CN114591855A - 一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用 - Google Patents

一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis购买自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为1A05942；所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis能够产生吲哚乙酸，其产量为7.19mg/L。所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有产铁载体、解钾促生的特性，但不具有解无机磷的能力。所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有耐盐性。本发明利用B.mobilis具有产IAA的促生特性，在盐胁迫下，接种B.mobilis能够提高油菜种子的萌发率，同时也能促进油菜幼苗的生长。因此，B.mobilis可作为开发微生物菌肥的优良菌株资源，并具有良好的应用前景。

Description

一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中 的应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用。
背景技术
我国现存土地大面积遭受盐渍化污染，主要分布在东北、华北、西北内陆和长江以北沿海地区，是我国农业生产力发展的主要障碍之一。土壤盐渍化一方面造成土壤板结与肥力下降，阻碍植物吸收养分，另一方面通过渗透和离子胁迫影响植物和细胞水平的生理过程，种子萌发受阻，叶绿素含量降低导致光合作用下降，根系活力降低，增加能量消耗，加速衰老，并最终导致植物枯萎或死亡。当植物受到盐分胁迫时，吲哚乙酸(IAA)等激素能够作为信号物质调节植物生长抵抗逆境，IAA在植物体内普遍存在，在提高植物耐盐性中发挥着重要作用。
土壤是巨大的微生物储存库，大量的有益微生物能定植于植物根部，通过调节植物体内激素变化、诱导植物体产生抗氧化酶体系、促进植物渗透保护物质增加、产生胞外多糖、调控植物体内离子平衡、诱导光合速率变化等过程提高作物的耐盐性。目前，利用外源物质添加来提高作物的抗逆性已有大量研究，通过微生物菌种促进植物种子萌发、幼苗生长和提高作物抗逆性越来越受到重视。在盐胁迫下，通过添加耐盐微生物能够提高黄瓜、紫花苜蓿、黑麦草、烟草、小麦等宿主的耐盐性，但在盐碱环境条件下对油菜生长发育的影响研究相对较少，且缺乏系统性。
因此本发明选用从中国海洋微生物菌种保藏管理中心购买的运动芽孢杆菌(Bacillus mobilis)，对其进行耐盐能力测定，再利用King氏培养基筛选出产IAA的阳性菌株；进一步通过在盐胁迫下，探究B.mobilis对油菜种子萌发及幼苗生长发育的影响，从而为改良盐碱土壤提供一定的理论支持和菌株资源。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株运动芽孢杆菌Bacillusmobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis购买自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为1A05942；所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis能够产生吲哚乙酸，其产量为7.19mg/L。
优选的是，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有产铁载体、解钾促生的特性，但不具有解无机磷的能力。
优选的是，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有耐盐性。
优选的是，在盐胁迫下，将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis接种到油菜种子以促进油菜种子的萌发及油菜幼苗的生长。
优选的是，在盐胁迫下，将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis接种到油菜种子以促进油菜种子的萌发及油菜幼苗的生长，其菌株培养及接种过程为：
步骤一、菌株培养及处理：将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后用接种环沾取菌种在LB培养基上划线，完成后放入30℃恒温培养箱中培养；待培养基上长出单菌落，用接种环挑取单菌落接种到5mL液体LB培养基中培养，取100μL菌液至100mL LB培养基中培养，连续培养至OD600介于菌株生长对数期，然后进行4000r/min×5min洗菌，倒掉上清液，加入20mL无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，然后离心加20mL无菌水待用，即菌液培养液；
步骤二、种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，浸没入75％酒精消毒2min，用无菌水洗涤3次，再用0.1％HgCl2消毒10min，用无菌水洗涤5次，直至将HgCl2完全去除干净；然后放入菌液培养液中，接菌1h，放入无菌环境中晾干；
步骤三、播种：将接菌的油菜种子播种在盐碱土壤中，培养。
本发明至少包括以下有益效果：本发明利用B.mobilis具有产IAA的促生特性，在盐胁迫下，接种B.mobilis能够提高油菜种子的萌发率，同时也能促进油菜幼苗的生长。在50mmol/L NaCl胁迫下，未接菌油菜种子的萌发率降低至60.0％，接种Bacillus mobilis菌株后，油菜种子的萌发率显著高于未接种菌株(其种子萌发率为77.78％)。在300mmol/LNaCl胁迫下，与未加NaCl胁迫相比，未接菌的油菜幼苗鲜重降低了78.49％，干重降低了71.63％；接种Bacillus mobilis的油菜幼苗鲜重和干重分别降低了48.28％和50.07％，说明接种Bacillus mobilis能够显著增强油菜幼苗对盐的耐受能力。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
图1 B.mobilis菌株的形态观察；
图2 B.mobilis菌株的产铁载体显色反应；
图3 B.mobilis耐盐能力测试结果；
图4不同IAA浓度的标准曲线；
图5接种B.mobilis对油菜种子萌发的影响；
图6不同盐浓度处理对油菜幼苗生长的影响；
图7接种B.mobilis对油菜幼苗鲜重的影响；
图8接种B.mobilis对油菜幼苗干重的影响。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1：
Bacillus mobilis产IAA的阳性反应测试：
King氏培养基(1L)：蛋白胨20g，K2HPO4 1.725g，丙三醇15mL，MgSO4·7H2O 1.5g，色氨酸0.1g，调pH至7.2，用ddH2O定容至1L。
PC比色液的配制：称取氯化铁(FeCl3)12g溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入429.7mL 98％H2SO4，待冷却后定容至1L，测定范围0.3～20mg/L。
采用Salkowski比色法测定菌株分泌IAA的能力：将购买的Bacillus mobilis菌株接种在LB液体培养基中培养12h(30℃、200r/min)后，用无菌水调节OD600值为0.05，取100μL菌悬液接种到含有100mg/L色氨酸的King培养液(不含色氨酸的King培养液为对照)中，实验重复3次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，置于30℃、120r/min的控温振荡器中培养2d。分别取50μL菌悬液和空白对照，各加入50μL比色液，置室温下静置15min，观察颜色变化，3个重复均变红视为阳性，说明能产生IAA，颜色越深表示产IAA的能力越强；3个重复均不变色为阴性，表明不产生IAA。
经过比色发现，B.mobilis能够产生IAA(如图2)。
本实施中的运动芽孢杆菌(Bacillus mobilis)购买于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，其保藏号为1A05942。实施例3中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，WB600)和大肠杆菌(Escherichia coli，Top10)均是从淼灵平台上购买。
实施例2：
菌株Bacillus mobilis的产IAA量：
标准曲线的绘制：配制3-IAA标准溶液，浓度依次为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5mg/L，取上述3-IAA溶液4mL，在标准溶液中加入PC比色液4mL，在黑暗中静置0.5h，取出立即用分光光度计测定OD600值，以加了比色液的蒸馏水调0，重复3次，获得数据制作标准曲线(图4)。
将待测菌株划线活化，提取单菌落于5mL液体培养基30℃、200r/min摇瓶培养1d，用无菌水调节OD600值为0.05，取100μL菌悬浮液接到含有100mg/L色氨酸的King培养液(不含色氨酸的King培养液为对照)中，每瓶50mL的培养液，重复3次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，一起置于30℃、200r/min的控温振荡器中培养2d。将经King培养液培养2d的菌液和空白对照菌液10000r/min离心10min取上清液4mL加等量比色液，在黑暗中静置0.5h，取出立即用分光光度计测定OD530值，每个样品重复测3次，以加了比色液的空白对照调零。用相应的标准曲线计算出待测菌株分泌IAA的量。
结果表明，Bacillus mobilis能产生IAA，其含量为7.19mg/L。同时对其进行形态观察(图1)，Bacillus mobilis菌株呈白色，菌落凸起，边缘呈不规则状，菌落表面光滑有色泽，LB培养基，30℃，有氧条件下生长良好。
实施例3：
Bacillus mobilis的耐盐能力测试：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加入琼脂粉15g/L；开展菌株耐盐能力比较时，按照2％、4％、6％、8％、10％NaCl加入到LB培养基中。
分别取Bacillus mobilis、B.subtilis和E.coli于LB固体培养基平板划线培养至长出单菌落。挑取单菌落于5mL LB液体培养基中过夜活化，次日将培养液按照1％转移至20mL LB液体培养基中，放入摇床中30℃、200r/min振荡培养至OD600为0.4～0.6。将各菌浓度OD600控制在相同的范围。使用无菌水将菌液稀释到10-5后取稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的菌液各10μL点于含不同NaCl浓度的LB固体培养基上。将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养1～2天后观察并记录结果。
经过观察(图3)，B.mobilis(Bacillus mobilis)能够在4％NaCl LB培养基中生长，具有一定的耐盐特性，其耐盐能力较阴性菌大肠杆菌强，但较同属阳性菌枯草芽孢杆菌弱。
实施例4：
对B.mobilis进行其他促生特性的定性试验
MSA基础培养基(1L)：葡萄糖4g，蛋白胨5g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，用ddH2O定容，调pH至7.0，112℃灭菌20min。
磷酸缓冲液(100mL)：NaH2PO4·2H2O 590.5mg，Na2HPO4·12H2O 2.427g，NH4Cl250mg，KH2PO4·H2O 75mg，NaCl 125mg，用ddH2O定容。
CAS染液(100mL)：A 液：称取铬天青S 60.5mg，用ddH2O定容至50mL，然后加入10mL1mmol/L FeCl3(用10mmol/L HCl配制)；B液：称取72.9mg十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)，用ddH2O定容至40mL；将A液混匀后缓缓沿杯壁加入到B液中，121℃灭菌15min。
MSA-CAS培养基：向1L MSA基础培养基中依次加入50mL磷酸缓冲液和50mL CAS染液，混匀即可。
PKO培养基(1L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.1g，MnSO4·H2O 30mg，FeSO4 30mg，Ca3(PO4)2 5g，酵母粉0.5g，琼脂20g，用ddH2O定容，调pH至7.0。
解钾培养基(1L)：葡萄糖10g，钾长石2.5g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g CaCO3 5g，CaSO4·7H2O 0.1g，琼脂20g，用ddH2O定容，调pH至7.0。
产铁载体检测：将菌株接种于MSA-CAS液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养2d。培养液由蓝色变为红色、橙黄色或紫色者均为阳性。
溶磷试验：将菌株接种至PKO培养基上，30℃培养一段时间后，菌落周围形成透明圈者为阳性。
解钾试验：将菌株接种至解钾培养基上，30℃培养一段时间后，菌落周围形成透明圈者为阳性。
结果显示(见表1)，B.mobilis不仅能使MSA-CAS液体培养液变紫，同时能在解钾培养基中产生透明圈，但是不能在PKO培养基上产生透明圈，说明B.mobilis能够产生铁载体和解钾，但不能解磷。所以B.mobilis同时具有产IAA、产铁载体和解钾3种促生特性，是制作微生物菌肥潜在的优良菌株资源，具有良好的应用开发前景。
表1
Figure BDA0003537098160000061
注：“+”表示对应的反应为阳性；“-”表示反应为阴性。
实施例5：
在盐胁迫下，接种B.mobilis对油菜种子萌发的影响
菌株培养及处理：将B.mobilis菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后用接种环沾取菌种在LB培养基上划线，完成后放入30℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出单菌落，用接种环挑取单菌落接种到5mL液体LB培养基中培养，取100μL菌液至100mL LB培养基中培养，连续培养至OD600介于菌株生长对数期，然后进行4000r/min×5min洗菌，倒掉上清液，加入20mL无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，然后离心加20mL无菌水待用。
种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，浸没入75％酒精消毒2min，用无菌水洗涤3次，再用0.1％HgCl2消毒10min，用无菌水洗涤5次，直至将HgCl2完全去除干净。然后放入菌液培养液中，接菌1h，放入无菌环境中晾干。
播种：将接菌的油菜种子按照一定的位置点在装有5层滤纸的盘子上(滤纸是用100mL不同盐浓度的无菌水浸湿，盐浓度依次为0、50、100mmol/L的NaCl)，每个处理设置3个平行。播种完成之后，将其放在20±2℃、明/暗为10h/14h的温室中培养7d，每天记录种子的发芽数。
根据统计油菜种子发芽率结果表明，在不加盐的情况下，对照和接种B.mobilis的油菜种子萌发率分别为93.33％和94.17％；进行50mmol/L盐胁迫处理时，对照组的种子萌发率降至60.00％，接种B.mobilis的油菜种子萌发率为77.78％。因此接种B.mobilis能够显著提高油菜种子的萌发率(图5)。
实施例6：
在盐胁迫下，接种B.mobilis对油菜幼苗生长的影响
播种：将营养土与蛭石进行灭菌，待冷却后将营养土与蛭石按照4:1混匀，分装至盆里(称重)，然后选用同实施例5相同处理的种子播种至盆中，每盆3粒油菜种子。待种子萌发后，加入1/2霍格兰营养液。
胁迫处理：种子萌发10d后接菌，20d后进行盐胁迫处理(0、100、200、300mmol/L)，每盆80mL不同浓度NaCl溶液。
结果显示，在300mmol/L NaCl胁迫下，与对照(不加NaCl)相比，未接菌的油菜幼苗的鲜重降低了78.49％，干重降低了71.63％，而接种B.mobilis的油菜幼苗的鲜重和干重分别降低了48.28％和50.07％，说明接种B.mobilis能够显著增强油菜幼苗对盐胁迫的适应能力(图6、图7和图8)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，其特征在于，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis购买自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为1A05942；所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis能够产生吲哚乙酸，其产量为7.19mg/L。
2.如权利要求1所述的一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，其特征在于，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有产铁载体、解钾促生的特性，但不具有解无机磷的能力。
3.如权利要求1所述的一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，其特征在于，所述运动芽孢杆菌Bacillus mobilis具有耐盐性。
4.如权利要求1所述的一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，其特征在于，在盐胁迫下，将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis接种到油菜种子以促进油菜种子的萌发及油菜幼苗的生长。
5.如权利要求4所述的一株运动芽孢杆菌Bacillus mobilis在增强油菜耐盐促生中的应用，其特征在于，在盐胁迫下，将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis接种到油菜种子以促进油菜种子的萌发及油菜幼苗的生长，其菌株培养及接种过程为：
步骤一、菌株培养及处理：将运动芽孢杆菌Bacillus mobilis菌株保存在-80℃冰箱中，取出菌株后用接种环沾取菌种在LB培养基上划线，完成后放入30℃恒温培养箱中培养；待培养基上长出单菌落，用接种环挑取单菌落接种到5mL液体LB培养基中培养，取100μL菌液至100mL LB培养基中培养，连续培养至OD600介于菌株生长对数期，然后进行4000r/min×5min洗菌，倒掉上清液，加入20mL无菌水，吹打混匀，再次离心，重复上述操作一次，然后离心加20mL无菌水待用，即菌液培养液；
步骤二、种子消毒：挑选质地、大小、颜色一致的油菜种子进行消毒，浸没入75％酒精消毒2min，用无菌水洗涤3次，再用0.1％HgCl2消毒10min，用无菌水洗涤5次，直至将HgCl2完全去除干净；然后放入菌液培养液中，接菌1h，放入无菌环境中晾干；
步骤三、播种：将接菌的油菜种子播种在盐碱土壤中，培养。
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彭玉龙等: "促烟草种子萌发的细菌菌株筛选及促生特性研究" *

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CN114591855B (zh) 2023-05-26

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