CN114574357A - 一种基于确定性侧向位移和介电泳技术联用的微藻与细菌分选装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置，属于细胞过滤分选技术领域。该装置包括PDMS盖片层，ITO电极层，玻璃基底层。所述PDMS盖片层包括确定性侧向位移分选模块，缓冲防堵塞模块，和介电泳阵列分选模块，确定性侧向位移分选模块能够根据尺寸对微藻细胞和细菌实现初步分离，缓冲防堵塞模块通过设计的箭头形微柱阵列防止细胞聚团和逆流，介电泳阵列分选模块通过设计的并列的8通道介电泳分选阵列实现高通量分选，并解决了确定性侧向位移分离与介电泳分离所需流速不匹配的问题，通过设计的梳状电极和麦穗状电极为细胞提供强而稳定的介电泳力，从而实现微藻细胞与残留细菌的高精度、高效率分离。

Description

一种基于确定性侧向位移和介电泳技术联用的微藻与细菌分 选装置

技术领域

本发明属于细胞过滤分选技术领域，具体涉及一种基于确定性侧向位移和介电泳技术联用的微藻细胞与细菌多级分选装置。

背景技术

微流控芯片技术是将样品的制备、反应、分选、检测等基本操作集成到微尺度的通道中，并自动完成分析和处理过程。具有所用样品量少，体积小，成本低，效率高，携带方便，易于集成等优点，已广泛应用于生物、医学、化学、农业、食品、环境、航海等各个研究领域。

微流控微粒分离技术主要分为主动式分离和被动式分离两大类。主动式分离方法常见的技术有介电泳分离技术、光分离技术、声波分离技术、磁分离技术等，这些方法都需要添加外部作用场来实现粒子的操控。被动式分离方法主要依靠流场的特性，以及粒子本身的尺寸，硬度等物理特性实现分离，主要包括微结构过滤技术、惯性分离技术、以及确定性侧向位移(DLD)分离技术等。但是，每种分离方法都有其局限性，比如分离纯度不高、通量偏低、制作复杂等问题。对于细菌等复杂情况的细胞分离领域，只采用单一技术难以实现有效分离。多技术联用可以综合不同技术的优点，是解决复杂条件下细胞分离的一种有效方法。

综上所述，结合多种技术设计一种高通量、高精度的微藻细胞与细菌多级分选装置及方法具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有单一技术的缺点与不足，采用多种技术联用，本发明提供一种高通量、高精度的微藻细胞与细菌多级分选装置，本发明克服了现有微流控细胞分离技术中通量低、分离精度低、易堵塞、成本高等问题，这将对于微藻分离领域以及船舶压载水检测应用具有重要的科学意义和现实价值。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置，主要包括PDMS盖片层1、ITO电极层2和玻璃基底层3；所述ITO电极层2积淀在玻璃基底层3上，所述PDMS盖片层1与玻璃基底层3紧密键合；所述PDMS盖片层1包括依次连通的DLD(确定性侧向位移)分选模块1-1、缓冲防堵塞模块1-2和DEP(介电泳)阵列分选模块1-3。

进一步地，所述的DLD分选模块包含DLD分选流道、样品入口1-1-1、鞘液入口1-1-2、两个废液出口1-1-8和1-1-9以及微藻细胞流出通道1-1-5，样品入口1-1-1通过左右分支管道与鞘液入口1-1-2的管道汇合于DLD分选流道入口端，DLD分选流道出口端分支为左右两个流阻匹配流道1-1-6和1-1-7以及中间的微藻细胞流出通道1-1-5，左右两个流阻匹配流道1-1-6和1-1-7分别与两个废液出口1-1-8和1-1-9连通；所述DLD分选流道包括位于前部的圆形微柱阵列1-1-3和位于后部的正三角形微柱阵列1-1-4，正三角形微柱阵列1-1-4以DLD分选流道中心轴线呈对称分布，每排正三角形微柱的连线与DLD分选流道中心轴线的夹角为1-10°；微藻细胞流出通道1-1-5的末端与缓冲防堵塞模块1-2连通；

进一步地，所述圆形微柱的直径为50μm，间距为200μm；正三角形微柱边长为55μm，三角形间距为40μm。

进一步地，微藻细胞流出通道1-1-5的末端通过一个突扩结构1-1-10与缓冲防堵塞模块1-2连通。

进一步地，缓冲防堵塞模块1-2包括流体通道1-2-1和交错排列的箭头阵列1-2-2，箭头的角度为30-60°，箭头的尖端朝向样品流入的方向，流体通道末端与DEP阵列分选模块1-3连通。

进一步地，流体通道末端通过一个依次串联的突缩结构1-2-3和突扩结构1-2-4与DEP阵列分选模块1-3连通。

进一步地，所述的DEP阵列分选模块1-3包含n条平行设置的并联的分选通道1-3-1、废液出口1-3-2和微藻细胞的收集出口1-3-3，每个分选通道1-3-1通过管道分别与废液出口1-3-2以及微藻细胞的收集出口1-3-3连通，其中，n为偶数。

进一步地，所述ITO电极层2位于DEP阵列分选模块1-3中的分选通道1-3-1的正下方，包括梳状ITO电极2-1和麦穗状ITO电极2-2，梳状ITO电极2-1和麦穗状ITO电极2-2分别与外部电源的正负极相连，梳状电极包含(0.5n+1)条的长条形电极2-1-2，长条形电极2-1-2等距分布，麦穗状电极包含0.5n条麦穗电极，麦穗电极等距分布，每条麦穗电极由一根长条形电极2-2-3和10-100个均匀分布的6边形电极2-2-2组成，梳状ITO电极2-1的长条形电极2-1-2和麦穗电极依次交替排布组成电极对，位于DEP阵列分选模块1-3中的每条分选通道1-3-1的正下方，其中，n为偶数。

进一步地，长条形电极的宽度为200μm。

本发明还提供了利用上述的基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置的分选方法，包括如下步骤：

A、配制所需电导率的待分离微藻细胞样品溶液和鞘液；

B、使用注射泵以一定速度将样品溶液注入样品入口1-1-1中，将鞘液以一定速度注入到鞘液入口1-1-2中；

C、经过DLD分选模块，微藻细胞经过微藻细胞流出通道1-1-5进入到缓冲防堵塞模块1-2中，细菌将从废液出口1-1-8和1-1-9流出；

D、微藻细胞经过缓冲防堵塞模块1-2中的交错排列的箭头形阵列，有效的防止细胞聚团和逆流，进入到DEP阵列分选模块1-3；

E、在DEP阵列分选模块1-3中，微藻细胞受负介电泳力，从微藻细胞收集出口1-3-3流出；细菌受正介电泳力，从废液出口1-3-2流出，实现微藻细胞和细菌的高通量高精度分选。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

(1)本发明的分选装置通过将确定性侧向位移技术和介电泳技术的结合，实现微藻细胞和细菌能够高通量、高精度的分离。

(2)本发明的分选装置通过设计的一组梳状电极和一组麦穗状电极，使得多条介电泳分离通道可以并行进行，提高了分离通量；设计的麦穗状电极由多个6边形ITO电极组成，6边形的尖端结构能够产生较强的介电泳力，残留的细菌在正介电泳力的作用下从中间的废液出口流出，目标微藻细胞受负介电泳力作用从上下出口流出，而实现高精度分选。

(3)本发明克服了单独采用DLD分选技术会产生细菌残留，分选精度低的缺点，以及介电泳技术通量低的缺陷，另外，本装置具有操作简单、自动化程度高等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

本发明共有附图5幅，其中：

图1为基于确定性侧向位移和介电泳技术联用的微藻与细菌分选装置整体结构示意图；

图2为PDMS盖片层的结构示意图。

图3为DLD分选模块的结构放大图。

图4为缓冲防堵塞模的结构放大图。

图5为DEP电极层的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

如图1所示，一种基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置包括PDMS盖片层1、ITO电极层2和玻璃基底层3；所述ITO电极层2积淀在玻璃基底层3上，所述PDMS盖片层1与玻璃基底层3紧密键合；

所述的PDMS盖片层1采用软光刻技术制作基底层，分为清洗、前烘、旋涂、中烘、曝光、后烘、显影几个步骤，然后，再在基底层上采用PDMS浇制而成。

所述PDMS盖片层1包括依次连通的DLD分选模块1-1、缓冲防堵塞模块1-2和DEP阵列分选模块1-3；

如图2所示，本发明所述的DLD分选模块包含DLD分选流道、一个样品入口1-1-1、一个鞘液入口1-1-2、两个废液出口1-1-8和1-1-9以及一个微藻细胞流出通道1-1-5，样品入口1-1-1通过左右分支管道与鞘液入口1-1-2的管道汇合于DLD分选流道入口端，DLD分选流道出口端分支为左右两个流阻匹配流道1-1-6和1-1-7以及中间的微藻细胞流出通道1-1-5，左右两个流阻匹配流道1-1-6和1-1-7分别与两个废液出口1-1-8和1-1-9连通；所述DLD分选流道包括位于前部的圆形微柱阵列1-1-3和位于后部的正三角形微柱阵列1-1-4，圆形微柱阵列1-1-3的作用是防止细胞聚团堵塞流道，圆形微柱直径为50μm，间距为200μm，正三角形微柱阵列1-1-4用于分选尺寸较大的微藻细胞和尺寸较小的细菌，尺寸较大的微藻细胞将从微藻细胞流出通道1-1-5流出，尺寸较小的细菌等将从所述两个上下废液出口1-1-8和1-1-9流出，正三角形微柱阵列1-1-4以DLD分选流道中心轴线呈对称分布，每排正三角形微柱的连线与DLD分选流道中心轴线的夹角为2.9°，正三角形微柱边长为55μm，三角形间距为40μm；微藻细胞流出通道1-1-5的末端通过一个突扩结构1-1-10与缓冲防堵塞模块1-2连通，目的是样品细胞经过突扩结构后，使样品能够均匀的进入缓冲防堵塞模块1-2；

如图4所示，缓冲防堵塞模块1-2包括流体通道1-2-1和交错排列的箭头阵列1-2-2，箭头的角度为60°，箭头的尖端朝向样品流入的方向，目的是防止细胞聚团和样品逆流，流体通道末端通过一个依次串联的突缩结构1-2-3和突扩结构1-2-4与DEP阵列分选模块1-3连通，目的是样品细胞经过突缩结构产生压力，然后进入突扩结构，充满较宽的出口通道，从而使样品能够均匀的进入所述的DEP阵列分选模块中；

所述的DEP阵列分选模块1-3包含8条平行设置的并联的分选通道1-3-1、4个废液出口1-3-2和一个微藻细胞的收集出口1-3-3，8条并联的分选流道1-3-1既增加了通量又能降低流速，从而解决DEP分选和DLD分选所需流速不匹配问题，每个分选通道1-3-1通过管道分别与4个废液出口1-3-2以及微藻细胞的收集出口1-3-3连通，经过DEP阵列分选出来的残留细菌将从这4个废液出口流出1-3-2，8条并联的分选流道1-3-1分选出来的微藻细胞汇聚到微藻细胞的收集出口1-3-3；

所述ITO电极层2位于DEP阵列分选模块1-3中的8条并联的分选通道1-3-1的正下方，是利用ITO薄膜通过湿法刻蚀的方法制作而成，如图5所示，包括梳状ITO电极2-1和麦穗状ITO电极2-2，该两组电极分别与外部电源的正负极相连，梳状电极包含5条宽度为200μm的长条形电极2-1-2，长条形电极2-1-2等距分布，麦穗状电极包含4条麦穗电极，麦穗电极等距分布，每条麦穗电极由一根长条形电极2-2-3和45个均匀分布的6边形电极2-2-2组成，梳状ITO电极2-1的长条形电极2-1-2和麦穗电极依次交替排布组成电极对，位于DEP阵列分选模块1-3中的每条分选通道1-3-1的正下方；麦穗电极中的6边形电极2-2-2的尖端结构能够产生较强的介电泳力，残留的细菌在正介电泳力的作用下从中间的废液出口1-3-2流出，目标微藻细胞受负介电泳力作用从上下出口流出，而实现高精度分选。

利用上述基于确定性侧向位移和介电泳技术联用的微藻与细菌分选装置的分选方法，包括如下步骤：

1、将扁藻细胞样品溶液15mL放入离心机中，以转速为8000rpm，室温下离心10min，倒出上清液；

2、将离心得到的扁藻细胞取出放入1.5mL试管中，加入配制的电导率为3000uS/cm的PBS缓冲液，震荡均匀；

3、将配制好的大肠杆菌悬浮液以浓度比1：1注入到配制好的扁藻细胞悬浮液中，震荡均匀，得到扁藻细胞与细菌悬浮液样品(以下简称样品溶液)。

4、将配制好的样品溶液和PBS缓冲液分别抽入两个注射器中，并装载在两台注射泵上；

5、将制作好的本发明所述的基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置芯片(以下简称芯片)放入等离子清洗机中清洗2min，保证通道的亲水性。

6、将清洗好的芯片放置在显微镜下，调整好焦距，并连接好外部的电源及信号发生器；

7、使用配制的PBS缓冲液缓慢注入到芯片中，排净芯片内的空气，以防电极上、微通道边缘形成气泡，同时冲刷通道，防止细胞粘附通道壁；

8、调节两台注射泵的流速控制，通过导管将样品溶液与芯片的样品入口1-1-1连接，将PBS缓冲液和芯片的鞘液入口1-1-2连接；

9、打开注射泵，样品溶液和鞘液被分别以稳定的流速注入到芯片中；

10、打开电源，调节信号发生器的电压与频率，使扁藻细胞受负介电泳力，大肠杆菌受正介电泳力，最终纯净的扁藻细胞从微藻细胞收集出口1-3-3流出，大肠杆菌从各个废液出口流出，从而实现对微藻细胞与细菌的高通量、高精度分选。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置，其特征在于，主要包括PDMS盖片层(1)、ITO电极层(2)和玻璃基底层(3)；所述ITO电极层(2)积淀在玻璃基底层(3)上，所述PDMS盖片层(1)与玻璃基底层(3)紧密键合；所述PDMS盖片层(1)包括依次连通的DLD分选模块(1-1)、缓冲防堵塞模块(1-2)和DEP阵列分选模块(1-3)。

2.根据权利要求1所述的分选装置，其特征在于，所述的DLD分选模块(1-1)包含DLD分选流道、样品入口(1-1-1)、鞘液入口(1-1-2)、废液出口I(1-1-8)和废液出口II(1-1-9)以及微藻细胞流出通道(1-1-5)，样品入口(1-1-1)通过左右分支管道与鞘液入口(1-1-2)的管道汇合于DLD分选流道入口端，DLD分选流道出口端分支为流阻匹配流道I(1-1-6)和流阻匹配流道II(1-1-7)以及中间的微藻细胞流出通道(1-1-5)，流阻匹配流道I(1-1-6)和流阻匹配流道II(1-1-7)分别与废液出口I(1-1-8)和废液出口II(1-1-9)连通；所述DLD分选流道包括位于前部的圆形微柱阵列(1-1-3)和位于后部的正三角形微柱阵列(1-1-4)，正三角形微柱阵列(1-1-4)以DLD分选流道中心轴线呈对称分布，每排正三角形微柱的连线与DLD分选流道中心轴线的夹角为1-10°；微藻细胞流出通道(1-1-5)的末端与缓冲防堵塞模块(1-2)连通。

3.根据权利要求2所述的分选装置，其特征在于，所述圆形微柱的直径为50μm，间距为200μm；正三角形微柱边长为55μm，三角形间距为40μm。

4.根据权利要求2所述的分选装置，其特征在于，微藻细胞流出通道(1-1-5)的末端通过一个突扩结构(1-1-10)与缓冲防堵塞模块(1-2)连通。

5.根据权利要求1所述的分选装置，其特征在于，缓冲防堵塞模块(1-2)包括流体通道(1-2-1)和交错排列的箭头阵列(1-2-2)，箭头的角度为30-60°，箭头的尖端朝向样品流入的方向，流体通道(1-2-1)末端与DEP阵列分选模块(1-3)连通。

6.根据权利要求5所述的分选装置，其特征在于，流体通道(1-2-1)末端通过一个依次串联的突缩结构(1-2-3)和突扩结构(1-2-4)与DEP阵列分选模块(1-3)连通。

7.根据权利要求1所述的分选装置，其特征在于，所述的DEP阵列分选模块(1-3)包含n条平行设置的并联的分选通道(1-3-1)、废液出口(1-3-2)和微藻细胞的收集出口(1-3-3)，每个分选通道(1-3-1)通过管道分别与废液出口(1-3-2)以及微藻细胞的收集出口(1-3-3)连通，其中，n为偶数。

8.根据权利要求1所述的分选装置，其特征在于，所述ITO电极层(2)位于DEP阵列分选模块(1-3)中的分选通道(1-3-1)的正下方，包括梳状ITO电极(2-1)和麦穗状ITO电极(2-2)，梳状ITO电极(2-1)和麦穗状ITO电极(2-2)分别与外部电源的正负极相连，梳状电极包含(0.5n+1)条的长条形电极(2-1-2)，长条形电极(2-1-2)等距分布，麦穗状电极包含0.5n条麦穗电极，麦穗电极等距分布，每条麦穗电极由一根长条形电极(2-2-3)和10-100个均匀分布的6边形电极(2-2-2)组成，梳状ITO电极(2-1)的长条形电极(2-1-2)和麦穗电极依次交替排布组成电极对，位于DEP阵列分选模块(1-3)中的每条分选通道(1-3-1)的正下方，其中，n为偶数。

9.根据权利要求8所述的分选装置，其特征在于，长条形电极的宽度为200μm。

10.利用权利要求1-9任一项所述的基于确定性侧向位移和介电泳技术的微藻与细菌分选装置的分选方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、配制待分离微藻细胞样品溶液和鞘液；

B、使用注射泵以一定速度将样品溶液注入样品入口(1-1-1)中，将鞘液以一定速度注入到鞘液入口(1-1-2)中；

C、经过DLD分选模块，微藻细胞经过微藻细胞流出通道(1-1-5)进入到缓冲防堵塞模块(1-2)中，细菌将从废液出口I(1-1-8)和废液出口II(1-1-9)流出；

D、微藻细胞经过缓冲防堵塞模块(1-2)中的交错排列的箭头形阵列，有效的防止细胞聚团和逆流，进入到DEP阵列分选模块(1-3)；

E、在DEP阵列分选模块(1-3)中，微藻细胞受负介电泳力，从微藻细胞收集出口(1-3-3)流出；细菌受正介电泳力，从废液出口(1-3-2)流出，实现微藻细胞和细菌的高通量高精度分选。

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