CN114591499B - 一种聚(r)-3-羟基丁酸酯的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化工技术领域，公开了一种聚(R)‑3‑羟基丁酸酯的制备方法和应用。该方法先采用乙醇溶液对大分子量的PHB粗品进行回流处理，使乙醇渗透至PHB粗品内部结构；然后采用蛋白酶和脂肪酶共同作用，实现对PHB粗品的降解与净化；在固液分离后，对上层清液进行纯化，即实现(R)‑羟基丁酸的回收；对固体沉淀物采用乙醇浸泡，即制得纯度高、分子量低、分散度低，内毒素含量低的聚(R)‑3‑羟基丁酸酯。该方法不仅能够对聚(R)‑3‑羟基丁酸酯进行提纯，实现分子量分级，而且能够使副产物(R)‑羟基丁酸得到合理回收。该方法操作简单，对生产设备要求低，不使用有毒溶剂，对环境友好。

Description

一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法和应用。
背景技术
由生物发酵获得的生物聚合物材料是近年来发展最为迅速的生物医用友好材料之一。在这些生物材料当中，聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)因其优异的性能，利用其制备神经导管、促进软骨材料和食管再生辅助功能材料的研究较多。如，因具有良好的生物相容性和优异的理化、力学性能，在PHA家族种的聚4-羟基丁酸脂(P4HB)已经作为补片用于人体腹壁缺损的修复，这种补片比传统的聚丙烯(PP)补片，具有更好的生物相容性；但其缺点是非常昂贵，相关产品上市产品相当少。导致其无法良好推广上市的主要原因是医用级聚羟基脂肪酸酯在制备上的困难。医用级聚羟基脂肪酸酯要求分子量较为准确，纯度高，内毒素含量低。
聚(R)3-羟基丁酸酯(PHB)作为PHA第四代产品，是PHA家族中性能较为优异的一种，由于其降解产物中是(R)3-羟基丁酸，有助于生物组织的修复。近些年微生物代谢生物塑料获得了较大的发展，对于聚羟基脂肪酸酯(PHA)基础研究，已经可以从生物发酵获得PHA再到收集与提纯，加工成PHA器件，已基本形成了产业链。也有初步获得了医用级PHA，但是，由于生物发酵相对化学过程还存在较多不足，其产物分子量等基础化学参数难以控制，后续提纯过程常常含有细胞膜、细胞质的残留，还有一定的细胞内毒素，获得的PHA原料不够纯净，难以实现产业化。因此，目前主要存在的问题是，大多数PHA原料的纯度不高，分子量分布较宽，分子量分散度大；而且分子量较大，这严重限制了其精细化、功能化应用。
一般已经商用的PHB，其分子量大都是40万以上，而医用领域使用的PHB所需的分子量一般是10-15万(如作为手术器械材料的防粘连膜)，或10万以下(如医疗级使用的微球填充剂)。因此，如果要让PHB要实现在医疗领域的使用，往往需对其进行分子量降解以及纯化。
目前，针对PHB降解降低分子量的方法，只要是使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)进行降解。NMP属于一种化学制剂，其作为一种无色液体，能够溶于水和部分有机溶剂，性质比较稳定；并且多方研究已经证实，NMP虽然仅具有一定的弱毒性，但无论是男性还是女性，如果长时间接触NMP，均有可能会影响到精子或卵子的质量，进而导致不孕。
另外，在PHB降解过程，往往伴随着有(R)3-羟基丁酸的形成。如果使用有毒溶剂降解或非环保方法进行降解，则在PHB降解过程所产生的有益附带产品(R)3-羟基丁酸，无法得到有效利用，这是一种很大的资源浪费。(R)3-羟基丁酸作为体内的一种重要酮体，由长链脂肪酸在肝中降解产生，经血液输送到外周组织中并对机体的功能产生调节作用。其在保健品，食品和医药行业都有很大的应用价值和前景。
而针对PHB纯度低的问题，目前常用的净化方法是将PHB粗品溶于有机溶剂中进行纯化。虽然该方法可以提高PHB的纯度，但是需要使用到有毒有机溶剂(例如，三氯甲烷、二氯甲烷、二氯乙烷或N-甲基吡咯烷酮等其他有机溶剂)，这些溶剂不仅对环境产生危害，而且也对操作员工健康产生威胁。其次，传统的净化方法需要多次循环水洗，消耗大量纯水，同时，由于水洗次数多，导致PHB收率低，净化成本进一步提高。更重要的是，提纯后的PHB分子量分布仍然较宽，无法将其精细化、功能化的应用。
因此，亟需提供一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法，能够对聚(R)-3-羟基丁酸酯进行提纯，且能实现分子量分级。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出亟需提供一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法，能够对聚(R)-3-羟基丁酸酯进行提纯，且能实现分子量分级。
本发明第一方面提供了一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法。
具体地，一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
向PHB粗品中加入乙醇溶液，回流，然后去除乙醇，调节pH值为碱性后加入蛋白酶和脂肪酶，反应，固液分离，得到上层清夜和固体沉淀物；将所述固体沉淀物洗涤后，采用乙醇浸泡，再去除乙醇，干燥，即制得所述聚(R)-3-羟基丁酸酯。
优选地，所述PHB粗品的数均分子量大于2.0×105；优选地，所述PHB粗品的数均分子量为2.0×105-1.0×106。
优选地，所述PHB粗品的分子量分散度高于1.5；进一步优选地，所述PHB粗品的分子量分散度高于1.8。
优选地，所述乙醇溶液中乙醇的质量百分数为80％-99.5％；进一步优选地，所述乙醇溶液中乙醇的质量百分数为90％-99.5％；更优选地，所述乙醇溶液中乙醇的质量百分数为95％-99.5％。
优选地，所述回流为沸腾回流。
优选地，所述沸腾回流的时间为4-8小时。
优选地，所述调节pH为碱性的过程为调节pH值为8.5-11；进一步优选地，所述调节pH为碱性的过程为调节pH值为8.5-10.5；更优选地，所述调节pH为碱性的过程为调节pH值为9-10。
优选地，所述蛋白酶的添加量为0.1％-0.8％；进一步优选地，所述蛋白酶的添加量为0.3％-0.8％。
优选地，所述蛋白酶的酶活力为15-50万U/g；进一步优选地，所述蛋白酶的酶活力为20-45万U/g。
优选地，所述脂肪酶的添加量为0.1％-0.8％；进一步优选地，所述脂肪酶的添加量为0.3％-0.8％。
优选地，所述脂肪酶的酶活力为0.5-15万U/g；进一步优选地，所述脂肪酶的酶活力为1-10万U/g。
优选地，在所述反应的过程中同时采用超声波进行处理。
优选地，所述超声波的强度0.8-1.5W/cm2，进一步优选地，所述超声波的强度1.0-1.20W/cm2。
优选地，所述反应的温度50-60℃，所述反应的时间为8-48小时。
进一步优选地，所述反应的时间为8-20小时；更优选地，所述反应的时间为12-20小时。
进一步优选地，所述反应的时间为21-48小时；更优选地，所述反应的时间为24-30小时。
优选地，当所述反应的时间为21-48小时，在反应中补充脂肪酶和蛋白酶。
进一步优选地，当所述反应的时间为21-48小时，在反应8-18小时时，补充脂肪酶和蛋白酶，所述脂肪酶和蛋白酶的补充量少于初始的加入量。
优选地，所述脂肪酶和蛋白酶的补充量分别为初始的加入量的1/3-2/3。
具体来讲，所述反应时间根据最终需要制备的聚(R)-3-羟基丁酸酯的数均分子量确定。当需要制备出数均分子量为1.0×105-1.8×105的聚(R)-3-羟基丁酸酯时，控制所述反应的时间为8-20小时；当需要制备出数均分子量为4.0×104-1.0×105的聚(R)-3-羟基丁酸酯时，控制所述反应的时间为21-48小时，并在反应8-18小时时，补充脂肪酶和蛋白酶，所述脂肪酶和蛋白酶的补充量少于初始的加入量。
优选地，对所述上层清夜进一步处理，所述处理的过程为：向所述上层清夜中加入盐酸调节pH值至为3-4，于45-50℃条件下，减压蒸发浓缩，然后离心分离析出的氯化钠，得到(R)-3-羟基丁酸溶液。该处理过程能够使PHB降解过程所产生的附带产品(R)-3-羟基丁酸也得到良好回收，实现资源利用的最大化。
优选地，所述盐酸的质量浓度为15％-25％。
优选地，所述洗涤的过程为先于超声波下采用1％-3％的盐酸洗涤，再于超声波下采用去离子水洗涤。
优选地，所述浸泡的时间为2-15小时；如2-5小时，8-12小时等。
更为具体地，一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
(1)将数均分子量大于2.0×105，分子量分散度高于1.8的PHB粗品，加入质量百分数为80％-100％的乙醇溶液中，沸腾回流4-8小时，然后去除乙醇。
(2)加入水，使用0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至9-10之间；然后加入质量百分数为0.1％-0.8％蛋白酶和质量百分数为0.1％-0.8％的脂肪酶，于超声波下反应；再冷却至室温，固液分离，得到上层清夜和固体沉淀物；
(3)向所述上层清夜中加入盐酸调节pH值至为3-4，于45-50℃条件下，减压蒸发浓缩，然后离心分离析出的氯化钠，得到(R)-3-羟基丁酸溶液；
(4)将所述固体沉淀物洗涤后，采用乙醇浸泡，再去除乙醇，经真空干燥，制得所述聚(R)-3-羟基丁酸酯。
本发明第二方面提供了一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法的应用。
具体地，一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法在制备医药器材中的应用。
由于高分子量的聚(R)-3-羟基丁酸酯是一种高结晶度聚合物，直接进行水解，比较困难。本发明通过采用乙醇溶液对其进行回流渗透处理，可以破坏其结晶区，有利于脂肪酶与蛋白酶渗透入PHB粗品内部，缩短水解时间，提高降解、净化效果和效率。其中脂肪酶主要作用是降解含有酯键的化合物或高聚物，蛋白酶主要是降解各种多糖蛋白或蛋白质，两者配合使用，有利于提高纯化效果。最终再采用乙醇浸泡，不仅可以溶解低分子量的PHB，降低分子量分散度，而且可以进一步去除PHB中的细胞内毒素。该方法能够解决大多数PHB粗品纯度不高，分子量分布较宽，附带产品(R)-3-羟基丁酸不能得到充分利用，且为了确保达到医疗级产品的纯度，需要多次频繁循环水洗而导致产品收率低与消耗大量水，以及生产过程中使用有毒有机溶剂等问题。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供的方法先采用乙醇溶液对大分子量、高分散度的PHB粗品进行回流处理，使乙醇渗透至PHB粗品内部结构，破坏其结晶区；然后采用蛋白酶和脂肪酶共同作用，实现对PHB粗品的降解与净化；在固液分离后，对上层清液进行纯化，即实现(R)-羟基丁酸的回收；对固体沉淀物采用乙醇浸泡，不仅可以溶解低分子量的聚(R)-3-羟基丁酸酯，降低分子量分散度，而且可以进一步去除聚(R)-3-羟基丁酸酯中的细胞内毒素；得到纯度高，分子量较低、分子量分散度低，内毒素含量低的聚(R)-3-羟基丁酸酯。
(2)本发明提供的方法，不仅能够对聚(R)-3-羟基丁酸酯进行提纯，实现分子量分级和调控，而且能够使副产物(R)-羟基丁酸得到合理回收，回收后的(R)-羟基丁酸纯净、无毒，可以应用于医药、食品领域，能够实现资源最大化利用。
(3)本发明提供的方法，其生产操作简单，对生产设备条件要求低，不使用有毒溶剂，对环境友好。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例和对比例中，所用的蛋白酶的型号为FDG-2272，酶活力为45万U/g，由夏盛(北京)生物科技开发有限公司提供；所用的脂肪酶为酶活力为10万U/g的液体脂肪酶，由夏盛(北京)生物科技开发有限公司提供。其他原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种医疗级聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为89％，数均分子量Mn为25万，分子量分散度2.0)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌，于80℃下沸腾回流6小时。加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水；然后降温至55℃，在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9.5。然后加入0.55％(重量百分比比)蛋白酶和0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2，超声时间12小时。
超声波结束后，自然冷却至室温。然后，于5000rpm转速下，离心10分钟，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清液中缓慢加入盐酸至体系pH为3.5。然后于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍，超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，超声波时间4小时每遍。然后使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物(转速为5000rpm，离心10分钟)，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡10小时，然后将固体沉淀物经80℃真空干燥，即可获得纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表1。
表1实施例1中样品1-3的检测数据
Figure BDA0003550913700000061
Figure BDA0003550913700000071
由表1可知，实施例1制备的聚(R)-3-羟基丁酸酯的重均分子量均在13-15万之间，分子量分散度(Mw/Mn)均小于1.35，比纯化前的分散度下降了0.69；纯度大于等于96.50％，且内毒素含量低至0.09EU/mL。
实施例2
一种医疗级聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为90％，数均分子量Mn为35万，分子量分散度1.9)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌，于80℃下沸腾回流6小时。然后加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水，降温至55℃。再在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9.5后，加入0.55％(重量百分比)蛋白酶，以及0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2，超声时间12小时。
超声结束后，自然冷却至室温。然后于转速为5000rpm下，离心10分钟，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3.5。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍，超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波的时间为4小时。然后使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡9小时，然后将固体沉淀物经80℃真空干燥，即可获得纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表2。
表2实施例2中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000081
由表2可知，测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的重均分子量Mw均在14-15万之间，分子量分散度(Mw/Mn)均小于1.3，比纯化前的分散度下降了0.64；纯度大于等于97.0％，且内毒素含量低至0.11EU/mL。
实施例3
一种医疗级聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为89％，数均分子量Mn为25万，分子量分散度2.0)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌于80℃下沸腾回流6小时。然后加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水，降温至55℃。再在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9.5之间后，加入0.55％(重量百分比)蛋白酶，以及0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2。在超声时间为12小时后，再分别加入相同的蛋白酶与脂肪酶，量分别原来的一半，然后再超声波处理14小时。
超声处理结束后，自然冷却至室温。然后于转速为5000rpm下，离心10min，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3-4。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将所分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍。超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波处理4小时。然后，使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡4小时，然后经80℃真空干燥，即可获得纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表3。
表3实施例3中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000091
由表3可知，测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的数均分子量Mn与重均分子量Mw均在4-6万之间，分子量分散度(Mw/Mn)均小于1.28，比纯化前的分散度下降了0.79；纯度大于等于95.5％，且内毒素含量低至0.11EU/mL。
实施例4
一种医疗级聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为90％，数均分子量Mn为35万，分子量分散度1.9)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌，于80℃下沸腾回流6小时。然后加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水，降温至55℃。再在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的PH值调节至9.5。然后，加入0.55％(重量百分比)蛋白酶，以及0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2。在超声时间为12小时后，再加入相同的蛋白酶与脂肪酶，量分别原来的一半。然后，继续超声波14小时(共超声处理26小时)。
超声处理结束后，自然冷却至室温。然后，于转速为5000rpm下，离心10min，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3.6。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍。超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波处理4小时。然后，使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡3.5小时，然后经80℃真空干燥后，即可获得纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表4。
表4实施例4中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000101
Figure BDA0003550913700000111
由表4可知，测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的数均分子量Mn与重均分子量Mw，均在4-6万之间，分子量分散度(Mw/Mn)均小于等于1.20，比纯化前的分散度下降了0.70；纯度大于等于95.5％，且内毒素含量低至0.10EU/mL。
对比例1
一种聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为89％，数均分子量Mn为25万，分子量分散度2.0)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌，于80℃下沸腾回流6小时。然后加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水，降温至55℃。再在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9.6。然后，加入0.55％(重量百分比)蛋白酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2，超声时间12小时。
超声处理结束后，自然冷却至室温。然后，于转速为5000rpm下，离心10分钟，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3.4。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍，超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波处理4小时。然后，使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡10小时，再经80℃真空干燥，即得到纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表5。
表5对比例1中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000121
由表5可知，聚(R)-3-羟基丁酸酯的纯度较高，内毒素含量较低。但是测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的重均分子量Mw均在42-46万之间，数均分子量Mn在22-24万之间，分子量下降不明显，分子量分散度(Mw/Mn)均大于1.8，比纯化前的分散度仅下降了0.11。
对比例2
一种聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为89％，数均分子量Mn为25万，分子量分散度2.0)加入500mL的三口烧瓶中，加入150mL无水乙醇，搅拌，于80℃下沸腾回流6小时。然后加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，将乙醇蒸发掉后，补加100mL纯化水，降温至55℃。再在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9.4。然后，加入0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2，超声时间12小时。
超声波处理结束后，自然冷却至室温。然后，在转速为5000rpm下，离心10分钟，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3.6。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍，超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波处理4小时。然后，使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡10小时，再经80℃真空干燥，即得到纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表6。
表6对比例2中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000131
由表6可知，聚(R)-3-羟基丁酸酯的内毒素含量较低，且测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的重均分子量Mw均在13-15万之间，数均分子量Mn在10-11万之间，分子量分散度(Mw/Mn)均小于1.35。但得到的聚(R)-3-羟基丁酸酯的纯度明显不如实施例的样品，无法达到医疗级。
对比例3
一种聚(R)-3-羟基丁酸酯及其附带产品(R)-3-羟基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
取50g的PHB粗品粉末(纯度为89％，数均分子量Mn为25万，分子量分散度2.0)加入500mL的三口烧瓶中，加入200mL纯化水，升温至90℃，敞开瓶口，保温1小时，降温至55℃。然后在搅拌的情况下，使用0.3mol/L的氢氧化钠溶液将体系的PH值调节至9.5之间。然后，加入0.55％(重量百分比)蛋白酶，以及0.55％(重量百分比)脂肪酶。将烧瓶固定于超声波设备上进行超声波。超声波相关参数为，温度55℃，功率1.20W/cm2，超声时间12小时。
超声波处理结束后，自然冷却至室温。然后，在转速为5000rpm下，离心10分钟，分别收集上层清夜和固体沉淀物。
上层清夜为含有(R)-3-羟基丁酸钠的水溶液，向上层清夜中缓慢加入盐酸至体系pH为3.5。然后，于50℃条件下，减压蒸发浓缩，得到主要成分为(R)-3-羟基丁酸的水溶液。
将分离出来的固体沉淀物，于超声波条件下，使用2％盐酸超声波净化2遍，超声波相关参数：温度60℃，功率1.74W/cm2，每遍超声波处理4小时。然后，使用纯化水在同样超声波条件下净化2遍。每遍超声波处理后，均需离心分离固体沉淀物，转速为5000rpm，离心10分钟，弃去上层清夜，收集固体沉淀物，使用纯化水洗涤至中性。
最后，将离心分离出来的固体沉淀物使用无水乙醇浸泡10小时，再经80℃真空干燥，即得到纯化分级后的聚(R)-3-羟基丁酸酯固体粉末(即为样品1)。
重复以上实验2遍，得到样品2和3。将样品1-3进行检测，测试样品的数均分子量Mn与重均分子量Mw，并计算分子量分散度(分子量分散度＝Mw/Mn)；使用GC-2010Plus气相色谱仪检测样品的纯度；按照《中国药典2020版》方法检测样品的内毒素含量，测试数据见表7。
表7对比例3中样品的检测数据
Figure BDA0003550913700000141
由表7可知，聚(R)-3-羟基丁酸酯的内毒素含量较低，且纯度较高；但是测得聚(R)-3-羟基丁酸酯的重均分子量Mw在41-47万之间，数均分子量Mn在22-24万之间，分子量下降不明显，分子量分散度(Mw/Mn)均大于1.8，比纯化前的分散度仅下降了0.1。
以上实施例和对比例中，纯度和分子量的具体测定方法如下：
(1)纯度的测定
采用气相色谱法测定聚(R)-3-羟基丁酸酯(PHB)的纯度，具体过程如下：
首先设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25MPa，程序升温条件为：80℃保持1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃，并在此温度保持0.5min。样品的进样量为1μL，设备为岛津GC2014气相色谱仪。
待测纯度PHB样品准备：取30～40mg干燥后的PHB样品于酯化管中，加2mL氯仿，2mL包含纯甲醇、3％(V/V)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作为内标的酯化液，置于100℃下加热反应4h。待冷却后取出加入1mL蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1mL于GC进样瓶中，将仪器按照预设步骤进行设定。其他操作按照气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。
标准样品准备：取10-20mg的标准样品酯化管中，其他与上述处理步骤相同。
结果分析：以标准样品为对照，待测PHB样品(待检测样品)在标样处有对应出峰，根据峰面积计算各个单位的质量分数，然后根据各个单体的质量分数计算出摩尔比；根据加入的样品量可以计算出待测PHB样品的纯度。
(2)聚(R)-3-羟基丁酸酯样品分子量的测定
采用Water公司150ALC/GPC仪测定聚(R)-3-羟基丁酸酯的分子量。色谱柱：ShodexKF-802.5，KF-804，溶剂为氯仿。同时以Water公司产的聚苯乙烯为标准样。

Claims (10)

1.一种聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
向PHB粗品中加入乙醇溶液，回流，然后去除乙醇，调节pH值为碱性后加入蛋白酶和脂肪酶，反应，固液分离，得到上层清夜和固体沉淀物；将所述固体沉淀物洗涤后，采用乙醇浸泡，再去除乙醇，干燥，即制得所述聚(R)-3-羟基丁酸酯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PHB粗品的数均分子量大于2.0×105；所述PHB粗品的分子量分散度高于1.5。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液中乙醇的质量百分数为80%-99.5%。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述回流为沸腾回流；所述沸腾回流的时间为4-8小时。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶的添加量为0.1%-0.8%；所述蛋白酶的酶活力为15-50万U/g；所述脂肪酶的添加量为0.1%-0.8%；所述脂肪酶的酶活力为0.5-15万U/g。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述反应的过程中同时采用超声波进行处理；所述超声波的强度0.8-1.5W∕cm2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为50-60℃，所述反应的时间为8-48小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，当需要制备出数均分子量为1.0×105-1.8×105的聚(R)-3-羟基丁酸酯时，控制所述反应的时间为8-20小时；
当需要制备出数均分子量为4.0×104-1.0×105的聚(R)-3-羟基丁酸酯时，控制所述反应的时间为21-48小时，并在反应8-18小时时，补充脂肪酶和蛋白酶，所述脂肪酶和蛋白酶的补充量少于初始的加入量。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对所述上层清夜进一步处理，所述处理的过程为：向所述上层清夜中加入盐酸调节pH至为3-4，于45-50℃条件下，减压蒸发浓缩，然后分离析出的氯化钠，得到（R）-3-羟基丁酸溶液。
10.权利要求1-9中任一项所述的聚(R)-3-羟基丁酸酯的制备方法所制得的聚(R)-3-羟基丁酸酯在制备医药器材中的应用。
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