约100mg/kg每天。此类药剂的其它代表性剂量包括约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg、2000mg/kg、2100mg/kg、2200mg/kg、and 2300mg/kg每天。在一些实施方式中，在人体内c-Met抑制剂的剂量是约400mg/天，每12小时一次。在一些实施方式中，在人体内c-Met抑制剂的剂量范围是300-500mg/天、100-600mg/天或25-1000mg/天。本文公开的c-Met抑制剂的有效剂量可以作为二、三、四、五、六或更多个亚剂量施用，全天以适当的间隔分开施用。

除c-Met抑制剂以外的抗癌剂

本公开内容的方法还涉及在确定对象不可能对c-Met抑制剂产生应答之后，向对象施用除c-Met抑制剂以外的抗癌剂。这些抗癌剂包括但不限于：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，如环磷酰胺(CTX；例如，

)、苯丁酸氮芥(CHL；例如，

)、顺铂(CisP；例如，

)、白消安(例如，

)、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、链脲佐菌素、三乙烯三聚氰胺(TEM)、丝裂霉素C等；抗代谢物，如甲氨蝶呤(MTX)；依托泊苷(VP16；例如，

)、6-巯基嘌呤(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(例如，

)、达卡巴嗪(DTIC)等；抗生素，如放线菌素D、多柔比星(DXR；例如，

)、柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、光神霉素等；生物碱，如长春花生物碱，如长春新碱(VCR)、长春碱等；和其他抗肿瘤剂，如紫杉醇(例如，

)和紫杉醇衍生物、细胞生长抑制剂、糖皮质激素，如地塞米松(DEX；例如，

)和皮质类固醇，如泼尼松、核苷酶抑制剂，如羟基脲、氨基酸消耗酶，如天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、亚叶酸、雷替曲塞和其他叶酸衍生物，以及类似的不同抗肿瘤剂。还可以将下述药剂作为另外的药剂：阿尼福汀(例如，

)、更生霉素、甲氯乙胺(氮芥)、链脲佐菌素、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星脂质(例如，

)、吉西他滨(例如，

)、柔红霉素脂质(例如，

)、丙卡巴肼、丝裂霉素、多西紫杉醇(例如，

)、阿地白介素、卡铂、奥沙利铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT 11(伊立替康)、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、聚门冬酰胺酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾丸内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、乌拉莫司汀、长春瑞滨和苯丁酸氮芥。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是抗激素剂。如本文所用，术语“抗激素剂”包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的天然或合成的有机或肽化合物。

例如，抗激素剂包括：类固醇受体拮抗剂、抗雌激素药如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、其他芳香酶抑制剂、42-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、酮昔芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(例如，

)；抗雄激素药，如氟他胺、尼鲁他胺、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；糖蛋白激素的激动剂和/或拮抗剂，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成素(LH)和LHRH(促黄体生成素释放激素)；LHRH激动剂醋酸戈舍瑞林，市售的

(AstraZeneca)；LHRH拮抗剂D-丙氨酰胺N-乙酰-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-L-赖氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-D-赖氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酸(例如，

Ares-Serono)；LHRH拮抗剂醋酸加尼瑞克；甾体抗雄激素醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，市售的

(Bristol-MyersOncology)；非甾体类抗雄激素氟他胺(2-甲基-N-[4,20-硝基-3-(三氟甲基)苯基丙酰胺]，市售的

(Schering Corp.)；非甾体抗雄激素尼鲁米特(5,5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4,4-二甲基-咪唑烷二酮]；和针对其他非许可受体的拮抗剂，如针对RAR、RXR、TR、VDR等的拮抗剂。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是血管生成抑制剂。抗血管生成剂包括，例如：VEGFR抑制剂，如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.,South San Francisco,Calif.,USA)，或如在例如国际申请号WO 99/24440、WO 99/62890、WO 95/21613、WO 99/61422、WO 98/50356、WO 99/10349、WO 97/32856、WO 97/22596、WO 98/54093、WO 98/02438、WO 99/16755和WO 98/02437，以及美国专利号5,883,113、5,886,020、5,792,783、5,834,504和6,235,764中所描述的；VEGF抑制剂，如IM862(Cytran Inc.,Kirkland,Wash.,USA)；angiozyme，一种来自Ribozyme(Boulder,Colo.)和Chiron(Emeryville,Calif.)的合成核酶；和VEGF的抗体，如贝伐单抗(例如，Avastin^TM,Genentech,South San Francisco,Calif.)、VRGF的重组人源化抗体；整合素受体拮抗剂和整合素拮抗剂，如针对αvβ3、αvβ5和αvβ6整合素及其亚型的，例如，西仑吉肽(EMD 121974)，或抗整合素抗体，比如例如αvβ3特异性人源化抗体(例如，

)；因子，如IFNα(美国专利号41530,901、4,503,035和5,231,176)；血管抑制素和纤溶酶原片段(例如，kringle 14、kringle 5、kringle 1-3(O'Reilly,M.S.等，(1994)Cell 79:315-328；Cao等，(1996)J.Biol.Chem.271:29461-29467；Cao等，(1997)J.Biol.Chem.272:22924-22928)；内皮抑素(O'Reilly,M.S.等，(1997)Cell88:277；和国际专利公开号WO 97/15666)；血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier,(1991)Curr.Opin.Cell Biol.3:792)；血小板因子4(PF4)；纤溶酶原激活剂/尿激酶抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；肝素酶；烟曲霉素类似物如TNP-4701；苏拉明和苏拉明类似物；血管抑制类固醇；bFGF拮抗剂；flk-1和flt-1拮抗剂；抗血管生成剂，如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂和MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例如在国际专利公开号WO 96/33172、WO 96/27583、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667和WO 99/07675，欧洲专利公开号818,442、780,386、1,004,578、606,046和931,788；英国专利公开号9912961，以及美国专利号5,863,949和5,861,510中所描述的。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有很少或没有抑制MMP-1活性的那些抑制剂。更优选的是相对于其它基质金属蛋白酶(即，MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些抑制剂。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是肿瘤细胞促凋亡或凋亡刺激剂。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是信号转导抑制剂。信号转导抑制剂包括，例如：erbB2受体抑制剂，如有机分子，或与erbB2受体结合的抗体，例如，曲妥珠单抗(例如，

)；其他蛋白酪氨酸激酶的抑制剂，例如，伊马替尼(Imitinib)(例如，

)；ras抑制剂；raf抑制剂；MEK抑制剂；mTOR抑制剂；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；和PDK-1抑制剂(参见Dancey,J.和Sausville,E.A.(2003)NatureRev.Drug Discovery 2:92-313，描述了此类抑制剂的几个实例，以及其在治疗癌症的临床试验中的用途)；GW-282974(Glaxo Wellcome plc)；单克隆抗体，如AR-209(AronexPharmaceuticals Inc.,The Woodlands,Tex.,USA)和2B-1(Chiron)；以及erbB2抑制剂，如在国际申请号WO 98/02434、WO 99/35146、WO 99/35132、WO98/02437、WO 97/13760和WO95/19970，以及美国专利号5,587,458、5,877,305、6,465,449和6,541,481中描述的那些抑制剂。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是癌症免疫疗法药剂，如与免疫检查点特异性结合的抗体。例如，免疫检查点包括：A2AR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、CD48、CD160、CD244、CTLA-4、ICOS、LAG-3、LILRB1、LILRB2、LILRB4、OX40、PD-1、PD-L1、PD-L2、SIRPα(CD47)、TIGIT、TIM-3、TIM-1、TIM-4和VISTA。

在某些实施方式中，c-Met抑制剂以外的抗癌剂是抗增殖剂。例如，抗增殖剂包括：法呢基蛋白转移酶抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFR抑制剂，包括在美国专利号6,080,769、6,194,438、6,258,824、6,586,447、6,071,935、6,495,564、6,150,377、6,596,735和6,479,513，和国际专利公开号WO 01/40217中公开和主张的化合物。

提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应被解释为限制本发明的范围。下面描述的所有具体化合物、材料和方法，全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体化合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而仅用于说明落入本发明范围内的特定实施方式。本领域技术人员可以在不行使创造性能力和不脱离本发明范围的情况下开发等效的组合物、材料和方法。应当理解的是，可以在本文描述的程序中进行多种变化，同时仍保持在本发明的范围内。发明人的意图是这些变化包括在本发明的范围内。

实施例1

本实施例说明某些c-Met基因改变可以用作确定对c-Met抑制剂敏感的癌症的生物标志物。

方法

使用公共领域的数据鉴定了携带c-Met点突变和融合的细胞系和PDX模型。为了验证肿瘤细胞系中的c-Met融合基因，使用RT-PCR扩增融合基因产物(mRNA)并克隆进行Sanger测序。使用western印记验证c-Met蛋白和c-Met融合蛋白在肿瘤细胞系中的表达。使用qRT-PCRPCT测量肿瘤细胞系中编码c-Met蛋白和c-Met融合蛋白的转录物的水平。然后在体外测试一组已鉴定的具有c-Met点突变和融合的细胞系对APL101的敏感性。用APL-101处理具有c-Met融合和扩增的PDX模型，以研究肿瘤在体内对c-Met抑制剂的敏感性。

结果

针对c-Met点突变和融合筛选了共计976个细胞系和1611个PDX。对于点突变，选择反复突变并测试IC50。如表3中所示，具有点突变但没有c-Met扩增的18个细胞系中没有一个对APL-101敏感。而相反的是，细胞系HS 746.T对APL-101敏感，其具有引起外显子14跳跃的点突变并且具有c-Met基因扩增。Y.Asaoka等(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(2010)394:1042-1046)已报道了在HS746.T中表达c-Met蛋白。

对于融合，我们的分析表明，所有分析的肿瘤细胞系和模型中平均有1.16％具有c-Met融合突变，其中70％具有激酶活性融合突变(占所分析肿瘤的0.81％)(见表6)。发明人鉴定了共计26个c-Met融合配偶体(见表8)，以及37个不同的融合事件，这是由于涉及几个反复配偶体的多个融合事件。在胆管癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肺癌等癌症类型中均发现了融合，其中肺癌发生的事件最多(见表9)。

为了说明APL-101治疗的有效性与c-MET等位基因的基因型和表型之间的相关性，本发明人鉴定了与c-MET作为配偶体的已知融合基因相关的转录物序列，并且在七种肿瘤细胞系中证明了连接点。发明人分别使用定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western印迹进一步测量了所选细胞系中c-Met和衍生物的转录物和蛋白的表达水平。

本发明人采用6个具有复发性融合的细胞系，用于体外敏感性测试。三种细胞系MKN45、MHCC97H、HCCLM3均具有融合以及c-Met扩增/过表达，对APL-101显示出高敏感性，其中IC50分别为0.18、0.24和0.61uM(见表11)。c-Met扩增不高的其它三种细胞系均对APL-101无反应，其中IC50高于10uM。结果证明了APL-101敏感性与单独的野生型c-MET或野生型c-MET与一个或多个融合基因的转录和蛋白水平的高表达之间的相关性，其中每个融合基因都编码完整的MET衍生蛋白激酶结构域。

发明人测试了具有体内c-Met融合和扩增两者的3种PDX肿瘤和一种CDX(细胞系衍生的异种移植物)肿瘤(MKN45)，以检测对APL-101的敏感性。如图1-4中所示，所有四种肿瘤模型都对c-Met抑制剂表现出极高的敏感性。

结果表明，单独的c-Met点突变和融合可能不足以决定对c-Met抑制剂的敏感性，而点突变和融合以及高水平表达(在转录和蛋白水平)结合在一起是可能的。随着临床上最近的发现，几乎所有c-Met表达水平低的c-Met外显子14跳跃患者对c-Met抑制剂没有反应，而c-Met高表达且外显子14跳跃的患者表现出对抑制剂治疗的敏感性，c-Met的一个共同主题正在出现，即c-Met基因突变可能需要一个以上的连续事件才能对c-Met抑制剂敏感。这可能对设计临床研究以将治疗引导至最有可能获得临床获益的患者具有重要意义。

表1：由c-Met基因突变引起的c-Met蛋白的氨基酸改变

表2：在肿瘤细胞系和PDX模型中鉴定的在c-MET基因融合中涉及的配偶体基因

表3：在c-Met点突变细胞系中的APL-101体外分析

表6：具有MET基因融合的模型

表7：激酶活(外显子15-21完整)融合

表8：在细胞系和PDX模型中鉴定的融合配偶体

表9：在细胞系和PDX模型中鉴定的c-Met融合

表10：在不同肿瘤细胞系中野生型c-MET和涉及c-MET的融合基因的转录水平

表11：在c-Met融合细胞系中的APL-101体外分析

序列表

<110> 浙江冠科美博生物科技有限公司

<120> 使用C-MET抑制剂治疗癌症患者的方法

<130> 071017-8007WO04

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 6876

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agacacgtgc tggggcgggc aggcgagcgc ctcagtctgg tcgcctggcg gtgcctccgg 60

ccccaacgcg cccgggccgc cgcgggccgc gcgcgccgat gcccggctga gtcactggca 120

gggcagcgcg cgtgtgggaa ggggcggagg gagtgcggcc ggcgggcggg cggggcgctg 180

ggctcagccc ggccgcaggt gacccggagg ccctcgccgc ccgcggcgcc ccgagcgctt 240

tgtgagcaga tgcggagccg agtggagggc gcgagccaga tgcggggcga cagctgactt 300

gctgagagga ggcggggagg cgcggagcgc gcgtgtggtc cttgcgccgc tgacttctcc 360

actggttcct gggcaccgaa agataaacct ctcataatga aggcccccgc tgtgcttgca 420

cctggcatcc tcgtgctcct gtttaccttg gtgcagagga gcaatgggga gtgtaaagag 480

gcactagcaa agtccgagat gaatgtgaat atgaagtatc agcttcccaa cttcaccgcg 540

gaaacaccca tccagaatgt cattctacat gagcatcaca ttttccttgg tgccactaac 600

tacatttatg ttttaaatga ggaagacctt cagaaggttg ctgagtacaa gactgggcct 660

gtgctggaac acccagattg tttcccatgt caggactgca gcagcaaagc caatttatca 720

ggaggtgttt ggaaagataa catcaacatg gctctagttg tcgacaccta ctatgatgat 780

caactcatta gctgtggcag cgtcaacaga gggacctgcc agcgacatgt ctttccccac 840

aatcatactg ctgacataca gtcggaggtt cactgcatat tctccccaca gatagaagag 900

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aaggaccggt tcatcaactt ctttgtaggc aataccataa attcttctta tttcccagat 1020

catccattgc attcgatatc agtgagaagg ctaaaggaaa cgaaagatgg ttttatgttt 1080

ttgacggacc agtcctacat tgatgtttta cctgagttca gagattctta ccccattaag 1140

tatgtccatg cctttgaaag caacaatttt atttacttct tgacggtcca aagggaaact 1200

ctagatgctc agacttttca cacaagaata atcaggttct gttccataaa ctctggattg 1260

cattcctaca tggaaatgcc tctggagtgt attctcacag aaaagagaaa aaagagatcc 1320

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agcaagccag attctgccga accaatggat cgatctgcca tgtgtgcatt ccctatcaaa 1500

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ttttacggac ccaatcatga gcactgcttt aataggacac ttctgagaaa ttcatcaggc 1620

tgtgaagcgc gccgtgatga atatcgaaca gagtttacca cagctttgca gcgcgttgac 1680

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gacctcacca tagctaatct tgggacatca gagggtcgct tcatgcaggt tgtggtttct 1800

cgatcaggac catcaacccc tcatgtgaat tttctcctgg actcccatcc agtgtctcca 1860

gaagtgattg tggagcatac attaaaccaa aatggctaca cactggttat cactgggaag 1920

aagatcacga agatcccatt gaatggcttg ggctgcagac atttccagtc ctgcagtcaa 1980

tgcctctctg ccccaccctt tgttcagtgt ggctggtgcc acgacaaatg tgtgcgatcg 2040

gaggaatgcc tgagcgggac atggactcaa cagatctgtc tgcctgcaat ctacaaggtt 2100

ttcccaaata gtgcacccct tgaaggaggg acaaggctga ccatatgtgg ctgggacttt 2160

ggatttcgga ggaataataa atttgattta aagaaaacta gagttctcct tggaaatgag 2220

agctgcacct tgactttaag tgagagcacg atgaatacat tgaaatgcac agttggtcct 2280

gccatgaata agcatttcaa tatgtccata attatttcaa atggccacgg gacaacacaa 2340

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gccaaccgag agacaagcat cttcagttac cgtgaagatc ccattgtcta tgaaattcat 2640

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caacatcgct ctaattcaga gataatctgt tgtaccactc cttccctgca acagctgaat 2880

ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac 2940

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tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt 3060

aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag agctgtgaga atatacactt acattctgaa 3120

gccgttttat gcacggtccc caatgacctg ctgaaattga acagcgagct aaatatagag 3180

tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat 3240

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tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa attaaagatc tgggcagtga attagttcgc 3360

tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc 3420

ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct gtagactacc gagctacttt tccagaagat 3480

cagtttccta attcatctca gaacggttca tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac 3540

atgtccccca tcctaactag tggggactct gatatatcca gtccattact gcaaaatact 3600

gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg 3660

attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc aatgaagtca taggaagagg gcattttggt 3720

tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa 3780

tccttgaaca gaatcactga cataggagaa gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc 3840

atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa 3900

gggtctccgc tggtggtcct accatacatg aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga 3960

aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat cttattggct ttggtcttca agtagccaaa 4020

ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt gtccacagag acttggctgc aagaaactgt 4080

atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt gctgattttg gtcttgccag agacatgtat 4140

gataaagaat actatagtgt acacaacaaa acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg 4200

gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc 4260

gtgctcctct gggagctgat gacaagagga gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt 4320

gatataactg tttacttgtt gcaagggaga agactcctac aacccgaata ctgcccagac 4380

cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt 4440

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355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Arg His Val Asn Ile Ala Leu Ile Gln Arg

755 760

<210> 5

<211> 158

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu

20 25 30

Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser

35 40 45

Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr

50 55 60

Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp Gln

85 90 95

Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro

100 105 110

Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser

115 120 125

Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn

130 135 140

Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro

145 150 155

<210> 6

<211> 190

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Lys Ser Lys Ser Lys Ser Leu Ala Glu Cys Phe Pro Tyr Asp Lys

1 5 10 15

Pro Leu Ile Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val

20 25 30

Leu Leu Phe Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala

35 40 45

Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn

50 55 60

Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp

85 90 95

Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro

100 105 110

Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly

115 120 125

Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr

130 135 140

Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys

145 150 155 160

Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu

165 170 175

Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln

180 185 190

<210> 7

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

1 5 10 15

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

20 25 30

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

35 40 45

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

50 55 60

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

65 70 75 80

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

85 90 95

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

100 105 110

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

115 120 125

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

130 135 140

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

145 150 155 160

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

165 170 175

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Val Gly

180 185 190

Phe Leu His Ser Ser His Asp Val Asn Lys Glu Ala Ser Val Ile Met

195 200 205

Leu Phe Ser Gly Leu Lys

210

<210> 8

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(135)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..(138)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (140)..(140)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 8

gtttgtccac agagacttgg ctgcaagaaa ctgtatggga agatggcgga tctggaggag 60

cagttgtctg atgaagagaa gaatccaact gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa 120

gtagccaaag gcannaantn tctgcaagca aaaa 154

<210> 9

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

ttgtctgatg agagaagtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg acaagaggag 60

ccccacctta tcctgatgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg caagggagaa 120

gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta aaatgctggc 180

accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgatgtttg tcgccagaag gaagatggcg 240

gatctggagg agcagttgtc tg 262

<210> 10

<211> 169

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

aagagtttag cagaatgctt cccatatgat aaacctctca taatgaaggc ccccgctgtg 60

cttgcacctg gcatcctcgt gctcctgttt accttggtgc agaggagcaa tggggagtgt 120

aagcctccca agtagctgag actacagggt ggtgatgaag agtaaatca 169

<210> 11

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 11

cttctccacg gttcctgggc accgaaagat tgactgaaga ngngatgcaa accagaaggg 60

acacacagtt ttgacggcat ttggaaggcc 90

<210> 12

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

tgtgtgcatt ccctatcaaa tatgtcaacg acttcttcaa caagatcgtc aacaaaaaca 60

atgtgagatg tctccagcat ttttacggac ccaatcatga gcactgcttt aataggattg 120

actttgaaga tgtgattgca gaaccagaag ggacacacag ttttgacggc atttggaagg 180

ccagcttcac caccttcact gtgacgaaat actggtttta ccgcttgctg tctgccctct 240

ttggcatccc gatggcactc atctggggca tttacttcgc caattgttcg cacaaagcaa 300

gccagattct gccgaaccaa tggatcgatc tgcca 335

<210> 13

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

tgcatttgca cagtataact tggaccagtt tactccagta aaaattgaag gttatgaaga 60

tcaggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt tgtaccactc cttccctgca 120

acagctgaat ctgcaactcc ccttcaatga tgttcggtta ctgcttaata atgacaatct 180

tctcagggaa ggagcagccc a 201

Claims

1.一种用于预测患有癌症的对象对使用c-Met抑制剂治疗的反应性的方法，所述方法包括

检测来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平；

检测在所述癌症样品中的c-Met基因突变、c-Met基因融合或c-Met基因扩增；

确定所述活性c-Met的表达水平高于c-Met的参考表达水平；和

确定所述对象可能对使用所述c-Met抑制剂的治疗有反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性c-Met的表达水平是mRNA水平或蛋白水平。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性c-Met是野生型c-Met、突变的c-Met、c-Met融合或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述c-Met基因突变导致产生具有选自下组的氨基酸变化的突变的c-Met蛋白：K6N、V13L、G24E、E34A、E34K、A347T、M35V、A48G、H60Y、D94Y、G109R、S135N、D153A、H159R、E167K、E168D、E168K、T17I、P173A、R191W、S197F、T200A、A204PfsTer3、F206S、L211W、G212V、S213L、T222M、L238YfsTer25、S244Y、I259F、T273N、F281L、E293K、K305_R307del、A320V、S323G、G344R、M362T、N375K、N375S、V378I、H396Q、C397S、S406Ter、F430L、F445L、L455I、T457HfsTer21、P472S、E493K、Y501H、L515M、L530V、V546M、R547Q、S572N、R591W、K595T、R602K、L604I、L604V、T618M、T621I、M630T、M636V、I638L、G645R、T646A、T651S、G679V、R731Q、S752Y、F753C、P761S、V765D、K783E、F804C、R811H、E815D、T835PfsTer7、G843R、I852F、I852N、Y853H、D882N、D882Y、E891K、L905_H906delinsY、H906Y、V910F、Q931R、V937I、V941L、Q944Ter、L967F、R976T、L982_D1028del、R988C、Y989C、Y989Ter、A991P、T995N、V1007I、P1009S、T1010I、M1013I、S1015Ter、D1028H、S1033L、R1040Q、Y1044C、Q1085K、G1120V、G1137A、L1158F、S1159L、R1166Q、R1166Ter、R1184Q、R1188Ter、D1198H、V1238I、A1239V、D1240N、Y1248H、A1299V、L1330YfsTer4、I316M、I333L、A1357V、V1368D、A1381T、L1386V和S1403Y及其组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述c-Met基因融合导致产生选自下组的基因融合产物：ACTG1/MET、ANXA2/MET、CAPZA2/MET、DNAL1/MET、FN1/MET、GTF2I/MET、KANK1/MET、MECP2/MET、MET/AGMO、MET/ANXA2、MET/CAPZA2、MET/CAV1、MET/IGF2、MET/INTU、MET/ITGA3、MET/NEDD4L、MET/PIEZO1、MET/PLEC、MET/POLR2A、MET/SLC16A3、MET/SMYD3、MET/ST7、MET/STEAP2-AS1、MET/TES、MET/TTC28-AS1、MGEA5/MET、PPM1G/MET、RPS27A/MET、ST7/MET、TES/MET、ZKSCAN1/MET及其组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自下组：肺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液系统癌症、白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌或肝细胞癌。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症样品是组织或血液。

9.根据权利要求1所述的方法，其中使用新一代测序检测所述c-Met基因突变、所述c-Met基因融合或所述c-Met基因扩增。

10.根据权利要求1所述的方法，其中使用扩增测定、杂交测定、测序测定或免疫测定检测所述活性c-Met的表达水平。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述c-Met抑制剂选自下组：克唑替尼、卡博替尼、特泊替尼、AMG337 APL-101(PLB1001，伯瑞替尼)、SU11274、PHA665752、K252a、PF-2341066、AM7、JNJ-38877605、PF-04217903、MK2461、GSK1363089(XL880，福雷替尼(foretinib))、AMG458、替凡替尼(ARQ197)、INCB28060(INC280，卡马替尼)、E7050、BMS-777607、沃利替尼(volitinib)、HQP-8361、美乐替尼、ARGX-111、奥妥珠单抗(onartuzumab)、利妥木单抗、依玛妥珠单抗和XL184。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述c-Met抑制剂是抗-c-Met抗体。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述c-Met抑制剂包含下式的化合物

其中：

R¹和R²独立地是氢或卤素；

X和X¹独立地是氢或卤素；

A和G独立地是CH或N，或者CH＝G被硫原子代替；

E是N；

J是CH、S或NH；

M是N或C；

R⁶是C_1-6烷基或C_3-7环烷基；和

R⁷和R⁸独立地是氢或C_1-6烷基。

14.一种用于治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括：

检测来自对象的癌症样品中活性c-Met的表达水平；

确定所述活性c-Met的表达水平高于c-Met的参考表达水平；

确定所述对象可能对使用c-Met抑制剂的治疗有反应；和

向所述对象施用所述c-Met抑制剂。

15.一种用于根据权利要求1-14中任一项所述的方法的试剂盒，其包含用于检测c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增或者活性c-Met表达水平的试剂。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂包含能够与c-Met基因的多核苷酸杂交的引物或探针。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述引物或所述探针被可检测地标记。

18.用于检测c-Met基因突变、c-Met基因融合、c-Met基因扩增或者活性c-Met表达水平的试剂在制备用于进行根据权利要求1-14中任一项所述的方法的试剂盒中的用途。