CN114591956A - Wdr43反义核苷酸在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用 - Google Patents

Wdr43反义核苷酸在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了反义核苷酸序列在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用。本发明还公开了一种表达载体，其包含所述的WDR43反义核苷酸序列。本发明还公开了一种宿主细胞，其包含所述的表达载体。本发明利用WDR43的反义核苷酸序列，通过RNA干扰的方法，降低WDR43的mRNA及蛋白的表达，从而有效抑制肠癌细胞的增殖和转移，可通过靶向治疗来提高肠癌治疗的特异性和有效性。

Description

WDR43反义核苷酸在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及WDR43反义核苷酸序列在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用。
背景技术
WDR43(WD repeat domain 43)属于WD重复蛋白(WD repeat protein)家族，WD重复蛋白通常由4-16个WD重复结构域组成，该结构域由40多个保守色甘酸-天冬氨酸核心序列组成，最早在GTP结合转导蛋白的β亚基中被发现。目前的研究表明WD重复蛋白家族与细胞信号通路转导，转录调控及增殖、凋亡有关；同时在恶性肿瘤、神经性疾病的发生机制中起到重要作用。WDR43是一种含有WD40结构域的蛋白质，可以作为RNA结合蛋白(RBP)和多个与启动子相关的非编码新生RNA结合，并通过与胚胎干细胞RNA聚合酶PolII相互作用调控染色体的转录过程。
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)作为消化系统常见恶性肿瘤，一直威胁着人群健康和社会经济。根据世界卫生组织下属国际癌症研究机构全球癌症统计估计，2020年全球结直肠癌新发病例数约为190万(发病率居第3位)，结直肠癌死亡人数约为93.5万(死亡率居第2位)。在中国，由于饮食结构变化、人口老龄化等原因，结直肠癌发病率和死亡率也有所增加。
早期肠癌患者的5年生存率可高达90％，由于缺乏早期诊断标志物，诊断时已处于晚期阶段，其5年生存率降至70.4％。数据调查显示，10％-20％的Ⅱ期和30％-40％的Ⅲ期结直肠癌患者在治疗后复发。
针对肠癌的特点，进行特异性治疗来提高肠癌治疗的特异性和灵敏性，是达到根治的重要策略。通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制WDR43的表达，从而抑制肠癌的生长和转移，可应用于制备抑制肠癌细胞增殖和转移的药物。
发明内容
本发明的目的在于针对目前肠癌治疗效果欠佳的情况，提供一种靶向治疗策略，其能够有效抑制肠癌细胞的增殖和转移从而治疗肠癌的药物。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种WDR43反义核苷酸序列在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用。
WDR43的反义核苷酸序列通过在基因水平封闭WDR43的表达，从而达到抑制肠癌增殖和转移的目的。
作为一种优选的实施方案，所述WDR43反义核苷酸序列的靶向序列为位于WDR43上的如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
作为一种优选的实施方案，所述WDR43反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
作为一种优选的实施方案，所述WDR43反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
作为一种优选的实施方案，所述肠癌细胞为肠癌细胞系HCT116和LS174T细胞。
作为一种优选的实施方案，将所述WDR43反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中，用于制备抑制肠癌细胞增殖和转移的药物。
另一方面，本发明还提供了一种表达载体，其包含根据本发明所述的WDR43反义核苷酸序列。
作为一种优选的实施方案，所述表达载体的基础载体为pLKO.1-TRC cloningvector载体。
另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明所述的表达载体。
作为一种优选的实施方案，所述宿主细胞来源于肠癌细胞。
与现有技术相比，本发明针对WDR43高表达的肠癌，利用WDR43的反义核苷酸序列，用WDR43的反义核苷酸序列与靶基因的信使RNA(message RNA，mRNA)结合来抑制WDR43的基因表达，实验结果表明WDR43的反义核苷酸可以有效降低其RNA及蛋白的表达，从而有效抑制肠癌细胞的增殖和转移，降低其恶性程度。本发明将WDR43的反义核苷酸序列应用于制备抑制肠癌细胞增殖和转移的药物中，可通过靶向治疗来提高肠癌治疗的特异性和有效性。
附图说明
图1为WDR43-shRNA-1质粒的测序结果，表明载体构建成功。
图2为WDR43-shRNA-2质粒的测序结果，表明载体构建成功。
图3为Scramble-shRNA质粒的测序结果，表明载体构建成功。
图4为westernblot检测HCT116敲降细胞中WDR43的蛋白表达水平。
图5为westernblot检测LS174T敲降细胞中WDR43的蛋白表达水平。
图6为HCT116敲降细胞的生长曲线。
图7为LS174T敲降细胞的生长曲线。
图8为平板克隆形成图，表示抑制WDR43表达后HCT116细胞和LS174T细胞克隆形成能力降低。
图9为软琼脂集落形成图，表示抑制WDR43表达后HCT116细胞和LS174T细胞集落形成能力降低。
图10为细胞迁移和侵袭实验结果图，表示抑制WDR43表达后HCT116细胞迁移和侵袭能力降低。
图11为细胞迁移和侵袭实验结果统计图，表示抑制WDR43表达后HCT116细胞迁移和侵袭能力降低(***：p<0.001，转染后细胞与未转染细胞相比，迁移和侵袭细胞数存在差异)。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。除非特别指出，实施例中所使用的的生物材料、试剂和仪器均可通过商业渠道购买获得。
实施例1.构建pLKO.1-WDR43-shRNA慢病毒载体
(1)合成以下含有WDR43的反义核苷酸序列的正反两条寡核苷酸序列(5’→3’)：
WDR43-shRNA-1-正向：
CCGGACCGATGAACCTGTCTATATTCTCGAGAATATAGACAGGTTCATCGGTTTTTTG(SEQ IDNO.3)
WDR43-shRNA-1-反向：
AATTCAAAAAACCGATGAACCTGTCTATATTCTCGAGAATATAGACAGGTTCATCGGT(SEQ IDNO.4)
WDR43-shRNA-2-正向：
CCGGAGGAGAGTTACACAGTAAATTCTCGAGAATTTACTGTGTAACTCTCCTTTTTTG(SEQ IDNO.5)
WDR43-shRNA-2-反向：
AATTCAAAAAAGGAGAGTTACACAGTAAATTCTCGAGAATTTACTGTGTAACTCTCCT(SEQ IDNO.6)
并同时合成以下在基因组上无任何对应序列的杂乱序列的正反两条寡核苷酸序列(5’→3’)作为对照：
Scramble-shRNA-正向：
CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG(SEQ IDNO.7)
Scramble-shRNA-反向：
AATTCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTG(SEQ IDNO.8)
(2)寡核苷酸退火
用灭菌去离子水溶解合成的寡核苷酸，终浓度为100nM，在微型离心管中配制以下反应体系：
Figure BDA0003529549930000041
反应条件为：100℃水浴中煮5min，然后在水浴中缓慢降温至室温。
(3)pLKO.1-TRC cloning vector(以下简称pLKO.1)慢病毒载体的酶切
慢病毒载体可以有效地将外源基因整合到宿主基因组上，从而实现持久表达，目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中，具有高效敲降基因，可以长期阻断基因的表达等有点，因此具有广泛的应用前景。pLKO.1慢病毒载体具有嘌罗霉素(Puromycin)抗性基因，可以快速得到稳定细胞株。pLKO.1载体(Addgene公司，货号#10878，质粒全长8901bp)，含有Age I和EcoR I限制性酶切位点，用这两个酶对该载体进行双酶切，得到含有粘性末端的线性化载体，双酶切反应体系如下所示：
Figure BDA0003529549930000042
Figure BDA0003529549930000051
反应条件为：37℃水浴孵育2-3h，然后跑琼脂糖凝胶电泳，用凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切产物，得到线性化载体片段。
(4)寡核苷酸退火产物与线性化的pLKO.1载体连接重组
连接反应体系如下：
Figure BDA0003529549930000052
反应条件为：16℃孵育1h。
(5)连接产物的转化
从-80℃温度下取出DH5α感受态细胞，待其融化后加入10μl连接产物，轻轻混匀，然后冰上放置30min；42℃水浴中热激90s，然后迅速放冰上2-3min；加入600μl LB液体培养基(不含抗生素抗性)，放在37℃摇床中振荡培养45-60min；3000rpm离心2min，用100μl上清液重悬沉淀，均匀涂布在含有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB固体培养皿中，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿放置在37℃恒温培养箱培养过夜。
(6)挑取单克隆并进行测序验证
培养皿培养14h后即可长成单克隆菌落，每个挑取2-3个单克隆菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃摇床240rpm振荡培养15h；提取质粒，送至公司进行二代测序，将测序的序列与设计的序列进行Blast同源性比对分析，选择比对正确的单克隆进行后面的实验，图1、图2和图3分别是三个质粒测序的结果图。
实施例2.构建稳定敲降WDR43的肠癌细胞
(1)慢病毒的包装
首先将HEK293T细胞以每孔5×105个细胞铺在六孔板中，培养过夜；第二天细胞密度为60-70％时进行转染，转染质粒的比例为pLKO.1载体：psPAX.2：pMD2.G＝4:3:1，转染过程按照LipofectinTM2000转染试剂说明书进行；转染8h后更换新鲜培养基，换液后48h收集上清即为慢病毒液。
(2)慢病毒感染肠癌细胞及稳定细胞系的筛选
用包装的慢病毒液感染肠癌细胞系HCT116和LS174T细胞，感染48h后加入嘌呤霉素(Puromycin)进行稳定筛选，筛选5天左右，使空白对照组细胞全部死亡，而感染慢病毒的细胞存活下来。
(3)稳定细胞系的鉴定
将上述筛选后的细胞，分别提取蛋白，进行Western blot验证蛋白水平的敲降效果。
Western blot检测蛋白水平的敲降效率：分别用蛋白裂解液(lysis)收取筛选得到细胞的总蛋白，充分裂解后离心取上清进行蛋白定量，定量方法按照BCA蛋白含量检测试剂盒的方法进行，提取20μg总蛋白进行Western blot实验。结果如图4和图5所示，以GAPDH蛋白为内参蛋白，在两种肠癌细胞中，与Scramble-shRNA相比，两条WDR43 shRNA在蛋白水平显著敲降WDR43。
经过Western blot验证，发现与Scramble-shRNA相比，WDR43-shRNA-1和WDR43-shRNA-2都可以显著敲降WDR43，可以用于后续实验。
实施例3.WDR43敲降对肠癌细胞生长的影响
对上述验证好的细胞进行计数，细胞稀释为1×105个/ml，接种在六孔板中，每孔接种1ml，即1×105个细胞/孔，每组细胞共接种7个孔，放在培养箱中继续培养。第二天取每组各一个孔的细胞进行计数，每次计三次，取平均值作为该组的细胞数目。继续计数，共统计7天每组细胞的数目。重复三次，以时间(天数)为横轴，每天的细胞数目为纵轴，绘制细胞生长曲线，用SPSS软件进行统计学分析。图6和图7分别为HCT116和LS174T细胞敲降WDR43后，细胞的生长曲线，表明shRNA抑制WDR43表达后，这两种细胞的增殖能力显著降低。
实施例4.WDR43敲降对细胞生物学行为的影响
(1)平板克隆形成实验
接种细胞，取对数生长期对照组细胞和实验组细胞。将细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后每孔1500个细胞接种于六孔板中，每个细胞设置3个复孔，37℃孵箱培养两周左右。弃原培养基，PBS清洗两次。然后，加入2ml甲醇室温固定15分钟。弃固定液，PBS清洗两次，用现配的Giemsa染液(Giemsa染料原液：PBS＝1：9)染色9分钟，缓慢冲洗掉染液，室温干燥。待六孔板完全干燥后，用数码相机拍照，计数后进行统计。
图8是平板克隆实验结果图，从该结果可以看出，抑制WDR43表达后，HCT116和LS174T细胞克隆形成能力降低。
(2)软琼脂集落形成实验
制备0.6％的软琼脂(40ml预热的完全培养基+10ml融化的3％软琼脂)，在六孔板的每个孔中分别加入2ml 0.6％的软琼脂，待其凝固。接种细胞，取对数生长期对照组细胞和实验组细胞。将细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后，将细胞浓度调整为1×104个/ml。将细胞悬液与软琼脂(4.5ml细胞悬液+0.5ml软琼脂)混合作为上层琼脂，分别向六孔板的每个孔中加入1ml上层琼脂。待其凝固后，放37℃孵箱中培养两周，观察结果。
图9是软琼脂集落形成实验结果图，从该结果可以看出，抑制WDR43表达后，HCT116和LS174T细胞在软琼脂中的集落形成能力降低。
(3)细胞迁移和侵袭实验
应用工取对数生长期的对照组细胞和实验组细胞进行基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入孔板中，室温放置。在孔板和小室内各加入即预热的37℃无血清培养基，37℃孵箱中水化。水化后，小心地将液体移出，不要碰到基底膜。用胰酶消化细胞，全培养基终止消化，细胞计数，将细胞稀释到1×105个/ml。24孔板内加入750μl全培养基，之后，将小室放入孔板中，注意小室膜下不要产生气泡。迅速加入500μl细胞悬液(5×104个细胞/孔)，每组细胞设个复孔。镜下观察，吹打均匀。37℃孵箱中，培养24h。取出24孔板，棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面，去掉未发生侵袭的细胞。膜在无水甲醇中固定1分钟，蒸馏水洗2次，苏木素染色5分钟，水洗干净(至无色)；伊红染色20秒，水洗干净。将膜完全晾干。刀切膜，中性树胶将膜粘到载玻片上，盖上盖玻片。光镜下观察，计数，拍照。
图10是细胞迁移和侵袭实验结果图，图11是细胞迁移和侵袭实验结果统计图，从该结果可以看出抑制WDR43表达后，HCT116细胞迁移和侵袭能力降低。通过ANOVA统计，Dunnett’s Multiple Comparison Test方法分析可知，p<0.001(***)，有统计学意义。
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> WDR43反义核苷酸在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accgatgaac ctgtctatat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggagagtta cacagtaaat t 21
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggaccgat gaacctgtct atattctcga gaatatagac aggttcatcg gttttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa accgatgaac ctgtctatat tctcgagaat atagacaggt tcatcggt 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaggaga gttacacagt aaattctcga gaatttactg tgtaactctc cttttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaaaaa aggagagtta cacagtaaat tctcgagaat ttactgtgta actctcct 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggcaacaa gatgaagagc accaactcga gttggtgctc ttcatcttgt tgtttttg 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattcaaaaa caacaagatg aagagcacca actcgagttg gtgctcttca tcttgttg 58

Claims (10)

1.WDR43反义核苷酸序列在制备抑制肠癌细胞增殖和转移药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述WDR43反义核苷酸序列的靶向序列为位于WDR43上的如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述WDR43反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述WDR43反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠癌细胞为HCT116和LS174T细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其特征在于，将所述WDR43反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中，用于制备抑制肠癌细胞增殖和转移的药物。
7.一种表达载体，其包含根据权利要求1所述的WDR43反义核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的基础载体为pLKO.1-TRC cloning vector载体。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的表达载体。
10.根据权利要求9的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞来源于肠癌细胞。
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